Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование Chamydia Psittaci вариант Ovis в перевиваемой линии клеток почки сайги

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование Chamydia Psittaci вариант Ovis в перевиваемой линии клеток почки сайги"

ВСЕРОССИЙСКИЙ ИЛУ'ШО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я Р. КОВАЛЕНКО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

КАЛУГИНА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ CHLAMYDIA PSITTACI ВАРИАНТ OVIS В ПЕРЕБИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК ПОЧКИ САЙГИ. 03. 00. 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мое к;:а - 1992

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней овец Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - лауреат премии Совета Министров СССР,

доктор ветеринарных наук, профессор Ю. Д. Караваев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ - ОППОНЕНТЫ:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор В. А. Бурлаков

2. Кандидат биологических наук А. ¡0. Беклешова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - БНШШВиМ (г. Покров)

Защита диссертации состоится " " мЛ-t. 1992 года в / Y часов на заседании специализированного совета Д 020.28.04 по заците диссертаций на соискание ученой, степени кандидата наук и 141 Всероссийском научно-исследовательской институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко по адресу: :0rJ472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией momio ознакомиться в библиотеке ВИЗЕ Автореферат разослан " /<Р " апреля 1992 года

Ученый секретарь

спьанализированного совета

кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

1. ОГ-ЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PATOTU

. Актуальность темы. Хламидийный аборт овец раснрострна-гя поч _ти во ■■ всех странах мира, занимающихся раэп0ден;;ем этого вид;! и Тот'ннх, а такяе зарегистрирован и в ряде овцеводческих рьйопов налей страны.

Эта инфекция наносит больной экономический улерб хогяас:Еау, вьрахчктайся в недополучении и гибели приплода (ь отдельных случаях с гибелью маточного поголовья). снижением же ой массы тела .тавотных, ухудшением шерстной продуктивности, нарушением силс-кц:;-олной и племенной работы, затратам! ка проведение Еетерпнарно-санитарных и профилактических мероприятий ( Kl Л. ¡{ьраЕагь. iOGV ).

Проблема лечения и профилактики хламидийного аоорта сгсц не нашла окончательного решения. Как покасал опит capy6e:"j:i:x отечественных ученых, эффект от актибиотикотерапип достигается но всегда . (К. Henning et al. , 1980; А. А. Шаткш и др., 1905) - Единственная возможность профилактики хламидиозов - специфическая сак цинация (D. Bowen, 1983; Т. Попов, С.Мартинов, 1905; J. Vitt-os. 19S6).

В налей стране широко применяется кнактивироганная эмульсин -вакцина против хлачидиозного аборта, овец. Культивирование к накопление антигенов хламидий для ее изготовления в производствен ных условиях осуществляется на развиващихся куриных эмбрионах (КПД. Караваев, 198?).

Существующей метод трудоемок, требует сложной очистки препарата (J. Harper, St. Dwyer et ai. , 1967); отрицательными факторами являются сезонные колебания чувствительности куриных эмб рионоп к хламидиям ( Е. Jawetn et, al. , 1962 ), необходимость использования эмбрионов от птицы, не лодвергав'лейс воздействию ан-

- 2 - . тикотиков и иммунизации живыми противовирусными вакцинами (. А. А. .Авакян, ЕЛ. Попов, 1976) и др.

Определенные преимущества имеет метод культивирования хлами^ дий в культурах клеток,* обладающих большей однородностью и дающих возможность ускоренного завершения опытов. Поскольку при моделировании персистентной хламидийной инфекции в условиях целостного организма невозможно учесть множество взаимодействующих факторов, ; то изучение персистентной инфекции в культуре клеток позволяет1 раскрыть некоторые механизмы взаимодействия возбудителя и клетки-: хозяина (A.A. Шаткин, 1986).

Для культивирования хламидий предложены первичнотрипсини-эированные культуры клеток ( J. Bland, 1935; E.Welss et al., 1954; A.A. Авакян, ЕЛ. Попов, 1965; J. V. Harris, 1984; Т. IL Щербань и др.,1984), диплоидные культуры клеток сельскохозяйственных животных (Г. П. Пан'кова и др., 1977), перевиваемые клеточные линии лабораторных животных (V.M. Becerra et al. , 1974; I.E. Anderson, 1986), культура клеток зеленой мартышки (J. Tessler et al. ,1983) и человека (L. Schindar-ov et al., 1964).-

Однако все эти поиски, sa исключением некоторых, не привели-к разработке стабильной технологии . выращивания хламидий' (С. psittaci). в культуре клеток.

