Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криптоспоридиоз рептилий

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Криптоспоридиоз рептилий"

005043109

На правах рукописи

ШАРОВА АННА ОЛЕГОВНА

КРИПТОСПОРИДИОЗ РЕПТИЛИЙ

(морфо-биологическая характеристика возбудителя, распространение, патогенез, терапия)

Специальность: 03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 мая тг

Москва - 2012

005043109

Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Гламаздин Игорь Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Малышева Наталья Семеновна

зав. кафедрой биологии растений и животных, директор НИИ паразитологии ФГБОУ ВПО «Курский государственный университет»

кандидат биологических наук, доцент Давыдова Ольга Евгеньевна кафедра паразитологии и инвазионных болезней ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина»

Защита диссертации состоится «30» мая 2012 г. в 14:30 часов на заседании диссертационного совета Д 006.011.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина».

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС.

Автореферат разослан лг\ре»л*% 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

В.К. Бережко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Разведение экзотических животных в условиях неволи в последние годы приобретает массовый характер. Среди большого количества людей, живущих в городах, стал популярным класс наземных позвоночных - рептилий, что вызывает проблемы прикладного значения, обусловленные содержанием и разведением экзотических животных в неволе. С каждым годом рептилии охватывают все больший коммерческий сектор на зоорьгаке и на сегодняшний день по обороту денежных средств занимают второе место после птиц среди экзотических животных. Это повлекло за собой появление новых организаций, а также частных лиц, занимающихся содержанием, разведением и эксплуатацией экзотических животных. В условиях частного сектора пункты передержек и реализации черепах, змей, ящериц города Москвы насчитывают сотни экземпляров и десятки видов рептилий. По последним данным только черепах содержится около 300 тысяч, а ежегодное поступление их на рынок составляет примерно 100 тысяч особей. Реальное количество животных в Москве, нуждающихся в лечении или квалифицированной консультации, может превышать 200 тысяч особей.

Стремительное развитие научно-прикладных направлений паразитологии оказывает мощное влияние на методологические подходы к изучению патогенеза болезней при кишечных простейших и разработку методов их терапии и диагностики. Однако многие аспекты патологии рептилий, в том числе вызываемой простейшими паразитами при содержании животных в неволе, изучены недостаточно.

Протистофауну рептилий в местах их естественного обитания исследовали многие авторы (Fantham Н.В., Porter А., 1950; Osman Hill W.C. et al., 1960; Kutzer E., Grimberg W„ 1965; Wallach J.D., 1969; Telford S.R., 1971; Bernstein J.J., Goodman D.C., 1972; Levine N.D., 1980; Frye F.L., 1991; McKenzie W. et al., 1995; Jacobson E.R., 2007). Однако в зоопарках эта проблема изучена недостаточно. Разные виды рептилий поступают в зоопарки из многих регионов тропического и субтропического поясов, а также от различных фирм-поставщиков и посредников. В связи с этим протистофауна рептилий, содержащихся в неволе, может быть многообразной и отличаться от естественной. Паразитические простейшие могут вызывать существенные патологические состояния животных. Одной из самых проблемных в этой группе болезней является криптоспоридиоз.

Эта болезнь описана более чем у 80 видов рептилий. Криптоспоридиоз в настоящее время является большой проблемой в крупных коллекциях рептилий. По данным зарубежных авторов падеж животных в зоопарках от криптоспоридиоза составляет больше 25 % (Васильев Д.Б., 2005; Upton S.J. et al., 1989; Cranfield M.R. et al., 1999; Frye F.L. et al., 1999; Graczyk Т.К., 2004; Pantchev "N., Vrhovec M., 2004; Jacobson E.R., 2007).

До настоящего времени многие вопросы криптоспоридиоза рептилий остаются не изученными - распространение возбудителя в условиях частного сектора, клиническая картина у разных видов рептилий, патогенез,

дифференциальная диагностика, терапия и профилактика криптоспоридиоза. Вопросы терапии криптоспоридиоза рептилий изучаются, в основном, зарубежными авторами. В литературе имеются данные о применении современных противопаразитарных средств. Но, к сожалению, пока не разработано успешной схемы лечения и рекомендаций по профилактике криптоспоридиоза." Для успешной борьбы с паразитическими простейшими и принятия решения о терапевтической тактике принципиально важна клинико-патогенетическая характеристика синдрома желудочно-кишечной недостаточности с различными клилико-морфологическими стадиями болезни. Представляется целесообразным учитывать характер влияния инвазии на течение болезни, патофизиологических особенностей при взаимоотношениях в системе «паразит-хозяин» с целью эффективного применения специфических терапевтических средств. В нашей стране с учетом специфики содержания рептилий в условиях зоопарков, климатических и других особенностей вопросы биологии и патогенеза при кригггоспоридиозе представляют научный и практический интерес.

Таким образом, несмотря на значительное число исследований по протистофауне, а в частности по криптоспоридиозу рептилий, многие аспекты этого направления не освещены в литературе и остаются малоизученными. Некоторые из них явились предметом наших исследований по теме диссертации.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось изучение распространения ооцист криптоспоридий рептилий, их биологических и морфологических характеристик, оценка эффективности методов дифференциальной диагностики возбудителей и разработка схем патогенетической терапии при криптоспоридиозе рептилий.

Для достижения обозначенной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить видовой состав протозойных паразитов и распространение возбудителя криптоспоридиоза рептилий в частном зоосекторе, а также в местах карантинирования, передержки и реализации крупных партий животных.

2. Изучить морфологические особенности разных типов ооцист криптоспоридий и модифицировать наиболее оптимальный метод дифференциальной диагностики для выявления возбудителя криптоспоридиоза рептилий.

3. Установить особенности биологического развития паразита в организме хозяина и течение патологического процесса при экспериментальном и спонтанном заражении рептилий.

4. Разработать методы специфической терапии криптоспоридиоза рептилий, содержащихся в зоопарках.

Научная новизна. Впервые исследована паразитарная ситуация в местах передержки и реализации рептилий города Москвы, в крупных частных коллекциях, а также основных зарубежных организаций по импорту рептилий в нашу страну. Получены новые данные о видовом составе

протозойных паразитов животных, содержащихся в частном секторе: жгутиковых, амеб, кокцидий. Впервые обнаружены стационарные очаги развития возбудителей криптоспоридиоза, выявлена степень экстенсивности и интенсивности инвазии. Определены морфологические особенности ооцист, полученных от различных видов рептилий. Модифицированы методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза рептилий. Впервые изучены особенности клинического течения болезни у различных чувствительных видов, биохимические изменения показателей крови и патоморфологические изменения в органах при криптоспорвдиозе. Получены данные об эффективности предложенных нами препаратов для лечения криптоспоридиоза рептилий. Предложена система комплексных лечебно-профилактических меропргоггай, которая позволяет проводить системные обследования рептилий в крупных коллекциях.

Практическая значимость. Разработаны методические рекомендации по лечению криптоспоридиоза рептилий (одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» РАСХН, 19 мая 2011г., протокол № 2), которые используется в практике специалистов Московского зоопарка и рекомендованы для организаций, занимающихся содержанием, разведением, караптинированием и реализацией рептилий.

Проведен мониторинг стационарных очагов криптоспоридиоза рептилий частного сектора города Москвы. Модифицированные методы лабораторной диагностики простейших у рептилий, а также результаты биохимических исследований крови успешно применяются в практике ветеринарных клиник. Предложена терапевтическая схема лечения криптоспоридиоза рептилий с учетом биоэкологических особенностей возбудителей из разных таксономических групп.

Полученные результаты явились основой для разработки научных и практических рекомендаций для оздоровления поголовья рептилий, содержащихся в неволе, от криптоспоридиоза.

Результаты исследований используются в учебном процессе на в етсрипарно-са! гитарном факультете ФГБОУ ВПО «Московского государственного университета пищевых производств».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распространение возбудителя криптоспоридиоза среди рептилий.

2. Морфо-биологаческая характеристика возбудителя и методы прижизненной диагностики криптоспоридиоза рептилий.

3. Течение патологического процесса при развитии возбудителя криптоспоридиоза рептилий.

