Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нарушения формирования осевых структур мейотических хромосом у штаммов шампиньона двуспорового с пониженной частотой рекомбинации
ВАК РФ 03.00.24, Микология
Автореферат диссертации по теме "Нарушения формирования осевых структур мейотических хромосом у штаммов шампиньона двуспорового с пониженной частотой рекомбинации"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
- 003054448
На правах рукописи УДК 575'3:57б.354.422:576.287.238
Мажейка Игорь Стасисович
НАРУШЕНИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ОСЕВЫХ СТРУКТУР МЕЙОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ У ШТАММОВ ШАМПИНЬОНА ДВУСПОРОВОГО С ПОНИЖЕННОЙ ЧАСТОТОЙ РЕКОМБИНАЦИИ
03.00.24 - микология, 03.0015 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА
2007
003054448
Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета МГУ им.М.ВЛомоносова
Научные руководители: доктор биологических наук,
профессор Ю.Т. Дьяков
доктор биологических наук, доцент по специальности «генетика» О.Л. Коломиец
доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, профессор И.А. Захаров
кандидат биологических наук А.И. Сафрай
кафедра генетики МСХА им. К.А. Тимирязева
Защита диссертации состоится « ^ » ТА 2007 г. в I $ на заседании диссертационного Совета Д 501.001.46 на Биологическом факультете Московского Государственного Университета по адресу: 119899, ГСП-2, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова
Автореферат разослан «_»_2007 г.
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
Ученый секретарь
диссертационного Совета ¡¿¿^/^^.¿^^и^-^
кандидат биологических наук V ^ М.А. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность исследования. Мейотическая рекомбинация эукариот - многоэтапный нелинейный процесс, заканчивающийся в профазе I мейоза кроссинговером или конверсией локусов (Rohr et al., 1997; Boer, Heyting, 2006).
Процесс рекомбинации тесно связан с другими важнейшими событиями профазы I мейоза, такими как: мейотическая когезия сестринских хроматид; формирование осевых элементов мейотических хромосом (ОЭ); направленное движение хромосом (сближение гомологов, формирование букета и.т.д.); синапсис хромосом, сопровождающийся формированием синаптонемных комплексов (СК) (Zickler, Kleckner, 1998; Богданов, 2003; Page, Hawley, 2004).
На стадии лептотены профазы I мейоза вдоль каждой хромосомы формируется ОЭ, являющийся нуклеопротеидной осью хромосомы, связанной с ее когезиновым тяжем, удерживающим вместе две хроматиды. На стадиях зиготены и пахитены происходят сближение и синапсис гомологичных хромосом, ОЭ таких хромосом выравниваются по длине относительно друг друга и соединяются белковыми поперечными филаментами. Сформированная таким образом на основе двух ОЭ структура называется синаптонемным комплексом.
На взаимосвязанность процессов, происходящих в профазе I мейоза, указывает, например, то, что у многих организмов мутации генов когезии, генов ранней рекомбинации, структурных генов ОЭ и СК, и прочих приводят к нарушениям сборки осевых структур хромосом (Zolan et al., 1988; Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Shinohara et al., 2003; Hederson, Keeney, 2004). Поэтому ОЭ и СК удобно использовать в качестве цитогенетических индикаторов нарушений в профазе I мейоза.
Однако подобные индикаторные свойства ОЭ и СК можно использовать не только для анализа ранних мейотических мутаций. Нарушения сборки осевых структур мейотических хромосом могут служить также индикаторами направленных нарушений рекомбинации.
Примером направленных нарушений рекомбинации является снижение частоты мейотической рекомбинации у штаммов шампиньона двуспорового с вторично-гомоталличным (двуспоровым) жизненным
циклом (Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993). Рекомбинационные нарушения у шампиньона представляют собой признак, прошедший отбор и вносящий свой вклад в обеспечение вторично-гомоталличного жизненного цикла.
Шампиньон двуспоровый Agaricus bisporus (Lange) Imbach культивируют с 17 века. В настоящее время он занимает лидирующие позиции по производству среди других культивируемых съедобных грибов (Callac, 1995)-
Всем культивируемым штаммам и большинству природных изолятов шампиньона свойственен вторично-гомоталличный жизненный цикл. При таком жизненном цикле базидии (мейотические спорангии базидиомицетов) в плодовых телах шампиньона формируют преимущественно гетерокариотические базидиоспоры. Каждая базидиоспора содержит по два ядра, совместимых по локусу типа спаривания. Такие базидиоспоры прорастают мицелием, способным к половому плодоношению без участия стороннего партнера (Miller, 1971; Elliott, 1972; Miller&Kananen, 1972; Râper et al., 1972).
Высокий процент гетерокариотических базидиоспор возможен, в том числе, благодаря неслучайному расхождению несестринских постмейотических ядер попарно в споры и подавленной рекомбинации. Нарушение рекомбинации приводит к косегрегации многих локусов шампиньона, в том числе МАТ-локуса, с центромерами. Последнее в сочетании с неслучайным расхождением несестринских ядер значительно снижает вероятность образования гомокариотических спор и обеспечивает высокую степень гетероаллельности генотипов потомства (Evans, 1959; Захаров, 2005).
Значительно реже встречаются природные популяции шампиньона двуспорового с гетероталличным (четырехспоровым) жизненным циклом. При подобном типе развития мицелия, в плодовых телах, после мейоза, образуются преимущественно гомокариотические базидиоспоры (каждая спора несет по одному ядру только одного типа спаривания). Такие споры дают начало первичному мицелию, не способному замкнуть жизненный цикл с половым процессом без участия совместимого полового партнера (Callac et al., 1993; Kerrigan et al., 1994).
У четырехспоровых штаммов (с гетероталличным жизненным циклом), в отличие от двуспоровых штаммов, значительных нарушений рекомбинации не обнаружено (Callac et al., 1997).
Выбор пути развития мицелия генетически детерминирован и зависит от аллельного состояния BSN-локуса 1-ой хромосомы шампиньона, сцепленного с локусом типа спаривания (Xu et al., 1993; Imbernon et al., 1996).
О распределении рекомбинационных нарушений по геному и о механизмах таких нарушений у двуспоровых штаммов практически ничего неизвестно. Установлено лишь, что первая хромосома двуспоровых штаммов несет крупный участок с подавленной рекомбинацией, видимо, включающий центромеру и МАГ-локус. Нерекомбинантные участки есть и в других хромосомах двуспоровых штаммов шампиньона (Kerrigan et al., 1993; Callac et al., 1997).
Таким образом, основанием настоящего исследования, посвященного изучению рекомбинационных нарушений шампиньона, служили следующие предпосылки:
1. Нарушение рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона и низкая изученность механизмов такого нарушения.
2. Возможность использования структуры ОЭ и СК в качестве цитогенетического индикатора нарушений мейотической рекомбинации.
3. Многолетний мировой опыт использования метода анализа тотальных препаратов СК эукариот, в том числе грибов (Counce, Meyer, 1973; Pukkila, Lu, 1985; Dresser, Giroux, 1988; Loidl et al., 1991; Коломиец, 1998).
4. Наличие в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ четырехспорового штамма шампиньона. Такой штамм можно использовать для сравнения при анализе профазы I двуспоровых штаммов шампиньона.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования служил сравнительный анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом и других ядерных структур у штаммов шампиньона Agaricus bisporus с разными жизненными циклами и
установление возможных причин нарушения мейотической рекомбинации у двуспоровых штаммов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Разработка метода получения тотальных препаратов распластанных ядер шампиньона, пригодных для электронно-микроскопического анализа синаптонемных комплексов.
2. Анализ связи между этапами морфогенеза плодовых тел шампиньона и становлением мейоза, направленный на выяснения стадий развития плодовых тел, позволяющих получить максимальный выход ядер на стадии профазы I мейоза.
3. Анализ ультраструктуры ядер четырехспорового штамма шампиньона (не имеющего значительных нарушений рекомбинации) на стадии профазы I. Кариотипирование на основе анализа синаптонемных комплексов. Установление особенностей морфологии различных внутриядерных структур, в частности, рекомбинационных узелков.
4. Анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом у двуспоровых штаммов шампиньона, которым свойственно снижение частоты мейотической рекомбинации.
5. Морфологический и статистический анализ различий в ультраструктуре ядер между дву- и четырехспоровым штаммами шампиньона.
Научная новизна работы. Впервые разработан метод получения тотальных препаратов ОЭ и СК шампиньона - метод распластывания мейотических ядер из протопластов, ферментативно выделенных из базидий шампиньона. Этот метод впервые использовали для исследования ОЭ и СК шампиньона, а подобный методический подход (ферментативное выделение протопластов) - впервые для мицелиальных грибов.
Впервые установлена связь между стадией морфогенеза плодового тела и становлением мейоза. В базидиях плодовых тел с интактным частным покрывалом мейоз течет с рядом нарушений, после разрыва частного покрывала - мейотический процесс в базидиях нормализуется.
Впервые цитогенетически исследована профаза I мейоза у одного из четырехспоровых штаммов шампиньона. Установлено, что профаза I у
такого штамма типична для большинства эукариот, за исключением некоторых нарушений в лептотене.
Шампиньон впервые кариотипирован на основе анализа тотальных препаратов СК. Установленное число N=13 соответствует числу, установленному ранее Керриганом и др. с помощью молекулярно-генетических методов кариотипирования (Kerrigan et al., 1993)-
Впервые описаны рекомбинционные узелки у шампиньона.
Обнаружены значительные ультраструктурные нарушения ядер на стадии профазы I у двуспоровых штаммов шампиньона, для которых характерна редукция частоты мейотической рекомбинации.
Впервые детально охарактеризованы структурные нарушения в ядрах двуспоровых штаммов шампиньона: неполное и атипичное формирование ОЭ и СК, нарушение процесса слияния ядрышек, появление поликомплекс-подобных структур в ядрах, редукция количества рекомбинационных узелков.
На основе сравнительных статистического и морфологического анализов особенностей формирования ОЭ и СК у дву- и четырехспорового штаммов предложена собственная модель, описывающая характер и механизмы рекомбинационных нарушений у двуспоровых штаммов шампиньона, в основу которой положена комплексная природа системы направленных рекомбинационных нарушений у шампиньона.
Практическая значимость исследования. Данная работа посвящена изучению направленных рекомбинационных нарушений у шампиньона двуспорового на основе анализа особенностей ультраструктуры ядер на стадии профазы I мейоза. Такое исследование имеет преимущественно фундаментальное значение и вносит вклад в понимание природы регуляции рекомбинации, особенностей мейоза шампиньона, обеспечения апогамных жизненных циклов и.т.д.
Практическое значение исследования обусловлено тем, что шампиньон является экономически важной и широко культивируемой сельскохозяйственной культурой. Селекционная работа с данным видом затруднена по причине традиционного использования в культуре вторично-гомоталличных штаммов. Особенности вторично-гомоталличного жизненного цикла усложняют проведение
гибридизации между штаммами шампиньона. Кроме того, атипичность раннего мейоза, по-видимому, приводит к снижению выживаемости спорового потомства.
Получение сортов шампиньона с классическими сортовыми признаками, но отсутствием рекомбинационных нарушений, может привести к увеличению продукции гомокариотических спор, важных для селекции, и улучшению выживаемости спорового потомства шампиньона.