Цель работы.

Разработка метода культивирования С. рэКЪас! ( штамм К- 8 ВИЭВ) в культуре клеток млекопитающих и получение "культураль-ного" антигена для изготовления вакцин и диагностикумов.

Задачи исследования:

- осуществить подбор культур клеток для выраотвания хламидлй;

- адаптировать "эмбриональный" штамм С. рз!Нас1 К- 8 ВИЭВ к перевиваемой линии клеток;

- разработать метод длительного культивирования персисгентно (хронически) инфицированной хламидиями линии клеток почки сайги (ПО);

- изучить развитие возбудителя в первично зараженной и пер-систентно инфицированной хламидиями культуре клеток ПС и биологические свойства "культурального" итамма К- 3 ВИЭВ.

- изучить возможность использования реакции нейтрализации с ' применением "культурального" антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза.

Научная новизна.

1. Осуществлена адаптация возбудителя хламидийного аборта овец (штамм К- 3 ВИЭВ) к перевиваемой клеточной линии ПС, в результате чего полудана линия клеток, персистентно инфицированная С. рэ 1 и.ас 1.

2. Изучены биологические свойства "культурального" штамма К-8 ВИЭВ и особенности развития возбудителя в первично и персистентно инфицированной линиях клеток ПС. Установлено, что адаптированные к культуре клеток хламидии сохраняют вирулентность и имму-ногенные свойства для куриных эмбрионов и лабораторных хивстпых.

3. Проведены цитологические и электронномикроскопические.ис-

следования взаимодействия С. рз1Нас1 с.клеткой. Предложена схема развития хламидий в первично инфицированной и персистентно инфицированной линиях клеток ПС.

Практическая значимость работы.

1. Разработан метод длительного культивирования хламидий в персистентно инфицированной культуре клеток ПС с целью получения "культурального" антигена для диагностики хламидиозов и изготовления вакцинного препарата

2. Материалы диссертационной работы включены в "Методические ■ рекомендации по культивированию возбудителя хламидийного аборта овец в перевиваемой клеточной линии почки сайги".

3. "Культуральный" хламидийный антиген может быть испольво-ван в иммунологических реакциях.

Апробация работы. '

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Конференции молодых ученых ВИЭВ (199'Ог.);. на III Всесоюзном совещании " Культивирование клеток животных и человека", г. Пущино (1990 г); на Всесоюзной научно- технической конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной № женерии в ветеринарной медицине", г. Нижний Новгород (1990'г.); на заседании секции Всесоюзного биохимического общества,МВД (1990г.)

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в двух работах.

•- Б -

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов, выводы и практические предложения, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами,.^- рисунками. Список литературы подержит. //¿> источников, в том числе.иностранных.

2.' СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

«

2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в период с 1988- 1-990 г. г. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней овец ВйЭВ. При проведении исследований были использованы штамм С. psittaci К--

8 ВИЭВ; перевиваемые клеточные линии почки карликовой козы (ПКК); почки сайги (клоны ПС- ФГМ- 10 и ПС- Г ЛАЮ), полученные из крио-банка Коллекции перевиваемых клеточных линий сельскохозяйственных и промысловых животных (ВСКК СЙЯ BAQXHU/I); перевиваемая клеточная линия почки плода овцы (FLK), полученная из Болгарии ( Институт инфекционных и паразитарных болезней); развивающиеся куриные эмбрионы 6... 7 и 4 - дневного возраста; белые мыши; морские свинки.

КуДЬтивирование клеточных линий проводили с использованием гидролизатных питательных сред - 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) на растворе Хенкса, 0.06Х ферментативного гидролизата мы щечных белков (ФГМ-С) и синтетических сред ИГЛА, ИГЛА- MEM, 199,

сыворотки крови крупного рогатого скота, телят, эмбриональной бычьей сыворотки.

Для снятия клеток при пересеве применяли 0,02% раствор вер-сена (ЭДТА) с химопсином (или химотрипсином) в соотношении 9:1.

