Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криптоспоридиоз (диагностика, культивирование Cryptosporidium parvum в клетках тканей, экспресс-оценка препаратов)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Криптоспоридиоз (диагностика, культивирование Cryptosporidium parvum в клетках тканей, экспресс-оценка препаратов)"

г г- ч О Г\

^ ^ -, -- л

1 . . ^ \ С

и 'МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХС-ШЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРПЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ВЕТЕРИНАРПНЯ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 619:818.093.192.1:816-053.2

АЛИЕВ А*и Абакаровяч

КРИПТОСПОРИДИОЗ

< ДАГНОСТЬКА,КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СЙТРТОЗРОРТШиН РАИУЧН В КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ,ЭКСПРЕСС-ОЦЕПКП ПРЕПАРАТОВ)

Специальность: 03 00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учбной степей« кандидата ветертнарнот цауж

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1333 г.

Работа выполнена в Санкт-Петербургском ветеринарном институте, на кафедре паразитологии им.проф.Б.Л.Якимова и проблемной научно-исследовательской лаборатории протозоологии,хозяйствах Ленинградской и Псковской ос :астей.

Научный руководитель: доктор биологически» наук,профессор

Т.й.Шибалова

Официальные оппоненты:

1.Доктор ветеринарных наук.профессор й.И.ятусевич

2.Доктор ветеринарных наук.профессор Ю.П.Илвоечксш Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия имени К.И.Скрябина.

Завита диссертации состоится декабря 1093 года в 11 часов на заседании Специализированного совета Д 120.20.02. Санкт-Петербургского ветеринарного института.

Адрес института:196084,Черниговская ул.,Ь. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского ветеринарного института.

Автореферат разослан /5"~ ноября 1В93 года.

Учёный секретарь специализированного совета.кандидат ветеринарных наук

И.В.Шустрова

1.ОБЩАЯ КПРЛКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Многие годы считалось,что среди протозойных болезней значительный экономический ущерб животноводству наносят кокцидиидо-зы,возбудители которых одна из самых значительных групп паразитических простейших.объединяющихся в классе Sporosoa.THna Apiccmple-ха,подцарство Protosoa.

Наибольший практический интерес приставляют:эймерии,сарко-цисты,токсоплазма.Дза последних возбудителя имеют социально-экономическое значение-они вызывают зоонозные болезни.

В последние годы активно обсуждается еще одна кокцндийная проблема - криптоспоридиоз .привлекая внима е геологов,ветеринарных и медицинских специалистов своей актуаль )стью.Возбудители крип-тоспоридиозов - кокцидии рода Cryptosporidium Туггег, 1910 поражают млекопитающих, в том числе человека,птиц,рыб,рептилий;они распространены во всех странах мира.

Подобно другим кокцидиям,криптоспоридин обладают широкой хо-зяинной специфичностью,одни животные способны заражаться от других,а также циркулировать между животными и человеком,что позволило отнести их к типичному зоонозу.в соответствии с опреде знием ВО? (Anderson W.,1982,Moon Н.19B6;Tzipori S.et.al.,1981-1983;Current К. 1983, Ree-s et. al. , 1982,Moon H.,1982;Hart et.al.,1984,Jokipiil..et. al.,1983,сейер Т.В.,1989).

Установлено,что криптоспоридин вызывают тяжелое заболевание при дисбалансе иммунитета у хозяина,т.е.я.ляются причиной оппортунистических инфекций .отягощающих общее течение болезни. Нанбол.?<> полно этот вопрос изучен при криптоспоридиозе с разными формами иммунной недостаточности (¿ayer.Ungar R.L., 1988;Шибалова Г.А.1907, Алиев А.А. и др.1992).

Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза.он продолжает оставаться значительной актуальной проблемой ветеринарии и медицины.Особенно слабой стороной в изучении ?-гой проблемы явля--е'. :я лечение и профилактика криптоспоридиоза.

Исследователями испытаны с лечебной и профилактической целью многочнеле.нные химические и химико-терапевтические средства.включая кокцидиостатики,антипаразитарные препараты,антибиотики широкого спектра действия.Однако,надёжных средств.полностью удовлетворяющие требованиям терапии и профилактики криптоспоридиоза,пока не найдено

Трудности борьбы с криптоспоридиозом усложняются репродуктивной способностью возбудителя.В 1г фекалий больные криптоспоридиозом телята выделяют во внешнюю среду до 74 млн.ооцист,устойчивых к большинству дезинфицирующих средств и сохраняющих свою инвазиоь ■ ность до года и более (Stein Б.,1983).

Отсутствие надёжных медикаментозных средств,способных воздействовать на развивающиеся эндогенные стадии паразита в организме хозяина,а также на ооцисты криптоспоридий во внешней среде,обуглов-ливлют стимул и большую необходимость поиска новых средств и системы борьбы с криптоспоридиозом.Решение этиt проблем з значительной степени может быть облегчено путём использования модельной системы клеточной культуры,с целью изучения биологии возбудителя, пар,тзп-то-хозяинных отношений,предварительной экспресс-оценки фармакологических средств и механизма их дейстгия в отношении криптоснорндмл.

Актуальность проблемы криптоспооридиоза млекопитающих определила цель и задачи наших исследований. Цедь п. задачи исследований..

Провести изучение методов диагностики криптоспооридиоза,культивирование Cryptosporidium parvum в клетках культуры тканей,получение модельь,й системы (тест-объекта) и проведение экспресс-оценки фармакологических средств in vivo и in vitro.Изучение ультраструктурнсй организации эндогенных стадий С.parvus,пара-зито-хозяинных отношений на лабораторной модели и механизма действия препаратов.

Б соответствии с реализацией поставленной цели были включены для решения следующие задачи:

1.Провести сравнительное изучение методов диагностики крип-тоспоридиоза с использованием лабораторных моделей.модельных систем и спонтанно больных животных.

2.Отработать и усовершенствовать методы получения биомассы возбудителя крилтиспоридиоза млекопитающих о.parvum.

3.Провести отработку методических приёмов эксцистирования споро-титов из слорулированкых ооцист С,parvus) in vitro.

4.Отработать и усовершенствовать в клетках культуры тканей культивирование С.parvum со стадии спорозоитов,эксцистированных in vitro.

5.Изучить ультраструктурную организацию эндогенных стадий C.parvun с помощью методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

6.Разработать методы и методические приёмы экспресс-опенки Фармакологических средств в отношении инвазионных стадий эндогенного развития С.parvum на экспериментальной модели in vWo и in vitro.

7.Изучить влияние иммуностимулятора,а также сочетание" имму-.<оетииулятора с кокцидиосгатическими препаратами -а течение крип-тослоридиозной инвазии у экспериментальных и спонтанно больных животных.

¡¡ауч-нал-нйьилиа.*.

П' »учены данные по сравнительному изучению методов лабораторной диагностики криптоспор^диоза,распространению,возрастной динамике и симптомококплексу болезни телят в некоторых районах Северо-За-:ада (Ленинградской,Псковской обл.).

Отработаны и усовершенствованы методы пс учения биомассы возбудителя криптоспоридноза млекопитающих - Cryptospoiidiu» parvun.Hx обезвреживание от микробной контаминации,получение (эксцистирова-ниё) спорозоитов из слорулированных ооцист in vitro.

Получены новые данные оригинальных исследований по культивированию спорозоитов С.parvum и развитию их в клетках культуры тканей, которые имеют принципиальное значение для более глубокого понимания особенностей жизненного ц>¿ла и паразито-хоэяинных 'отношений у i^иптоспоридий.способности паразита развиваться не только ьа лове гности клетки,но и внутриклет!>чно .

