Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криптоспоридиоз. Эпизоотология, симптомокомплекс болезни, ультраструктура Cryptosporidium parvum, особенности развития хозяин-паразит-клетка-эмбрион, принципы лечения и профилактика

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Криптоспоридиоз. Эпизоотология, симптомокомплекс болезни, ультраструктура Cryptosporidium parvum, особенности развития хозяин-паразит-клетка-эмбрион, принципы лечения и профилактика"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РФ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ЯКУТСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ

АКАДЕМИЯ

р Г к од

4 с пси 100С На правах рукописи

1 0 ДСП УДК 619:616.993.1-053.2:636.22/28

БОЧКАРЁВ ИННОКЕНТИЙ ИЛЬИЧ

КРИПТОСПОРИДИОЗ

ЭПИЗООТОЛОГИЯ, СИМПТОМОКОМПЛЕКС БОЛЕЗНИ, УЛЬТРАСТРУКТУРА CRYPTOSPORIDIUM PARVUM, ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ХОЗЯИН-ПАРАЗИТ-КЛЕТКА-ЭМБРИОН, ПРИНЦИПЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКА

03.00.19 - паразитология и гельминтология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Т.А.Шибалова

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Э.Х.Даулгалиева; доктор медицинских наук, профессор А.Ф.Никитин; доктор биологических наук, профессор В.А.Ромашов.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Защита состоится 26 декабря 1996 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.20.02 Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (196084, г.Санкт-Петербург, ул.Черниговская, 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины

Автореферат разослан 25 ноября 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.В.Узюмова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Криптоспоридиоз животных и человека широко распространенное заболевание и актуальная проблема в настоящее время во всех странах мира. Экстенсивность заражения животных и человека криптоспоридиозом в разных странах изучена неодинаково. Различия в путях заражения зависят от ветеринарно-санитарных условий содержания животных, народно-хозяйственных условий, санитарного состояния жизни социальных групп населения.

Возбудители криптоспоридиоза - кокцидии рода Cryptosporidium Tyzzer (1910) поражают млекопитающих, в том числе домашних и диких животных, грызунов и птиц (Fayer R., Ungar B.L., 1986; Шибадова Т.А., 1987; Бейер Т.В., 1989; Бочкарев И.И., 1989).

Криптоспоридии обладают широкой хозяинной специфичностью. Ооцисты Cryptosporidium parvum способны заражать млекопитающих многочисленных видов, включая человека, с последующим симптомокомплексным проявлением болезни у каждого из хозяев (Anderson B.C. et al., 1982; Current W.L., Long P.L., 1983; Tzipori S„ 1983).

В соответствии с определением ВОЗ криптоспоридиоз отнесен к числу типичных зоонозов, возбудители которых трансмиссируются между позвоночными животными и человеком. Криптоспоридии млекопитающих известны как паразиты преимущественно кишечного тракта, хотя они были установлены и в других органах и тканях животных (Fayer R., Ungar B.L., 1986).

Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о тяжелом течении криптоспоридиоза, осложненном энтеритом у телят молочного периода, которым этот возбудитель наносит большой экономический ущерб (Никитин В.Ф., Павласек И., 1983; Горбов Ю.К. и др., 1984; Шибалова Т.А., 1987; Бочкарев И.И., 1992; Алиев A.A., 1993; Шибалова Т.А., Розанова Ю.Ю., 1995). Криптоспоридии вызывают тяжелое заболевание при дисбалансе иммунитета у хозяина,

отягощают общее течение болезни (Fayer R., Ungar B.L., 1986).

По имеющимся данным криптоспоридиоз оказался одним из наиболее часто диагностируемых гастроэнтеритов телят и вторым среди кишечных инвазий невирусной этиологии (Baxby D., Hart С.А., 1986). Отмечено, что в России болезни органов пищеварения у телят молочного периода составляют 82,3%-85,7%, около трети заболевших гибнут в первые дни жизни (Ноздрин Г.А., 1996). Желудочно-кишечные болезни у молочных телят чаще возникают при пониженной неспецифической резистентности организма, нарушении ферментативного пищеварения, ослаблении механизмов адаптации (Урбан В.П., 1982).

В последние годы значительное количество исследований посвящено изучению влияния фармакологических средств на состояние иммунной системы (Урбан В.П. и др., 1992; Соколова В.Д. и др., 1992; Ноздрин Г.А., 1996).

Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспори-диоза во многих странах мира, в том числе и в нашей стране, он продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарии и медицины; особенно слабой стороной в изучении этой проблемы является профилактика и лечение криптоспо-ридиоза.

До настоящего времени в некоторых странах, а также и в некоторых регионах России эта проблема остается слабо изученной. К началу наших исследований по региону Крайнего Севера и, в частности, в республике Саха (Якутии) данные по криптоспоридиозу отсутствовали.