4. Терапевтические схемы при криптоспорвдиозе рептилий.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2008-2012 гг.).

Материалы диссертационной работы доложены на Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки

сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», посвященной 80-летию МГУПБ (Москва, 2009); VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010); XI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов по кандидатским диссертациям.

Личный вклад автора. Представленная диссертационная работа является результатом четырехлетних научных исследований аспиранта. Основная экспериментальная часть исследований выполнена автором лично. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора кафедры инфекционных и паразитарных болезней ФГБОУ ВПО «МГУПП» И.Г. Гламаздина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. Также выражаем огромную благодарность ведущему герпетологу ГУК «Московский зоологический парк», доктору ветеринарных наук Д.Б. Васильеву за консультации и помощь в проведении экспериментов. Во всех совместных публикациях личный вклад автора составляет не менее 80 %.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает 159 источников, в том числе 130 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена с 2008 по 2012 годы на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московского государственного университета пищевых производств».

Всего в экспериментах был использован материал, полученный от 575 рептилий.

Для оценки распространения криптоспоридиоза среди рептилий, содержащихся в неволе, исследования проводили в Московском зоопарке, в условиях частного сектора города Москвы, а также в крупных отечественных и зарубежных фирмах по реализации экзотических животных. Паразитологическому обследованию подвергли 355 животных:

• «Московский зоопарк» и частный сектор - 155 экз.;

• «Бион» (Украина) - 50 экз.;

• «АкваЛого» (Москва) - 38 экз.;

• «Аква-экзотика» (Москва) - 42 экз.;

• «Экопарк» (Турция) - 25 экз.;

• «Террария» (Индонезия) - 45 экз.

Для оценки распространения криптоспоридиоза среди животных, обитающих в природе, обследовали 157 рептилий, отловленных на территории Таврийских гор (Турция).

Всех рептилий с подозрением на протозойную инвазию после диспансеризации делили на две группы: 1 группа - неспецифические признаки (анорексия, летаргия, нарушение линьки) и 2 группа -специфические признаки (кровавая диарея, вздутие желудка, регургитация).

Экспериментальное заражение проводили с целью изучения патогенеза, клинической картины и оценки эффективности терапии при криптоспоридиозе рептилий. Материалом для исследований являлись 33 бородатых агам и 30 обыкновенных удавов. Агамы были разделены по принципу аналогов на 2 опытные и 1 контрольную группы по И голов в каждой. Удавы были также разделены на 2 опытные и 1 контрольную группы по 10 голов в каждой.

Для заражения использовали суспензию ооцист криптоспоридий, которые выделяли от больных рептилий и накапливали флотационными методами, применяемыми в паразитологии. В качестве флотационных растворов преимущество отдавали тем, которые позволяли получать наибольшее количество инвазионной биомассы - ооциты возбудителя. Исходный материал, максимально богатый ооцистами, предпочитали получать непосредственно из прямой кишки спонтанно инвазированных животных. Из флотационных растворов использовали смесь Бреза, состоящую из сульфата магния и тиосульфата натрия (плотность раствора 1,25-1,3 мг/см3), насыщенных растворов гипосульфата и поваренной соли, которые заранее готовили, а затем смешивали (плотность раствора 1,3 мг/см3), а также раствора сахарозы (плотность 1,25 мг/см3). Методом центрифугирования полученный изолят ооцист отмывали в 10-кратном объеме воды от флотационного раствора (3 тыс.об./мин. в течение 10 мин). Полученные ооцисты криптоспоридий сохраняли в 0,9 %-ом растворе №С1 с добавлением антибиотиков. На 500 мл физиологического раствора добавляли: 0,2 г цефазолина, 0,2 г метронидазола и 300000 ЕД нистатина, который помещали в холодильник при температуре 4-6 °С. Плотность флотационного раствора подтверждали показаниями ареометра.

Количество ооцист криптоспоридий в 1 мл раствора определяли в камере Горяева, из расчета 1 капля = 0,02 мл. Заражение рептилий проводили орально, для этого использовали суспензию криптоспоридий с содержанием в 1 мл раствора по 200 тыс. ооцист.

В течение всех исследований ежедневно проводили взвешивание рептилий. Наблюдение за общим состоянием животных, состоянием линьки, видимых слизистых оболочек, желудочно-кишечного тракта, частотой дефекации, сердца, осуществляли методом общего осмотра, пальпации и аускультации. Для дифференциальной диагностики от пневмонии проводили

аускультацшо, которая осуществлялась с помощью фонендоскопа и через влажную ткань.

Для испытания эффективности терапии использовали препараты байкокс, бактрим и гипериммунное коровье молозиво, полученное нами от иммунизированных коров в стельный период. С целью иммунизации коров ооцисты криптоспоридий совместно с полным адьювантом Фрейцда вводили животным подкожно, двукратно с интервалом в две недели. Молозиво для дальнейших исследований от иммунизированных животных получали через две недели после второй инъекции. Отобранные образцы фасовали по пробиркам по 10 мл, замораживали и хранили в холодильнике при температуре минус 20 °С. Перед употреблением размораживали при комнатной температуре.

Для гематологических и биохимических исследований кровь брали в объеме до 0,7 % от массы тела из вентральной или дорзальной хвостовой вены. Общий анализ крови (ОКА) проводили на анализаторе ABS Micros. В качестве антикоагулянта добавляли 0,2 мл литиевого или кальциевого гепарина, так как цитрат и ЭДТА в крови рептилий вызывают гемолиз. Окраску мазка осуществляли по Романовскому-Гимза (Васильев Д.Б., 2005).

Биохимическое исследование крови проводили на биохимическом анализаторе VetLab фирмы IDEXX (США) с использованием слайдов и программы подсчетов показателей для рептилий в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Трупы павших животных вскрывали для регистрации патологических изменений и обнаружения криптоспоридий. Патоморфологические исследования кусочков органов (желудок, 12-перстная и прямая кишка, печень, почки) проводили в ветеринарной лаборатории «ГлобалВетНостикс». Материал фиксировали в 10%-м водном растворе нейтрального формалина, после выполнения стандартных гистологических процедур окрашивали гематоксилин/эозином и исследовали на микроскопах Motic Bl, Olympus ВХ 51.

Для прижизненной диагностики криптоспоркдиоза всех животных обследовали копроскопическим методом. Свежие образцы фекалий получали путем массажа толстого кишечника, пальпацией клоаки и катетеризацией копродеума. По возможности свежие фекалии собирали в террариумах. При отсутствии материала для исследований брали смывы из желудка, кишечника и клоаки. Для этого использовали мочевые катетеры, силиконовые зонды и эндотрахеальные трубки маленького размера, которые вводили в кишку на 310 см в зависимости от размера рептилии (Васильев Д.Б., 2005). Затем, вводя 1-2 мл теплого физиологического раствора, перемешивали с помощью массажа брюшной стенки и аспирировали шприцем. Наиболее ценным материалом для паразитологических исследований являлась первая капля (в кончике трубки).

Полученные фекалии и смывы в первую очередь исследовали на наличие простейших методом нативного мазка на микроскопе Lumam-P8 с помощью фазово-контрастного устройства под увеличением в 800 раз с

добавлением жидкости Натта-Геррика, применяемой в клиниках для подсчета клеток крови у рептилий и птиц. Для дифференциальной диагностики жгутиковых высушенные мазки кала окрашивали красителем Diff-Quick (азур/эозин). Раствором Люголя окрашивали цисты амеб, что значительно облегчало подсчет ядер в цисте. Идентификацию кокцидий до рода проводили на основании морфологии спорулированных ооцист. При обнаружении не спорулированных ооцист кокцидий проводили инкубирование фекалий в бихромате калия в течение трех суток. При исследовании нативных мазков также визуально оценивали качественный состав микрофлоры кишечника.

Для выявления интенсивности зараженности криптоспоридиями окраску мазка кала проводили кислотоустойчивыми красителями по Цшно-Нильсену, краску PAS (перийодная кислота-реактив Шиффа), а также по методу Киньюн (Kinyoun) по общепринятым методикам.