Цитологические исследования, криогенизацию и электронную микроскопию проводили согласно методикам, описанным Дьяконовым ЛИ с'соавт. (1988).

Цитологические препараты фиксировали в одной из фиксирующих смесей: растворе Буэна, метиловом спирте, фиксаторе Карнуа. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином или по Романовскому-Гимза.

Криоконсервацию клеток осуществляли в среде,содержащей 502 среды культивирования, 10% диметилсульфоксида (ДДОО) и 40% эмбриональной бычьей сыворотки.

Для электронной микроскопии инфицированной хламидиями перевиваемой культуры клеток клеточную Ьзвесь в монослое фиксировав 5% глутаровым альдегидом, приготовленным на фосфатном буфере ( пс Миллонгу). Клетки, отмывали буферным раствором с сахарозой (5%) ) дофиксировали 1,33 % раствором четырехокиси осьмия ( по Паладу ). Обезвоживание проводили в спиртах 'нарастающих концентраций 30° 50®, 70®, а затем в 70*, 80°, 90°ацетоне, .заканчивая двумя смена ми 100% ацетона. После этого материал проводили через смесь эпок

> сидных смол с катализаторами. Удалив остатки смолы и залив клетк

<

. свежей порцией рабочей смеси смол,их помещали в термостат при 37 а затем при 60°С. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме фир ЬКВ (Швеция). Контрастирование ультратонких срезов проводили ур Пил- ацетатом и цитратом свинца по Кеупа1;). Препараты просматрива в электронном микроскопе 'УЕМ - 100В (в лаборатории биофизики ВИЗ

при постоянном напряжении тока 80 к*. Инструментальное увеличение 3- 50 тыс.

Для "освежения" штамма К- 8 при адаптации хламидий к перевиваемой линии (меток использовали 6- дневных развивающихся куриных эмбрионов, которых заражали в желточный мешок 10% суспензией клеток стенок желточных мешков, инфицированных хламидиями при предыдущем пассаже. Наличие возбудителя устанавливали микроскопией пазков- отпечатков внутренней поверхности желточных оболочек. • Мазки фиксировали в спирт- эфире и окрашивали по Романовскому-Римза Перевиваемую клеточную линию ПС инфицировали 1% суспензией клеток желточных мешков, приготовленной на среде культивирования ■меточной линии. Материал не подвергали предварительному замора- ' киванию. После двухчасовой экспозиции с антибиотиками ( гентами-дином) при +4°С суспензию клеток желточных•оболочек дважды центрифугировали при 800 "об/мин на центрифуге К- 70 и надосадок, этобранный из- под слоя жиров и липидов инокулировали на клеточ-1ьгй монослой, выращенный без антибиотиков.

Для индикации хламидий в инфицированных клетках использовали;• краску по Романовскому- Гимза, а также реакцию иммунофлуоресцен^ щи (в непрямом варианте) с отрицательной , специфической гипе-жммунной и антивидовой (антибараньей), меченной ФИТЦ, сыворотка-ш, изготовленными ИЭМ им. Н. Ф. Гамалея АМН СССР. Препараты изу-[али в люминесцентном микроскопе ЛОМАМ при комбинации светофиль-'ров: ЯС 1-5, ВС 8-2, СЭС 7-2, ЖС 8 (объектив с масляной иммерсий х 90; окуляры х 5 и х Э).

- 8 - .

2. 2. Результаты исследований.

2.2.1. Первичное инфицирование культуры клеток почки сайги' (ПС) "эмбриональным" штаммом хламидий К- 8 ШЭВ.

Выбор клеточной линии, выведенной И. Г. Кекухом и др. (1984) из тканей почки сайги определялся с учетом того, что сайга филогенетически близка к роду Ovis и свободна от инфекций, свойственных овцам ( особенно медленных инфекций: висны-мэди, скрепи). Способность клеток линии ПС переживать in vitro без существенной дегенерации при культивировании без смены среды около 3...4- х недель, позволила проводить длительное пассирование зараженных клеток.