В своей работе мы исходили из особого интереса к изучению опасного зооноза - криптоспоридиоза новорожденного молодняка в суровых природно-климатических условиях, в конкретной экологической зоне. В последнее десятилетие значительное количество работ посвящено изучению влияния экологических факторов, среды обитания на иммунную систему животных.

В настоящее время иммунодефицит у новорожденных телят, превратившийся в проблему, и отсутствие эффективных

лекарственных средств при криптоспоридиозе животных, сопровождающимся стойким снижением иммунитета, обуславливают необходимость поиска новых иммуномодулирующих средств.

Актуальность проблемы крипстоспоридиоза млекопитающих, его неизученность в регионе Крайнего Севера и (Якутии) и отсутствие надежных средств для профилактики и лечения криптоспоридиоза определили цель и задачи наших исследований.

Цель работы. Изучить эпизоотологический процесс криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии), симптомокомплекс болезни, ультратонкую организацию Cryptosporidium parvum, особенности развития хозяин-паразит-клетка-эмбрион, принципы лечения и профилактики криптоспоридиоза.

Задачи исследования:

1. Изучить характер эпизоотологаческого процесса криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) в зависимости от природно-климатических, хозяйственно-экономических и ветеринарно-санитарных условий содержания животных.

2. Изучить особенности симптомокомплекса болезни криптоспоридиоза крупного рогатого скота и определить паразитарную реакцию.

3. Методами световой и электронной микроскопии изучить жизненный цикл, биологические и морфологические особенности возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidium), впервые выделенного в регионе Крайнего Севера (Якутии); установить его видовую принадлежность.

4. Выяснить возможность развития Cryptosporidium parvum в сравнительном плане в клетках культуры: эмбриональной трахеи крупного рогатого скота (TR), почек теленка (ПТ), почек мышей (EL-4), аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320), легкого при лейкозе человека (L-41), раб-

домиосаркомы человека (RD), для выяснения особенностей развития паразита в клетке in vitro и получения модельной системы хозяин-паразит-клетка.

5. Отработать метод культивирования C.parvum (со стадии спорозоитов, эксцисгарованных in vitro) в эмбрионах кур, с целью возможности использования экспериментальной модели.

6. Изучить эффективность химиотерапевтических препаратов (фармкокцида, кокцикола, полимиксина, тилана, это-ния) и кокцикола в сочетании иммуномодулятора - Т-активином (вьщеленного из тимуса северного оленя) при криптоспоридиозе.

7. Разработать и апробировать способ профилактики и лечения криптоспоридиоза с использованием рекомбинантно-го интерлейкина-ip (ИЛ-1р), с учетом специализации, зональных и экологических особенностей ведения животноводства и мероприятий по охране окружающей среды, населения от инвазии, общей для человека и животных.

Научная новизна. В настоящей работе впервые изучен и представлен характер проявления эпизоотологического процесса криптоспоридиозной инвазии крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) в зависимости от природно-климатических, хозяйственно-экономических и ветери-нарно-санитарных условий. Установлены источники, факторы и пути передачи возбудителя криптоспоридиоза, резервуары возбудителя в окружающей среде. Определены экстенсивность и интенсивность эпизоотологического процесса.

На основании изучения и анализа симптомокомплекса криптоспоридиозной инвазии крупного рогатого скота в динамике и анализа паразитарной реакции, гематологических, биохимических и иммунологических изменений, установлены закономерности метаболических процессов, формирования и угнетения иммунного статуса организма, соответствующего этой патологии новорожденных телят.

Впервые в регионе Крайнего Севера (Якутии) выделен и установлен вид Cryptosporidium parvum, соответствующий

описанному ранее Tyzzer (1910). Показана возможность культивирования и развития Cryptosporidium parvum, впервые выделенного в регионе Якутии (со стадии эксцистированных in vitro спорозоитов) в клетках культуры: эмбриональной трахеи крупного рогатого скота (TR), почек теленка (ПТ), почек мышей (EL-4), аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320), легкого при лейкозе человека (L-41), рабдомиосар-комы человека (RD). Выявлено внутриклеточное развитие паразита, в несвойственных для них клетках. Установлено, что лучшие результаты по внедрению и развитию стадий жизненного цикла криптсспоридий происходили в клетках культуры: аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320), легкого при лейкозе человека (L-41), рабдомиосаркомы человека (RD). В этих клетках число развившихся паразитов значительно превышало таковое в других использованных нами клетках культуры.

Отработан метод культивирования Cryptosporidium parvum в эмбрионах кур. С использованием световой микроскопии, гистологии и электронной микроскопии, показан полный жизненный цикл развития паразита на хорионаллан-тоисных и амниотических оболочках.