Видовой состав и морфологию ооцист криптоспоридий определяли по описаниям И. Павласека (1999) и Т.К. Graczyk (2004), по консультациям с профессором «ВИГИС» В.Ф. Никитиным и ведущим герпетологом Московского зоопарка, доктором ветеринарных наук Д.Б. Васильевым.

Интенсивность выделения ооцист с расчетом на 1 г фекалий определяли степенью инвазированиости животных в крестах: «+» (слабая) - 1-5 ооцист в поле зрения (50000-500000 в г/фекалий); «++» (средняя) - 6-10 ооцист (550000-1000000 в г/фекалий); «+++» (сильная) - более 10 ооцист в поле зрения (свыше 1000000 в г/фекалий) при микроскопии с увеличением в 600 раз.

Измерения ооцист производили с помощью окулярного микрометра, представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм на микроскопе Micros MC 100, с помощью компьютерной программы MVC-3000 с видео-захватом и линейки измерения, с расчётом 1 микрон = 20 пикселей. Также определяли индекс формы -отношение длины к ширине.

Отбор проб ооцист с поверхности террариумов и их паразитологическое исследование проводили в соответствии с нормативно-методическими документами: МУК 4.2.796-99 «Методы санитарно-паразитолошческих исследований»; МУК 4.2.735-99 «Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов».

Результаты исследований обрабатывали методом статистического анализа с использованием программного обеспечения Microsoft Office 2010, программ «SPSS» и «Statistika».

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Распространение криптоспоридиош рептилий в г. Москва

Для оценки распространения криптоспоридиоза было исследовано 155 рептилий из коллекции Московского зоопарка, а также животных,

поступавших на прием в ветеринарные центры города Москвы: 95 ящериц и 60 змей.

Среди обследованных 155 животных с характерными клиническими проявлениями криптоспоридиоза было обнаружено 85 рептилий - 46 ящериц и 39 змей, а с неспецифическими признаками было выявлено 70 рептилий - 49 ящериц и 21 змея. Среди 46 ящериц с клиническими признаками ооцисты криптоспоридий были выявлены в мазках у 42 животных, а среди 39 змей - у 35 животных. Среди рептилий с неспецифическими признаками, ооцисты криптоспоридий были выявлены: из 49 ящериц-у 36, из 21 змей-у 17.

Экстенсивность инвазии среди всех обследованных ящериц с неспецифическим признаками составляет 73,4 %, и 91,3 % - со специфическими, а среди змей - 80,9 % в первой группе и 89,7 % — во второй группе. Среди 70 рептилий с неспецифическими признаками ооцисты криптоспоридий выявлены у 53 экземпляров, что составляет 75,7 %, а со специфическими признаками - среди 85 рептилий - у 77 экземпляров, что составляет 90,5 %.

Всего из 155 животных, ооцисты криптоспоридий были выделены у 130 животных, что составляет 83,8 %.

Суммированные данные приведены в табл. 1.

Таблица 1

Экстенсивность инвазии криптоспоридиями рептилий в городе Москве

Отряд Группа 1 (неспецифические признаки) % Группа 2 (специфические признаки) %

рептилии обследовано заражено обследовано заражено

рептилии рептилии

Ящерицы 49 36 73,4 46 42 91,3

Змеи 21 17 80,9 39 35 89,7

Всего 70 53 75,7 85 77 90,5

2.2.2 Зараженность разных видов рептилий криптоспоридиями

Различные виды рептилий, как известно, обладают разной иммунной устойчивостью к тем или иным болезням. К криптоспоридиозу более чувствительны королевские питоны, молочные змеи, маисовые полозы, молодые обыкновенные удавы и кобры различных видов, агамовые, гекконы, хамелеоны различных видов, игуаны, вараны, сцинки (Васильев Д.Б, 2005).

С неспецифическими признаками среди 36 ящериц ооцисты были выделены у: 10 йеменских хамелеонов, 3 хамелеонов Парсона, 1 хамелеона Меллери, 9 бородатых агам, 3 капских варанов, 6 эублефаров, 3 земляных гекконов, 1 синеязыкого сцинка.

Среди 17 змей с неспецифическими признаками криптоспоридии были обнаружены у: 6 обыкновенных удавов, 7 маисовых полозов, 2 гадюк Рассела, 1 водяной змеи, 1 коралловой змеи.

Среди 42 ящериц с клиническими признаками ооцисты были выделены у 20 йеменских хамелеонов, 10 бородатых агам, 8 эублефаров, 1 шипохвоста, 1 капского варана, 1 бананоеда и 1 земляного геккона.

Среди 35 змей с клиническими признаками ооцисты выделили у 11 обыкновенных удавов, 9 маисовых полозов, I сетчатого питона, 4 гадюк Рассела, 1 тигровой змеи, 4 молочных змей, 2 египетских кобр и 3 щитковых кобр.

Наибольший процент инвазии наблюдается у йеменских хамелеонов, бородатых агам, обыкновенных удавов и маисовых полозов. Очевидно, что в условиях неволи эти виды являются самыми чувствительными к криптоспоридиозу.

2.2.3. Сравнительное распространение криптоспоридиоза среди

диких рептилий и рептилий, содержащихся в торговых фирмах

Для изучения паразитарной ситуации в крупных центрах по поставке, карантинированию, разведению и реализации экзотических животных, в том числе и рептилий, было проведено паразитологическое обследование разведенных в неволе животных - «Бион» (Украина), «АкваЛого» (Москва), «Аква-экзотика» (Москва), «Экопарк» (Турция), «Террария» (Индонезия), а также рептилий, отловленных в природе (на территории Таврийских гор, Турция).

Среди змей было обнаружено: «Аква-экзотика» - 3 из 12, что составляет 25 % от числа обследованных, «Аквалого» - 5 из 7 (71,4 %), «Бион» - 4 из 10 (40 %), «Экопарк» - 2 из 10 (20 %), «Террария» - 6 из 15 (40 %).

С характерными признаками среди змей, соответственно: «Аква-экзотика» - 4 из 10, что составляет 40 % от числа обследованных, «Аквалого» - 7 из 13 (53,8 %), «Бион» - 5 из 10 (50 %), «Экопарк» - 3 из 5 (60 %), «Террария» - 2 го 5 (40 %).

С неснецифическими признаками среди ящериц было обнаружено: «Аква-экзотика» - 4 из 9, что составляет 44,4 % от числа всех обследованных, «Аквалого» - 6 из 10 (60 %), «Бион» - 7 из 13 (53,8 %), «Экопарк» - 3 из 6 (50 %), «Террария» -4 из 12 (33,3 %).

С характерными признаками среди ящериц, соответственно: «Аква-экзотика» - 9 из 11, что составляет 81,8 % от числа всех обследованных, «Аквалого» - 5 из 8 (62,5 %), «Бион» - 11 из 17 (64,7 %), «Экопарк» - 2 из 4 (50 %), «Террария» - 6 из 13 (46,1 %).

С неспецифическими признаками всего было выявлено 42 животных из 104, что составляет 40,3 % и с характерными признаками 53 из 96, что составляет 55 %.

Всего из 200 животных ооцисты криптоспоридии были выявлены в мазках фекалий у 95 экземпляров, что составляет 47,5 %,

В результате копрологического обследования среди 157 отловленных диких рептилий было установлено, что ооцисты криптоспоридий чаще выделялись в мазках фекалий у степных агам - у 23 экземпляров, турецких хамелеонов - у 18 экземпляров, листолапых гекконов - у 7 экземпляров, балканских гекконов - у 5 экземпляров, желтопузиков - у 3 экземпляров.

В мазках фекалий обнаруживали от 2 до 10 ооцист в одном поле зрения у степных агам, от 2 до 6 - у турецких хамелеонов, от 1 до 5 - у гекконов и желтопузиков. Следовательно, интенсивность выделения ооцист была слабая на «+» - 50000-500000 в г/фекалий или средняя на «++» - 550000-1000000 в г/фекалий.

Нехарактерные клинические признаки криптоспоридиозной инвазии (истощение, дегидратация, нарушения линьки) были обнаружены у 7 степных агам, 9 турецких хамелеонов, 3 листолапых гекконов.

Всего ооцисты криптоспоридий были обнаружены у 56 рептилий из 157 обследованных, что составляет 35,6 %.

