Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Критерии отбора и гибридизации гомоклонов культивируемого шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Критерии отбора и гибридизации гомоклонов культивируемого шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach"

московский государственный университет

имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Р f" ß Q д Биологический факультет

'Q^i На правах рукописи

УДК 287.238:575.2

/ ^

ГРУБЕ ЕЛЕНА ТАРИЗЛЬЕННА

критери1 отбора и гш=и00ации гомоклонов

куль^шруемого иампжьона

agaricus bisporus с lange ) imbach (03.00.24 - МИКОЛОГИЯ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре микологии к альгологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова- -

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Дьяков D.T.

Официальные оппонента: доктор биологических наук Каменева C.B. кандидат биологических наук Козлова Р.Г.

Ведущее учреждение: совхоз "Заречье".

Защита состоится 'Я&* (.¿ШЛ- 1994 ГОда На заседании специализированного совета Д 053.05.55 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119399, г. Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультёт.-

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан Ucf 1994 года.

Ученый секретарь

^специализированного совета ,

кандидат биологических: наук С.Н.Лекомцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темп. Гибридизация - важнейший селекционный

прием, который позволяет сочетать в гибриде полезные свойства родителей и експлуатировать эффект гетерозиса. Жизненные циклы большинства культивируемых грибов позволяют проводить гибридизацию, поскольку клоны, получаемые при рассеве одноядерных ба-зидиоспор, самостерклыш и могут Сыть использованы для скрещивания. У культивируемого шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach, на базидии как правило формируются две двуядерные споры. Вследствие исходной гетероаллэльности ядер большинство моноспоровых клонсв А.bisporus самофертильны и формируют плодовые тела. В связи с этим селекционная работа с культивируемым шампиньоном затруднена. Актуальность темы обусловлена необходимостью исследования новых ^подходов к гибридизации Agaricus bisporus для создания в дальнейшем новых урожайных, болезнеустойчивых сортов культивируемого шампиньона.

Цели и задачи исследований:

1). Изучение важных хозяйственных признаков дикорастущих втаммоз А.Ызрогиь.

2). Получение самостерильных гомокариотических изолятов из культурных сортов и диких штаммов А.МзрогиБ.

3). Изучение морфологических и физиологических особенностей полученных гомокариотических изолятов.

4) - Использование этих изолятов для создавая гибридов

шампиньона двуспорового.

Нгучяая новизна и практическая ценность работы.

• Разработаны новые подходы к методу получения самостерильных гомокариотических штаммев у культивируемого ичмшшьона. По-

а

добран резав» центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (ГПС), который позволяет отбирать фракцию, обогащенную одноядерными базздиоспорами, и создавать коллекция гомокариотичес-■• ких культур. Ееобходиыыг для гибридизации. .

Проанализированы важные хозяйственные признаки диких штаммов А.Мзрагиз, "выделенных в Пензенской области, отобраны штаммы с полезными хозяйственными признаками для использования в гибридизация. "

ПредлсиЕН прием скрещивания на зерне, позволяющий ускорить проведение гибридизации за счет сокращения одеого этапа культивирования.

Проанализирована пригодность критериев отбора гомокариоти-ческих штамюв. С помощью метода электрофореза ферментов в по-лиакрдламидапи геле обнаружены локусы-рбгэстеразы, которые могут служить маркерами при отборе гомокариотических штаммов и гибридов.

Получены внутри- и межсортовые гибриды А.Ызрогиз, которые

можно использовать в дальнейшем селекционном процессе.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ----

III Всасопзноы совгщашш "Проблемы культивирования съедобных грибов в СССР" (Еущгно, 1991), ГУ Совещании "Промышленное культивирование съедобных грибов" (Донецк, 1993), заседании кафедры цикологии я альгологии ЛГУ (Москва, 1993) и конференции "Физиология' и биохимия мвделиальЕых грибов в связи с проблемами биотехнологии".