■Так как способность штамма С. psittaci К- 8 ВИЭВ к репродукции на культуре клеток без дополнительных методических приемов, а-равно и чувствительность линии ПС к возбудителю хламидиозного аборта овец, были не иавестны, то первичное заражение культуры клеток ПС хламидиями было проведено в параллельных опытах: 1. с предварительной обработкой монослоя ДЕАЕ-декстраном, механической адсорбцией микроорганизма на монослое с помощью центрифугирования и добавлением глюкозы в поддерживающую среду; 2. без оптимизации условий культивирования хламидий. Титр 'инфицирующей суспензии составлял 4,5 lg ЭЛД 50\0,2мл. При первом варианте заражения после центрифугирования пробирок с монослоем инокулят удаляли, внося в пробирки по 1-2 мл поддерживающей среды с 5Z глюкозы. При вторах варианте заражения клеток ПС инокулят удаляли через 24 часа.. .

Пересев первично инфицированных клеточных линий проводили через 3 недели,' в течение которых не меняли среду культивирования клеток. В качестве контроля^ Ml культивировали-неинфицированные почки сайги, контроля N2-, монослой культуры ПС с инокулятом в ви-

де 1% суспензии клеток стенок .телточных мешков неинфицированных куриных эмбрионов.

После проведения трех "слепых" пассажей при световой микроскопии цитологических препаратов разницы в накоплении в клетках ПС хламидий при обоих способах первичного заражения культур мы • по отмечали. В дальнейшем культивирование персистентно инфицированной хламидиями линии ПС проводили без ДЕАЕ- декстрана и глюкосы.

2. 2.2. Культивирование хронически инфицированной хламидиями линии клеток почки, сайги.

В первично зараженных культурах клеток ПС не наступало значительной дегенерации монослоя, и при последующих пересевах культуры в клетках отмечали накопление ' возбудителя. При длительном оубкультивировании зараженных хламидиями клеток на 20-30 пассажах, была получена хронически инфицированная линия клеток почки сайги. Если монослой поражалсй хламидиями на 50% и более к моменту пере'.-сева персистентно инфицированных клеток, то последующий пассаж проводили путем их сокультивирования с неинфицированным гомологичным клоном. Для чего во флаконы высевали суспензию,- состоящую из инфицированных клеток предыдущего пассата и "чистых" клеток в соотнопйнии 1:0,5 - 1:1. Пэсевная концентрация -200 тыс. кл. в 1 мл суспенздо. Продолжительность пассирования- около 10...14 суток. Роллерное культивирование персистентно инфицированного хламидиями клона ГО- ГЛА- 10 проводили аналогичным образом. Посевная концентрация клеток- 300 тыс. /ил. Продолжительность культивирования-10.. .12 суток.

2.2.3. Развитие хламидий в первично зараженной и .хронически инфицированной культуре клеток почки сайги.

Электронномикроскопические исследования"и описание цитологи-препаратов проведены совместно-с проф. Л. П. Дьйконовым. Анализ-опытов по изучению взаимодействия культивируемых хламидий с клеткой, проведенный в результате наблюдения нативных препаратов в живой культуре,микроскопии окрашенных препаратов в динамике куль- ■ тивирования и развития хламидий, а также электронномикроскопичес- ■ ких исследований ультратонких срезов пораженных тканей в монослое позволяет сделать вывод о характере паразитирования хламидий и реакции клетки на их внедрение и развитие. -Имеется возможность •• выделить несколько характерных этапов всг взаимодействии ыикроор-- -• ганизма и клетки в-зависимости от продолжительности развития возбудителя и числа пересевов зараженной культуры. На первых 8- ми. пересевах инфицированной хламидиями линии ПС наблюдалась интенсивная вакуолизация цитоплазмы клеток. На электроннограммах видно, что часть вакуолей не содержит хламидий; их появление, по- видимому, связано с токсическим воздействием микроорганизма на клетку.; На более поздних этапах адаптации штамма К-.8 БИЭВ к постоянной линии клеток ПС (9- 12 пассажи) паразитофорные вакуоли стали увеличиваться в размерах. Подобные вакуоли содержали микроколонии возбудителя, состоящее из "олиморфно окрашенных телец хламидий на ■■ разных этапах развития.

На 3... 5 сутки в длительно пассируемой хронически инфицированной *, культуре почки сайги происходит слияние паразитофорных вакуолей..- .