2.2.4. Зараженность рептилий другими видами простейших желудочно-кишечного тракта

В желудочно-кишечном тракте рептилий можно обнаружить около 12 родов жгутиковых, 5 из которых встречаются исключительно у ящериц. Большинство из них условно патогенные паразиты (Васильев Д.Б., 2005),

Из семейства Тгю1готопасИс1ае наиболее распространенными оказались два рода паразитов: Мопосегсотопая и ТгИгюкотопая. Из всех обследованных рептилий они были выявлены у 68 % рептилий (рис. 1).

Рис.1. Интенсивная инвазия жгутиковыми семейства ТпсЬотопасИае у агамы (нативный препарат, х 800)

Представители трипаносом рода ЬерЮтопая были диагностированы среди хамелеонов коллекции зоопарка, что составило 11 % от всех обследованных животных.

Кокцидии были обнаружены у 23 % обследованных животных. Выявлены: отряд Еисосс1сИа, семейство ЕтегМае представляли четыре рода Асгоежег1а, Ско1еое1тег1а, Етег1а и Ьозрога.

Амебиаз диагностировали в нативных мазках у 6 % рептилий. Среди 157 отловленных рептилий-природников (на территории Таврийских гор, Турция) было обнаружено:

Амебиаз диагностировали у 2 желтопузиков, 18 средиземноморских черепах, 12 агам, 8 полозов. Преимущественно амебиаз наблюдался у украшенного полоза и кавказкой агамы.

Кокцидии были выявлены преимущественно у 13 болотных черепах, 9 средиземноморских черепах, 2 водяных кошачьих змей, 28 степных агам, 6 кавказских агам, 3 желтопузиков, 4 средиземноморских гекконов, 14 европейских хамелеонов, 2 прытких ящериц, 1 слепозмеек, 3 песчаных удавчиков (рис. 2).

Рис. 2. Ооцисты Eimeriidae sp. в фекалиях болотной черепахи (нативный препарат, х 1 ООО)

2.2.5. Диагностика криптоспоридиоза и оценка жизнеспособности ооцист с объектов внешней среды

Копроскопические исследования проводили в динамике. При регулярном питании дефекация у змей осуществлялась, в среднем, каждые 1014 дней. Исследование фекалий дает наилучшие результаты, если материал берут из крупных порций кала. Искусственное кормление с последующим лаважом желудка змей в 3 раза более чувствительный метод, чем исследование кала, так как после кормления концентрация ооцист в содержимом желудочно-кишечного тракта значительно увеличивается.

Для диагностики криптоспоридиоза рептилий использовали метод фазово-контрастной микроскопии нативных мазков (с увеличение х 800 раз) смывов из желудка и смывов из клоаки с добавлением 3 капель жидкости Натта-Геррика. Ооцисты криптоспоридий в препарате выглядели как

округлые и овальные шары, с розоватым ореолом, размером 4,5-5,5 мкм, внутри которых обнаруживали свободно лежащие спорозоиты и в большинстве случаев находили остаточное тельце. Дрожжевые клетки -меньшего размера (2,5-4,0 мкм) и будут иметь ярко-желтый светящийся ореол. Данный метод является нетрудоёмким, быстрым в исполнении и по результатам наших исследований позволяет выявлять 70 % инвазированных рептилий при однократном исследовании.

При окраске по PAS ооцисты криптоспоридий приобретали ярко красный или малиновый цвета на фоне розового препарата толщина оболочки и границы четко просматривалась. Полярная крышечка и спорозоиты часто не визуализировались.

Из используемых методов окраски для изучения морфологии ооцист наиболее оптимальным мы считаем метод по Циль-Нильсену, так как он является нетрудоемким, быстрым в исполнении и позволяет оценивать состояние ооцист, визуализировать спорозоиты и дифференцировать ооцисты до вида.

В искусственной подстилке, предметах уборки, в смывах с террариумов и мазках-отпечатках с разных частей тела животных оценивали сохранность возбудителя во внешней среде.

В результате исследований было выявлено, что из 16 смывов с поверхности террариумов, жизнеспособные ооцисты были обнаружены в 12 образцах (8 - в террариумах со змеями и 4 - с ящерицами). Среди 32 положительных смывов с искусственных ковриков живые ооцисты были обнаружены в 28 образцах (20 - у змей, 8 - у ящериц). Из 11 смывов с поверхности столов и предметов уборки, живые ооцисты были обнаружены в 5 образцах. Среди 22 положительных смывов с поверхности тела, живые ооцисты были обнаружены в 16 образцах (7 - со змей и 9 - с ящериц).

2.2.6. Морфологический полиморфизм ооцист криптоспоридий у разных видов рептилий

Окрашенные ооцисты четко выявляются на фоне других компонентов мазка, однако при этом нередко полностью экранируется внутреннее содержимое ооцисты: спороциста, спорозоиты, остаточное тело. В связи с этим при идентификации криптоспоридий на первое место выступает размерная характеристика ооцист - длина, ширина, индекс формы (отношение длины к ширине).

По морфологии все ооцисты, выделенные от регггилий, гладкие, покрытые оболочкой, разного размера, сферические или округлые, с характерной «крышечкой» на верхнем конце, содержат по четыре удлиненных спорозоита и остаточное тельце.

Следует отметить, что ооцисты, выделенные нами от змей, более крупные и овальные - Cr. serpentis (рис. 3), чем ооцисты, полученные от ящериц, которые меньше по размеру и имеют округлую форму -СУ. saurophilum (рис. 4).

Рис. 3. Ооцисты в фекалиях питона (окраска по Циль-Нильсену, хЮОО)

Рис. 4. Ооцисты из желудка варана (окраска по Циль-Нильсену, хЮОО)

Исследование ооцист криптоспоридий по морфологическим критериям позволяет нам достоверно разделить их на 3 группы: 1 - змеиный (СУ. serpentis), 2 - ящеричный (Cr.saurophilum) и 3 - возможно новый вид. Однако для окончательного заключения о существовании 3-го вида Cryptosporidium у рептилий, отличающегося по морфологии ооцист, необходимо исследовать больше изолятов от различных видов рептилий.

Анализ ооцист по совокупности трех показателей (длина, ширина и индекс формы) у разных представителей трех отрядов хозяев-рептилий показал, что размеры и форма ооцист значительно варьируют между таксонами (F(6,338)= 14,6, р<0,00001). Статистический анализ изменчивости отдельных показателей показал, что длина ооцист не зависит от таксономической принадлежности хозяина и одинакова у ящериц, змей и черепах (F(2,172)=0,40, 3=0,7, NS). Ширина ооцист различается у представителей разных отрядов (F(2,171)=3,98, р=0,02) и у змей она достоверно меньше, чем у ящериц (тест Тьюки, р=0,033) и меньше, чем среднее для всей выборки хозяев.

Индекс формы как интегральный показатель демонстрирует еще более заметную достоверную изменчивость у хозяев разных отрядов (F(2, 172)=8,97, р=0,0002). При этом ооцисты змей оказываются более вытянутыми и по индексу формы достоверно отличаются как от ооцист ящериц (тест Тьюки, р<0,0001), так и черепах (тест Тьюки, р<0,0001) и заметно превышают среднее значение по всей выборке хозяев. Индекс формы черепах и ящериц достоверно не различается (тест Тьюки, р=0,9).

Размерные показатели ооцист и индекс формы позволяют дифференцировать криптоспоридий, инвазирующих змей-хозяев от паразита ящериц и черепах: у змей ооцисты меньшей ширины и имеют более вытянутую форму. Особенно маленькие размеры ооцист характерны для представителей трех видов: шипохвоста украшенного (Uromastyx ornata), новогвинейского колючего сцинка (Ttribolonotus gracilis) и египетской кобры

{Naja haje). Это может указывать на существование ещё одного вида криптоспоридий, отличающегося более мелким размером и индексом формы.