Объем е структура работы. Диссертация написана на

страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, применявшихся в

работе, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литератури из Ц нвименозаяий, из них зарубежных

авторов -{0.5, приложения. Работа иллюстрирована 13 таблицами и ЗУ рисунка!®.

материалы и методы

Сорта и штаммы

В работе иопользоЕаны 6 сортов культивируемого шампиньона зарубехной и отечественной селекции (табл.1) из коллекции совхоза "Заречье" и 15 дикорастущих штэимов А.Ызрогиэ из коллекции института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Таблица 1.

Сорта шампиньона, использованные в работе

. Название Цвет шляпки Прокмгоздевие

273 коричневый Киевская обл.

ГДР-2 . —//— ' Германия

56 —//— вранция

РС-17 кремовый Венгрия ' ■

113 белый Голландия

В8б --//-- Франция

Дикие штаммы, использованные в работе, собраны в Пензенской области в основном в окрестностях животноводческих ферм на сильно унавоЕенвой почве. Большинство из них имели плодоша тела от кремового до коричневого цвета. Штамм 25П - белый, штамм

50П - текЕо-коричневнй. Метода

Споровые отпечатки получали из плодовых тел на стадии зре-

лого частного покрывала. Окрашивание ядер в спорах проводили методой KCl-Гииза. Вследствие отложения меланина в оболочках спор необходимо предварительно их обесцвечивать. Был отработан метод обесцвечивания спор шампиньона 7 -55?-кыы растворои перекиси водорода в течение 10„ мин при 60°С.

Центрийггирование спор проводили стерильно в ГПС (30; 50; 60; 70л) при 1000-3000 otí/мин в течение 3-15 мин при 0°С. После центрифугирования отобранные фракции со спорами использовали для получении моноспоровых культур и окрашивания ядер. Фракции, обогащенную одноядерными спорами, извлекали из верхнего слоя градиента и распределяли в теплом картофельно-г.такозном агаре (КГА, 0.7Я) ей в агаризованной (0.7S) среде ДТ-60 (Somenberg et al., 1968). Прорастание спар стимулировали мицелием шампиньона на крышке - чашки Петри (Morgen et al-, 1989). Моноспоров не штажы выращивали при"24°С.

Для проверки фертильности моноспоровых культур и гибридных комбинаций хх" выращивали на зерне 24-30 суток, приготовленном по Лейке (Leales, 1968), после чего переносили в компост.

* Для анализа полиморфизма неспецифических естераз мицелий выращивали в 20%-вои жидком пивном сусле 14-28 суток при 24°С. Разделение белковых фракций осуществляли методом вертикального, гель-елэктрофореза в блоках полиакриламидного геля в камере Трувеллера - Нефедова (1974). Концентрирующий (3.5Í) и разделяющий (7.5%) полиакриламидные гели готовили по Девису (Davis, 1964). В хичестве електродного буфера использовали трис-глнциновый (0.051Í трис, 0.38М глицин» pH 8.3) в разведении 1:9. Гистохимичеаюе окрашявание гелевых блоков на естеразы проводили по общещмнятвм методикам (Корочкин и др., 1977).

Протопласты получала, используя стандартную методику (Sonnenberg et al., 1968) с некоторыми модификациями. Мицелий выращивали на поверхности полкой дрожжевой среда (йзрег J.R., Râper С.А., 1972), покрытой стерильный целлофаном, ггрю 24°С 1012 суток. Затем выросший мицелий фрагмвнтировали стерильно в стеклянном гомогенизаторе к засевали им колбы с жидкой дрожжевой средой. Инкубировали в течение 4-5 суток на качалке (100 об/ман) при24°С. Выросший мицелий фильтровали через капроновый фильтр, промазали стерильной водой и цитрвтным буфером (рН 6.6). Для получения протопластов мицелий суспендировали в лпти-ческой снеси и инкубировали в течение 2 часов при 24°С. Лити-ческие смеси состояли из ферментов кульгураль.чой жидкости ÏTic-hoderma harzianum и/или улиточного фермента, сахарозы до концентрации* 1 ,2М и нитратного ■буфера до концентрации 0.02М- Прот-топласта фильтровала через ватный фильтр, затем собирали центрифугированием (3-4 тыс. об/мин, 15 минут), промывааи дваждц в 0.6Î.1 сахарозе.