Пораженная клетка превышает размеры нормальной в 2- 3 раза и имеет, как правило, округлую или овальную форму. В нативных препаратах живой культуры клетки такого рода имеют вид прозрачных, блестящих шаров, окруженных утолщенной оболочкой. При исследовании в РИФ на темно- зеленом фоне наблюдали хламидии, которые светились в виде ярких гомогенных скоплений неправильной формы разных раз меров и одиночно лежащих в цитоплазме клеток частиц, либо в виде. колоний, состоящих из отдельных элементарных телец с темним злип-сообразным центром и ярким желто- зеленым ореолом вокруг каждой частицы. На окрашенных препаратах видно, что ядро клетки оттесня-', . етс'я, на переферию клетки и "расплющивается" между ее оболочкой и мембраной паразитофорной вакуоли.В отдельных случаях наблюдается пикноз ядер, а цитоплазма при этом замещена паразитофорной вакуоль» с хламидиями, превышающей размеры нормальных клеток в 5-б раз. Пересев подобных структур не удается, то есть они разрушаются, и при последующих пассажах (в первые 48 часов) не обнаруживаются.

При делении клеток в зараженной культуре можно наблюдать■патологические форш митозов:_ отставание, а также недостаточную спирализацию хромосом, что на завершающем этапе 'деления приводит к образованию микроядер. Наряду с этими процессами отмечается появление небольших 2- 4- ядерных симпластов. Симпластообразование при хламидийной инфекции перевиваемой линии клеток 1Ю имеет свои особенности. На окрашенных препаратах можно видеть, как вокруг паразитофорных вакуолей, заполненных хламидиями, группируются ядра соседних клеток. Слияние вакуолей сопровождается формирование.: . концентрических структур из расположенных рядом клеток и ядер.

Процесс подобного 'симпластообразования происходит, как в хрони-1 чески инфицированной, так и в первично зараженной культурах» -(рис.1). Е персистентно инфицированной культуре можно видеть уникальные '.Ьормы сочетания Формируицихся' паразитофорных вакуолей, при которых по фону крупной вакуоли с микроорганизмами образуется новый симпласт с соответствующей вакуолью. На отдельных стадиях Еакуоль име^т разную толщину стенки: е одних случаях она тонкая, в. других - более плотная, чем клеточная стенка. На электронноу.ик-. роскопичееком снимке ультратонкого среза видно, что такая мембрана пар&зитофорной вакуоли представлена в виде нескольких концентрических слоев, что указывает на разные сроки форкироьания яеыэ-. раны. Относительно независимое рьггитие хдамидий,' отграниченных от цитоплазмы клетки оболочкой этой вакуоли, повидимому, оСе^ле-• читает определенное равновесие е системе "паразит- клетгл", со всеми последствиями, связанными с развитием хламидий.

Обобщая данные электрокномикроскопических исследований хро- . нически инфицированной линии клеток ПС, мы мохем выделить три основные пути взаимодействия хламидий с клеткой (рис.2). При "продуктивном" цикле развития возбудителя ' наблюдается закономерная смена его форм: ь элементарных тельцах (ЭТ). нуклеоид становится менее плотным, нити ДНК рассосредотачиваются по цитоплазме, которая тоже становится просветленной. Увеличиваясь в размерах, элементарное тельце преобразуется в ретикулярное (РТ), которое де--лится бинарно или почкованием. Превращение вегетативной формы в спороподобну!} (ЭТ) происходит .в результате обратного процесса,' то • есть конденсации нуклеоида и уплотнения цитоплазмы через ряд промежуточных форм. На ультратонких 'срезах в цитоплагызтическшс

Рис. 1 •

Схема отдельных этапов симпластообрагования в персистентно инфицированной хламидиями линии клеток почки сайги (по результатам сЕетовой и электронной микросколии).

и симпластообразоЕания.

1 - утолщенная мембрана ларазитофорной вакуоли;

2 -.включение ("колония" хламидий); 3. - ядра 'слившихся клеток;

4 - концентрическая структура из ядер прилегающих к симп- , ; ласту непораженных клеток.

РИС. 2

Возможные пути развития хламидийной инфекции в паразитофорных ьакуолях персистентно инфицированной линии клеток почки сайги.

I. "Продуктивное" размножение хламидий. 1а1 Деление хламидий путем почкования. 10. Бинарное деление хламидий.

II. Образование Ь-подобных форм хламидий.

III. Деструкция хламидий.

П. Е - парз?кгсфорна<з вакуоль, Э. Т. - элементарное тельце , Д. Ф. - делящаяся форма, К.- "колония" хламигий на разных стадиях развития под обпей оболочкой, Р. Ф. - разрутющаяся форм%1.-ппдогяая форма, 1-мембрана паразитофс-риой вакуоли, конценгп1Ч'Т1М-- мегбраны лара:;итофорной впкуоли.