2.2.7. Изучение клинического статуса при экспериментальном криптоспоридиозе рептилий

Угнетенное состояние у рептилий сопровождалось отказом от корма, отдышкой, «стрессуемой» окраской, признаками метеоризма, иногда угнетение сменялось беспокойством или агрессией. Главным признаком было изменение актов дефекации, которые учащались на пятые или шестые сутки опыта. Иногда диарея была с примесями слизи и имела неприятный запах. Угнетение животных нарастало до 5 дней и сохранялось до 14-16 суток. На шестые сутки опыта появились болевые признаки в области желудка и кишечника. Некоторые рептилии принимали неестественные позы, испытывали беспокойство, некоторые проводили долгое время непосредственно под лампой накаливания или на теплых камнях, прижимаясь к ним верхней областью живота. Чешуя теряла первоначальную яркость и блеск, появлялась мышечная дрожь и бледность слизистых оболочек. У многих рептилий на 14-15 сутки эксперимента появились характерные «чётки» рёбер по бокам тела. У двух агам на 8-9 сутки появлялась кровавая диарея. У трех удавов после приема пищи на 2-3 сутки появлялась отрыжка или регургитация. У двух других удавов на 20-25 сутки появилось характерное вздутие тела в области желудка. Прогрессирующее истощение рептилий наблюдалось в течение всего эксперимента.

2.2.8. Гематологические и биохимические изменения крови

Пресмыкающиеся имеют ряд особенностей в строении форменных элементов крови рептилий. Главное, все клетки, как у рыб, гггиц и амфибий, имеют ядра. Кроме того, в разных группах рептилий имеются значительные различия в морфологии циркулирующих клеток, физиологических нормах гематологических и биохимических показателей (Васильев Д.Б., 2005).

Нами установлено, что количество лейкоцитов в организме подопытных удавов составляло 33,6±1,5х103/мкл, а в крови контрольных животных 25,4±1,9х103/мкл, т.е. на 8,4±0,4х103/мкл больше. Количество гетерофилов в крови контрольных животных - 26,0±1,9 %, а в подопытной составляло в среднем 28,0±1,8 %, что на 2,0±0,1 % больше. Содержание лимфоцитов в крови подопытных животных составляло 46,0±5,3 %, в то время как у контрольной было 50,0±5,8 %, что меньше на 4,0±0,5 %. Количество лимфоцитов, моноцитов, базофилов, азурофилов в подопытной группе удавов также было понижено. Содержание гематокрита в крови контрольных животных 37,0±3,1 %, а в подопытной 20,0±2,2 %, что на 17±0,7 % меньше. В организме подопытных рептилий содержание эозинофилов составляло 15,0±1,6 %, а у рептилий в контрольной группе 13,0±1,1 %, т.е. на 2,0±0,5 % больше.

По результатам биохимического анализа установлено, что содержание глюкозы в крови подопытных животных составляло 2,2±0,2 ммоль/л, а в крови контрольных животных 3,8±0,3 ммоль/л, что на 1,6±0,1 ммоль/л меньше. Количество мочевины в крови подопытных удавов составляло 9,3±0,8 ммоль/л, а в крови контрольных рептилий 7,6±0,5 ммоль/л, т.е. на 1,7±0,3 ммоль/л больше. Содержание мочевой кислоты в контрольной группе было 345,0±31,2 ммоль/л, а в подопытной 438,0±39,2 ммоль/л, что больше на 93,0±8,0 ммоль/л. Содержание в AJIT и ACT в крови подопытных животных было больше на 11,0±1,3 ЕД/л и на 8,0±0,6 ЕД/л, соответственно, чем в контрольных группах. Количество кальция в подопытной группе было 4,2±0,4 ммоль/л, что меньше, чем в контрольной на 1,2±0,2 ммоль/л. Количество фосфора в подопытной группе рептилий увеличивалось на 0,6±0,1 ммоль/л. Количество натрия, калия, хлоридов в крови подопытных животных снижалось на 8,0±0,7 ммоль/л, 0,6±0,1 ммояь/л и 7,0±0,2 ммоль/л соответственно. Содержание холестерина в подопытной группе составляло на 1,1±0,2 ммоль/л больше, чем в контрольной.

2.2.9. Патологошштомическая картина

Основная функция кишки заключается в переваривании и всасывании питательных веществ, кроме того, она выполняет экзокринную, эндокринную, иммунную, моторно-эвакуаторную функции. Структурно-функциональной единицей слизистой оболочки тонкой кишки является комплекс крипта - ворсинка. Сложность функционирования кишки обусловлена гетерогенностью структуры и. архитектоники стенки тонкой кишки. В этой системе имеются определенные динамические взаимоотношения между пролиферирующими, дифференцирующими, функционирующими эпителиальными клетками. Изменения взаимоотношений между этими популяциями клеток, а также темпов обновления в системе, влечет за собой изменения архитектоники слизистой оболочкой тонкой кишки.

Результаты вскрытия змей.

Желудок. Слизистая оболочка желудка утолщена, отечна, воспалена с очагами поверхностных некрозов, просветы железистых крипт сужены, заполнены спущенными клетками эпителия и воспалительным экссудатом, клетки эпителия крипт плохо различимы, с явлениями дистрофии с полиморфными ядрами, многие клетки находятся в состоянии аутолиза. Мышечный слой содержит большую фокальную экспансивную массу некротической ткани с центральной минерализацией и большим количеством бактерий. По границе складки наблюдались петехии, или полосчатые кровоизлияния. Собственная кишечная пластинка инфильтрирована гетерофилами, лимфоцитами, гистиоцитами и макрофагами (рис. 5).

Рис. 5. Гистосрез участка желудка обыкновенного удава Окраска гематоксилин-эозином (ув. 10x40)

Тонкий кишечник. Слизистая деформирована за счет большого количества бокаловидных клеток, десквамирована, ворсинки с полнокровным кровоизлиянием в строму, с поверхности покрыта призматическим кутикулярным эпителием с примесью прозрачных бокаловидных клеток. Просветы железистых крипт свободны. Собственно мышечный слой слизистой оболочки тонкий, местами еле заметен, представлен гладкомышечными волокнами. Подслизистый слой разрыхлен и состоит из однородных округлых желез, переплетен сосудами, а также единичными клетками, состоящими из лимфоцитов и макрофагов.

Печень и желчный пузырь увеличены. Ткань печени набухшая, гепатоциты очерчены слабо, вакуолизированы. Ядра клеток с явлениями полиморфизма, разрыхленные, с сетчатым характером хроматина. Цитоплазма гистиоцитов набухшая, с грубой зернистостью, явлениями выраженной творожистой дистрофии. Система строения долек относительно сохранена, просвет большинства центральных вен расширен, с явлениями гемостаза. В проекции междольковых перегородок имеются скопления из лимфоцитов, гистиоцитов и плазматических клеток.

Почки. Поверхность неровная, светло-красного цвета, корковое вещество малокровно, мозговое вещество отечное, с выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом, ядра клеток разрыхлены, цитоплазма частично набухшая, гиалинизирована, местами с грубой зернистостью, выраженными явлениями дистрофии.

Результаты вскрытия у ящериц.

Желудок. Атрофия слизистой оболочки за счет большого количества бокалловидных клеток, десквамированна, с признаками ослизления апикальных частей. Просвет желез плохо различим, в тонких отделах формируют тубулярные структуры, отсутствие париетальных клеток в слизистой. Подслизистый слой несколько разрыхлен, со слабой клеточной реакцией из лимфоцитов, гистиоцитов. Мышечный слой истончен и представлен тремя пластинами гладкомышечных волокон, идущих в разных

направлениях, в межмышечных пространствах мелкие инфильтраты из лимфоцитов, гистиоцитов и плазматических клеток. Серозный покров тонкий, представлен пластом клеток мезотелия.

Тонкий кишечник. Слизистая с утолщенными укороченными ворсинками, в просвете видны ооцисты криптоспоридий, которые покрыты призматическим эпителием. Бокаловидные клетки представлены прозрачной цитоплазмой, просвет железистых крипт расширен. В просвете крипт имеются следы слизи и единичные спущенные клетки эпителия. Атрофические изменения эпителиальной выстилки кишечника иногда сопровождаются гиперплазией крипт. В строме ворсинок признаки слабого отека. Подслизистый слой разрыхлен, между сосудами встречаются единичные клетки, состоящие из лимфоцитов и гистиоцитов. Мышечный слой представлен двумя слоями гладких мышечных волокон, в межмышечных пространствах встречаются лимфоциты и макрофаги. Серозная оболочка тонкая, представлена клетками мезотелия (рис. 6).