Для регенерации протопласты разводила в 0.83 вгарозе и 0.6М сахарозе до концентрации 2.0-3.0x10^ протоалаатов/мл и высевали на поверхность среда СМР (Sonnenbrg et al., 1S88), инкубировали при 24°С. Контроль чистоты протопластировгния: делали разведенке суспензии протопластов в воде в 10 раз д высевали на поверхность СМР. На 10-12 сутки инкубгцяи регистрировали появление первых колоний.

Производственный эксперимент был проведен в камере выращивания' с искусственным климатом по стандартной технологии на базе совхоза "Заречье".

Данные, обрабатывали статистически п> Батунеру, Позину

(1970), Яакину (1990), а также, используя программу "31а1£гарЬД.сз" компьютера 1ВН-ХТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение хозяйственны* признаков дикорастущих штаммов Аеаг1сиз Ызрогиз

J

Хозяйственные признаки изучали у 15 диких штаммов в сравнении о культурными сортами В36 и 273. В ходе эксперимента учитывали слвдундие показатели: массу и количество плодовых тел, процент закрытых плодовых тел, урожайность, сроки плодоношения.

У 13тк из 15ти исследованных диких штаммов по количеству плодовых тел и урожайности результаты сравнимы с этими показателями у контрольных сортов (табл.2). Коаффициент корреляции между урожайностью и количеством плодовых тел у диких штаммов (0.8) показывает высокую корреляцию меяду етими признаками. Наиболее высокоурожайна первая волна сбора грибов и у культурных сортов,- и у диких штаммов. Исключение -составляют, два- диких штамма: 43П и 53П, у которых высокоурожайна вторая волна сбора.

Среди диких штаммов ыожзо выделить следующие: ЗЗП, 11П, 25П, 47П и 53П, большая часть плодовых тел которых оказалась с закрытым частным покрывалом.

Со срокам плодоношения все дикие штаммы можно разделить на гдве группы: к более поздним были отнесены штаммы 48П, 43П и 1П. У штамма 48П начвло плодоношения сдвинуто на двое суток по сравнению с культурными сортами и остальными штаммами.

По морфологии плодовые тела дигасс штаммов отличались от культурных сортов. У диких ножка была длиннее, края шляпки менее прижаты к нскке, чем у культурных сортов.- Крепкие плодовые

Таблица 2.

Общее количество плодовых тел и урожайность культурных сортов и диких штаммов А.Ызрогиа за весь период плодоношения (три волны сбора)

Сорта и Количество Ковф. Урожайность Ковф.

штаммы , плод, тел вариации % кг/м вариации %

В86 191.7+32.7 29 6.96+0.36 9

273 223.0+20.9 16 6.87+0.49 12

ззп 183-7±40.0 38 7.34+0.87 20

50П 16В.7+51-1 52 6.70;1.24 32

ЗОП 171.3+5.8 в 7.6В+0.42 9

24П 154.0±33.8 38 6.71+0.59 15

49П 153.0±18.9 21 6.82+0.41 10

11П 173-0+10.5 ' ' 11 7.48+0.56 ' " 13"

34П 265.0+45.4 29 7.96±0.33 7

25П 189-3+31.1 28 7.23+0.34 8

■47П 164.7+11.0 12 - 7.06+0.22 • 5-

53П 168.3+26.2 27 6-35+0.49 13

ЮН 131.7+28.0 37 5.40±0.73 23

31П 320.3+78.5 4 г 8.12+0.76 16

48П 140.7+14.2 17 7.12+0.45 11

43П 120.7+18.4 26 5.20+0.32* 11

1П 41.0±10.2 43 1.66±0.43* * 44

Коэффициент корреляции - 0.8

* - Достоверность различий мевду средними показателей диких щтаьалов и культурных сортов при уровне значимос^я 95?».