включениях нами были обнаружены аномальные формы хламидий с■ дефектами клеточной стенки. По- нашему мнению, одни из этих структур хламидий являются Ь- подобными формами, а другие представляют 'собой дегенерирующие формы возбудителя.

Титр' хламидий в культуральной жидкости 24-го пасеаяа итамма К-8 ЕИЭВ на клетках ПС- ФГМ-10 к 14-ому дню культивирования при титрации на куриных эмбрионах составил 8,5 ЭЛЦ 50/0,2мл. Большее число пассажей (около 40), потребовавшихся получения персис-1 тентно инфицированного хламидиями клона ПС- ГЛА 10, который в дт-личии от'-клеток ПС- ФГМ- ю можно культивировать ь роллерных условиях, связано, по-видимому, с нестабильным составом среды культивирования инфицированных клеток. Динамика и характер проявления ЦГЩ Хламидий, вызванные адаптированным штаммом.в течение одного пассажа на клонах клеток ПС- ФГМтЮ и ПС- ГЛА--10,бшш сходными. ' Титр хламидий, полученных из культуральной жидкости 39-го пассажа клона ПС-ГЛА- 10, составил 9,8 ТЦЦ 50/мл.(табл. 1).

V

»

2.2. 4. Определение чувствительности перевиваемых клеточных , линий почки карликовой газы (ПКК) и почки эмбриона овцы (П.К) к штамму хламидий К-8 ВИЭВ, адаптированно-, му к клеткам почки сайги (ПС).

Для заражения клеточных линий ПКК и ПК мы использовали: культуральную жидкость от 21-го пассажа клона клеток ПС-ФГМ-10, -персистентно инфицированного хламидиями (титр-7,51д ЭЛД 50/0,2мл, • доза заражения 1000 ЭЛД 50). В "клетках ПКК, имеющих сходный морфологические свойства с клоном Ш- ФП4- 10 ( и культивируемых на

Таблица 1

Результаты титрования культуральной жидкости от 39 - го пассажа персистентно инфицированного хламидиями клона ПС - ГЛА -10 Разведение . _ • ■

культуральной Динамика проявления ЦПД ( сутки после инфицирования)

лидлиити

1 2 3 .4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

исходная ++ ++++ -++++ н ИНН к ++++- -н-н- • ++++ ,++++ ++++ ++++ ++++ 1 3»

10-1 •• +■ +++ ++++ + - ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

10-2 -м- ++. ++ + +++ ■ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ •

10-3 ■ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

10-4 ++ +++ + •++4 ■ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 4-+++

10-5 - . + ++ +-» +++ ++++ ++4+ ++++ ++++ ++++ ++++

10-6 ■ - ; • ■ - + ' . +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

10-7 ■ .•■> - + ++ +++ +++ ++++• ++++ ++++ ++++ ++++

10-3 _ * - ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ .

10-9 . - _ - • • • + :' + ++ +++ +++ +++

10-10 + + + + ' +

10-11 + + +

контроль - - -

Обозначение: + ЦПД в одной пробирке +++ ЦВД в трех пробирках

++. ЦПЦ в двух пробирка* ++++ ЩЩ в четырех пробирках. Титр: 9,8 1е ТЦД 50.

- а? -

среде того же состава), после проведения 12- ти длительных пасса-'.жей "культуральный" штамм К- 8 ВИЭВ репродуцировался в титре 3,5-4,51g ЭЛД 50/0,2 мл. Возможно, что эти показатели не являются предельными, поскольку для полной адаптации возбудителя необходимо большее число пассажей. В перевиваемой линии клеток FLK хламидии не удавалось накапливать даже в минимальных титрах. Это может объясняться контаминацией линии FLK вирусом лейкоза и его возможным антагонизмом с хламидиями. Кроме того в клетках FLK невозможно проведение длительных пассажей возбудителя, так как через 5- 7 дней культивирования клетки дегенерируют.