Печень дряблая и увеличена. Желчный пузырь увеличен. Дольковое строение смазано. Грубые дистрофические изменения гепатоцитов, вплоть до некробиоза групп клеток. Синусоиды и межклеточные пространства резко и неравномерно сужены за счет отека и дистрофии гепатоцитов. На гистосрезах обнаруживается гиперхроматин в виде гранул средней, величины. Присутствуют случайные маланомакрофаги. Около кровеносных сосудов скопления лимфоцитоподобных клеток. На периферии дольки найдены очаги микронекроза. По периферии его отмечается зона нейтрофильных гепатоцитов. Эпителиальная выстилка в них представлена кубическим эпителием, в основных протоках выявлена пролиферативная реакция эпителия.

Почки. Поверхность неровная, клубочки в состоянии дистрофии, вплоть до полного гломерулонекроза петель капилляров. Канальцы с тотально выраженными дистрофическими и некротическими изменениями, в части из них в просветах рыхлые цилиндры (десквамированные нефроциты). Стенка

расширенных артериол утолщена за счет плазморрагии, эндотелий капилляров пролиферирует, извитые канальцы атрофированы. Ядра клеток с явлениями полиморфизма.

По результатам наших исследований установлено, что при экспериментальном заражении возникают воспалительно-дегенеративные процессы в стенке желудка у змей и в стенке кишечника у ящериц, в результате чего развивается диарея, приводящая к истощению и гибели животных.

2.2.10. Терапия криптоспоридиозарептилий

Для испытания эффективности терапии использовали препараты байкокс и бактрим, которые в современной ветеринарии часто применяют для лечения криптоспоридиоза у рептилий. А также добавили в схему гипериммуннос коровье молозиво, полученное нами от иммунизированных коров в стельный период. Эффективность терапии оценивали по таким показателям, как продолжительность диареи, периода выделения ооцист и сохранность животных.

Контроль за клиническим состоянием животных и выделением ооцист проводился ежедневно, в течение двух месяцев. Выделение ооцист у инвазированых рептилий начиналось уже на 3-4 сутки после заражения. Животные были угнетены, пропадал аппетит, появлялись симптомы метеоризма, отдышка, диарея.

Первую подопытную группу рептилий лечили с помощь кокцидиостатика байкокс (1 мл/кг, орально, однократно) в сочетании с антибиотиком бактрим (0,6 мл/кг, ежедневно, 5 дней подряд).

Во второй подопытной группе было применено сочетание препаратов байкокс (1 мл/кг, орально, однократно) и гипериммунное коровье молозиво (10 мл/кг, орально, четырехкратно, с интервалом в один день).

После дачи препаратов в первой группе животных выделение ооцист прекращалось на 7-9 сутки. В это время у некоторых подопытных животных появлялся аппетит, прекращалась диарея. Однако на 33-37 сутки после окончания курса лечения отмечали возобновление выделения ооцист. Также следует отметить, что 1 агама и 2 змеи погибли с признаками интоксикации на 9-11 сутки эксперимента.

Во второй группе животных были достигнуты наиболее терапевтически ценные результаты. Нами отмечено, что выделение ооцист прекращалось на 56 сутки после начала терапии, к тому же у всех животных появлялся аппетит и прекращалась диарея. Выделение ооцист не наблюдали в течение двух месяцев. При применении этой схемы в ходе эксперимента ни одна рептилия не погибла. Многие ящерицы стали набирать вес.

В результате эксперимента установлено, что наиболее эффективная схема лечения криптоспоридиоза - сочетание кокцидиостатика байкокс и гипериммунного коровьего молозива.

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

В третьей главе обсуждаются результаты собственных экспериментов с результатами, полученными другими исследователями. Делаются предположения по улучшению эффективности диагностики ооцист возбудителя и терапии криптоспоридиозной инвазии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В условиях зоопарков и крупных коллекций рептилий следует проводить паразитологическое обследование вновь прибывших животных методом фазово-контрастной микроскопии под увеличением в 800 раз с использованием красителя Натга-Геррика. Так же рептилиям необходимо создавать условия, способствующие активному перемещению животных, обеспечивать оптимальный температурный режим, использовать фильтрованную или прокипяченную воду, включать в рацион корма с пониженным содержанием жиров и фосфора.

2. Для успешной терапии рептилий предлагаем использовать сочетание кокцидиостатика байкокс (1 мл/кг, орально, однократно) с гипериммунным коровьим молозивом (10мл/кг, орально, четырехкратно, с интервалом в один день). Дополнительно вводить в схему лечения кристаллоидные растворы и витаминные препараты.

3. Разработанные методические рекомендации можно использовать в практике ветеринарных клиник, зоопарков, частных экзотариумов, а также в учебном процессе ветеринарных факультетов и вузов.

ВЫВОДЫ

1. Ооцисты кршттоспоридий широко распространены в условиях частного зоосектора, носителями возбудителя являются 40 % рептилий, клинические признаки болезни имеют 25 % животных. Болезнь часто приводит к летальному исходу.

2. Определены морфологические характеристики ооцист криптоспоридий у рептилий. Уточнены индексы формы ооцист кршттоспоридий: для змеиного типа - 1,16 (1,08-1,25), для ящеричного типа -1,07 (1,05-1,20).

3. Доказано, наличие паразитических простейших в желудочно-кишечном тракте рептилий, которые могут влиять на течение криптоспоридиозной инвазии. С помощью световой микроскопии выявлены роды простейших: Monocercomonas, Tritrichomonas, Leptomonas, Entamoeba, Acroeimeria, Choleoeimeria, Eimeria и Isospora.

4. Установлено, что популяция диких рептилий на 35 % инвазирована возбудителем криптоспоридиоза, большинство особей является носителями инвазии, что поддерживает существование стационарных очагов инвазии в дикой природе.

5. Доказано, что копрологический метод исследования в нашей модификации с использованием красителя Натта-Геррика и исследование на михроскопе с помощью фазово-контрастного устройства под увеличением в 800 раз является эффективным и выявляет 70 % инвазированных животных при однократном исследовании.

6. Развитие криптоспоридий в организме хозяина сопровождается диареей, анорексией, прогрессирующим истощением, дегидратацией и летаргией у рептилий. Характерными проявлениями криптоспоридиозной инвазии следует считать: «базовую» диарею ящериц, видимое увеличение стенки желудка и отрыгивание пищи у змей.

7. Патогенез при крилтоспоридиозе рептилий подтверждается морфологическими и биохимическими изменениями крови, с увеличением количества лейкоцитов (до 8,4±0,4х103/мкл), мочевины (до 2,2±0,1 ммоль/л), мочевой кислоты (до 93±8,0 ммоль/л), АЛТ (до 11±1,3 ЕД/л).

8. Показано, что патологоанатомическая картина характеризуется увеличением стенки желудка, вызванной гиперплазией слизистой оболочки и гипертрофией туники. Собстве1шая кишечная пластинка инфильтрирована гетерофилами, лимфоцитами и макрофагами. Изменения в деятельности желудка и кишечника связаны с нарушением целостности слизистой оболочки и синдромом мальабсорбции.