Апробация работы. Материалы настоящего исследования доложены на конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 1999); на конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001); на конференции, посвященной юо-летию проф. А.Р. Жербака (Москва, 2002); на 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002); на VIII международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003); на Ш съезде ВОГИС (Москва, 2004); на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (С-Петербург, 2005).
На конференции, посвященной юо-летию проф. А.Р. Жербака, работа отмечена почетной грамотой. Работа также представлена на конкурсе молодых ученых ИОГен РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2006) и заняла 2-ое место.
Результаты исследования отражены в трех статьях в реферируемых журналах и 7 сборниках тезисов научных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: Введение, Глава I. Обзор литературы, Глава II. Материалы и методы, Глава III. Собственные результаты, Глава IV. Обсуждение результатов, Заключение, Выводы, Список цитируемой литературы, включающий ^35* работ. Работа изложена на стр., содержит 4 таблицы и 42 иллюстрации.
Экспериментальная часть выполнена непосредственно автором диссертации. Основной объем исследований выполнен в лаборатории цитогенетики ИОГен РАН им. H.H. Вавилова, часть работы - на кафедре микологии и альгологии МГУ.
В первую очередь автор благодарен научным руководителям профессору Ю.Т. Дьякову (являющемуся инициатором данного
исследования) и д.б.н. О.Л. Коломиец за внимательное отношение, за передачу профессионального опыта и всестороннюю поддержку при выполнении настоящей работы.
Автор выражает благодарность зав. лаб. цитогенетики профессору Ю.Ф. Богданову за возможность проведения исследований в его лаборатории. Автор также благодарен сотрудникам лаборатории цитогенетики ИОГен и каф. микологии и альгологии МГУ д.б.н. О.В. Камзолкиной, к.б.н. О.И. Карповой, н.с. Т.Ф. Мазуровой, к.б.н. С.Я. Дадашеву, к.б.н. Т.М. Гришаевой, В.Е. Спангенбергу за консультативную и другую помощь.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Штажмы шампиньона. Два штамма шампиньона - BS94 и Bs26 (из коллекции ARP) были предоставлены нам западными коллегами -Р. Керриган и Ф. Каллак, на некоммерческой основе.
BS94 - гетерокариотический потомок одного из Калифорнийских изолятов, демонстрирующий гетероталличный жизненный цикл. Bs26 - обычный вторично-гомоталличный штамм распространенного сорта U-i. Также в работе были использованы другие двуспоровые штаммы шампиньона, культивируемые в Подмосковных хозяйствах.
Методы получения препаратов распластанных базидиалъных ядер шампиньона. Методы выгонки плодовых тел шампиньона, выделения базидиальных протопластов, получения тотальных ядерных препаратов, их контрастирования и анализа с помощью просвечивающего электронного микроскопа подробно описаны в наших работах (Мажейка, Коломиец, 2003; Мажейка и др., 2006). Некоторые детали метода рассмотрены ниже в разделе «Результаты исследования и их обсуждение».
Морфометрия и статистика. Размеры осевых структур хромосом измеряли на оцифрованных микрофотографиях в программе MicroMeasure 3.3 (http://www.colostate.edu/Depts/Biology/MicroMeasure). Статистические расчеты производили в программе Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.). С помощью Statistica вычисляли средние значения количественных данных в выборках, оценивали стандартные отклонения этих величин (приведены после знака «плюс-минус»). Оценку статистической
значимости различий между двумя выборками (принадлежности их к одной/разным генеральным совокупностям) производили с помощью непараметрического критерия Уитни-Манна. Уровень значимости (р) принимали равным 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Основные характеристики разработанного метода получения распластанных мейотических ядер шампиньона.
Разработанный метод распластывания ядер из базидий шампиньона позволяет получать качественные тотальные препараты ОЭ, СК и других ядерных структур.
Первый этап метода — выделение протопластов из базидий с помощью литических ферментов. Подобранные условия позволяют достичь выхода протопластов до 2хю7 протопластов/мл из 0,5-1,0 г свежих пластинок шампиньона, что достаточно для проведения дальнейших исследований.
Второй этап - распластывание ядер шампиньона по Лойдл (Loidl et al., 1991), заключающееся в распластывании протопластов на тонкой пластиковой пленке (фирмы Falcon) в гипотоническом растворе. Особенность метода Лойдла - одновременное использование параформальдегида и детергента (Nonidett) при распластывании ядер.
Третий этап - контрастирование препаратов. Для окрашивания осевых структур хромосом использовали разработанный в лаборатории цитогенетики ИОГен для исследования мейоза ржи метод контрастирования кислым (рНз,5) 70% раствором нитрата серебра в герметичных условиях (Коломиец и др., 2001). Данный метод позволяет добиться хорошего контраста для осевых структур хромосом, ядрышек, рекомбинационных узелков. Однако для идентификации рекомбинационных узелков целесообразней использовать контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой.
Электронно-микроскопически было исследовано несколько тысяч распластанных ядер шампиньона, получено около 8оо электроннограмм распластанных ядер шампиньона на ранних мейотических стадиях. Для сравнительного статистического и морфологического анализа было
отобрано около сотни электроннограмм распластанных ядер дву- и четырехспорового штаммов шампиньона.
Связь между морфогенезом плодовых тел шампиньона и СтановлениемI мейоза в базидиях. В ходе исследования было обнаружено, что в препаратах распластанных ядер разных штаммов шампиньона можно встретить три типа распластанных ядер, разделяемых по степени выраженности осевых структур хромосом:
Тип 1 - к данному типу относятся ядра без осеных структур. Чаще всего такие ядра являются либо предпрофазными, либо постпрофазными (Рис. 1 а).
Тип 2 - ядра с неясно выраженными осевыми структурами хромосом (Рис. 1 б).
Тип 3 - ядра, в которых ОЭ и СК, нормальные или дефектные, четко выражены (Рис. 1 в).
Рис. 1. Примеры каждого из трех типов распластанных ядер шампиньона, а -Тин I. Четырехспоровый штамм вб94. Распластанное ядро не содержит осевых структур мейотических хромосом. Запечатлен момент слияния ядрышек (Яд) в пред профазе; б - Тип 2. Двуспороный штамм. Ядро с нечетко выраженными осевыми структурами (ОС); В - Тип 3, Четырехспоровый штамм Ве94- Ядро на стадии знготены с четко выраженными ОЭ (обозначен один ИЗ ОЭ} и СК (обозначен один из СК)
Распластанные ядра второго типа можно было бы отнести к артефактам. Если бы не следующая особенность - в препаратах, полученных из плодовых тел шампиньона с цельным частным
покрывалом (тонкой пленкой, закрывающей пластинки в молодом плодовом теле), встречаются ядра первых двух типов, но не третьего типа.
В препаратах, полученных из плодовых тел после разрыва частного покрывала, кроме ядер 1-го и 2-го типов можно обнаружить распластанные ядра с четко выраженными ОЭ и СК. Причем сразу после вскрытия частного покрывала в препаратах будут доминировать ядра на стадиях прелептотены и лептотены, позже - ядра на более поздних стадиях профазы I.
Таким образом, не всегда структура ядер 2-го типа - проявление
артефакта. Видимо, в плодовых телах с интактным частным покрывалом
ранний мейоз протекает с отклонениями от нормы, что выражено в
сильной несвоевременной конденсации хроматина и, возможно,
нарушении сборки осевых структур хромосом. После разрыва частного
покрывала плодового тела, во многих вновь вступивших в мейоз
базидиях течение мейоза нормализуется.
Таблица 1. Средние длины синаптонемных комплексов
шампиньона (четырехспоровый штамм - Вв94) и их средние относительные длины (длина СК / суммарная
длина СК).
№ Средняя длина СК, мкм Средняя относит, длина СК. № Средняя длина СК, мкм Средняя относит, длина СК.
I 4,7 ±о,7 о,14 VIII 2,2 ±0,3 о,07
II 4,0 ±0,6 0,12 IX 2,0 ±0,2 0,06
III 3,7 ±0,4 0,11 X 1,9 ±0,2 0,06
IV 3,2 ±0,4 0,09 XI 1,7 ±0,2 0,05
V 2,8 ±0,6 о,о8 XII 1,6 ±0,2 0,05
VI 2,5 ±о,4 о,07 XIII 1,3 ±0,2 0,04
VII 2,3 ±о,з 0,07 Итого 33 ±4,1
Результаты электронно-микроскопического анализа препаратов распластанных ядер из базидий четырехспорового штамма (Вв94) шампиньона. Профаза I четырехспорового штамма Вз94 типична для большинства эукариот.
Лишь незначительные мейотические нарушения можно обнаружить в препаратах распластанных ядер 3-го типа (весь дальнейший анализ мейоза дву- и четырехспорового штаммов шампиньона проводили на ядрах 3-го типа) в лептотенс («слипание» ОЭ, переход ОЭ в тонкую спиралевидную форму, изредка - наличие поликомплекс-подобных структур).
Рис. 2. Распластанные ядра четырехспорового штамма Вк94 па разных стадиях профазы I мейоза. Осевые элементы хромосом и синаптоншные комплексы обозначены ОЭ и СК, соответственно, а - стадия лептотены, присутствуют одно ядрышко (Яд) и осевые элементы хромосом; б — стадия ранней зиготены. Ранние рекомбинационные узелки (РРУ), поздние рекомбинационные узелки (ПРУ); в - стадия зиготены. В центральном пространстве синаптонемных комплексов (СК) видны поздние рекомбинационные узелки (два из них обозначены - РУ); г - стадия пахитены, римскими цифрами обозначены синаптонемные комплексы в порядке убывания их длины, на конце УП-го СК - ядрышко (Яд).
В течение всей профазы I в распластанных ядрах Вв94 присутствует одно ядрышко (не всегда идентифицируемое), находящееся на конце УП-го бивалента (Рис. 2 а, г). В препаратах четырехспорового штамма шампиньона можно обнаружить разные типы рекомбинационных узелков только на стадиях ранней и средней зиготены.
До проведения иммуноцитохимических исследований белков ранней и поздней рекомбинации мы идентифицируем рекомбинационные узелки как «ранние» и «поздние» условно, опираясь лишь на особенности их морфологии и стадию их выявления. Ранние узелки меньше поздних по размеру и обычно связаны с ОЭ, тогда как поздние узелки расположены в центральном пространстве СК. Контрастирование препаратов азотнокислым серебром, при определенных условиях, позволяет визуализировать поздние узелки (Рис. 2 б, в) и крайне редко -ранние узелки (Рис. 2 б). Контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой обеспечивает выявление узелков разных типов.
На стадии пахитены можно наблюдать полный синапсис всех 13-ти бивалентов, длины СК составляют ~ от 1 до 5 мкм (Рис. 2 г; Таблица 1).
Результаты электронно-микроскопического анализа препаратов распластанных ядер из базидий двуспоровых штаммов шампиньона. В распластанных ядрах двуспоровых штаммов шампиньона на стадии профазы I обнаружены значительные нарушения ультраструктуры ядер:
1. Нарушение процесса слияния ядрышек. Подобное нарушение можно встретить в ядрах двуспоровых штаммов, как на ранних, так и на поздних стадиях профазы I (Рис. 3 б, г). Тогда как у четырехспорового штамма слияние ядрышек происходит перед профазой I. Затем в течение всей профазы I мейоза в распластанных ядрах этого штамма можно наблюдать не более одного ядрышка (Рис 2 а, г).