йпервь. для к"1 пьтявировани С.parvum использованы клетки пе-pejjHBsfcMiix тканей пачек теленка - "ТАУРУС-1",которые применяются для вир!соло!ическнх исследований.Клетки ^той линии оказались пригодными для. полного эндогенного развития С. parvut. .начиная со стали» ''ггорозоитоа.

.'..чип характеристики ультраструкгу fiioi! организации эндогенных ■мадин С .{••>)• VJ« с помощью методов сканируют"' и электронной микроско -

пии и ультратонких срезов,а также показаны паразито-хозяинные отношения на лабораторной модели.

Получены новые данные по использовании модельной системы для экспресс-оценки высокоэффективного антикокцидийного препарата с полным спектром действия-стенерола (гсэллофугннона) в отношении эндогенных стадий С.рагуит и показан механизм его действия на лабораторной модели.

Получены новые данные по испытанию иммуностимулятора - лак-толена,а также сочетание иммуностимулятора с кокцидиоцидннм , препаратом при экспериментальном и спонтанном криптоспоридиозе животных.

Предложены в неблагоприятных хозяйствах по криптоспоридиозу новорождённых телят лечебно-профилактические мероприятия с применением иммуиостимулятора-дактолена и сочетанного использования иммуностимулятора с кокцидиостатическими препаратами (стереролом и хи-миркоком),позволившие определить один из реальных путей в системе борьбы с криптоспоридиозом-зоонозом.с учетом вете[инарно-меди-цинского значения.

Отработаны и усовершгнствованы методы получения биомассы возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих на примере Cryptosporidium parvum,a также эксцистирования спорозоитов из спорулированнг'х . ооцист in vitro,их обезвреживание от кишечной микробной контамнна-ции; биомасса инвазионных стадий возбудителя может использоваться для культивирования в модельных системах-клетках культуры тканей ,эмбрионах,в биотехнологии,генной инженерии,для получения диагностических и профилактических средств.

Разработанный метод культивирования криптостпоридий в клетках культуры«позволили получить удобную модельную систему-тест объект для экспресс-оценки различных веществ,с целью поиска антикриптоспо-ридийных средств.

Модельная система-культура клеток позволила проведение экспериментов в стерильных условиях.контролировать степень экспериментальных параметров,а также иметь экономически выгодные условия использования небольшой дозы испытываемых средств,минимального числа экспериментальных 'животных,экономию времени в 2-3 раза.Устраняются ошибки влияния факторов кормления экспериментальных животных,сезона года,внешней среды и других факторов.

Полученные данные характеристики ультраструктурной организации эндогенных и экзогенных стадий" Cryptosporidium parvum и экспресс-оценка кокцидийного препарата стенорола найдут применение в курсах лекций,лабораторно-практич?ских занятиях и будут использованы в соответствующей научной и научно-практической литературе.

Материалы настоящих исследований подготовлены для представления в качестве методических наставлений и заявки ira изобретение.

Материалы диссертации были предстамены на заседании кафедры паразитологии им.проф.Якимова <С-Петербург 1991-1993 гг.),на научных конференциях профессорского-преподавательского состава и аспирантов ветеринарного института (1991, 1.992 гг.),на Международном и Всероссийском съезде протозоологов (Витебск.1992 г.),на Международном паразитоцекологическом съезде (Киев,1992 г.),на IX Интернациональном конгрессе протозоологии (Берлин,1993 г.);на XI конференции Украинского общества паразитологов (Киев 1993 г.).По материалам диссертации опубликовано б работ,в которых изложены основные ре-

зультатц исследований.

Оснонные положения диссертации«выносимые на защиту:

1.0 возбудителе криптослоридиоза животных и методах диагностики болезни.

2.Методы получения биомассы Cryptosporidium parvum и использование клеток культуры тканей для культивирования возбудителя со стадии спорозоитоь.аксцистированных in vitro.

5.Характеристика ультраструктурной организации эндогенных стадий С.parvum с помощью методов сканирующей электронной микроско-пиии и ультратонких срезов;парзито-хозяинные отношения.

4.Экспресс-оценка Фармакологических средств в отношении инвазионных стадий эндогенного развития С.parvum на экспериментальной модели in vivo и in vitro и определение путей в системе лечебно-профилактических мероприятий при криптоспоридиознай инвазии. Ой ртациаянай. .mísxiu

Диссертация изложена на У/У страницах машинописного текста и включает:введение.общую характеристику работы,обзор литературы,5 глэа собственных исследований.обсуждение полученных результатов,выводы .практические предложения.список литературы.Последний включает отечественных и <f¿ зарубежных авторов. Материалы диссертации иллюстрированы ¿ таблицами и рисунками,в том числе электрон-

ног раммами.

2.Собственные исследования. 2.J.Материалы и методы.

Работу выполняли на кафедре Паразитологии им.проф.Якимова, Проблемной научно-исследовательской лаборатории протозоологии в Период 19ЙВ-1ЯЭ1 гг.,а также ь хозяйствах Ленинградской и Псковской областей.

В 10 хозяйствах Ленинградской t. Псковской областей изучена эпизоотическая ситуация и проведано обследование 525 телят в возрасти от J до 45 суток.Для постановки диагноза на криптослоридиоз проводили комплексные исследования.включая микроскопию.Диагноз подтверждали обнаружением ооцисг криптослоридий из фекальных масс в цативных препаратах.используя флотационны" методы или различные методы окраски.Проводили сравнительную оценку методов диагностики кричгоспоридиоза¡лечебно-профилактические мероприятия.

Больные телята подвергались ежедневному клиническому осмотру, проводили анализ крови,Павших животных вскрывали,готовили маз-ки-ооскобы со слизистых оболочек пораженных участков кишечника и других органов;изучали паталогоанатомическуи картину.

Ь экспериментах также были использованы лабораторные живот-ные:50 кроликов,70 новорождённых мышат,25 крысят,25 цыплят.

Заражение лабораторных животных проводили суспензией ооцист Cryptosporidium parvum,полученных методом флотации из фекальных масс больных криптоспоридиозом телят.Б качестве флотационных »ид остей использовались различные насыщенные растворы.

Для изыскания эффективных химиотерапевтических и химиопрофи-лактических средств в отношении криптоспориаиоза испольчовпли :сте -порол (галлоругинон)-иэвеетний "кокцидноцид" полного спектра дел;гвия;химиркок-кокцидиостатический препарат,а также иммуномоду-

Xílr'J р - л.1ктолен.

Дли экспресс - оценки препаратов исмильзог.али клеточные культуры леревинЖ'мих линий попек телёнка '"ГЛУРУС-V ,а также лабораторных

Для изучения возбудителя криптоспоридиоза различных Сталин эндогенного развития .паразито-хозяинн. :х отношений , выяснения меха низма действия изучаемых препаратов проводили электронно-мнкг°ско-пические исследования:метод ультратонких срезов и метод сканирования .

Полученные образцы изучали в трансмиссионном электронной микроскопе ЛЕН-100 СХ (Япония).

2.1.2.Лабораторная диагностика криптоспоридоза.

На обезжиренное предметное стекло наносили каплю фекалий и размешивали .распределяя тонким слоем.В случае густых фокальных масс добавляли каплю воды или физиологического раствора.Мазок сушили на воздухе,при комнатной температуре.Высуиенный мазок фиксировали при +18-20°С метиловым (этиловым)спиртом до его полного испарения (5-10 мин , ).

Нативные препараты готовили по методу Павласека И. ( 1990).

Окраску мазков проводили по мгтоду Циля-Нильсена или Рома-новского-Гимза и другими красителями.

2.1,3.Методы флотации и флотационные растворы,применяете для диагностики криптоспоридиоза и выделение ооцист Cryptosporidium.