9. Доказано, что наиболее эффективной терапевтической схемой является сочетание препарата байкокс (I мл/кг, орально, однократно) и гилериммунного коровьего молозива (10 мл/кг, орально, четырехкратно, с интервалом в один день). После курса терапии выделение ооцист прекращалось на 5-8 сутки и не возобновлялось в течение двух месяцев. У животных появлялся аппетит и прекращалась диарея.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шарова А.О. Диагностика простейших пищеварительной системы рептилий // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания: материалы Международной научной конференции студентов и молодых ученых. -М., МГУПБ, 2009. - С. 241-243;

2. Шарова А.О. Эпизоотологические аспекты криптоспоридиоза рептилий в условиях неволи / Шарова А.О., Гламаздин И.Г. // Российский паразитологический журнал. - М., - 2010. - Вып. № 4. - С. 64-68;

3. Шарова А.О. Морфометрический полиморфизм ооцист криптоспоридий изолированных от различных вцдов рептилий / Шарова А.О., Васильев Д.Б. // Научные исследования в зоологических парках. - М., - 2010. -№26.-С. 109-115;

4. Шарова А.О. Особенности копрологического метода диагностики криптоспоридиоза рептилий // Материалы VIII Международной научной

конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., МГУПБ, 2010. - С. 261-262;

5. Шарова А.О. Биохимические изменения показателей крови при криптоспоридиозе бородатых агам // Материалы IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., МГУПП, 2011. - С. 203-204;

6. Шарова А.О. Распространение паразитических простейших у диких рептилий в Украине и Турецкой республике // Материалы IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., МГУПП, 2011, - С. 270-271;

7. Шарова А.О. Биологические особенности развития возбудителей криптоспоридиоза рептилий / Шарова А.О., Гламаздин И.Г. // Ветеринарная клиника. - Екатеринбург, - 2011. - № 10 (113), - С. 27-29;

8. Шарова А.О. Терапевтические схемы при криптоспоридиозе рептилий / Шарова А.О., Гламаздин И.Г. // Российский паразитологический журнал. -М.,-2012. -Вып. № 1.-С. 117-120;

9. Шарова А.О. Методические рекомендации по лечению криптоспоридиоза рептилий / Шарова А.О., Гламаздин И.Г. // Российский паразитологический журнал. - М., - 2012. - Вып. № 1. — С. 130-131.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 26.04.2012г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" ЯОг/м1. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,50. Тираж 100. Заказ 519.

WWW.FRANTERA.COM

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарова, Анна Олеговна, Москва

61 12-3/923

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

На правах рукописи

Шарова Анна Олеговна

КРИПТОСПОРИДИОЗ РЕПТИЛИИ

(морфо-биологическая характеристика возбудителя, распространение, патогенез, терапия)

Специальность 03.02.11 - Паразитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор И.Г. Гламаздин

Москва

-2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................10

1.1. Характеристика класса рептилий, особенности их пищеварительной

системы............................................................................Ю

1.2. Особенности протистофауны и распространение криптоспоридиоза рептилии..................................................АО

1.3. Цикл развития возбудителя криптоспоридиоза рептилий, особенности патогенеза, терапии и профилактики болезни............30

1.4. Методы диагностики криптоспоридиоза рептилий и их эффективность...................................................................

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45

2.1. Материалы и методы........................................................45

2.1.1. Диагностика криптоспоридиоза..........................................48

2.1.2. Исследование ооцист возбудителя.......................................51

2.1.3. Статистическая обработка данных.....................................52

2.2. Результаты исследований..................................................53

2.2.1. Распространение криптоспоридиоза рептилий в городе

Москва........................................................................

2.2.2. Зараженность разных видов рептилий криптоспоридиями.........55

2.2.3. Сравнительное распространение криптоспоридиоза среди диких рептилий и рептилий, содержащихся в торговых фирмах..........57

2.2.4. Зараженность рептилий другими видами простейших желудочно-

............................59

кишечного тракта......................................................

2.2.5. Диагностика криптоспоридиоза и оценка жизнеспособности

ооцист с объектов внешней среды.......................................64

2.2.6. Морфологический полиморфизм ооцист криптоспоридий у

разных видов рептилий..............................................

2.2.7. Изучение клинического статуса при экспериментальном криптоспоридиозе рептилий........................................

2.2.8. Гематологические и биохимические изменения крови.......

2.2.9. Патологоанатомическая картина..................................

2.2.10.Терапия криптоспоридиоза рептилий...........................

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ВЫВОДЫ.....................................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЕ...............................

..93 104 104 107 .124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Разведение экзотических животных в условиях неволи в последние годы приобретает массовый характер. Среди большого количества людей, живущих в городах, стал популярным класс наземных позвоночных - рептилий, что вызывает проблемы прикладного значения, обусловленные содержанием и разведением экзотических животных в неволе. С каждым годом рептилии занимают все больший коммерческий сектор на зоорынке и на сегодняшний день по обороту денежных средств занимают второе место после птиц среди экзотических животных. Это обусловлено рядом причин. Современные научные достижения расширили возможности фармацевтической отрасли и перерабатывающей промышленности в производстве ядов, ферментов, биологически активных веществ, сырья для кожевенной и пищевой отрасли, что существенно увеличило роль рептилий в экономике данных производств. Помимо этого, развитие террариумистики и любительского содержания рептилий в неволе, увеличение стоимости перевозок, ограничения на отлов в природе и борьба с контрабандным вывозом значительно подняли цены на рептилий во всем мире. Это повлекло за собой появление новых организаций, а также частных лиц, занимающихся содержанием, разведением и эксплуатацией экзотических животных. В условиях частного сектора пункты передержек и реализации черепах, змей, ящериц города Москвы насчитывают сотни экземпляров и десятки видов рептилий. По последним данным только черепах содержится около 300 тысяч, а ежегодное поступление их на рынок составляет примерно 100 тысяч особей. Реальное количество животных в Москве, нуждающихся в лечении или квалифицированной консультации, может превышать 200 тысяч. Значительную долю патологий рептилий, содержащихся у любителей, занимают травмы (18 %) и паразитарные болезни (23 %). Животные, попадающие на рынок из дикой природы, практически на 100 % заражены гельминтами и протозойными паразитами

разной степени патогенности. Данные цифры отражают только случаи обращения к врачам по поводу паразитарных болезней. По подсчетам ветеринарных специалистов США, в страну ввозят до 800 000 игуан ежегодно, и одновременно содержится около 4,5 млн. рептилий (Васильев

Д.Б., 2005).

Ветеринарные специалисты вынуждены больше внимания уделять экзотическим животным, результатом чего явился ряд публикаций по их болезням. Однако многие аспекты патологии рептилий, в том числе вызываемой простейшими паразитами при содержании животных в неволе, изучены недостаточно. Протистофауну рептилий в местах их естественного обитания исследовали многие авторы в нашей стране и за рубежом (Fantham Н.В., Porter А., 1950; Osman Hill W.C. et al., 1960; Kutzer E., Grunberg W., 1965; Levine N.D., 1980; Frye F.L., 1991; McKenzie W. et al„ 1995; Jacobson E.R., 2007). Однако в зоопарках эта проблема изучена недостаточно. Вместе с тем, в крупных коллекциях количество рептилий обычно превышает 200 видов и насчитывает 700 экземпляров. Разные виды рептилий поступают в зоопарки из многих регионов тропического и субтропического поясов, а также от различных фирм-поставщиков и посредников. В связи с этим протистофауна рептилий, содержащихся в неволе, может быть многообразной и отличаться от естественной. Паразитические простейшие могут вызывать существенные патологические состояния животных. Одной из самых проблемных в этой группе болезней является криптоспоридиоз.

Эта болезнь описана более чем у 80 видов рептилий. Криптоспоридиоз в настоящее время является большой проблемой в крупных коллекциях рептилий. По данным зарубежных авторов падеж животных в зоопарках от криптоспоридиоза составляет больше 25 % (Upton S.J. et al., 1989; Cranfield M.R. et al., 1999; Frye F.L. et al, 1999; Graczyk Т.К., 2004; Jacobson E.R.,

2007).

До настоящего времени многие вопросы криптоспоридиоза рептилий остаются не изученными - распространение возбудителя в условиях частного

сектора, клиническая картина у разных видов рептилий, патогенез, дифференциальная диагностика, терапия и профилактика криптоспоридиоза. Вопросы терапии криптоспоридиоза рептилий изучаются, в основном, зарубежными авторами. В литературе имеются данные о применении современных противопаразитарных средств. Но, к сожалению, пока не разработано успешной схемы лечения и рекомендаций по профилактике криптоспоридиоза. В нашей стране с учетом специфики содержания рептилий в условиях зоопарков, климатических и других особенностей вопросы биологии и патогенеза при криптоспоридиозе представляют

научный и практический интерес.