Нарушение слияния ядрышек может быть следствием нарушения сближения участков двух хромосом, несущих ядрышковые организаторы.
2. Появление в распластанных ядрах поликомплекс-подобных структур. Многие исследованные распластанные ядра с дефектными ОЭ и СК, также содержат одно или несколько удлиненных, более
широких, чем СК, плотных образований обычно имеющих веретеновидную форму (Рис. з а, б). Ультраструктура поликомплекс-подобных структур плохо различима. Изредка можно наблюдать неоднородность внутренней структуры поликомплекс-подобных структур, однако многолинейную параллельную, свойственную классическим поликомплексам - крайне редко. Принято считать, что поликомплексы сформированы из избыточных белковых материалов ОЭ и СК (Богданов, Коломиец, 2007). Соответственно, наличие таких структур в ядре может являться индикатором атипичной сборки осей хромосом. Возможно, это относится и к поликомплекс-подобным структурам шампиньона, поскольку в нормальных ядрах четырехспорового штамма они не встречаются.
3. Нарушения формирования ОЭ.
1). Малочисленные, короткие ОЭ. Из Таблицы 2. следует, что среднее количество ОЭ на ядро двуспоровых штаммов в среднем почти вдвое меньше среднего количества ОЭ в ядрах четырехспорового штамма.
Средняя суммарная длина ОЭ на ядро двуспоровых штаммов в среднем почти втрое короче таковой в ядрах четырехспорового штамма шампиньона. Средняя длина среднего ОЭ и самого длинного в ядре ОЭ двуспоровых штаммов примерно в полтора раза меньше соответствующих величин в ядрах штамма Вз94-
2). Нарушения морфологии ОЭ. Выявлены следующие основные морфологические дефекты ОЭ: неравномерная толщина ОЭ вдоль его длинной оси (Рис. 4 в); повышенная извитость ОЭ (Рис. 4 в); боковые ответвления ОЭ (Рис. 4 в); переход ОЭ в тонкую спиралевидную форму; расщепление ОЭ. И у Вэ94, и у двуспоровых штаммов в некоторых случаях можно видеть, что ОЭ состоят из двух тесно сближенных линейных структур (двунитчатость) (Рис. 4 а), что подтверждает представление о двунитчатой природе ОЭ и боковых элементов СК (Коломиец и др., 2001). У двуспоровых штаммов можно наблюдать расщепление некоторых ОЭ на две нити (Рис. 4 б).
4. Нарушения формирования СК.
1). Малочисленность и фрагментарность СК. Из данных, приведенных в Таблице 2, следует, что количество СК на ядро, средняя суммарная длина СК, средняя длина СК и средняя длина самого
длинного СК у двуспоровых штаммов значительно меньше, чем у четырехспорового. Так, например, средняя суммарная длина СК двуспоровых штаммов более чем в 4 раза короче той же величины четырехспорового штамма.
Таблица 2. Статистическое сравнение некоторых количественных характеристик осевых структур мейотических хромосом дву- и четырехспорового штаммов шампиньона
Штаммы \ р Измеряемая величина Штамм Вв94 (четырех споровый) Штамм Вв2б (двуспо ровый) р и- крите рия
Среднее количество ОЭ на 23,6 ±2,8 13,7 ±7Д 0,005
ядро, шт.
Среднее количество СК на 13 ±0,0 7,4 ±3,5 0,001
ядро, шт.
Средняя длина 48,4 ±8,3 18,1 ±10,4 0,0003
совокупности ОЭ, мкм.
Средняя длина СК- 33,7 ±4Д 7,8 ±3,4 0,001
совокупности, мкм.
Средняя длина ОЭ, мкм. 2,1 ±0,4 1,3 ±0,2 0,0001
Средняя длина СК, мкм. 2,6 ±0,3 1,4 ±1Д 0,004
Средняя длина самого 4,4 ±0,5 3,1 ±0,8 0,0004
длинного ОЭ, мкм.
Средняя длина самого 4,7 ±0,7 1,9 ±1,0 0,001
длинного СК, мкм.
Примечание: все количественные характеристики ОЭ измерены на стадиях лептотены и ранней зиготены, все характеристики СК - на стадиях поздней зиготены и пахитены.
2). Нарушения морфологии СК. В случае двуспоровых штаммов предпочтительнее говорить о СК-подобных структурах, поскольку типичные СК встречаются редко.
Многие СК-подобные структуры замаскированы плотным хроматином, что затрудняет анализ деталей их ультраструктуры. В тех случаях, когда анализ возможен, выявлены нарушения нескольких типов:
А. В ядрах двуепоровых штаммов шампиньона СК-подобные структуры и СК, с более или менее выраженной структурой, представлены либо полными, по тогда одиночными и чаше небольшими СК, либо фрагментами СК (Рис. з в), либо непарным ОЭ с фрагментами сннапсиса на протяжении его длинной оси (Рис. 4 е).
Рис. з- Распластанные ядра двуепоровых штаммов шампиньона на стадии профазы I мейоза. Стадии определены условно в силу значительной атипичносга ядерных структур, а - стадия лептотены, немногочисленные сильно извитые осевые элементы (ОЭ), ядрышко (Яд), поли комплекс-подобная структура (ПКП); б - стадия лептотены - ранней зиготены, небольшое количество осевых элементов (ОЭ), поликомплекс-подобная или СК-подобная структура (ПКП), два несдавшихся ядрышка (Яд); и - стадия зиготены, малочисленные значительно укороченные СК-нодобные структуры (СГ<) и осевые элементы (ОЭ); г - стадия поздней зиготены - пахитены, СК-подобные структуры с неясной, но явно атипичной ультраструктурой (СК), сближенные, но не слившиеся ядрышки (Яд).
Б. Некоторые СК-подобные структуры двуспоровых штаммов выглядят как переплетенные друг с другом ОЭ (Рис. 4 д), тогда как нормальные СК такой же длины редко можно встретить с несколькими перехлестами ОЭ.
В. Кроме названных морфологических дефектов СК и СК-подобных структур, можно выделить еще несколько заметных структурных аномалий. Так на Рис. 4 г короткий СК, во-первых, имеет неравномерную ширину, во-вторых, центральный элемент этого СК представлен явным образом не одним линейным элементом.
Рис. 4. Увеличенные фрагменты электроннограмм распластанных ядер двуспоровых штаммов шампиньона, демонстрирующие некоторые дефекты ультраструктуры осевых структур хромосом на стадии профазы I. а -двунитчатый осевой элемент (собственно, это не нарушение - каждая сестринская хроматида имеет свой осевой тяж); б - растепление осевых элементов на две нити (звездочка); в - "извитой" осевой элемент с неравномерной толщиной и боковым ответвлением или петлей; г - короткая СК-подобная структура - выражена двунитчатость центрального элемента; д -дефект поперечных филаментов в СК-подобной структуре - боковые элементы сближены и перекручены; е - осевой элемент с СК-подобными участками.
Возмоэ1сные причины нарушения рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона. Недостаточное среднее число ОЭ (<<2б при 2N=26) и их малая длина в ядрах двуспоровых штаммов шампиньона по сравнению с ядрами четырехспорового штамма позволяют утверждать, что ОЭ у таких штаммов формируются лишь в отдельных участках некоторых хромосом.
Высокий полиморфизм распластанных ядер, большие стандартные отклонения средних характеристик ОЭ свидетельствуют о случайном распределении участков сборки ОЭ по хромосомам.
Если в хромосомных регионах с нарушенной сборкой ОЭ нарушена и рекомбинация, следовательно, рекомбинационные нарушения распределены у двуспоровых штаммов шампиньона по геному случайно (регион-неспецифически).
Из Таблицы 3. следует, что у двуспоровых штаммов, как и у четырехспорового, среднее количество СК на ядро на стадиях поздней зиготены и пахитены статистически не отличается от среднего вдвое уменьшенного количества ОЭ на стадиях лептотены и ранней зиготены. Таким образом, согласно данным статистического (и морфологического) анализа, все участки хромосом, сформировавшие ОЭ, синаптируют и формируют СК.
Такая особенность шампиньона, синапсис образованных участков ОЭ при сильных нарушениях сборки ОЭ, в целом, необычна. У большинства описанных в литературе ранних мейотических мутантов грибов при нарушенном формировании ОЭ, чаще всего отмечают нарушения в сближении и синапсисе гомологов. СК у таких мутантов если и образуются, то в меньшем количестве, чем количество сформированных ОЭ (Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Hederson, Keeney, 2004).
Данная особенность мейоза шампиньона позволяет предполагать, что регион-неспецифические нарушения рекомбинации обусловлены дисфункцией генов, работающих до или во время формирования ОЭ (прелептотена - ранняя лептотена), и слабо влияющих на сближение гомологов. Известно, что комплексы генов, генерирующие двунитевые разрывы ДНК и осуществляющие ранний процессинг таких разрывов, сильно влияют на сближение гомологичных хромосом (Heyting, 1996;
Celerin et al., 2000; Gerecke et al., 2000; Page, Hawley, 2004). В таком случае, можно предположить участие в случайно распределенных нарушениях рекомбинации генов мейотической когезии или структурных генов самих ОЭ. Причем дисфункция таких генов должна быть неполной, в противном случае, ОЭ не формировались бы вовсе.
Дисфункция вышеназванных генов может обеспечиваться как регуляцией, так и мутацией одного из таких генов, но обязательно сцепленной и косегрегирующей с Ъ аллелем локуса BSN (b/b генотип данного локуса задает вторично-гомоталличный тип развития мицелия (Imbernon et al., 1996)).
Данные, приведенные в нижней строке Таблицы 3, демонстрируют, что у двуспоровых штаммов, в отличие от четырехспорового, средние длины самого длинного СК и самого длинного ОЭ статистически различаются. Средний самый длинный СК двуспоровых штаммов более чем в 1,5 раза короче соответствующего ОЭ (Таблица 2). Тогда как в целом средние длины средних СК и ОЭ статистически равны (Таблица 3).
Опустив более детальные, приведенные в диссертации, рассуждения, можно заключить, что ОЭ хромосом 1-ой пары (самые длинные в кариотипе) или ОЭ нескольких самых длинных бивалентов остаются асинаптированными в определенном участке (участках).
Возможно, в таком участке (участках) действует регион-специфическая регуляция рекомбинации, приводящая к подавлению в нем (в них) рекомбинации.
Крупный нерекомбинантный район на хромосоме I двуспоровых штаммов шампиньона, обнаруженный на основании анализа расщепления молекулярных маркеров (Kerrigan et al., 1993), может соответствовать выявленному нами статистически асинаптическому участку бивалента I.
Таким образом, у двуспоровых штаммов в раннем мейозе действует генетически-детерминированная система рекомбинационных нарушений, состоящая из двух независимых подсистем. Подсистема регион-специфической регуляции рекомбинации затрагивает определенные участки длинных хромосом (возможно, не только длинных, что требует дополнительных исследований).
Подсистема регион-неспецифических нарушений сборки ОЭ и рекомбинации проявляется случайно в разных участках генома и обеспечивается регуляцией или сцепленной с BSN локусом мутацией в системе генов мейотической когезии или структурных генов ОЭ.