Предварительно фекалии животного разводили дистилироваиной водой 1:10, процеживали через сито .гомогенизировали в течение 3-.с' минут.Полученную взвесь центрифугировали в течение 5-10 минут при 1,5 тыс.об/мнн.Надосадочную жидкость сливали,а к осадку добавляли один из флотационных растворов в отношении 1:0,тщательно перемешивали стеклянной палочкой и центрифугировали в том же режиме.Пробирки осторожно вынимали цз центрифуги и по стенке наслаивали столбик дистилированной воды.Затем перемешивали воду с верхним слоем флотационного раствора и наА-<садок отсасывали пастеровой пипеткой.

В некоторых случаях ооцисты с поверхности раствора снимали паразитологической петлёй,без применения дистилированной водн.Для флотации применяли следующие насыщенные растворьпсахарозм,хлорида натрия,аммиачной селитры,хлорида цинка,сульфата магния,смссь Вреза ,а также использовали' спесь насыщенных растворов гипосульфита натрия и поваренной соли,которые готовили путём смешивания,заранее приготовленных растворов,с плотностью 1,3 г/смЗ.Б процессе работы отрабатывали необходимую плотность каждого из растворов для получения оптимального числа ооцист .Плотность Флотационного раствора подтверждалась показанием ариометра.Количество ооцист криптоспори-дий в полученном концентрате опреде-яли в камере Горяева. 2.1.4.Заражение ооцистами криптоспоридий лабораторных кивотных .

В работе использовали кроликов.новорожденных крысят.мыгаат,которых заражали per os суспензией ооцист Cryptosporidium parvtm,выделенных методом флотации из фекалий больных криптоспоридиозом телят.Ооцисты инокулировали лабораторным животным из шприца с вмонтированной плстиковой трубкой.Заражающая доза для мышат составила 10-20 тыс. свеяевыделенных ооцист;для кроликов,крысят и цыплят 50-70 тыс.ооцист на животное.Ежедневно проводили наблюдения за экспериментальными животными,а спустя двое суток исследовали фекалии .

2.1.5.Электронно-микроскопические исследования.

Для сканирующей микроскопии использовли суспензию свободных ооцист,эксцистнропанные in vitro спорозоиты,опытный клеточные куль-

тури,после заражения их спорозоитами,а также кусочки кишечника от экспериментальных животных.Каждый из образцов промывали в 0,1 М какодилатном буферном растворе,рН 7, 2-7,4.;спорозоиты,ооцис1и,суспензия клеток центрифугировали при 1000 об/мин,затем в течение 2-3 минут все образцы фиксировали 3% раствором глутарового альдегида на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,2-7,4,в течение 45 минут.последующая фиксация в 10Х растворе осмия (0г.04) в течение 10 минут.

После фиксации трижды промывали в 0,1 М какодилатном буфере .Обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации <50,60,70,60, 90,96,100 градусов),из абсолютного спирта экспериментальные образцы переносили на столик с тонким слоем специального клея,напыляли золотом в вакуумном испарителг ч!ЕЕ-5С.Образцы исследовали под сканирующим устройством электронного микроскопа ¿ЕН~1000 СХ (Япония).

Ультратонкие срезы готовили на ультратоме ЬКВ-У,контрастировали насыщенным раствором уранил-ацетата.Дополнительное окрашивание срес^в производили раствором цитрата-свинца и исследовали в электронном микроскопе ЛЕМ-ЮО СХ (Япония).

Исследуемый материал обрабатывали по общепринятым методикам ,описан,шм Б.Уикли (1975),с некоторыми модификациями,принятыми в Проблемной Научно-исследовательской лаборатории протозоологии Санкт-Петербургского ветеринарного института.

2.2.Сравнительная оценка различных методов диагностики н крилтосло-ридиоза животных.

Данным способом лучше всего окрашивать мазки из свежего исследуемого материала,т.к.при длительном хранении фекалий возбудитель слаъо воспринимает или не воспринимает краску,может окрашиваться часть клетки.

Эндогенные стадии криптоспоридий соскобах слизистой оболочки кишечника карболовым фуксином не окрашиваются.

Ооцисты криптоспоридий,при данном методе окрашивания,приобретают яркий пурпурный цвет,имеют округлую ил>1 слегка продолговатую форму.с диаметром 5-6 мкм.Иногда внутри окрашенной ооцисты удаётся рассмотреть очертания спорозоитов с тёмнь'чи включениями .Фон и сопутствующая микрофлора окрашены в зелёный цвет.

В то же время,в красноватый цвет могут быть окрашены капельки, жировых веществ или кусочки дебриса,содержащиеся в Фекалиях.

Однако,не все ооцисты приобретают ярко-пурпурный цвет.Часто в мазках наблюдали бледно-розовые или совершенно неокрашенные клетки возбудителя.При использовании качественных красителей данный метод является демонстративным и надёжным для выявления ооцист криптоспоридий.

Этот метод мы считаем также надёжным,позволяющим выявление эндогенных стадий развития паразита.

В препаратах из Фекалий,окрашенных указанным способом.ооцисты Приобретают вид неокрашенных или слабоокрашенных по периферии образований.При внимательном изучении в ооцистрк можно обнаружить спо-роэойты голубоватого цвета с небольшим розовым ядром.

В эндогенной стадии паразиты окрашиваются в голубой или бледно-голубой цвет с тёмными включениями и ярко-розовым (одним или пескол).?:ими,в зависимости от стадии развития) ядром,Данная окраска позволяет дифференцировать меронты,микрп-.иакрогамонты.созревающие и С1?ррртие ооцисты.Окраска препаратов занимает около одного

часа,исследование проводят в иммерсионной системе микроскопа. Исс ле лдддииа-ыахидыих... гшедзаатрз .дгигатд влек нш ад на ишгшиаи

Данный метод исследования может явиться весьма трудным для начинающих специалистов,т.к.отличить ооцисты криптоспоридий от других .сходных по морфологии клеток.содержащихся в фекалиях.бывает непросто.когда интенсивность выделения паразита не велика.

Ооцисты Cryptosporidium представляют собой небольшие округлые образования с тонкой оболочкой.внутри которых находятся 4 бледно-зелёных банановидных спорозоита.Исследование проводится без иммерсии (объектив*40,окуляр*10).

Обнаружение эндогенных стадий паразита в соскобах слизистой оболочки также может быть затруднено,т.к.в кишечном содержи.¡ом находится большое количество разнообразных микроорганизмов.остатков корма,элементов крови и других частиц.Но.поскольку,эндогенные стадии паразита находятся на поверхности эпителиальных клеток,то при высокой степени заражения,этот метод диагностики может быть довольно объективным.

Данный метод исследования нативного мазка является,по наисну мнению,одним из надёжных.точных и быстрых в выполнении.Благодаря флотационному свойству глицерина ооцисты поднимаются в верхние слои препарата,дебрис и микрофлора остаются в нижнем,что облегчает исследование.

При добавлении глицерина в каплю фекалий ооцисты криптоспоридий приобретают слегка розоватый цвет и становятся хорошо различимы.В ооцистах чётко выявляются спорозоиты.Другие простейшие и частицы не обладают свойством менять свой цвет под влиянием глицерина.

Такая окраска оогчст криптоспоридий может исчезнуть через 30-40 минут после приготовления нативного препарата.Однако,этого времени вполне достаточно для исследования,даже при высокой интенсивности выделения ооцист.В связи с этим,необходимо исследовать под микроскопом только свежеприготовленные препараты.Исследование проводится при увеличений микроскопа 40x10.

получения ооцист.

Данный метод чаде всего применяют для выделения я сбора ооцист из исследуемого материала.Было необходимо провести сравнительный анализ различных Флотационных растворов и отдать преимущество позволяющим получить наибольшее количество биомассы возбудителя.