Таким образом, несмотря на значительное число исследований по протистофауне, а в частности по криптоспоридиозу рептилий, многие аспекты этого направления не освещены в литературе и остаются мало изученными. Некоторые из них явились предметом наших исследований по

теме диссертации.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось изучение

распространения ооцист криптоспоридий рептилий, их биологических и морфологических характеристик, оценка эффективности методов дифференциальной диагностики возбудителей и разработка схем патогенетической терапии при криптоспоридиозе рептилий.

Для достижения обозначенной цели необходимо было решить

следующие задачи:

1. Определить видовой состав протозойных паразитов и

распространение возбудителя криптоспоридиоза рептилий в частном зоосекторе, а также в местах карантинирования, передержки и реализации

крупных партий животных.

2. Изучить морфологические особенности разных типов ооцист криптоспоридий и модифицировать наиболее оптимальный метод дифференциальной диагностики для выявления возбудителя криптоспоридиоза рептилий.

3. Установить особенности биологического развития паразита в организме хозяина и течение патологического процесса при экспериментальном и спонтанном заражении рептилий.

4. Разработать методы специфической терапии криптоспоридиоза

рептилий, содержащихся в зоопарках.

Научная новизна. Впервые исследована паразитарная ситуация в местах передержки и реализации рептилий города Москвы, в крупных частных коллекциях, а также основных зарубежных организаций по импорту рептилий в нашу страну. Получены новые данные о видовом составе протозойных паразитов животных, содержащихся в частном секторе: жгутиковых, амеб, кокцидий. Впервые обнаружены стационарные очаги развития возбудителей криптоспоридиоза, выявлена степень экстенсивности и интенсивности инвазии. Определены морфологические особенности ооцист, полученных от различных видов рептилий. Модифицированы методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза рептилий. Впервые изучены особенности клинического течения болезни у различных чувствительных видов, биохимические изменения показателей крови и патоморфологические изменения в органах при криптоспоридиозе. Получены данные об эффективности предложенных нами препаратов для лечения криптоспоридиоза. Предложена система комплексных лечебно-профилактических мероприятий, которая позволяет проводить системные обследования рептилий в крупных коллекциях.

Практическая значимость. Разработаны методические рекомендации по лечению криптоспоридиоза рептилий (одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» РАСХН, 19 мая 2011г., протокол № 2), которые используется в практике специалистов Московского зоопарка и рекомендованы для организаций, занимающихся содержанием, разведением,

карантинированием и реализацией рептилий.

Проведен мониторинг стационарных очагов криптоспоридиоза рептилий частного сектора города Москвы. Модифицированные методы

лабораторной диагностики простейших у рептилий, а также результаты биохимических исследований крови успешно применяются в практике ветеринарных клиник. Предложена терапевтическая схема лечения криптоспоридиоза рептилий с учетом биоэкологических особенностей

возбудителей из разных таксономических групп.

Полученные результаты явились основой для разработки научных и практических рекомендаций для оздоровления поголовья рептилий, содержащихся в неволе, от криптоспоридиоза.

Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «Московского государственного университета пищевых производств».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распространение возбудителя криптоспоридиоза среди рептилий.

2. Морфо-биологическая характеристика возбудителя и методы прижизненной диагностики криптоспоридиоза рептилий.

3. Течение патологического процесса при развитии возбудителя криптоспоридиоза рептилий.

4. Терапевтические схемы при криптоспоридиозе рептилий.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2008-2012 гг.).

Материалы диссертационной работы доложены на:

- Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», посвященной 80-летию МГУПБ (Москва, 2009);

- VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва,

2010);

- XI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва,

2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации

материалов по кандидатским диссертациям.

Личный вклад автора. Представленная диссертационная работа является результатом четырехлетних научных исследований аспиранта. Основная экспериментальная часть исследований выполнена автором лично. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора кафедры инфекционных и паразитарных болезней ФГБОУ ВПО «МГУПП» И.Г. Гламаздина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. Также выражаем огромную благодарность ведущему герпетологу ГУК «Московский зоологический парк», доктору ветеринарных наук Д.Б. Васильеву за консультации и помощь в проведении экспериментов. Во всех совместных публикациях личный вклад автора составляет не менее 80 %.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика класса рептилий, особенности их пищеварительной системы

Пресмыкающиеся (рептилии) являются первыми настоящими

позвоночными наземными обитателями.

Классификацию хордовых в общем виде можно представить

следующим образом:

тип Хордовые (Chordata) подтип Оболочники (Urochordata)

Бесчерепные (Cephalochordata) Позвоночные (Vertebrata) класс Бесчелюстные (Agnatha)

Пластиножабернообразные (Elasmobranchio-morphi) Костные рыбы (Osteichthyes) Земноводные (Amphibia) Пресмыкающиеся (Reptilia) Птицы (Aves)

Млекопитающие (Mammalia)

Рис. 1. Упрощенное родословное древо рептилий

10

Рептилии - потомки древних амфибий, которые отличаются умением продуцировать амниотические яйца нового типа (основной диагностический признак), что позволяет им размножаться на суше. Они являются первыми

наземными позвоночными.

Современными рептилиями являются, главным образом, ящерицы, змеи и черепахи, которые обитают в тропических областях и не играют существенной роли в фауне умеренных областей. В холодном климате "холоднокровным" животным выжить невозможно, поэтому они не обитают в странах с продолжительной и морозной зимой. Хорошо известно, что мезозойскую эру называют "веком рептилий" (рис. 1). Они дали огромное количество разнообразных морфологических форм, что и сделало их господствующими на Земле. Давно вымерший отряд ШуЬзаипа приобрел усовершенствованный способ размножения, при этом оставаясь

морфологически очень архаичным.

Рептилии появились 260 миллионов лет назад. Они достигли большого разнообразия видов, однако к началу третичного периода большинство из них вымерло. Оставшимся 5 отрядам можно противопоставить, как минимум, 12 вымерших. Из Апарз1с1а осталось лишь 220 видов черепах, из АгсИозаипа -21 вид крокодилов, из Ш1упос11ерЬаНа - 3 вида гаттерий. Только Ьербозаипа, составляющие примерно 6000 видов, сохранились достаточно полно. В то время как некоторые отряды рептилий полностью вымерли, у других эволюция продолжалась далее. С течением времени из отряда ТЬегорз1да развились млекопитающие, а из ТЬесоёопНа, кроме крокодилов, позже

развились птицы (Васильев Д.Б., 2005).

У рептилий эволюционно сложились некоторые особенности в

строении органов пищеварительной системы.

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) рептилий состоит из ротовой полости, пищевода, желудка (включая кардиальный, фундальный и пилорический отделы, а также сфинктеры), тонкого кишечника (включая двенадцатиперстную кишку и плохо дифференцируемые тощую и

подвздошную), толстого кишечника (включая илеоцекальный сфинктер, слепокишечный вырост у некоторых видов, ободочную кишку, прямую кишку) и клоаки.

Пищевод ящериц - эластичная и легко растяжимая трубка, формирующаяся тонкими стенками, которая начинается сразу после глоточного жома. У подавляющего большинства ящериц задняя часть глотки и пищевод сильно пигментированы меланином. На уровне сердца пищевод имеет вид довольно узкой трубки, тянущейся по средней линии вентральнее и параллельно спинной аорте, от которой к нему подходят несколько пар пищеводных артерий. Под базальной мембраной эпителия залегает фиброколлагеновая соединительная ткань, lamina propria разной толщины, гладкомышечные клетки, свободные ореолярные ткани, а также продольные и циркулярные волокна поперечнополосатых мышц. Плоский многослойный или умеренно столбчатый эпителий покрывает грубые продольные складки, образованные подслизилым слоем. Они позволяют пищеводу значительно растягиваться при проглатывании крупного пищевого комка и сильнее развиты у хищных ящериц. В подслизистом слое расположены многочисленные слизистые железы. Их секрет выделяется в просвет пищевода по коротким, выстланным эпителием протокам. Под базальной мембраной залегают также небольшие агрегаты лимфоидной ткани. Снаружи пищевод покрыт тонкой адвентицией (Mader D.R., 1996).

Желудок у голодных ящериц расположен в левой половине брюшной полости, обычно прикрыт печенью и представляет собой относительно неширокую С-образну