тела хорошее формы наблюдали у диких штаммов ЮП, 4ЭП, 53П, 47П, ЗЗП.

Таким образом, исследованные дикие штаммы по основным коммерческим показателям в данных условиях сравнимы с контрольными сортами, за жсклвчением двух штаммов 43П и 1П.

2. Концентрирование одноядерных спор Наблюдения за изменением числа ядер в спорах шампиньона у разновозрастных споровых отпечатков показала, что с увеличением возраста спорового отпечатка количество одноядерных ссор уменьшается, тогда как число иногоядерных спор вследствие митозов увеличивается (табл. 3).

Таблица 3.

Изменение частоты встречаемости спор с различным количеством ядер у А.Ызрогиз в разных по возрасту споровых отпечатках.

Сорт ИЗ, Ш волна_сбора грибов (%)■

КСЛ-ВОГ 1 ." ■ возраст спорового отпечатка

ядер 24ч 36ч 48ч 60ч 72ч

1 ю.5±1 .84 4.6±0.8б 3.1+0.31 2.5+0.08

2 40.5+1 -19 20.3+1.80 30.7±1 -78 12-4+1-09 8.7+0.97

3 30.2±2.89 27-6±1.74 37.ц2.24 41.8+1.70 20.9+2.03

4 17.0±1.29 41.3+2.15 21.3+1.43 37-0+1.67 53.3+1.81

5 1.8ю.25 3-3+0.29 4.7±0.'37 4.5±р-28 11.4+1-65

6 2.0+р-21 2.3±0.30 1.0+0.05 3.8+0.72

7 " 0.4+р.оз 0.8±0.06

8 1.9+0.31

Количество ядер в спорах при хранении готового отпечатка не изменяется. Поетому все дальнейшие исследования проводили с суточными отпечатками.

После центрифугирования в ГПС большинство иного ядерных спор распределилось по слоям сахарозы, а в верхней водной фракции накапливались одаоядервые споры, концентрация которых достигала 50%. В дальнейшей работе для получения одноядерных спор использовали следующий режим центрифугирования: 3000 об/мин, 15 мин. 0°С, ГПС - 30, 50, 60, 70Я5. Прозодили сбор верхней водной фракции.

3. Получение моноспоровых культур и их свойства Центрифугирование в ГПС заметно не влияло на прорастание спор.-А.Мврогиз. Число сформировавппкся колоний составляло 3-6Я от числа внесенных в агар спор. Колонии, сформировавшиеся из спор верхней водной фракции, были разделены по скорости роста на быстро- и медленнорастущие. К первым отнесены колонии с диаметром около 40 мм на 12-е сутки роста, с хорошо развитым воздушным ватообразным мицелием и слабо развитым субстратным (раса С по классификации Гарибовой, 1964). Ко вторым отнесены колонии с дяамтром около. 11 мм (тот же возраст) со слабо развитым вой-лочно-паутинистым надсубстратным мицелием и хорош развитым субстратным (раса А). Небольшое число колоний были промежуточными по характеру и скорости роста (рвса В).

Для самостерильных моно споровых культур характерен нети-'личный медленный рост (К11©пап, 1943). Среда сформировавшихся колоний-из спор верхней водкой фракции медленных бяяо 25%, что приблизительно вдвое меньше процента одноядерных шор по ре-

зулътатам цитологического анализа. По-видимому, часть таких спор нежизнеспособна. Выделенные колонии из споровой суспензии без центрифугирования били все быстрорастущими (раса С).

При инокуляции быстрорастущими изолятами зерна оно равномерно обрастало мицелием, и впоследствии на нем образовывались пплодовые тела. Медленнорастущие изоляты или равномерно медленно обрастал зерно, или обрастала только часть зерна, прилегающая к инокулюыу. Перше способны были разрастаться в компосте, но не росл* в покровной смеси. Вторые не росли в компосте. Мед-, леннорастущне изоляты были стерильны.