Плотность флотационных растворов подбирали в процессе эксперимента. Применение н<чсыщенного раствора хлорида натрия (плотность раствора 1;18-1,25 г/мл.) приводило к разрушению ооцист в течение 30-60 минут.Ещё более быстрое разрувение ооцист происходило при применении насыщенного раствора аммиачной селитры,В этом случае меняется Форма паразита,разруиается оболочка.Использование указанных растворов существенно сокращает сроки исследования.

В качестве Флотационного раствора была использована смесь Бреэа,состоящая из сульфата: магния и тиосульфата натрия (плотность раствора 1,25-1,3 г/смЗ) этот раствзр не кристаллизуется при хранении, длительное время не нарушает ооцист.Его можно использовать" для получения ооцист.

Были использованы насыщенные растворы хлорида цинка й сульфа-

та магния.Рекомендуемая плотность раствора <1,18-1,20 г/мл).

При нахождении ооцист в этих растворах они не подвергались раэруиеяию в течение 2-3 часов.Указанное время позволяет несколько раз центрифугировать пробы фекалий и получать в процессе исследования массу ооцист.

Использовали такж? смесь насыщенных растворов гипосульфита и поваренной соли,которые заранее готовили,а затек смешивали.Плотность этой смеси 1,3 г/смЗ.

Применение насыщенного раствора сахарозы (плотность 1,25 мг/смЗО имеет преимущество перед другими флотационными растворами,т.к. он является наиболее щадящим по отношению к ооцистам.Оо-цисты практически в течение суток и более не подвержены разрушению.

При использовании этого раствора получали наибольший выход ооцист из Фекалий по сравнению с другими растворами.Взвесь ооцист практически не содержала сопутствующей микрофлоры и Остатков дебриса. Ми отдавали преимущество чаще двум последним методам в нашей экспериментальной работе.

Я процессе получения изолята необходимо контролировать плотность Флотационных растворов,т.к. изменение плотности при снятии ооцист крилтоспоридий может привести к их потере.

Применение указанных флотационных растворов позволяет получить изолят ооцист - биомассу возбудителя.Методом центрифугирования собранный материал в десятикратном объёме водопроводной воды отмывали от Флотационных растворов (3 тыс.об./мин.,в течение 1С минут ). Полученную биомассу возбудителя сохраняли в физиологическом растьоре с добавлением антибиотиков при +4-5 С.

Для получения концентрированного осадка суспензию ооцист центрифугировали.Полученную биомассу ооцист криптоспоридий необходимо бчло освободить от бактериальной 'контаминации и различного дебриса.

В наших экспериментах поду.чение "чистых" .свободных от загрязнений ооцист.необходимой биомассы спорозоитов криптоспоридий получали по методу.описанному Юибаловой Т.А. ( 1983,1969,1974).для кок-иидий рода Eineria.c нашей модификацией.

Для культивирования спорозоитов в клетках культуры требуется большое количество очищенных спорозоитов .свободных от оболочек и различного дебриса.В наших экспериментах спорозоиты были концентрированы и очищены по методу Шибаловой Т. А. (1974,1979) .описанному для кокцидий рода Eimoria.Mu воспользовались некоторыми приемами ,модифицированными для Cryptosporidium.

Всю суспензию после процесса эксцистрирования дробно центрифугировали в тёплом 0.2 М фосфатно-буферном растворе (38-3SJ' С) при 500-800 об/мин.Дебрис осаждался на дно центрифужнсй пробирки,а чистые сиорязоиты оставлись в надосадочном слое.Последний сливали я чис. ук> центрифужную пробирку и освобождали от 'трипсина и желчи дополнительным центрифугированием в тех же режима».Такими.усовершенствованными нами методическими приёмами,получены новые данные ляя малоизученного рода кокцидий Cryptosporidium.

Концентрированную массу спороооитов в мерной центрифужной пробирке разбавляли до необходимого объема стерильной питательной рос uvBC "i средой,той которая использовалась для гсотчетструклчик кле-ioV- гультуры,подсчитывали в камере Горясга и Н'*п< льзпгдли для ?KCtifрим«.ито8 с клеточными культурами.

С целью установления возможности культивирования полученных нами спорозоитов C.parvum были использованы различные клеточные культуры-.первично трипсинизировакиые и перевиваемые линии клеток .Первично- трипсинизированные линии клеток готовили из куриных эмбрионов.посевная доза эмбриональных клеток составляла 600-700 тыс./мл.среды.В качестве перевиваемых линий клеток использовали клетки почек телёнка-"ТАУРУС-1".посевная доза составляла 100-150 тыс.клеток/мл.среды.Клеточная культура "ТАУРУС-1" готовилась в лаборатории клеточных культур Научно-исследовательского Института гриппа РАМН по общепринятым методикам (Антонова Б.И.,1986).

Для получения монослоя во Флаконы с покровными ¿теклами вносили суспензии ростовых культуральных клеток в питательной ростовой среде (по 2 мл.в каждую),клетки выращивали при t-37-38°C в течение 2-4 суток.Когда покровные стёкла покрывались монослоеи клеток, для экспериментов отбирались флаконы с хорошим монослоем на каждом стекле.

Для выяснения возможности развития спорозоитов криптоспориди-дий в клетках культуры из флаконов удаляли ростовую среду и вносили по 2 мл. суспензии опытного материала,состоящего из спорозоитов в питательной среде.Число спорозоитов в экспериментах использовали в пределах 30-50 тыс.на один флакон с монослоем на покровном стскде и помещали для инкубации при t +38-39°С.Спустя 12 часов-время первичного контакта спорозоитов с клетками,экспериментальную среду из флаконов удаляли,а стёкла с клетками мон^слоя тщательно промывали питательной средой.подогретой до 38-30 С,а затем в каждый флакон вносили по 2 мл.новой питательной среды "Игла" и оставляли каждн^ 12 часов;продолжительность наблюдения за ростом и развитием паразита обычно составляла 84-96-108 часов.Для определения развития паразита в клетках культуры через каждые 12 часов покровные стёкла с монослоем клеток фиксировали этиловым спиртом в возрастающих концентрациях :50, 70,80,9В % ¡Фиксированные препарата окрашивали гемз-токсилином-эозином по Гейденгайну.изучали под световым микроскопом МБИ-15 (об.100 ок.10).

2.4. Разработка схем и тгетода экспресс-оценки фармакологических средств в,отношении инвазионных эндогенных стадий Cryptosporidia» in vivo и In vitro.

Для выполнения поставленной задачи были необходимы следующие условия:

а)удобная экспериментпльная модельная система - клеточная культура тканей,а также лабораторные животные.

б)химические препараты,хорошо известные своими антикокцидий-ными свойствами.

в)большой объём биомассы возбудителя - спорулированных ооцнет криптоспоридий;больое число свободных (полученных ин витро) спорозоитов .

В наших экспериментах по установлению возможности использования метода культивирования криптоспоридий в клетках культуры тканей для оценки ангикриптоспоридиозного действия использовались:клетки культуры тканей почек телёнка "ТАУРУС-1".Клетки линии "ТАУРУС-1" не контаминиропаны клетками других животных и человека,а также вирусами и микоплазмами;они гетероплоидны и способны к длительным перевивкам без снижения пролиферативной активности клеток.Монослой клеток выращивался на полосках покровных стёкол,помещённых в пеницияи-

культур

новые Флаконы.Для экспериментов по заражению клеточных использовали свежие полученные спорозоиты криптоспоридий.

В экспериментах использовали 12-15 суточных мышат.В качестве антикокцидийного препарата использовали стенорол (галлофугинон).