2. 2.5. Изучение биологических свойств хламидий, культивируемых в хронически инфицированной линии ПС, на развивавшихся куриных эмбрионах, белых мышах, морских свинках.

В опытах по изучёнию патогенности и вирулентности хламидий на куриных эмбрионах нами был применен метод заражения в желтой-. ный мешок, как наиболее оптимальный (Ю. Д. Караваев, 1987). Результаты опыта (табл.2) показывают, что "культуральный" штамм хламидий К- 8 ВИЭВ в процессе адаптации к перевиваемой культуре клеток ПС не потерял' способности репродуцироваться в куриных эмбрионах. Массовая гибель эмбрионов ( 90-96Х) приходится на 10... 13 сутки с момента инфицирования и продолжается до 21- дневного возраста. Титр- хламидий, 'выращиваемых в клетках ПС-ГЛА- 10 (39- ый пассах : 8,5 lg ЭДД 50/0,2 ka) превышает" титр исходного "эмбрионального" штамма (6,.5 lg ЭЛД 50/мл).

Таблица 2.

Результаты титрования' штамма хламидий К-8 ВИЭВ, полученного из культуральной .жидкости от 39-го пзооага персистентно инфицированной линии клеток ПС-ГЛА-Ю на четьфехдневных куриных эмбрионах.

Разведе-Кол-во Доза за- Динамика гибели эмбрионов, Всего Результаты кие хла-эмбри- ранения, сутки после заражения пало микроскопии

мидий. снов мл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

10-1 10 . 0,2 1 - - 1 - - - 2 3 1 1 . - - - 9 ++++

10-2 10 0,2 - 2 1 - 3 1 1 2 - - - 10 ++++

10-3 10 0,2 - - 1 - - - 1 3 - 2 1 1 1 - - - 9 ++++

10-4 10 0,2 - 3 1 1 2 1 - 1 - 10 ++++

10-5 10 0,2 - 1 - - - - - 2 2 - 3 1 -. - 9 ++++

10-6 ■ 10 0,2 - 1 - 3 1 г 1 1 - 10 ++++

10-7 10 .А2 - . . . 1 -• - - 1 2 1 2 - 1 1 10 ++++

10-8 10 . ^ о - 1 - - - - - - 1 1 - - . 2 1 6 +++

10-9 10 0,2 1 - 1 1 4 ++

10-10 •10 0,2 - - 1 - .- - - - - - 1 - 1 1 3 +■+

контроль 8 0,2

среда культивирования Титр штамма - 8,5 ЭЛД 50/0,2мл.

Примечание: + наличие хламидий в мазках - отпечатках, - отсутствие хламидий в мазках - отпечатках.

Для изучения чувствительности белых мышей к хламидиям,культивируемым в клетках ПС, в опыт было ваято 30 нелинейных животных массой 15-20 г,которых заражали интраназально и интраперитониаль-•но культуральной жидкостью, полученной от 39-го пассажа персис-тентно инфицированного клона ПС- ГЛА- 10 в дозе 0,1 мл. Из результатов опыта видно, что "культуральный" штамм хламидий остался не инвазивныы для белых мышей при интраназальном введе--нии. При внутрибрюшинном заражении мыши заболевали на 5... 8 и погибали на 7... 10 сутки с момента инфицирования.

В опыт о целью изучения инфекции, вызываемой хламидиями, пог . лученными от 27-го пассажа персистентно инфицированного клона ПС-ГЛА-10, взяли 24 йебеременные морские свинки массой 500-600 г.-.Прц' интраназальном заражении животным вводили 1,0 мд, а при интрапе-ритониальном- 1. 5 мл культуральной жидкости в титре 7,0 lg ЭЛД 50/0,2 мл. В первом случае пало две трети, а во втором - половина животных. Клиническое проявление заболеваний, вызываемых у белых ■ мышей и морских свинок "эмбриональным" и "культуральным" штаммами. К- 8 ВИЭВ Сьао сходным. В мазках-отпечатках из паренхиматозных ' органов павших животных были обнаружены хламидии.

Сыворотки крови, полученные от морских свинок, оставшихся живыми на 21- е сутки после заражения, а также выборочно от ли-:: вотных контрольной группы, были проверены на наличие хламидийньа: антител в реакции нейтрализации на перевиваемой клеточной линии. ПС. В качестве антигена использовали "культуральный" штамм хламид . дий.. Титр1 антител в сыворотках крови инфицированных морских сви-. нок составил 1:16 - 1:32 при отсутствии антител у не инфицированных чсивотных.