Таблица 3. Статистическое сравнение средних величин некоторых количественных характеристик ОЭ и СК внутри _каждого из двух исследуемых штаммов._
S\. р-уровень ^\значимости р-уровень значимости U- р-уровень значимости U-
критерия критерия
четырехспорового двуспорового
Сравниваемые штамма BS94. штамма Bs26.
величины.
Сравнение среднего 0,2 0,5
количества ОЭ/2 и
СК на ядро.
Сравнение средних 0,003 0,7
суммарных ОЭ/2 и СК. длин
Сравнение средних 0,02 1,0
длин средних ОЭ и СК.
Сравнение средних 0,2 0,005
длин самых длинных
ОЭ и СК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Настоящая работа выполнена с помощью нового метода, разработанного для цитогенетического анализа шампиньона на основе анализа СК (Мажейка, Коломиец, 2003).
В процессе разработки метода были установлены важнейшие закономерности становления мейоза у шампиньона двуспорового. В частности, выявлена связь между вскрытием частного покрывала и началом становления типичного мейоза у этого вида.
Детально описана профаза I четырехспорового штамма шампиньона, у которого, по данным Каллак с соавт. (СаНас е1 а1., 1997), нет значительных отклонений в мейотической рекомбинации. Установлено, что профаза I (после вскрытия частного покрывала) протекает по схеме, характерной для большинства эукариот.
Обнаружены значительные и разнообразные нарушения ультраструктуры ядер на стадии профазы I у двуспоровых штаммов шампиньона, сопряженные с супрессией мейотической рекомбинации.
Морфологический и статистический анализ различий в формировании ОЭ и СК дву- и четырехспорового штаммов позволил предложить гипотетическую схему характера и механизмов нарушений рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона.
В результате проведенного исследования определены подходы к дальнейшему исследованию причин нарушения рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона, основными из которых являются иммуноцитохимические исследования белков, участвующих в процессе рекомбинации и формировании структуры СК.
ВЫВОДЫ:
1. Разработанный метод распластывания выделенных из базидий шампиньона мейотических ядер, основанный на ферментативном выделении протопластов, эффективен для цитогенетического исследования профазы I шампиньона двуспорового Адапсиэ Ызрогт.
2. Полноценное становление мейоза у шампиньона происходит только после вскрытия частного покрывала плодового тела. В молодых плодовых телах профаза I мейоза течет с нарушениями конденсации хроматина и формирования осевых элементов хромосом и синаптонемных комплексов.
3. Профаза I мейоза у четырехспорового штамма шампиньона типична для большинства эукариот, за исключением, незначительных особенностей формирования осевых элементов хромосом в некоторых ядрах на стадии лептотены.
4. У шампиньона (N=13), длины синаптонемных комплексов составляют = от 1 до 5 мкм (установлено кариотипированием на основе анализа синаптонемных комплексов четырехспорового штамма шампиньона).
5. На стадиях лептотены-зиготены у шампиньона идентифицируются рекомбинационные узелки двух типов.
6. С помощью сравнительного электронно-микроскопического анализа осевых структур мейотических хромосом штаммов шампиньона с
разными жизненными циклами установлено, что у двуспоровых штаммов:
а) Нарушено формирование осевых элементов хромосом и синаптонемных комплексов;
б) Редуцировано количество рекомбинационных узелков;
в) Во многих ядрах нарушен процесс слияния ядрышек;
г) Нередко в ядрах присутствуют поликомплекс-подобные структуры. 7. Характер нарушений сборки осевых структур хромосом у двуспоровых
штаммов шампиньона имеет ряд особенностей. К таким особенностям, установленным с помощью статистического и морфологического анализа относятся:
а) Осевые элементы хромосом формируются лишь на отдельных участках некоторых хромосом, причем распределение участков формирования осевых элементов носит случайный характер;
б) Участки хромосом, сформировавшие осевые элементы, сближаются
и синаптируют. Исключение составляет определенный участок первого бивалента (или участки нескольких длинных бивалентов), осевые элементы которых не синаптируют.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Мажейка И.С., Камзолкина О.В. Метод получения протопластов из пластинок гименофора шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach. // В сб. трудов науч. конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов». М. 2000. С. 72.
2. Мажейка И.С., Грубе Е.Т., Камзолкина О.В., Дьяков Ю.Т. Нестабильность гомокариотических штаммов Agaricus bisporus. // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34. С. 34-38.
3. Мажейка И.С. Метод получения препаратов синаптонемных комплексов мейотических хромосом дву- и четырехспоровой форм Agaricus bisporus. // Матер, науч. конференции «Памяти Грегора Менделя». М. 2001. С. 80-81.
4. Мажейка И.С., Коломиец О.Л. Получение тотальных препаратов синаптонемных комплексов шампиньона двуспорового. // Матер, науч.
конференции, посвященной 70-летию образования кафедры генетики МСХА им. К.А.Тимирязева. М. 2002. С. 54.
5. Мажейка И.С., Коломиец О.Л. Исследование профазы I мейоза в распластанных протопластах, полученных из базидий культивируемого шампиньона. // В сб. докл. I Съезда микологов НАМ «Современная
микология в россии». м. 2002. С. 201,
6. Мажейка И.С., Козлова М.В., Камзолкина О.В., Дьяков Ю.Т. Грибные протопласты и их использование в микологических исследованиях. //В сб. тезисов VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов. 2003. С. 190.
7. Мажейка И.С., Коломиец О.Л. Метод получения препаратов синаптонемных комплексов мейотических хромосом из базидиальных протопластов шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach. // Генетика. 2003. Т. 39. С. 357"36i.
8. Мажейка И.С., Коломиец О.Л. Различия ультраструктурной организации синаптонемных комплексов мейотических хромосом у двух форм шампиньона с разными жизненными циклами. // В сб. тезисов 111-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. М. 2004. С. 261.
9. Мажейка И.С., Спангенберг В.Е., Коломиец О.Л.. Рекомбинационные узелки синаптонемных комплексов шампиньона. Тезисы XV Всероссийского совещания «Структура и функции клеточного ядра». // Цитология. 2005. Т. 47. С. 817-818.
ю. Мажейка И.С., Коломиец О.Л., Дьяков Ю.Т., Богданов Ю.Ф. Аномалии мейоза у двуспоровых штаммов шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach. // Генетика. 2006. Т. 42. С. 361-368.
Заказ № 204/12/06 Подписано в печать 28.12.2006 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5
ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с[г.ги
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мажейка, Игорь Стасисович
Введение
Термины
Список сокращений Ю
Глава I. Обзор литературы п
1.1. Профаза 1-го деления мейоза грибов И
1.2. Шампиньон двуспоровый. Особенности жизненного цикла
1.3. Методы получения тотальных препаратов СК грибов
Глава II. Материалы и методы
Глава III. Собственные результаты
111.1. Особенности метода получения тотальных препаратов распластанных ядер шампиньона двуспорового
111.2. Результаты анализа препаратов распластанных ядер из базидий дву- и четырехспоровых штаммов шампиньона
111.2.1. Классификация типов распластанных ядер в тотальных препаратах осевых структур хромосом шампиньона
111.2.2. Анализ тотальных препаратов осевых структур хромосом четырехспорового штамма BS
111.2.3. Анализ тотальных препаратов осевых структур хромосом двуспорового штамма Bs
111.2.4. Сравнительные характеристики ядер, распластанных на стадии профазы I дву- и четырехспорового штаммов шампиньона
Глава IV. Обсуждение результатов исследования
IV.1. Оценка эффективности и преемственности метода распластывания мейотических ядер, полученных из препаративно выделенных протопластов базидий шампиньона
IV.2. Обсуждение результатов анализа препаратов распластанных ядер из базидий дву- и четырехспоровых штаммов шампиньона
IV.2.1. Типы распластанных ядер, мейоз и морфогенез плодовых тел шампиньона
IV.2.2 Внутриядерные нарушения у штаммов шампиньона с вторично-гомоталичным жизненным циклом и обсуждение возможных характера и механизмов рекомбинационных нарушений у этих штаммов
Введение Диссертация по биологии, на тему "Нарушения формирования осевых структур мейотических хромосом у штаммов шампиньона двуспорового с пониженной частотой рекомбинации"
Актуальность проблемы исследования. Ранний мейоз эукариотических организмов насыщен динамическими событиями, в той или иной степени взаимно влияющими друг на друга. Развитие таких событий определяет судьбу последующих этапов мейоза - сбои в системах ранних мейотических процессов могут вызвать мейотический арест или впоследствии нарушить расхождение хромосом во время анафаз I и II. Кроме того, процессы раннего мейоза имеют глобальное биологическое значение, обеспечивая генотипическую изменчивость организмов за счет общей мейотической рекомбинации.
Совокупность процессов раннего мейоза состоит из нескольких основных систем со своими, зачастую общими для таких систем, контролирующими генами. Прежде всего, среди подобных систем можно выделить систему мейотической рекомбинации. Это сложная система процессов, несколькими путями приводящая к конверсии генов и кроссинговеру (Rohr et al., 1997; Boer, Heyting, 2006). Во-вторых - система хромосомного внутриядерного движения, которая включает в себя и сближение гомологичных хромосом, и движение хромосом за счет перемещения закрепленных в ядерной мембране хромосомных теломер и прочее (Zickler, Kleckner, 1998). В-третьих, система мейотической когезии сестринских хроматид, обеспечивающая формирование когезинового кора хромосом, состоящего из мейозспецифичных когезиновых белков (Page, Hawley, 2004). В-четвертых, система образования нуклеопротеиновых осей мейотических хромосом - осевых элементов хромосом (ОЭ) и синаптонемных комплексов (СК) (Богданов, 2003). Сборка ОЭ происходит на базе когезинового кора каждой мейотической хромосомы, СК формируются их двух ОЭ, скрепленных поперечными филаментами, во время синапсиса гомологичных хромосом.
Распространенный способ установления роли мейотических генов и связи между собой вышеописанных процессов - анализ мутантов, с нарушениями в раннем мейозе. Причем в качестве цитогенетического индикатора наличия таких нарушений часто используют структуру ОЭ и СК. Дефекты сборки ОЭ и СК, хорошо визуализируемые в тотальных препаратах мейотических хромосомных осей, позволяют констатировать наличие мейотических нарушений. Характер таких дефектов, в некоторых случаях, дает возможность предположить механизмы возникновения мейотических нарушений (Zickler, Kleckner, 1998; Zolan et al., 1988; Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Shinohara et al, 2003; Bhuiyan, Schmekel, 2004; Hederson, Keeney, 2004).
Существуют варианты атипичного прохождения раннего мейоза, относящиеся к другой категории, нежели дефекты у мутантов раннего мейоза. Речь идет о направленных нарушениях мейотических процессов, то есть, о нарушениях, прошедших отбор, выполняющих определенную функцию в организме, онтогенезе или жизненном цикле организма.
К подобным нарушениям можно отнести направленное подавление мейотической рекомбинации. Существуют, например, «холодные точки рекомбинации» - участки генома/хромосом с «запрещенной» рекомбинацией - субтеломерные области, прицентромерные и.т.д. (Rohr et al., 1997). Но особый интерес представляет направленная супрессия рекомбинации у грибов со вторично-гомоталличным жизненным циклом, у которых рекомбинационный «запрет» распространен если не на большую, то на значительную часть генома (Дьяков, 1999; Захаров, 2005).
Одним из таких видов, среди штаммов которого есть вторично-гомоталличные, является широко распространенный в культуре шампиньон двуспоровый, Agaricus bisporus (Lange) Inbach.