Б экспериментах с клеточными культурами.после инокуляции в них спорозоитов криптоспоридий,стенорол вносили в концентрациях 0,01 мк/мл среды,это соответствует рекомендуемой дозе в наставлении к препарату.

Критерием оценки антикриптоспоридиоэной активности стенорола в клетках культуры тканей являлся подсчёт количества развившихся стадий эндогенного цикла паразитов на каждом покровном стекле с хорошо выраженным монослоем клеток.

Оценка эффективности стенорола и лактолена на лабораторной модели-экспериментальных животных определили по выделению ооцист криптоспоридии,начиная с третьего дня после заражения,а также по жизнеспособности животных,по определению иммуного статуса организма. 2.5.Результаты исследований.

2.6.1.Спонтанная криптослорндиозная инвазия у телят.

Основным клиническим признаком крнптоспоридиоза телят является диарея в первые дни жизьи.Фекалии- водянистые с гнилостным запахом приобретают бело-серый цвет.В них содержатся кусочки слизистой оболочки кишечника.прогилки крови.

Животные при. дефикации тужатся,в дальнейшем жидкие массы вытекают самопроизвольно.При заболевании телята почти не принимают пивд и воду.Через несколько дней после появления клинических признаков наблюдали снижение массы тела,отставание е росте.

Телята находятся в угнетенное состоянии.Температура тела в период заболевания повивается,может оставаться нормальной.иногде понижг --тся. Единичные ооцисты появляются'в фекалиях телят на 4-6 день после рождения .Наибольшее количество ооцист Сгур^зроНсНип ра^шп телята выделяют с фекалиями на 8-13 день от рождения.

Динамика выделения ооцист криптоспоридий телятами,в зависимости от возраста,приведена в 'таблице 1.Исследования проведены в 4 хозяйствах Ленинградской и 3 хозяйствах Псковской областей.

Таблица 1.Динамика .выделения ооцист криптоспоридий телятами различного возраста.

1

возраст телят (в сутках)

1-3

4-8т

0-13

14-19

20-30

31-45

кол-во исследованных проб (

из Фекалий|

кол-во положительных проб

15 62 50 44 10 10

I

1

60 50 32 4 1

кол-во отрицательных проб

14 2

12

6 9

наличие ооцист в фекалиях

1 - -

28 24 8

9 30 11

11 18 3

4 - -

1 2 -

Примечание: 6 одном поле зрения микроскопа содержатся : /^/-единичные юцистм,/-»+/-До 25 ооцист,/+++/-&олсе 25 ооцист.

Заболеваемость телят криптоспоридиозом в возрасте 9-13 суток принципиально сходна в исследуемых Хозяйствах и достигает ЮОК.Се-

- u -

эонности в проявлении криптоспоридиоза нами не выявлено.Количество чыделенных ооцист зависит от возраста телёнка.

Наибольшая интенсивность выделения ооцист наблюдалась у телят 9-13 суто-шого возраста.При сопоставлении клнических наблюдений и результатов микроскопии в каждом конкретном случае не удалось установить прямой зависимости клинического состояния телят от количества выделяемых ооцист.Как правило.такие клинические признаки,как профуэний понос.слабость.угнетение состояния отмечали на 6-8 день после рождения телёнка,когда интенсивность выделения ооцист бала разной,даже сравнительно невысокой.В момент наибольиего выделения возбудителя состояния телят частично улучшалось и их уже переводили из индивидуальных клеток в профилакторий.

2.5.2.Паталогоанатомические изменения при криптоспоридиозе телят.

Паталогоанатомическую кар'.-ину изучали при вскрытии 13 телят в возрасте 7-10 суток.Лечение техят специфическими препаратами в хозяйствах не проводили,они получали только отвари дубовой коры и льна .

Восемь телят пали в возрасте 7 суток и пять г десятисуточном возрасте.При вскрытии этих телят мы наблюдали сравн< -ельно сходную патдлоганатомическую картину.

Шерстный покров слипшийся,влажный,загрязнён испражнениями.В подкожной клетчатке отсутствуют жировые отложения.Слизистые оболочки ротовой,носовой полостей,а также поверхность внутренних органов анемичны,& синеватым оттенком.При исследовании органов брюшной полости наблюдали кровоизлияния на серозной оболочке на всем протяжении тонкого кииечника.В просвете кишок находилось жидкое содержимое зеленовато-серого цвета с гнилостным запахом.Толстый кишечник бледный .содержимое или отсутствует,или серо-жёлтого цвета,жидкое.Кезек-териальние лимфатические узлы слегка отечны,серого цвета.Днальное отверстие полуоткрыто,слизистая оболочка красновато-серого цвета.Из кишечника,сердца,пече'ни,трахеи готовили мазки-отпечатки,

Установлено,что крилтоспоридии локализуются в повздошной кивке, где находили значительное количество возб/дителя разных эндогенных стадий и ооцис^ы Cryptosporidia parvum.Большое количество ооцист обнаруживали в содержимом, толстого кишечника и слепого отростка,» также и в прямой кишке.

2.6.Экспериментальный криптоспоридиоэ лабораторных животных.

Моделью для воспроизведения и изучения криптоспоридиозной инвазии служили беспородные белые мыши и крысы в возрасте до 20 дней.Доза заражения для мышат и крысят была постоянной в течение всех опытов и составляла 20-50 тыс.ооцист на животное соответственно .Криптоспоридиями были заражены одно- и семидневные цыплята,в дозе 50 тис. ооцист на каждого цыплёнка.

Со второго дня после заражения всех животных обследовали .ю методу И.Павл-сека (1980) на наличие ооцист криптоспоридий в фекалиях .

В течение всего исследуемого периода /25 дней/ выделения оэ-будителя с фекалиями у экспериментальных цыплят не установлено.это позволило нам подтвердить имеющиеся данные,что данный вид криптоспоридий принадлежит к Criptoaporidiua parvum,а цыплята не восприимчивы к данному возбудителю.Летального исхода у мышей или крые не отмечали.инвазия протекала без выраженного сммломокомплекса болезни .

Мншпта выделяли ооцисты С.parvum на 4~? сутки,а крысята на

4-5,после заражения .1{орфологически ооци :ты,полученные от лабораторных животных,не отличались от ооцист.полученных от телит.Лик выделения ооцист преходился на 8-10 сутки после заражения.В это время в одном поле зрения микроскопа обнаруживали более 25 ооцист.Затем количество их снижалось и на. 12-15 день обнаруживали в фекалиях единичные ооцисты.Латентный период выделения ооцист криптоспоридий составлял 14-16 суток.

Интенсивность инвазии оценивали в нативных препаратах по среднему количеству ооцист в 10 полях зрения йикрсопа.Эа слабую интенсивность принимали обнаружение.единичная /1-4/,за среднгою-5-25 и за высокуи-более 25 ооцист.

Такой же расчёт интенсивности криптоспоридиозной инвазии использовали и в дальнейшей нашей работе.

Животных убивали в динамике развития заболевания /на 2,5,7,10,15 сутки после заражения/.Готовили соскобы из различных органов /желудок.тонкий и толстый кишечник,слепая кишка,печень,селезёнка, лёгкие/ и окрашивали по методу Романовского-Гимза.Часть материала обрабатывали для исследования в электронном микроскопе.

Эндогенные стадии криптоспоридий локализировались,главным образом в подвздошной кишке.При заражении 4-х дневных крысят удвоенной дозой обнаруживали эндогенные стадии развития паразита в 12-лерстной и тощей кишках.Каких-либо патологических изменений в органах заражённых животных при вскрытии не выявляли. 2.7.Культивирование спорозоитов Cryptosporidium parvun.полученных in vitro и изучение их развития в клетках культуры тканей.