У мовоспоровых изолятов изучали полиморфизм неспецифических эотераз методом электрофореза. Как видно на рисунке 1, все быстрорастущие изоляты имеют профили, неотличимые от профиля родительского сорта. Наш данные, таким образом, подтверждают результаты анализов изоферментов (May, Royse, 1982) и полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (Sumraerbell et al., 1989) о превышение частоты гетерозигот в моноспоровом потомстве над расчетной. Вероятно, у A.biaporus имеются механизмы подавления рекомбинации при иэйозз. .

В профилях естераз медленнорастущих штаммов, (рис.1) присутствуют общие с родительским сортом фракции. Вместе с тем наблюдается обеднение профилей. Исчезновение отдельных полос, по-видимому, вызвано переходом гетерозиготных локусов исходного сорта в гомозиготное состояние у полученных из него моноспоровых изолятов. Это наиболее четко видно на примере одного локуса «¿-астеразы с высокой электрофоретичеежой подвижность» (фракции с Rf 0.82 и 0.84). В спектре гетерозиготных локусов исходного сорта и бастрорастущих изолятов он' представлен обеими фракция-

m

u

2 n ü

U

m rc

X

o •a ß>

r

x o>

<r> 1

? ff>

-3

CO

to

O.

tt M.

q tp

•ts Q

Tg*-

O

,-a

fl

CD M.

o

i I 1 II III

11- ' II H !

i I 1 i liill i

11 1 II III

II 1 8 IUI:

Ii IIIIII

Ii i 1 IUI ^

1111! 1 ilülllil !

DI I rinn

II : I ililli '

Ulli ■ IIIIIIIII 1

Ulli 1 illllllll 1

liill ilillllll 1

Iii!! 1 HIHIHI 1

Ollil 1 IIIIIIIII i

Hill I illllllll 1

liill 1 illllllll 1

liiil 1 illllllli 1

HUI 8 Illllllll 1

Ulli 9 illllllll 1 '

H

ми, а у большинства медленворасткщих присутствует или та, или другая фракция. Интересно отметить, что ццленнорастущий изолят 8 имеет профиль эстераз, сходный с профилями исходного сорта из и быстрорастущих изолятов. В частности, он гетерозиготен по ло-кусу оО-естеразы с М 0.82 и 0.84. Для изолята 8 характерна в пересевах реверсия к быстрой скорости роста. Эти данные подтверждают мнение о том, что характер и скорость роста - важный, но недостаточный критерий для отбора гомокариотических штвммов.

Таким образом, подобранный нами режим центрифугирования в ГПС позволяет отбирать фракцию, обогащенную одаоядерннми спорами, и создавать коллекцию гомокариотических культур, необходимых для гибридизации.

В последующих экспериментах выделение гомокариотических культур проводили, используя разработанный нами метод. Полученные медленнорастущие- изоляты отбирали по следующим параметрам: скорость и характер роста, полиморфизм неепецифичесхих естераз, который изучали методом электрофореза, и способность к плодооб-разованию. Результаты этих экспериментов сведены в таблице 4. Заметное снижение количества гомокариотических штаммов, по-видимому, можно объяснить очень низкой жизнеспособностью одноядерных спор, причем неодинаковой у разных сортов и штаммов. Данные таблицы подтверждают сделанное выше заключение . о недостаточности критериев скорости и характера роста для отбора гомокарионов. Этот 1фитерий следует использовать на начальных ' этапах отбора и в совокупности с данными електрофореза и пяодо-образования.

Таблица 4.

Результаты экспериментов по выделению гомокариотических изолятов из культурных сортов и диких штаммов А.Ызрогиз

Сорта и штаммы

5? одно яд. спор, из верхн.фр. после ц/ф

% медл.раст.