У большинства штаммов данного вида частота мейотической рекомбинации значительно снижена. О характере и распределении
Молекулярно-генетическими методами показан крупный участок на первой хромосоме с подавленной рекомбинацией (далее -нерекомбинантный участок), включающий МАГ-локус и, скорее всего, центромеру. Нерекомбинантные регионы есть и в других хромосомах шампиньона (Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993; Callac et al., 1997).
Однако нарушение рекомбинации происходит не у всех штаммов шампиньона. Наличие или отсутствие супрессии рекомбинации генетически детерминированы и предопределены при наследовании типа развития мицелия (Callac et al., 1997).
Тип развития мицелия - вторично-гомоталличный или гетероталличный, задается детерминирующим локусом BSN. Генотип Ъ/Ь такого локуса несут штаммы со вторично-гомоталличным, или двуспоровым, жизненным циклом (Imbernon et al., 1996). Подобные штаммы наиболее распространены в культуре и среди природных изолятов. Завершив мейоз, ядра в базидиях таких штаммов расходятся преимущественно по два в каждую спору, причем гетерокариотическими, и прорастают мицелием способным к половому плодоношению без стороннего партнера (Miller, 1971; Elliott, 1972; Miller&Kananen, 1972; Raper et al., 1972).
У изредка выделяемых из природы гетероталличных, или четырехспоровых, штаммов шампиньона с фенотипом t локуса BSN, не выявлено значительных нарушений рекомбинации в мейозе. Их преимущественно одноядерные базидиоспоры прорастают самостерильным мицелием, нуждающемся в половом партнере для замыкания жизненного цикла (Callac et al., 1993; Kerrigan et al., 1994). c* нарушении по геному шампиньона известно мало. неслучайно базидиоспоры чаще всего оказываются
Таким образом, шампиньон, имеющий большую практическую ценность, парадоксально слабо изучен генетически и цитогенетически, и ставит перед исследователями проблему, решение которой актуально для фундаментального понимания разнообразия механизмов мейоза эукариот. Проблема заключена в понимании характера и механизмов рекомбинационных нарушений у шампиньона двуспорового. Решение этой проблемы возможно путем многоэтапного сравнительного исследования мейоза разных по типу развития штаммов шампиньона.
Настоящая работа является первым этапом такого исследования. Используя вышеописанные индикаторные свойства ОЭ и СК и цитогенетические методы их тотального изучения, в настоящем исследовании предпринята попытка выявления и осмысления природы особенностей сборки ОЭ и СК в связи с нарушениями рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона.
Важно, что в качестве сравнения мы имели возможность исследовать имеющийся в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ четырехспоровый штамм шампиньона, характеризующийся отсутствием значительных нарушений рекомбинации.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -сравнительный анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом и других ядерных структур у штаммов шампиньона Agaricus bisporus с разными жизненными циклами и установление возможных причин нарушения мейотической рекомбинации у двуспоровых штаммов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка метода получения тотальных препаратов распластанных ядер шампиньона, пригодных для электронно-микроскопического анализа синаптонемных комплексов.
2. Анализ связи между этапами морфогенеза плодовых тел шампиньона и становлением мейоза, направленный на выявление этапов развития плодовых тел, позволяющих получить максимальный выход ядер на стадии профазы I мейоза.
3. Анализ ультраструктуры ядер четырехспорового штамма шампиньона (не имеющего значительных нарушений рекомбинации) на стадии профазы I. Кариотипирование- на основе анализа синаптонемных комплексов. Установление особенностей морфологии различных внутриядерных структур, в частности, рекомбинационных узелков.
4. Анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом у двуспоровых штаммов шампиньона, которым свойственно снижение частоты мейотической рекомбинации.
5. Морфологический и статистический анализ различий в ультраструктуре ядер между дву- и чётырехспоровым штаммами шампиньона.
Научная новизна работы. Впервые- получены препараты распластанных мейотических ядер из ферментативно выделенных протопластов шампиньона. Подобный метод распластывания, на основе ферментативного выделения протопластов, ранее использовали только для исследований дрожжей, но не мицелиальных грибов.
Впервые установлена связь между стадиями морфогенеза плодовых тел шампиньона и становлением мейоза.
Впервые шампиньон кариотипирован на основе анализа СК четырехспорового штамма, впервые детально описаны с помощью электронно-микроскопического анализа различные стадии раннего мейоза шампиньона. Обнаружены и описаны разные типы рекомбинационных узелков шампиньона и некоторые другие внутриядерные структуры.
Впервые выявлены и проанализированы значительные внутриядерные нарушения на стадиях раннего мейоза у двуспоровых штаммов шампиньона, в частности, нарушения формирования ОЭ и СК.
Предложена модель, объясняющая особенности рекомбинационных событий у шампиньона, основанная на предположении о генетически-детерминированных онтогенетических рекомбинационных нарушениях. Такие нарушения обеспечиваются существованием двух функциональных подсистем - подсистемы регион-специфической регуляции в первой и, возможно, других хромосомах шампиньона и подсистемы регион-неспецифического нарушения сборки ОЭ и нарушения рекомбинации в случайно распределенных по генотипу регионах.
Практическая значимость полученных результатов.
Настоящее исследование имеет преимущественно фундаментальное значение и вносит вклад в понимание природы регуляции рекомбинации, особенностей мейоза шампиньона, обеспечения апогамных жизненных циклов и.т.д.
Однако данная работа может иметь в дальнейшем практическое значение. Культивируемый шампиньон - важный сельскохозяйственный объект. Селекционная работа с данным видом затруднена по-причине традиционного использования в культуре вторично-гомоталличных штаммов. Вторично-гомоталличный жизненный цикл осложняет проведение гибридизации между штаммами. Также атипичность раннего мейоза, возможно, приводит к снижению выживаемости спорового потомства.
Получение сортов шампиньона с классическими сортовыми признаками, но отсутствием рекомбинационных нарушений, может привести к увеличению продуцирования гомокариотических спор, важных для селекции, и улучшению выживаемости спорового потомства шампиньона.
НЕКОТОРЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
Базидия - мейоспорангий базидиомицетов, в котором происходит кариогамия и мейоз, постмейотические ядра распределяются в экзогенные 8 мейоспоры (базидиоспоры). В простом случае базидия одноклеточна -холобазидия. У некоторых групп базидиомицетов встречаются многоклеточные базидии - фрагмобазидии (базидия с перегородками) и гетеробазидии (базидия, разделенная на функционально дивергентные пробазидию и базидию).
Боковой элемент (БЭ) - два БЭ входят в состав СК. Формируются БЭ на основе ОЭ каждого из пары спаренных гомологов.
Гетерокариотический мицелий (спора) - мицелий (спора) со специфическим для грибов ядерным статусом - такой мицелий (спора) содержит ядра, несущие разные совместимые состояния локуса спаривания. Обычно гетерокарион образуется в интервале (у базидиомицетов такой интервал составляет большую часть жизненного цикла) между плазмогамией совместимых мицелиев и кариогамией родительских ядер.
В широком смысле гетерокариотическим могут называть любой мицелий, несущий ядра, полученные из разных мицелиев.
Гомокариотический мицелий (спора) - мицелий (спора), содержащий ядра одного типа, то есть несущие одно и то же состояние локуса спаривания.
Гимений - палисадный слой клеток, покрывающий поверхность гименофора многих сумчатых и базидиальных грибов, включающий как мейоспорангии, так и стерильные элементы гимения.
Гименофор - часть плодового тела гриба, несущая гимений. Весьма разнообразен по морфологии у различных грибов. У шампиньона так называемый пластинчатый гименофор.
Осевой элемент (ОЭ) - осевая нуклеопротеидная структура мейотических хромосом. Является осью неспаренного гомолога в ранней профазе I мейоза.
Поликомплекс (ПК) - многолинейная белковая структура, не связанная с хроматином. Видимо, формируется за счет избыточного белкового материала ОЭ и СК, можно обнаружить в ядре или цитоплазме после расформирования СК в диплотене или в случае нарушений сборки ОЭ иСК.
Рекомбинационный узелок (РУ) - шаровидная или удлиненная структура, связанная с ОЭ, БЭ или ЦЭ. Представляет собой 9 нуклеопротеидный комплекс рекомбинационных ферментов и различных вспомогательных белков. Функции РУ зависят от его типа.
Синаптонемный комплекс (СК) - мейозспецифическая трехлинейная нуклеопротеидная осевая структура хромосом. Образуется в профазе I деления мейоза у большинства эукариот в процессе синапсиса гомологичных хромосом и состоит из двух боковых элементов (бывших индивидуальных осевых элементов каждого из двух гомологов) и центрального элемента (ЦЭ)
Сумка - аналог базидии у сумчатых грибов. В отличие от базидии, сумка формирует эндогенные споры.
Центральный элемент (ЦЭ) - линейный элемент СК, занимающий его центральное пространство, сформированный перекрывающимися участками поперечных филаментов СК.
Частное покрывало - часть плодового тела у базидиомицетов с типом развития плодового тела, как у некоторых агариковых грибов. Представлено в виде тонкой пленки, закрывающей гименофор на ранних стадиях развития плодового тела.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ
БЭ - боковой элемент СК;
ДНР - двунитевой(-ые) разрыв(-ы) ДНК;
ДТТ (DTT) - дитиотретол;
МЭС (MES) - морфолиноэтансульфоновая кислота;
ОЭ - осевой элемент;
ПК - поликомплекс;
ПКП - поликомплекс-подобная структура;
РУ - рекомбинационный узелок;
СК - синаптонемный комплекс;
ФВК - фосфорновольфрамовая кислота;
ФМСФ (PMSF) - фенилметилсульфонилфлюорид;
ЦЭ - центральный элемент СК;
ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетраацетат.
Заключение Диссертация по теме "Микология", Мажейка, Игорь Стасисович
ВЫВОДЫ
1. Разработанный метод распластывания мейотических ядер из базидий шампиньона, основанный на ферментативном выделении протопластов, эффективен для цитогенетического исследования профазы I шампиньона двуспорового Agaricus bisporus. В частности, метод применен для анализа ультраструктуры осей мейотических хромосом, используемой в качестве цитогенетического индикатора нарушений мейотической рекомбинации.
2. На эффективность метода распластывания мейотических ядер шампиньона и качество получаемых препаратов наибольшее влияние оказывают факторы: а. Температура заключительных стадий выгонки плодовых тел шампиньона (температура влияет на интенсивность мейоза); б. Использование плодовых тел шампиньона со вскрытым частным покрывалом (в плодовых телах с целым частным покрывалом мейоз нарушен); в. Состав и концентрации ферментов для получения протопластов из базидий (влияние на продуктивность выделения протопластов); г. Правильное использование детергентов при получении препаратов распластанных ядер шампиньона (завышенные концентрации и пролонгированное действие детергентов негативно сказываются на качестве препаратов). д. Условия контрастирования и выбор метода в зависимости от цели контрастирования (осевые структуры или рекомбинационные узелки).
3. Становление типичного мейоза (профазы I) происходит только после вскрытия частного покрывала плодового тела, что приводит к частичной синхронизации типичного мейоза шампиньона. До вскрытия частного покрывала плодового тела мейоз шампиньона протекает с рядом нарушений.