В работе использовали возбудитель криптоспоридиоза телят,выделенный от спонтанно больных животных,в неблагополучных хозяйствах Ленинградской и Псковской областей.

В проведённых экспериментах по использованию для клеточных культур культивирования спорулированных ооцист получены отрицательные результаты.Эксцистирование спорозоитов из спорулированных .ооцист в культурах клеток не происходило,они оставались бгз изменений, не претерпевая дальнейшего развития.Установлена способность вызывать заболевание Ю-суточных мшат при введении им таких ооцист.

Клетки культуры тканей,в которых находились ооцисты криптоспоридий разрушались быстрее,чем контрольные и в некоторых из них • отмечали дегенеративные изменения клеточного монослоя¡вакуолизацию клеток,пикноз и кариорексис ядер и т.д.Это даёт основание предполагать, что продукты .жизнедеятельности ооцист криптоспоридий могут быть токсичными для культур клеток.

Заражение C.parvun клеток культуры тканей было возможным ' только после инокуляции в них спорозоитов,эксцистированных. in vitro.

Из испытанных клеточных культур,приготовленных из фибропластов куриных эмбрионов,почки морской свинки.почки телят "ТАУ-РУС-1" и "Нер-2".наиболее полно отвечали требованиям культивирования спорозоитов C.parvun клетки перевиваемых линий почки телят "ГА-УРУС-1".Спорозоиты наблюдали внутри этих клеток ухе в первые 30 мин.,и этот гроцесс был активным в течение 5-ти часов,а затем темп их внедрения замедлялся .Показано,что внедрившийся в цитоплггму клетки спорозоит ра:полагался вблизи ядра.Иногда можно было наблюдать как бы вдавливание спорозоита в ядро клетки-Иногда, в одной клетке находилось два и более спорозоитов .Нами, установлено,что до-

-льстпом присутствия- спорозоита Енутри клетки хозяина является наличие плразигорнзй вакуоли, которая окружала паразита tie только на

стадии спорозоита.но и в процессе его дальнейшего развития.

Контроль за развитием паразита в клетках культуры осуществляли каждые 12 часов.продолжительность наблюдений обычно составляла 84-108 часов.В этот период времени удалось наблюдать все эндогенные ■ стадии развившихся криптоспоридий:трофозоиты,меронты,а также спору-лированные ооцисты.

2.8.Электронно - микроскопические исследования эндогенных стадий Сгур1озрог1<Иио рагуцо и ультраструктурные изменения кишечника у экспериментально з.1ражйшшх лабораторных животных.

В работе использовали новорождённых мышат и крысят,которых в суточном возрасте заражали спорулированными ооцистами С.рагуцш в дозе 10-20 тыс. - мышатам;50 тыс.- крысятам.

Исследования заражённых животных проводили методом сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.Для этого заражённых животных убивали в динамике развития криптоспоридиоза,первоначально через 6-12 часов,а затем через каждые 24 часа и до 10 суток после заражения.Для исследования использовали участки трети подвздошной кишки.

При исследовании экспериментальных и контроль ых образцов методом сканирующей микроскопии на поверхности кишечн.жа обнаруживали развивающегося паразита в различных стадиях.Основные сведения ультраструктурной организации эндогенных стадий С'.рагуит были получены при помощи трансмиссионной электронной микроскопии.

Разбитие всех эндогенных стадий паразита отмечали внутри па-разитофорной вакуоли.

При электронно-микроскопическом исследовании через 24 часа после заражения животных наблюдали трофозоиты и формирующие меронты в зоне щёточной каёмки эктероцитов.Они не были внедрены в клетку,а находились в контакте с энтероцитами у основания микроворсинки.Паразиты находились внутри паразитофорной вакуоли,которая образована двумя мембранами слившихся . микроворсинок.Трофозои» имеет крупное ядро .окружённое ядерной оболочкой.По мере роста'паразита-трофоэоита растущего меронта ядро претерпевает несколько последовательных де-лений.в результате которых образуется 6-8 мерозоитов. Мерозоиты имеют удлинённую банановидную форму.Покрыты'■типичной для кокцидий двухслойной пелликулой.

Внутри мерозоита различимы ядро с ядрышкемикронемы,элементы шероховатой эндоплазматической сети.После созревания меронтов нарушается целостность оболочки меронта и мерозоиты покидают клетку. Мерогопия или бесполое размножение паразита.повторяется.

Меронты I типа Формируют 6-8 мерозоитов,развитие которых может повторяться ,а меронты II типа - 4 мерозоита.Именно мерозоиты второго типа дают начало половому развитию - макро - и микрогамон-там,которые превращаются в микро- и макрогаметы.

Макрог?мета окружена двухмембранной пелликулой и находится в паразитофорной вакуоли.Ядро круйное,имеет ядркико.Зрелая макрогамета н цитоплазме с гранулами амилопектина и многочисленными рибосомами . Микрогаметоцит криптоспоридий содержит - сформированные гутиковые микроглметы,они имеют вытянутую,слегка овальную ч>р-му.Эгнм они отличаются от других кокпидий.Микрогаметы отпочковываются от остаточного тела.

Опи;-:,. I г.орг.-шг.чч макрогамета становится зиготой,а после с«$ор-мнрм) ннн'-ч" »'»круг неё двухслойной оболочки .она превращается в со-цисту.

Спорогония у криптоспоридий происходит при внутриклеточной локализации в паразитофорной вакуоли Сформированные четыре спорозо-ита имеют удлинённую форму и двухмембранную пелликулу.

Процесс формирования ооцист у экспериментально заражённых крысят наблюдал> на 4-5 .-утки лосле заражения.На 10-е сутки число ооцист значительно увеличивается,что совпадает с пиком выделения возбудителя во внешнюю cpt-ду.

Выраженные ультраструкгурные изменения кишечника у экспериментально заражённых животных отмечены на 7-10 сутки.Наблюдается полная атрофия микроворсинок;гликокаликс редуцирован или отсутствует,цитоплазма энтероцитов вакуолизирована.Помимо этого было заметно выражен внутри- и межклеточный отёк энтероцитов,набухание митохондрий, инфильрациЕ слизистого слоя макрофагами и лимфоцитами нейтрофи-лами,выход эритроцитов в просвет кишечника из поражённых сосудов .Наибольшему поражению была подвергнута подвздошная кишка у экспериментально заражённых животных.Структурных видовых отличий паразита на разных стадиях жизненного цикла у мышат или крысят не выявлено.Однако,у крысят паразит локализировался не только в подв-эдоиной кишке,но и в двенадцатиперстной и тощей кишкау. 2.9.Экспресс-оценка фармакологических средств в отношении Cryptosporidium в модельной сиситеме-клетках культуры тканей in vitro.

В серии проведённых экспериментов было показано,что клеточная культура является модельной системой для развития эндогенных стадий Criptosporidium,включая елорудирование ооцист.Эти данные позволили нам считать,что имеется удобная модель,которую можно использовать для проведения экспериментов в стерильных.строго контролируемых условиях,с целью экспресс-оценки различных фармакологических средств.

Анализ проведённых экспериментов по определению воздействия кокцидиоцидного препарата - стенорола на инвазиочные стадии паразита.ответственные за заражение хозяина-спорозоиты C.pacvun (эксцистированные in vitro) показал,что стенорол в котцентрации 0,02 мкг/мл в питательной среде ингибировал спорозоиты.Эти эксперименты выполнялись В определённых условиях-.первоначально свободные спорозоиты находились в течение 4-х часов в питательной среде,содержащей 0,02 мкг/мл стенорола,после непосредственного контакта -спорозоитов с препаратом, экспериментальный материал (спорозоиты со стеноролом в питательной культурной ср^де "Игла") были «нокулирова-ны на монослой клеток культуры тканей почки телёнка "ТАУ-РУС-1".Контроль за спорозоитами в клеточной культуре продолжался в течение 96 часов.Внедрившихся в клетки спорозоитов не наблюдали,да- • же в тех опытах где препарат был удалён из среды через 12 часов и проведена замена опытное питательной среды на контрольную.