колоний

•Я оставшихся медл.раст. после проверок

из 273 ГДР-2 В86 РС-17

56 ЗЗП 53П 34П 48П „

49-0

45.4 46.2 47.0 41.7

50.5

25.0 10.2 29.8 21 .7 22.4 21.2 28.1 34.3 26.2 24-8

11.9 0.24* 0.54* О *

1.05* *

1.4 0.56 1,4** О ** О *

Примечание » - проверка методом електрофореза

*« - проверка методом аектрофорреза и - ' ' на плодообразовавие

Таблица 5.

Внутри- и межсортовая гибридизация А.Ызрогиз

Скрещивание

Число

комбинаций

Число гибридов на зерне

Теор. огад.

X

113x03 - 16 4 50» 0.05-0.1

иЭхЗЗП 8 6 10056 0.3-0.5

ГОх53П 16 • 11 10055 0.2-0.3

03x273 8 .4 1005? 0.05-0.1

ЗЗПх5ЭП 2 .2 100Й -

33пх273 1 1 100Й ' --

53ПХ273 2 1 1005? 0.3-0.5

. 4. Выделение гомокарионов из протопластных рвгенерантов

Протопласты получали из мицелиальной культуры сорта U3 A.bisporus. Выход протопластов составлял от 4.0x10е до 3.4x10^ протопластов на 1г сухого веса, что выше на 1-2 порядка по сравнению с литературными данными (Sonnenberg et al.,1938; Yoshiyki et al., 1990; Chen., Hampp, 1993). Однако регенерация протопластов в наших експериыентах оказалась низкой - 4.2x10-% по сравнению с литературными данными: 25-3055 для A.bisporus (Sonnenberg et al., 1988). Возможно, используемые нами литичес-кие смеси не только увеличивают выход протопластов, но и влияют на их способность к регенерации.

Среди регенерировавших протопластов оказалось 50Й гомока-риотических. Анализ електрофоретических спектров эстераз-показал, что все они имеют профили, характерные для гомокариотичес-ких изолятов 1-4 (рис.1). При инокуляции этими регенерантами зерна обррастала только часть зерна (5-8 мм), прилегающая к' инокулвму. По известным из литературы данным, выделяли до 10д гомокарионов из протопластных регенерантов разных сортов и штаммов A.bisporus (Horgen, Jin, Anderson, 1991). Поскольку мы получали протопласты из мицелия только одного сорта, вполне вероятно , что результаты по другим сортам и штаммам могут ока-. •заться иными, чем у сорта U3. К тому же, количество гомокарио- • нов, выделенных из моноспорового медленнорастущего потомства а того сорта с помощью метода центрифугирования в ГПС, значительно выше,чем у других сортов.и штаммов (табл.4). Хотя процент одноядерных спор у сорта TJ3 и других сортов и штаммов примерно одинаков, число оставиихся гомокарионов после проверок у

гибридного сорта ИЗ выше. Возможно, его характерно для гибридов, однако такое предположение требует дополнительных исследований.

5. Получение гибридов Между полученными моноспоровыыи гомокариатическики иэоля-тами сорта 03 была поставлена внугрисортовая гибридизация. Первые вксперименты по гибридизации ставили на чашках с КГА. Совместимые комбинации определяли по наличии срастания. Последующие вксперименты го гибридизации между гоыокарионами сортов 03, 273 и диких штаммов выполняли на зерне, что позволило ускорить получение гибридов за счет сокращения одного этапа культивирования (на чашках с КГА). Гибрида отбирали по характеру и скорости обрастания зерна. Успешными комбинациями считали'такие, при которых зерно равномерно обрастало ватообразЕЫм мицелием полностью, не отличаясь по скорости роста от исходных сортов и штаммов. Такие комбинации проверяли методом электрофореза и на - плодообразование в компосте-. В таблице 5 представлены результаты внутри- и межсортовой гибридизации А.Мзрогиз.

У гибридных комбинаций изучали полиморфизм неспецифических естераз методом электрофореза (рис.2). Среда гибридных комбинаций было выыделено три группы: к первой отнесены гибрида, истинность которых подтверждена методом електрофореза, ко второй - комбинации, оказавшиеся негибриднами, к третьей - сомнительные случаи, требующие дополнительной проверки.