4. Профаза I мейоза у четырехспорового штамма шампиньона в целом типична для большинства эукариот. Исключение составляют незначительные нарушения ультраструктуры осевых элементов хромосом в некоторых ядрах, распластанных на стадиях лептотены и ранней зиготены, и редкая встречаемость распластанных ядер на стадии диплотены.
5. Кариотипированием, на основе анализа синаптонемных комплексов четырехспорового штамма шампиньона, показано п= 13 (длины синаптонемных комплексов от « 1 до 5 мкм).
6. На стадиях лептотены-зиготены (но не поздней зиготены-пахитены) идентифицируются рекомбинационные узелки. Рекомбинационные узелки, условно определенные (на основе морфологии и локализации) как ранние, связаны чаще всего с осевыми элементами хромосом. «Поздние» рекомбинационные узелки, более крупные, всегда расположены в центральном пространстве синаптонемных комплексов.
7. С помощью сравнительного электронно-микроскопического анализа распластанных ядер штаммов шампиньона с разными жизненными циклами установлено, что у двуспоровых штаммов шампиньона, характеризующихся снижением частоты рекомбинации: а. Нарушено формирование осевых элементов хромосом и синаптонемных комплексов; б. Редуцировано количество рекомбинационных узелков; в. Во многих ядрах нарушен процесс слияния ядрышек; г. Нередко в ядрах присутствуют поликомплекс-подобные структуры.
8. Атипичностъ сборки осевых структур хромосом двуспоровых штаммов шампиньона имеет ряд важных особенностей (установлено с помощью статистического и морфологического анализов, в сравнении с четырехспоровым штаммом шампиньона): а. Осевые элементы хромосом формируются лишь на отдельных участках некоторых хромосом. Причем распределение участков формирования осевых элементов носит случайный характер. б. Участки хромосом, сформировавшие осевые элементы, сближаются и синаптируют (исключение см. в следующем пункте). в. Не синаптируют осевые элементы постоянного участка первого бивалента или постоянные участки нескольких длинных бивалентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящем исследовании, посвященном цитогенетическому изучению профазы I мейоза шампиньона, был решен круг разнообразных задач: разработан метод, установлены особенности мейоза на разных этапах морфогенеза плодовых тел, электронно-микроскопически исследованы особенности ядерной ультраструктуры на стадии профазы I у штаммов шампиньона с разными жизненными циклами, проведен анализ различий формирования осевых структур мейотических хромосом между разными штаммами и предложена гипотетическая схема, поясняющая природу направленных нарушений рекомбинации у шампиньона.
Для того чтобы изучить морфологические характеристики, установить особенности и выявить нарушения распластанных ядер шампиньона на стадии профазы I мейоза, нами был разработан эффективный метод получения тотальных препаратов осевых структур мейотических хромосом. Методические результаты нашего исследования, которые сами по себе обладают научной новизной, позволили нам получить крайне интересные и новые результаты при анализе профазы I мейоза шампиньона.
Разработанный метод получения препаратов распластанных ядер из базидий шампиньона представляет собой синтез различных адаптированных методов, применяемых для исследований других видов грибов и прочих организмов. Метод распластывания мейотических ядер был впервые применен для цитогенетического исследования профазы I шампиньона двуспорового. Можно говорить о том, что наш метод распластывания за счет использованного в нем подхода (осуществляемого через ферментативное выделение протопластов мейоспорангиев), на примере шампиньона, впервые применен для мицелиальных грибов в целом.
Составная часть нашего метода распластывания - выделение протопластов из базидий шампиньона - разработана на основе предложенных другими авторами способов выделения протопластов из гимения шампиньона и культур клеток дрожжей. Разработанный метод выделения протопластов обеспечивает достаточно высокий продуктивный выход протопластов и необходимую для дальнейшей работы их сохранность.
Другая составная часть нашего метода распластывания - само распластывание полученных протопластов, представляет собой модифицированный метод по Лойдл (Loidl et al., 1991), также используемый при исследовании дрожжей.
Контрастирование препаратов распластанных мейотических ядер шампиньона основано на способах контрастирования тотальных препаратов СК мышей и злаков. Подобранные нами условия распластывания ядер и их контрастирования обеспечивают получение качественных электронно-микроскопических препаратов ядер на стадии профазы шампиньона, дают возможность исследовать совокупности ОЭ и СК, ультраструктуру осевых структур мейотических хромосом, другие ядерные структуры.
Впервые установлена связь между становлением мейоза у шампиньона и морфогенезом плодовых тел. Обнаружено, что до момента вскрытия частного покрывала плодового тела ранний мейоз в базидиях плодового тела протекает атипично - в распластанных ядрах обнаруживаются осевые структуры мейотических хромосом, но ультраструктура их плохо выражена, хроматин уплотнен. Становление типичного мейоза шампиньона, с четко выраженными структурами, соответствующими профазе I в распластанных ядрах, синхронизировано с разрывом частного покрывала плодовых тел.
Электронно-микроскопический анализ распластанных ядер на стадии профазы I четырехспорового штамма шампиньона показал типичность профазы I у этого штамма. Хотя ряд особенностей профазы I обнаружены и у четырехспорового штамма (наличие нарушений структуры ОЭ в некоторых ядрах, распластанных, обычно, на стадиях лептотены и ранней зиготены; редкая встречаемость ядер на стадии диплотены, возможно, из-за скоротечности данной стадии).
Описан СК-кариотип шампиньона; впервые исследованы разные стадии профазы I и изучены особенности формирования, как осевых структур хромосом и рекомбинационных узелков, так и других ядерных структур.
Один из самых важных результатов нашего исследования -обнаружение и анализ значительных внутриядерных нарушений, в частности, нарушений формирования ОЭ и СК у двуспоровых штаммов шампиньона. Морфология осевых структур мейотических хромосом, как и в многочисленных работах, посвященных ранним мейотическим нарушениям у других организмов (Zolan et al., 1988; Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Shinohara et al., 2003; Hederson, Keeney, 2004), сыграла роль цитогенетического индикатора наличия рекомбинантных нарушений у шампиньона. О нарушении рекомбинации у вторично-гомоталличных штаммов шампиньона известно давно (как и у некоторых других вторично-гомоталличных грибов) (Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993; Дьяков, 1999; Захаров, 2005), и такое явление, наряду с отрывочными цитогенетическими данными, и ранее позволяло предполагать наличие дефектов сборки ОЭ и СК у шампиньона (Fletcher, 1981). Однако четкое подтверждение тому и исчерпывающий анализ особенностей формирования таких атипичных ОЭ и СК впервые получены в результате проведения данного исследования.
Статистический и морфологический анализ внутриядерных нарушений у шампиньона позволил нам сделать предположение о характере и механизмах таких естественных нарушений. Нами было предположено наличие у шампиньона генетически-детерминированной (зависимой от локуса BSN) изменчивости рекомбинации, состоящей из двух подсистем. Подсистема регион-специфической регуляции функционирует в определенном участке (вероятнее всего прицентромерном) первой хромосомы (или в определенных участках нескольких длинных хромосом) и сопровождается асинапсисом в данном участке. Подсистема регион-неспецифических нарушений сборки ОЭ, и, возможно, нарушений рекомбинации, может иметь нерегуляторную природу (мутация, косегрегирующая с BSN Ъ) и быть обусловленной неполной дисфункцией гена/генов мейотической когезии или структурных генов ОЭ.
Однако для действительного установления механизмов супрессии рекомбинации, нарушения сборки осевых структур хромосом и нарушений мейоза в базидиях закрытых плодовых тел, необходимо дальнейшее проведение исследования шампиньона с помощью других цитогенетических и генетических методов.
Так следующим этапом, продолжающим настоящее исследование, мог бы быть этап, включающий иммуноцитохимический анализ ранних мейотических белков. Ввиду консервативности таких белков (особенно, белков рекомбинации), возможно использование коммерческих антител против антигенов животных и растений. Иммуноцитохимически возможно установить наличие и активность изучаемых белков, что может быть информативно в том случае, если у шампиньона действительно есть элементы регион-неспецифической супрессии рекомбинации.
Итог данного исследования подводят краткие выводы, сформулированные на основе результатов исследования и их обсуждения.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мажейка, Игорь Стасисович, Москва
1. Богданов Ю.Ф. Изменчивость и эволюция мейоза // Генетика. 2003. Т. 39. С. 453-473 (Bogdanov Yu. F. Variation and Evolution of Meiosis // Russ. J. Genet. 2003. v. 39. p. 363-381).
2. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Синаптонемный комплекс как индикатор динамики мейоза и изменчивости хромосом, м. Товарищество научных изданий КМК. 2007. 350 с.
3. Восток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М. Мир. 1981. 450 С.
4. Волкова В.Н., Камзолкина О.В., Козлова М.В., Дьяков Ю.Т. Сравнительная кариология штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach с разными типами жизненного цикла // Микология и фитопатология. 2003. Т. 37. С. 30-41.
5. Гарибова Л.В. Некоторые вопросы селекции многоспоровых штаммов шампиньона Agaricus bisporus // Вест. МГУ Сер. Биол. 1965. Т. 2. С. 44-516. Дьяков Ю.Т. Системы размножения грибов и их эволюция // Микология и
6. Фитопатология. 1999. Т. 33. С. 137-1497. Жизнь растений. Т.2. Грибы. Под. ред. М.В. Горленко. 1976. М. Просвещение. 480 С.
7. Захаров И.А. Внутритетрадное спаривание и его генетико-эволюционные последствия // Генетика. 2005. Т. 41. С. 508-519.
8. Камзолкина О.В., Можина И.А., Грубе Е.Т., Сафрай А.И., Дьяков Ю.Т. Получение самостерильных клонов культивируемого шампиньона // Биотехнология. 1992. №1. С. 14-17.
9. Ю. Камзолкина О.В. Цитологические исследования гомокариотических и гетерокариотических штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach // Микробиология. 1996. Т. 2. С. 228-234.
10. Коломиец О.Л., Федотова Ю.С., Богданов Ю.Ф. Естественная деградация синаптонемных комплексов на стадии диплотены мейоза позволяет анализировать организацию его ультраструктурных компонентов // Биол. Мембраны. 2001. Т. 18. С. 230-239.
11. Мажейка И.С., Грубе Е.Т., Камзолкина О.В., Дьяков Ю.Т. Нестабильность гомокариотических штаммов Agaricus bisporus // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34. С. 34-38.
12. Можина И.А., Белякова Г.А., Фиреал M.C., Дьяков Ю.Т. Маркирование сортов и дикорастущих штаммов культивируемого шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach изоферментами эстеразы // Биол. науки. 1993. Т. 1. С. 131-ИО.
13. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М. Мир. 1995.343 С.
14. Alani Е., Padmore R., Kleckner N. Analysis of Wild-type and rad.50 Mutants of Yeast Suggests an Intimate Relationship between Meiotic Chromosome Synapsis and Recombination // Cell. 1990. V. 61. P. 419-436.
15. Anderson L.K., Offenberg H.H., Verkuijlen W.H.M.C., Heyting C. RecA-like Proteins are Components of Early Meiotic Nodules in Lily // Genetics. 1997. V. 94. P.6868-6873.
16. Anderson L.K., Stack S.M. Recombination Nodules in Plants // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 109. P. 198-204.