Б серии экспериментов по оценке г.нтикриптоспоридиозного действия стенорола в той же концентрации (0,02 мкг/мл .среды) на развивающихся паразитов в клеточной культуре (на стадии троФоэои-тов.не сегментированных меронтов).Установили,что препарат не оказывал полного ингибирующего воздействия.Стенерол вносили в среду через 12-24 часа после инокуляции спорозоитов на выросший моносяой клеток почки телёнка "ТАУРУС-1".Через 48-72 часа в препаратах лэ экспериментальных клеточных культур наблюдали только меронты с сегментированными мерозоигами и' отдельные мерозоигм,внедрившиеся в клетки хозяина.Однако,через" 84-9S часов дальнейшего развития паразита не происходило.Не удалось обнаружить половых стадий криптоспо-

ридий.В контрольных клеточных культурах в этот период развивались все эндогенные стадии паразита,включая спорулироьанную ооцисту. 2.10.Изучение эффективности стенорола на течение экспериментального криптоспоридиоза у мышей.

Для изучения антикокцидийного препарата стенорола на течение экспериментального криптоспоридиоза у мышей,вызываемого С.рагуиш били подобраны следующие подопытные группы:

1 - мышатам давали стенорол за сутки до заражения и одновременно с заражением,с профилактической целью.

2 - животным этой группы вводили препарат на 3,4,5 сутки после заражения с лечебной целью.

3 - контрольные животные,заражение которых проводили одновременно с 1 и 2 группами.Препарат мышатам не задавали.

<1 - контроль препарата стенорол применяли мышатам 3-х кратно с интервалом в сутки,также как и во второй группе.Заражение их оо-цистами не проводил.

Новорождённые мышата каждой группы находились вместе с самкАми в отдельных клетках.Доза заражения для одного мк.тонка составляла 10-20 тыс. ооцист .Препарат применялся в дозе 0,02 1.г/кг массы.

Для эксперимента использовали мышат в возрасте 12-15 суток. Начиная с третьего дня после заражения.фекалии мышат ежедневно исследовали для обнаружения ооцист нативными и флотационными методами .

Интенсивность выделения ооцист С.рагуцт у мышей в пределах одной группы,была практически одинаковой и поэтому для копрологи-ческих исследований отбирали фекалии у 2-3 животных.

Данные исследования позволили установить,что мышата,которым применяли стенорол 3-х кратно с лечебной целью,выделяли ооцист» криптоспоридий в течение 6-ти дней.Интенсивность выделения С.раг*иш была слабой.ооцисты в фекалиях этик мышей обнаруживали на 5-й день после заражения,одновременно с контрольными хивртнйми..

У мышей 1 группы выделение ооцист продолжалось в течение 15-ти суток после заражения¡Первые ооцисты обнаруживали в фекалиях мышей на шестые сутки с момента Заражения ,т . е .~на сутки позже по сравнению с мышатами во второй, группе.Интенсивность выделения паразита у животных 1-й группы, была средней степени.

Мышата,которым вводили только стенорол ос диеты криптоспоридий не выделяли до конца эксперимента.Таким образом,введение стенеро-ла зараженным мышатам,по указанной выше схема значительно сокращает сроки и интенсивность выделения ооцист по сравнению с контрольными животными.

2.10.1.Ультраструктурные аспекты меканизма действия стенорола (галлофугинона) на СгурЪовроНсНига рагуип в организне заражённых мывей.

Мышат р-крьшали на 4,5,6,7,10 сутки после заражения.Материалом для электронно-микроскопического исследования послужили кусочки тонкой кишки экспериментальных живо+ных.

При электронно-микроскопическом исследовании срезов тонкой кишки мыгаат из обоих групп были получены сходные результаты.Во все сроки исследования находили как бесполые,так и половые стадии криптоспоридий .Развитие эндогенных стадий происходило в парззитофврну* яакуилях.образованных микроворсинками энтероцитов и мембраной плрч-зитчческой клетки.На 4-е сутки после заражения чаблкла»« ^лг^ирч"*-иие ооцист.

У мышат обнаруживали интенсивное поражение слизистой оболочки исследуемой части кишечника.Несмотря на однократное применение сте-норола с профилактической целью,во все сроки исследования у животных первой группы находили значительное количество эндогенных стадий паразита,не имеющих морфологических отличий от контрольных.

При исследовании срезов тонкой кишки мышат из второй группы на 4-е сутки после заражения и однократном введении стенорола было отмечено развитие бесполых стадий криптоспоридий.Находили большое количество созревших керонтов с сегментированными мерозоита.чи.в которых чётко контурировалось ядро с ядерной оболочкой и другие органоиды .

В этот же период также наблюдали и половые стадии паразита,структура которых была деформирована,в некоторых случаях концентрация содержимого цитоплазмы и органеллы чётко не просматривались .Наблюдали нарушение целостности мембраны,окружающей клетку паразита .

Органеллы прикрепления и питающая органелла.паразитофорная вакуоль нарушены не были.В материале от экспериментальных животных,которым двукратно вводили препарат,метод электронной микроскопии показал,что значительное количество клеток паразита утрачивали свою овальную или округлую форму,паразитофорная вакуоль отсутствовала .

В дальнейшем находили полностью деформированные клетки возбудителя .Обнаруживали большое количество секреторных клеток.содержимое которых изливалось в кишечнике.что по-видимому,являлось ответной реакцией на имевший место процесс развития паразита и действие лечебного препарата.У контрольных животных количество секреторных клеток было незначительным.

На 10-е сутки после заражения мышат C.psrvum на слизистой оболочке тонкой кишки обнаружить паразита не всегда удавалось.Чаше выявляли единичные меронты.а также морфологически деформированные ооцисты.

Z.11.Влияние лактолена и сочетайте применение лактолена с кокциди-оетатиками на течение криптоспоридиозной инвазии.

Исследования проводились на экспериментально и спонтанно больных животных.

В лабораторных экспериментах использовали 50 кроликов породы "Шиншилла" в Еозрасте 2,5-3 месяцев.Предварительно исключили наличие криптоспоридиозной инфекции.Кролики были разделены на 5 групп по 10 голов.Для заражения животных использовали ооцисты криптоспоридий ,выделенные от спонтанно больных криптоспоридиозом телят,в дозе 50-70 тыс. на кролика.

I группа-интактные животные,II группа-кролики,заражённые Crlptospo-ridiun parvum (контрольныеIII группа-животным дважды применяли лэктолен (в дозе 5 мкг/кг массы) с интервалом в 24 часа,до заражения С. parvuci Л V и V группы-животных заражали C.parvun.a с появлением первых признаков криптоспоридиозной диареи <5-6 сутки) и обнаружением единичных олцчет криптоспоридий из фекалий .осуществляли лечение по схеме: живлным IV группы инокулировали однократно лактог-н и пграхелльне применяли "кокцидисцид" стенорол (в концентрации 0.02 ух"/гг." Mfu животного) пчтиднерным курсом,с интервалом 7Л часа.

Ж?потнып V группы по той же схсмо инокулирогали лактолен,но п г.чч. - г.? я'ч-'Сно профилакти"«-.'кого препарата применяли химиркок ,лн-",'.>:■■:.; г л;! i: ' .v Je си'1--ргичсскую смесь .содержащую в сроем составе хим-

кокцид,ирамин и наполнитель.С лечебной целью хкмиркок использовали из расчёта 10 гр.хЮ кг корма,девятидневным курсом.