Инфекционность штамма хламидий, выращенных в культуре клеток .' Ж подтверждена в опытах на овцах аспирантом лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней овец С. П. Шакаряном. штамм К- 8 ВИЭВ сохранил после длительного пассирования в культу-. ре клеток почки сайги вирулентность, антигенные и иммуногенные свойства.

ВЫВОДЫ.

1. Перевиваемые линии клеток почки сайги ПС и почки карликовой козы ПКК чувствительны к С.рз1иас1 (штамм К- 8 ВИЭВ). Развитие хламидий в клетках культуры ПС и ПКК после первичного заражения и в процессе субкультивирования сопровождается выраженным ци-топатогенным действием. В опытах по адаптации С. рзИЛас1 (штамм К- 8 ВИЭВ) к постоянной клеточной линии .фибробластов плода овцы П.К получены отрицательные результат

2. Впервые получена стабильная хронически (персистентно) ин фицированная линия клеток парнокопытных ПС, являются продуцентом С. рз1ЬЬас1. Хламидии, выращенные в культуре ПС, сохраняют виг рулентные, антигенные и иммуногенные свойства.

3. В постоянной клеточной линии почки сайги, хронически ин=-фицированной хламидиями, цитопатогенное действие отмечается, начиная с третьих суток после пересева, и нарастает в течение 7. .'.14 дней. Оптимальный срок пассирования - 14 суток.

4. Развитие хламидий в культуре ПС харастеризуется формированием в клетках многочисленных, увеличивающихся в размерах, а затем сливающихся паразитофорных вакуолей, готорые оттесняют ядро клетки между клеточной мембраной и оболочкой паразитофорной вакуоли. В монослое инфицированной линии ГК наблюдаются симпдасты

клеток, к которым по переферии примыкают ядра, как пораженных, так и непораженных хламидиями клеток.

5. Процесс заражения клеток в монослое идет за счет проникновения хламидий' из пораженных клеток в "здоровые" или слияния инфицированных и неинфицированных клеток.

6. Методом электронной микроскопии выявлены отдельные этапы развития хламидий в клетках, формирование паразитофорных вакуолей и различные формы возбудителя на определенных стадиях развития. Предложена схема развития хламидий в первично зараженной и хрони-. чески инфицированной культурах клеток ПС.

7. На ультратонких срезах персистентно инфицированной хлами- .. днями постоянной линии клеток ПС выявлены подобные формы возбудителя и хламидии в стадии дегенерации.

8. Хроническая инфекция в клетках ПС свидетельствует об определенном равновесии взаимоотношений в системе "хламидии- клетка".

9. Хламидии, выращенные в культуре клеток почки сайги, могут быть использованы в качестве антигена с целью получения гипериммунных сывороток и постановки реакции нейтрализации, а также изготовления инактивированной вакцины против хламидиозов сельскохозяйственных животных.

практически; предложения

1. Адаптированный штамм С. рз1ЪЬас1 К- 8 ВИЭВ к перевиваемой клеточной' линии почки сайги. Метод культивирования хламидий в

I

'хронически (персистентно) инфицированной линии ПС с целью получения антигенного материала.

- е2 -

2. Культуральный хламидийный антиген может Оьггь использован в иммунологических реакциях для ретроспективной диагностики хла-мидиозов.

3. Материалы диссертации включены в нормотивно- техническую документацию по изготовлению и применению хламидийного антиген; при производстве вакцины.

ПУБЛИКАЦИИ.

1. Караваев Ю. Д. , Калугина И. А. , Дудар ЕЕ Адаптация хлами-дий штамма К- 8 ВИЭВ к перевиваемой культуре клеток почки сайги. В кн.: Культивирование клеток животных и человека. Тезисы докладов, - Пушино, 1990, - С. 99.

2. Калугина И. А. , Караваев Ю. Д., Кекух И. Г. Адаптация хлами-дий к различным клеточным культурам. Бюллетень ВИЭВ, - М., 1991.- Выпуск 77- 78. - С. 31-33.

Подписано в печать 14.04.92. Зак&з 571 Формат 60x84/16 Тирах 130

Москва. Типография ' РАС2Н