17. Anuradna S., Muniyappa K. Meiosis-Specific Yeast Hopi Protein Promotes Synapsis of Double-Stranded DNA Helices via the Formation of Guanine Quartets // Nucleic Acids Research. 2004. V. 32. P. 2378-2385.
18. Bachmann B.J., Bonner D.M. Protoplasts from Neurospora crassa // J. of Bacteriology. 1959. V. 78. P. 550-556.
19. Burgess S.M., Kleckner N., Weiner B.M. Somatic Pairing of Homologs in Budding Yeast: Existence and Modulation // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1627-1641.
20. Burhler J., Wyler Т., Loidl J., Kohli J. Unusual Nuclear Structures in Meiotic Prophase of Fussion Yeast a Cytological Analysis // J. Cell Biol. 1993. V. 121. P. 241256.
21. Burnett J.H. Mycogenetics: An Introduction to the General Genetics of Fungi. W W Norton & Co Inc. 1981.375 P.
22. Carpenter A.T.C. Electron Microscopy of Meiosis in Drosophila melanogaster Females. II. The Recombination Nodule a Recombination-associated Structure at Pachytene? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3186-89.
23. Celerin M., Merino S. Т., Stone J. E., Menzie A. M., Zolan M. E. Multiple Roles of Spoil in Meiotic Chromosome Behavior // The EMBO J. 2000. V. 19. P. 2739-2750.
24. Casselton L.A., Olesnicky N.S. Molecular Genetics of Mating Recognition in Basidiomycete Fungi // Micr. and Mol. Biol. Reviews. 1998. V. 62. P. 55-70.
25. Callac P., Billette C., Imbernon M., Kerrigan R. Morphological, Genetic and Interfertility Analyses Reveal a Novel, Tetrasporic Variety of Agaricus bisporus from the Sonoran Desert of California 11 Mycologia. 1993. V. 89. P. 835-851.
26. Callac P. Breeding of Edible Fungi with Emphasis on the Variability among French Genetic Resources of Agaricus bisporus // Can. J. Botany. 1995. V. 73. P. 980-986.
27. Callac P., Desmerger C., Kerrigan R. W., Imbernon M. Conservation of Genetic Linkage with Map Expansion in Distantly Related Crosses of Agaricus bisporus // FEMS Microbiol. Letters. 1997. V. 146. P. 235-240.
28. Callac P., Hocquart S., Imbernon M., Desmerger C., Olivier J-M. Bsn-t Alleles from French Field Strains of Agaricus bisporus // App. and Environmental Microbiol. 1998. V. 64. P. 2105-2110.
29. Callac P., de Haut J.I., Imberton M., Guinberteau J. A Novel Homothallic Variety of Agaricus bisporus Comprises Rare Tetrasporic Isolates from Europe // Mycologia. V. 95. 2003. P. 222-231.
30. Cayley D. Spores and Spore Germination in Wild and Cultivated Mushrooms // Trans. British. Mycol. Soc. 1936. V. 20. P. 225-241.
31. Castle A.J., Horgen P.A., Anderson J.B. Restriction Fragment Length Polymorphisms in the Mushrooms Agaricus brunnescens and Agaricus bitorquis 11 Appl. Environm. Microbiol. 1987. V. 53. P. 816-822.
32. Castle A.J., Horgen P.A., Anderson J.B. Crosses among Homokaryons from Commercial and Wild-collected Strains of the Mushroom Agaricus brunnescens (= A. bisporus) // Appl. Environm. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1643-1648.
33. Chen X.Y., Hampp R. Isolation and Regeneration of Protoplasts from Gills of Agaricus bisporus // Cur. Microbiology. 1993. V. 26. P. 307-312.
34. Earnshaw W.C., Laemmli U.K. Architecture of Metaphase Chromosomes and Chromosome Scaffolds // J. Cell Biol. V. 96. P. 84-93.
35. Eddy A.A., Williamson D.H. Formation of Abberant Cell Walls and of Spores by the Growing Yeast Protoplasts // Nature. 1959. V. 183. P. 1104-1114.
36. Elliott T.J. Sex and Single Spore // Mush. Sci. 1972. V. 8. P. 11-18.
37. Elliott T.J., Challen M.P. Genetic Ratios in Secondarily Homothallic Basidiomycetes // Exp. Mycol. 1983. V. 7. P. 170-174.
38. Elliott T.J., Langton F.A. Strain Improvement in the Cultivated Mushroom Agaricus bisporus 11 Euphytica. 1981. V. 30. P. 175-182.
39. Engebrecht J., Roeder G.S. MERi, a Yeast Gene Required for Chromosome Pairing and Genetic Recombination, is Induced in Meiosis // Mol. And Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 2379-2389.
40. Engelhardt P., Ruokolainen J., Dolenc A. Electron Tomography of Chromosomes and Viruses // CSC News. 1994. V. 6. P. 14-20.
41. Evans H. J. Nuclear Behavior in the Cultivated Mushroom // Chromosoma. 1959. V. 10. P. 115-135.
42. Fedotova Yu.S., Kolomiets O.L., Bogdanov Yu.F. Synaptonemal Complex Transformations in Rye Microsporocytes at the Diplotene Stage of Meiosis // Genome. 1989. V. 32. P. 816-823.
43. Fletcher H. L. Asearch for Synaptonemal Complexes in Ustilago maydis //J. Cell Sci. 1981. V. 50. P. 171-180.
44. Gasior S.L., Olivares H., Ear U., Hari D.M., Weichselbaum R., Douglas K. Bishop D.K. Assembly of RecA-like Recombinases: Distinct Roles for Mediator Proteins in Mitosis and Meiosis // PNAS. 2001. V. 98. P. 8411-8418.
45. Gerecke E.E., Zolan M.E. An mreu Mutant of Coprinus cinereus Has Defects in Meiotic Chromosome Pairing, Condensation and Synapsis // Genetics. 2000. V. 154. P. 1125-1139.
46. Goetsch L., Byers B. Meiotic Cytology of Saccharomyces cerevisiae in Protoplast Lysates 11 Mol. Gen. Genet. 1982. Vol. 187. P. 54-60.
47. Grishchuk A. L., Kohli J. Five RecA-Like Proteins of Schizosaccharomyces pombe Are Involved in Meiotic Recombination // Genetics. 2003. V. 165. P. 10311048.
48. Henderson K.A., Keeney S. Tying Synaptonemal Complex Initiation to the Formation and Programmed Repair of DNA Double-Strand Breaks // PNAS. 2004.1. V. 101. P. 4519-4524.
49. Heyting C. Synaptonemal Complexes: Structure and Function // Current Biol. In Cell Biol. 1996. V. 8. P. 389-396.
50. Hober J.E. Mating-type Gene Switching in Saccharomyces cerevisiae // Trends in Genet. 1992. V. 8. P. 446-452.
51. Howell W.M., Black D.A. Controlled Silver-staining of Nucleolus Organizer Region with a Protective Colloidal Developer: a l-step Method // Experientia. 1980. V. 36. P. 1014-1015.
52. Imbernon M.P., Callac P., Gasqui P., Kerrigan R.W., Velcko A.J. BSN, the Primary Determinant of Basidial Spore Number and Reproductive Mode in Agaricus bisporus, Maps to Chromosome I // Mycologia. 1996. V. 88. P. 749-761.
53. Jiao K., Salem L., Malone R. Support for a Meiotic Recombination Initiation Complex: Interactions among Reci02p, Reci04p, and Spoup // Mol. and Cell. Biol. 2003. v. 23. p. 5928-5938.
54. Jin Q.W., Trelles-Sticker E., Schertan H., Loidl J. Yeast Nuclei Display Prominent Centromere Clustering That is Reduced in Nondividing Cells and in Meiotic Prophase // J. of Cell Biol. 1998. V. 141. P. 21-29.
55. Kamzolkina O.V., Volkova V.N., Kozlova M.V., Pancheva E.V., Dyakov Yu.T., Callac P. Karyological Evidence for Meiosis in the Three Different Types of Life Cycles Existing in Agaricus bisporus // Mycologia. 2006. V. 98. P. 763-770.
56. Kiies U. Life History and Developmental Processes in the Basidiomycete Coprinus cinereus // Microbiol, and Mol. Biol. Reviews. 2000. V. 64. P. 316-353.
57. Kerrigan R.W., Royer J.C., Bailer L.M., Kohli Y., Horgen P.A., Anderson J.B. Meiotic Behavior and Linkage Relationships in the Secondaiy Homothallic Fungus Agaricus bisporus // Genetics. 1993. V.133. P.225-236.
58. Kerrigan R.W., Imbernon M., Callac P., Billette C., Olivier J.M. The Heterothallic Life Cycle of Agaricus bisporus var. burnettii and the Inheritance of its Tetrasporic Trait // Experimental Mycology. 1994. V. 18. P. 193-210.
59. Klein H.L., Byers B. Stable Denaturation of Chromosomal DNA from Saccharomyces cerevisiae during Meiosis // J. of Bacteriology. 1978. V. 134. P. 629635.
60. Labarere J., Noel T. Mating Type Switching in the tetrapolar Basidiomycete Agrocybe aegerita // Genetics. 1992. V. 60. P. 307-319.
61. Langton F.A., Elliott T.J. Genetics of Secondarily Homothallic Basidiomycetes // Heredity. 1980. V. 45. P. 99-106.
62. Li L., Gerecke E.E., Zolan M.E. Homolog Pairing and Meiotic Progression in Coprinus cinereus // Chromosoma. 1999. V. 108. P. 384-392.
63. Lodder S., D. Wood, K. Gull. A Protoplasting Technique with General Applicability for Molecular Karyotyping of Hymenomycetes // J. Gen. Microbiology. 1993- V. 139. P. 1063-1067.
64. Loftus M.G., Moore D., Elliott T.J. DNA Polymorphisms in Commercial and Wild Strains of the Cultivated Mushroom, Agaricus bisporus // Theor. and App. Genet. 1988. V. 76. P. 712-718.
65. Loidl J., Jones G.H. Synaptonemal Complex Spreading in Allium // Chromosoma. 1986. V. 93. P. 420-428.
66. Loidl J., Naizz K., Klein F. Meiotic Chromosome Synapsis in Haploid Yeast // Chromosoma. 1991. V. 100. P. 221-228.
67. Loidl J., Scherthan H., Dunnen J.T.D., Klein F. Morphology of a Human-derived YAC in Yeast Meiosis // Chromosoma. 1995. V. 104. P. 183-188.
68. Loidl J. S. pombe linear elements: the modest cousins of synaptonemal complexes // Chromosoma. 2006. V. 115. P. 260-271.
69. Lu В. C. Cellular events in the meiosis of Coprinus // Molecular bases of genetic processes. Proceeding of the XIV international congress of genetics. 1981. V. 3. P. 305-317.
70. Lu B.C. Spreading the Synaptonemal Complex of Neurospora crassa // Chromosoma. 1993. V. 102. P. 464-472.
71. Lu В. C., Gallo N., Kiies U. White-cap Mutants and Meiotic Apoptosis in the Basidiomycete Coprinus cinereus // Fungal Genet, and Biol. 2003. V. 39. P. 82-93.
72. Malone R.E., Haring S.J., Foreman K.E., Pansegrau M.L., Smith S.M., Houdek D.R., Carpp L., Shah В., Lee K.E. The Signal from the Initiation of Meiotic Recombination to the First Division of Meiosis // Eukar. Cell. 2004. V. 3. P. 598609.