Исследования показали,что у кроликов контрольной (11-й группы, заражённых) на 5-6 сутки появилась диарея,а спустя 8-3 суток после заражения был выражен симптомокомплекс криптоспоридиозной инвазии, с максимальным выделением ооцист криптоспоридий до 20-25 в полз зрения микроскопа.

В этот же период и животные IIX-й группы не заболевали крип-тоспоридиозом,хотя единичные ооцисты криптоспоридий животные выделяли в течение 2-3 суток.

У подопытных животных IV и V групп получен высокий лечебно-профилактический эффект.В течение 3-5 суток наблюдали выздоровление животных и резкое снижение числа ооцист криптоспоридий до единичных.

При оценке иммунного статуса животных контрольных и подопытных групп на десятые сутки после заражения и лечения,выявляли достоверные различия ряда иммунологических показателей (Т- и в-лим-Фоцитов).

Полученные обнадёживающие результаты по профилактике лечения криптоспоридиоза в условиях эксперимента были с успохом использованы в производственных условиях.

В неблагополучных по криптоспоридиозу хозяйствах 1-2 суточным телятам,до проявления симптомокомплекса болезни,с целью иммуно корректирующей профилактики криптоспоридиоза применяли иммунномодуля-тор-лактолен.Одно- двукратное введение препарата,® зависимости or Физиологического состояния новорождённых телят позволяло предотвратить заболевание криптоспоридиоэом.У таких телят отсутствовали признаки диареи и они не выделяли ооцист криптоспоридий.

Во второй серии опытов телятам 5-6-10 суточного возраста с выраженным симптомокомплексом криптоспоридиозной инвазии и выделением ооцист криптоспоридий.применяли сочетании? препараты:лактолен и один из кокцидиостатических препаратов (стенорол или хикиркоч) по схеме.описанной в лабораторных экспериментах.Всего в неблагополучных по криптоспоридиозу хозяйствах Ленинградской и Псковской областей оказана реальная помощь 280 телятам.' •

ВЫВОДЫ.

1.Получены новые данные по сравнительное ' изучению методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза,распространению,роз раст-ной динамике и симптомокомплексу болезни телят в некоторых районах Северо-Западной зоны Российской Федерации (Ленинградская,Псковская обл.).

2.Отработаны и усовершенствованы методы получения биомассы возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих-Cryptosporidium parvus.а также эксцистирования спорозоитов из спорулированнных ооцист in vitro.

Эти методы позволяют получать биомассу инвазионных стадии возбудителя.которая может использоваться для культивирования в модельных системах-клетках культуры тканей,эмбрионах,в биотехн:до-гии,генной инженерии,для получения диагностических и профилактических средств.

З.Иолуч,эны новые данные оригинальных исследований по культик-poBiimw спорозоитов C.parvun и развитию их в клетках культ,vru тк-ч-Ной .которые имеют принципиальное значение для Сохез глуСоктг пом,: и;шня щ'.чч'нно^'гой течения гиэменного цикла кгинтг-опчп'Л''''' •т-т'<

зито-хозяиньых отнесений.Установлена способность паразита развиваться не только на поверхности клетки.но и внутриклеточно., в несвойственных ому условиях.

Модельная система - культура клеток позволила проведение экспериментов в стерильных условиях,контролировать степень экспериментальных параметров,име"ь экономически выгодные условия:использо-ваиие небольшой дозы исгытуемых средств,минимального числа экспериментальных живогньш,экономию времени в 2-3 раза.Устраняются ошибки влияния факторов кормления экспериментальных' животных.сезона года, внешней среды и других факторов.

4.Для культивирования C.parvun впервые использованы линии перевиваемых клеток почек телёнка "ТАУРУС-Í".применяемые для вирусологических исследований.Клетки этой линии оказались пригодны для полного эндогенного развития С.parvua,начиная со стадии инокулиро-ванных спорозоитов,полученных in vitro.

5.Даны характеристики ультраструктурной организации эндогенных стадий C.parvum с помощью методов сканирующей электронной микроскопии и ультратонких срезов,а также установлены паразито-хозяин-ные отношения на лабораторной модели.

6.Разработаны методы и методические приёмы экспресс-оценки Фармакологических средств в отношении инвазионных стадий эндогенного развития C.parvum на экспериментальной модели in vivo и in vitro.

Получены новые данные по использованию модельной системы для экспресс-оценки высокоэффективного антикокцидийного препарата с полным спектром действия стенорола в отношении эндогенных стадий C.parvum и показано антикриптоспоридийкое действие препарата.

7.Полученные результаты по испытанию иммуностимулятора (лак-толена), а также иммунноетимулятора с кокцидиостатическими препаратами (стенорола,химиркока) при криптоспоридиозе новорождённых телят, позволяют определить один из реальных путей в системе лечебно-профилактических мероприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Разработаны методы получения биомассы возбудителя криптоспо-ридиоза млекопитающих на примере Cryptosporidium parvum.a также эг.сцистирования спорозоитов из спорулированн..х ооцист in vitro,позволяющие получать биомассу инвазионных стадий возбудителя,которая моХег использоваться для культивирорания в модельных системах клеточных культурах,в биотехнологии.генной инженерии,в целях получения диагностических и профилактических средств.

Модельную систему - клеточную культуру можно использовать в качестве тест-объекта для экспресс-оценки фармакологических средств,с целью поиска антикриптоспоридийных свойств в отношении криптоспоридий млекопитающих. . ■

Следует рекомендовать высокоэффективный кокцидиостатический препарат стснорол (галлофугинон),а также иммуномодулятор лактолен для лечебно - профилактических целей новорожденных телят,в неблагополучных хозяйствах,что может иметь один из реальных п.утей в получении дополнительной продукции,а также в решении социально-экономических проблем.

К диссертации приложены соответствующие акты по внедрению cx>"mw лечебно-профилактических мероприятий.

Полученные данные экспериментальной работы.включая ультра^т-гукт-,", itst«? характеристики простейшего, рекомендуем использовать в курсах лгкцкп , лабораторно-практических занятиях,а также при и?д;птии

соответствующей учебной и научно-практической литературы.

Материалы настоящих исследований .выполненных в диссергацион ной работе,подготовленны для представления в качестве методических рекомендаций и заявки на изобретение. Список работ,опубликованных по теме диссертации.

1.Перспективы использования оптического излучения для профилактики парзитоценоэов и повышения племенного промышленного птице -водетва.//Сборник научных трудов ЛВИ.1988(соав.Т.А.Шибалова,Е.С?Ма-зин,М.Н.Тагворян).

2.Возможные компоненты паразитоценоза.// Тезисы III всеюэ съезда парзитоценологов.Киев.1991 (соав.Т.А.Шибалова,Н.Ф.Павласек, Н.В.Касаткина).

3.Cryptosporidium кроликов.//Цитология,1992,т.34(соав.Т.А.Ши• балова, А.Е.Зацепин,(О.Ю.Розанов).

4.Перспективы использования иммуностимуляторов в сочетании с химическими препаратами при криптоспоридиозе.//Цитология,1992,т.34 (соав.Н.В.Касаткина,Т.А.Шибалова,И.Ф.Павласек).

5.Поиск экспериментальной модели-как основа для изучения жнэ ненного цикла возбудителей криптоспоридиозов.//Тезисы дсклалов XJ конференция Украинского общества паразитологов.Киев. 1993. (соав Т.А.Шибалова.И.Ф.Павласек.Н.В.Касткина).

e.Ultrastruetural investigation of Cryptosporidia.//Interna tional Congrees of protozoology,1993,Berlin,Germany.(соав.T.А.Шибл лова,H.В.Касаткина).