У гибридных штаммов, полученных нами, в електрофоретичес-ких профилях имеются как полосы, общие с исходными родительскими формами, так и некоторые полосы, характерные для гетерозигот (рис.2). Внутрисортовыв гибридные комбинации имеют профили,

тш шз..... аз

138ег шкшв кбяб (иди

ш £22 ЕИЗ ЕЭЕ3

сорт 12> 17 ШТ7 14 15 ЗЗДН5 ЪЖ 52,п

122222

± . - . * СС22Э УУЛУ1

Г---3

шсага еака аса - ояж ~

а75 ¿73 273 «а* ¿7^2. 341н зъпгипг 55г\

сорт м2. иэ кзьш х55п1

Рис.2. Электрофорегические спектры эстераз шцелиальных культур внутри- и-ыехсортовшс гибридов, родительских гомокарионов и исходных сортов / штаммов/ л.Ызрогиз.

частично <14x17) или полностью (13x17) аналогичные профилю исходного сорта ТО.

Две внутрисортовые и три межсортовые гибридные комбинации (из скрещиваний между сортом из и дикими ЗЗП и 53П"штаммами) были доведены до образования плодовых тел в компосте.

По скорости обрастания зерна мийелиальными культурами и срокам плодоношения гибрида не отличались от культурных сортов, и, следовательно, могут быть использованы в дальнейшем для селекционной работы.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ важных признаков 15 дикорастущих штаммов А§ах1сиз Ызрогиз. Выделены штаммы, обладающие полезными хозяйственными признаками (скорспёлость, высокий процент закрытых плодовых тел, равномерность урожая по волнам и др.). Выде-

" -ленные штаммы перспективны для гибридизации.

2. Разработан метод центрифугирования в градиенте плотности сахаройы базидиоспор А.Ыэрогиз, увеличивающий на порядок выход самостерильных гомокариотических клонов культивируемого шампиньона.

3. Предложен прием скрещивания на зерне, позволявший ускорить проведение гибридизации за счет сокращения одного етапа культивирования.

4. Проанализирована пригодность критериев отбора гомокариотических штаммов (скорость и характер роста, влектрофоретичес-кие спектры, плодообразование). Обнаружены локусы об-встеразы, которые могут служить маркерами при отборе гомокариотических штаммов и гибридов. >

5. Подобраны условия получения протопластов из мицелиаль-ной культуры А.bisporus. 503 регенерантов оказались гомокарио-нами. Таким образом, вротспластирование - еффектнвный прием получения самостерильных культур.

6. Проведена внутри- и межсортовая гибридизация у А.bisporus. Получено 29 гибридных комбинаций, 5 из которых доведены до образования плодовых тел. Гибридная природа комбинаций подтверждена методом электрофореза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Грубе Е.Т., Дьяков Ю.Т., Камзолкина О-В. Изменение ко-' отчества ядер в спорах разновозрастных споровых отпечатков у

шампиньона двуспорового // Проблемы культивирования съедобных

i

•грибов в СССР.; Тез. докл. III Всесовзн. .совец. гПущиво. -1991.

-сиг

2. Камзолкина О.В., Можина И.А., Грубе Е.Т., Сафрай А.И., Дьяков D.T. Получение самостерильных клонов культивируемого шампиньона Agaricus bisporus (lange) Imbach // Биотехвол. -1992. -Ni. -С.14-17.

3. Дьяков Ю.Т., Камзолкина О.В., Рыбакова И.Н., Грубе Е.Т. Способ получения одноядерных спор шампиньона // Авторское свидетельство N1817472 от 11.10.1992.

4. Грубе Е.Т., Камзолкина О-В., Дьяков Ю.Т. Критерии отбора и гибридизации гомокариотичаскшс штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach // Промышленное культивирование съедобных гримов. Тез. дохл. 17 совещ. -Донецк. -1993. -С.6. ,