73. Martinez-Carrera D., Challen M.P., Thurston C.F., Smith J.F., Elliott T.J. Homokaiyotic Fruiting of Agaricus bitorquis: a New Approach // Science and Cultivation of Edible Fungi. Rotterdam. Balkema. 1995. P. 37-44.
74. McLaughlin D.J. Ultrastructure and Cytochemistry of Basidial and Basidiospore Development / in Basidium and Basidiocarp. 1982. Springer Verlag. N.Y. P. 37-73.
75. Merino S.T., Cummings W.J., Achaiya S.N., Zolan M.E. Replication-dependent Early Meiotic Requirement for Spoil and Radso // Genetics. 2000. V. 97. P. 1047710482.
76. Miller R.E. Evidence of Sexuality in the Cultivated Mushroom, Agaricus bisporus 11 Mycologia. 1971. V. 63. P. 630-634.
77. Miller R.E., Kananen D.L. Bipolar sexuality in the Mushroom // Mush. Sci. 1972. V. 8. P. 713-718.
78. Molnar M., Burhler J., Sipiczki M., Kohli J. The REC8 Gene of Schizosaccharomyces pombe is Involved in Linear Element Formation, Chromosome Pairing and Sister-chromatid Cohesion during Meiosis // Genetics. 1995. V. 141. P. 61-73.
79. Nag D.K., Scherthon H., Rockmill В., Bhargava J., Roeder S. Heteroduplex DNA Formation and Homolog Pairing in Yeast Meiotic Mutants // Genetics. 1995. V. 141. P. 75-86.
80. Page S.L., Hawley R.S. The Genetics and Molecular Biology of the Synaptonemal Complex // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. V. 20. P. 525-58.
81. Peberdy J.F. Presidential Address: Fungi without Coats Protoplasts as Tools for Mycological Research // Mycol. Res. 1989. V. 93. P. 1-20.
82. Pieck A.C., van der Velden H.M., Rijken A.A., Neis J.M., Wanka F. Protein Composition of the Chromosomal Scaffold and interphase Nuclear Matrix // Chromosoma. 1985. V. 91. P. 137-144.
83. Plus A.W., Peters A.H., Keegan K.S., Hoekstra M.F., Boer P., Ashley T. Changes in Protein Composition of Meiotic Nodules during Mammalian Meiosis // J. of Cell Sci. 1998. V. 111. P. 413-423.
84. Prieto I., Tease C., Pezzi N., Buesa J.M., Ortega S., Kremer L., Martinez A., Martinez C., Hulte M.A., Barbero J.L. Cohesin Component Dynamics during Meiotic Prophase I in Mammalian Oocytes // Chromosome Research. 2004. V. 12. P. 197213.
85. Pukkila P.J., Lu B.C. Silver Staining of Meiotic Chromosomes in the Fungus, Coprinus cinereus // Chromosoma. 1985. V. 91. P. 108-112.
86. Pukkila P.J., Skrzynia C., Lu B.C. The rad.3-1 Mutant is Defective in Axial Core Assembly and Homologous Chromosome Pairing during Meiosis in the Basidiomycete Coprinus cinereus // Dev. Genet. 1992. V. 13. P. 403-410.
87. Rohr H., Kiies U., Stahl U. II. Recombination: Meiotic Recombination in Fungi // Progress in Botany. 1997. V. 58. P. 307-350.
88. Ramesh M.A., Zolan M.E. Chromosome Dynamics in radi2 Mutants of Coprinus cinereus 11 Chromosoma. 1995. V. 104. P. 189-202.
89. Reynolds E.S. The Use of Lead Citrate at High pH as an Electronopaquestain in Electron Microscopy// J. Cell Biol. 1963. V.17. P. 208-212.
90. Royse D.J., May B. Use of Izozyme Variation to Identify Genotypic Classes of Agaricus brunnescens // Mycologia. 1982. V. 74. P. 93-102.
91. Raper C.A., Raper J.R., Miller R.E. Genetic Analysis of the Life-Cycle of Agaricus bisporus 11 Mycologia. 1972. V. 64. P. 1088-1117.
92. Royer J.C., Hintz W.E., Kerrigan R.W., Horgen P.A. Electrophoretic Karyotype Analysis of the Button Mushroom, Agaricus bisporus 11 Genome. 1992. V. 35. P. 694-698.
93. Rose D., Holm C. Meiosis-Specific Arrest Revealed in DNA Topoisomerase II Mutants // Mol. And Cell Biol. 1993. V. 13. P. 3445-3455.
94. Rockmill В., Engebrecht J., Scherthan H., Loidl J., Roeder S. The Yeast MER2 Gene is Required for Chromosome Synapsis and Initiation of Meiotic Recombination 11 Genetics. 1995. V. 141. P. 49-59.
95. Saksena K.N., Marino R., Haller M.N., Lemke P.A. Study on Development of Agaricus bisporus by Fluorescent Microscopy and Scanning Electron Microscopy // J. of Bacteriology. 1976. V. 126. P. 417-428.
96. Sherman J.D., Herickhoff L.A., Stack S.M. Silver Staining Two Types of Meiotic Nodules // Genome. 1992. V. 35. P. 907-915.
97. Schmekel K. Methods for Immuno-electron Microscopic and Fine Analysis of Synaptonemal Complexes and Nodules in Yeast // Chromosoma. 2000. V. 109. P. 110-116.
98. Schulz-Weddigen I. Protoplasten aus Basidien und Vegetativen Zellen von Coprinus radiatus // Ber Deutsch Bot. Ges. 1982. B. 95. S. 431-440.
99. Shinohara M., Sakai K., Shinohara A., Bishop D.K. Crossover Interference in Saccharomyces cerevisiae Requires a TID1/RDH54- and DMCi-Dependent Pathway // Genetics. 2003. V. 163. P. 1273-1286.
100. Spear M.C., Royse D.J., May B. Atypical Meiosis and Joint Segregation of Biochemical Loci in Agaricus brunnescens //J. Heredity. 1983. V. 74. P. 417-420.
101. Strunk C. Light and Electron Microscopic Studies of Regenerating Protoplasts of Polystictus versicolor // Z. Allg. Mikrobiol. 1969. V. 9. P. 205-216.
102. Summerbell R.C., Castle A.J., Horgen P.A., Anderson J.B. Inheritance of Restriction Fragment Length Polymorphisms in Agaricus brunnescens // Genetics. 1989. V. 123. P. 293-300.
103. Svoboda A., Burhler J., Kohli J. Microtubule-draven Nuclear Movements and Linear Elements as Meiosis-specific Characteristics of the Fusion Yeasts Schizosaccharomyces versalitis and S.pombe // Chromosoma. 1995. V. 104. P. 203214.
104. Swaminathan J., Baxter E.M., Corces V.G. The role of histone H2Av variant replacement and histone H4 acetylation in the establishment of Drosophila heterochromatin // Genes Dev. V. 19. P. 65-76.
105. Takami K., Matsuda S., Sono A., Sakaguchi K. A Meiotic DNA Polymerase from a Mushroom, Agaricus bisporus // Biochem. J. 1994. V. 299. P. 335-340.
106. Thielke C. Intranucleare Meiose bei Agaricus bisporus // Zeitschr. f. Pilzkunde. 1976. B. 42. S. 57-66.
107. Thielke C. Meiotic Divisions in the Basidium / in Basidium and Basidiocarp. 1982. Springer. N.Y. P. 75-91.
108. Thing J.P., Sung R., Ye M., Hendzel M.J. Hi family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 27809-14.
109. Trelles-Sticker E., Loidl J., Schertan H. Bouquet Formation in Budding Yeast: Initiation of Recombination is Not Required for Meiotic Telomere Clustering // J. of Cell Sci. 1999- V. 112. P. 651-658.
110. Tsutsui Y., Khasanov F.K., Shinagawa H., Iwasaki H., Bashkirov V.I. Multiple Interactions Among the Components of the Recombinational DNA Repair System in Schizosaccharomycespombe // Genetics. 2001. V. 159. P. 91-105.
111. Vries O.M.H., Wessels J.G.H. Release of Protoplasts from Schizophyllum commune by a Lytic Enzyme Preparation from Trichoderma viride // J. of Gen. Microbiology. 1972. V. 73. P. 13-22.
112. Weiner B.M., Kleckner N. Chromosome Pairing via Multiple Interstitial Interactions before and during Meiosis in Yeast // Cell. 1994. V. 77. P. 977-991.
113. White E.J., Cowan C., Cande W.Z., Kaback D.B. In vivo Analysis of Synaptonemal Complex Formation During Yeast Meiosis // Genetics. 2004. V. 167. P. 51-63.
114. Xu J., Kerrigan R.W., Horgen P.A., Anderson J.B. Localization of the Mating Type Gene in Agaricus bisporus 11 Appl. Env. Microbiol. 1993. V. 59. P. 3044-3049.
115. Xu J., Horgen P.A., Anderson J.B. Variation of Mating Interactions in Agaricus bisporus // Cultiv. Mush. Res. Newsl. 1996a. V. 3. P. 23-30.
116. Xu J., Horgen P.A., Anderson J.B. Somatic Recombination in the Cultivated Mushroom Agaricus bisporus // Mycol. Res. 1996b. V. 100. P. 188-192.
117. Xu J., Kerrigan R.W., Callac p., Horgen P.A., Anderson J.B. The Genetic Structure of Natural Population of Agaricus bisporus, the Commercial Mushroom // J. Hered. 1997. V. 88. P. 482-494,
118. Xu J., Kerrigan R.W., Sonnenberg A.S., Callac p., Horgen P.A., Anderson J.B. Mitochondrial DNA Variation in Natural Populations of the Mushroom Agaricus bisporus // Mol. Ecol. 1998. V. 7. P. 19-33.
119. Xu J., Desmerger C., Calac P. Fine-scale Genetic Analyses Reveal Unexpected Spatial-temporal Heterogeneity in Two Natural Population of the Commercial Mushroom Agaricus bisporus // Microbiol. 2002. V. 148. P 1253-1262.
120. Zickler D., Moreau P.J.F., Huynh A.D., Slezec A. Correlation between Pairing Initiation Sites, Recombination Nodules and Meiotic Recombination in Sordaria macrospora // Genetics. 1992. V. 132. P. 135-148.
121. Zickler D., Kleckner N. The Leptotene-zygotene Transition of Meiosis // Ann. Rev. Genet. 1998. V. 32. P. 619-697.
122. Zickler D., Kleckner N. Meiotic Chromosomes: Integrating, Structure and Function // Annu. Rev. Genet. 1999. V. 33. P. 603-754.
123. Zolan M.E., Tremel C.J., Pukkila P.J. Production and Characterization of Radiation-Sensitive Meiotic Mutants of Coprinus cinereus 11 Genetics. 1988. V. 120. P- 379-387.
-
Мажейка, Игорь Стасисович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.24
- Изоферментные маркеры штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach.
- Кариология штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach с разными типами жизненного цикла
- Синапсис и рекомбинация у млекопитающих - носителей хромосомных перестроек
- ДОПОЛНЕННЫЕ ЛИНИИ КАК МОДЕЛЬ ИНТРОГРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОГО МАТЕРИАЛА S. LYCOPERSICOIDES В ГЕНОМ КУЛЬТУРНОГО ТОМАТА
- Биологические основы борьбы с грибными болезнями шампиньонов