На основании полученных результатов культивирования спорозоитов Cryptosporidium parvum - возбудителя-зооноза в клетках культуры и эмбрионах разработана модельная система хозяин-паразит-клетка-эмбрион, которая позволяет контролировать экспериментальный процесс в стерильных строго контролируемых и экономически выгодных условиях; расширяет наши представления об интимных механизмах, лежащих в основе паразито-хозяинных отношений, что может быть одним из условий при разработке мер борьбы с болезнями-зоонозами, вызываемыми криптоспоридиями.

Показана определенная эффективность фармакологических препаратов: кокцикола, фармкокцида, полимиксина, ти-лана, этония и иммуномодулирующее действие общепризнанного иммуномодулятора - Т-активина в сочетании с кокцико-лом при криптоспоридиозе новорожденных телят.

Впервые в ветеринарии испытан рекомбинантный им-муномодулятор - ИЛ-1р в экспериментальных и производственных условиях при криптоспоридиозной инвазии.

Рекомбинантный иммуностимулятор ИЛ-ip в организме лабораторных животных и телят показал высокую биологическую активность, вызывая комплексные изменения позитивного характера в течение 1 -2-месячного наблюдения.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований доказано, что эпизоотологический процесс криптоспоридиозной инвазии крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) - процесс управляемый, и находится в зависимости от постоянного совершенствования хозяйственно-экономических, экологических, ветеринарно-санитарных условий; источников инвазии болезни; факторов, путей и резервуаров, способствующих передаче возбудителя в окружающей среде.

Полученные на основании многолетних исследований данные симптомокомплекса болезни при криптоспоридиозе крупного рогатого скота с учетом анализа паразитарной реакции, гематологических, биохимических и иммунологических изменений, выяснения иммунодефицитного состояния как общего признака патогенеза животных при криптоспоридиозе явились основой для разработки научно обоснованной профилактики и лечения криптоспоридиозной инвазии.

Проведенные исследования по культивированию Cryptosporidium parvum в различных клеточных культурах и эмбрионах птиц позволяют предложить модельную систему - хо-зяин-паразит-клетаа-эмбрион, открывающую возможность более детально контролировать экспериментальный процесс в строго контролируемых и экономически выгодных условиях, расширяют наши представления об интимных механизмах, лежащих в основе паразит-хозяинных взаимоотношений, что может быть одним из условий при разработке мер борьбы с болезнями, вызываемыми криптоспоридиями.

Модельную систему - хозяин-паразит-клетка-эмбрион -можно использовать в качестве тест-объекта для предвари-

тельной экспресс-оценки антикокцидийной активности фармакологических средств в отношении возбудителя криптоспо-ридиозной инвазии.

Показана целесообразность использования сочетанного применения антикокцидийного препарата кокцикола с имму-номодулятором Т-активином при криптоспоридиозной инва-31ш телят.

Разработана и апробирована коррекция иммунного статуса больных криптоспоридиозом животных и профилактика болезни ИЛ-ip в экспериментальных и производственных условиях, с учетом специализации зональных и экологических особенностей ведения животноводства. Проведена паразито-логическая и клинико-иммунологическая оценка в сравнении с таковой при традиционном комплексном лечении. Показано, что препарат ИЛ-Ip обладает многогранным биологическим действием, заключающимся в активации различных типов клеток-мишеней; стимулирует неспецифическую резистентность, вызывая выход нейтрофнльных гранулоцитов з кровоток, усиливает их миграцию и функциональную активность, а также способствует ускоренному созреванию предшественников лимфоцитов и усиливает пролиферативный потенциал иммунокомпетентных клеток - блаетную трансформацию лимфоцитов и продукцию ими интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Основные положения, выносимые на защиту:

•характер эпизоотологического процесса и симптомо-комплекса болезни криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) в зависимости от природно-климатических, хозяйственно-экономических и ветери-нарно-санитарных условий содержания животных;

• ультратонкая организация возбудителя криптоспоридиоза Cryptosporidium parvum, впервые выделенного в регионе Крайнего Севера (Якутии);

•особенности развития возбудителя криптоспоридиоза Cryptosporidium parvum, модельная система - хозяин-паразит-клетка-эмбрион;

•принципы лечения и профилактики криптоспоридиоза животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

•ежегодных отчетах ученых советов Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства, Якутской государственной сельскохозяйственной академии и Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины;

•1У-м и У-м съездах Всесоюзного общества протозооло-гов (Ленинград, 1987., Витебск, 1992);

•Международной конференции "Актуальные проблемы ветеринарии" (Барнаул, 1995);

•П-й циркумполярной сельскохозяйственной конференции (Норвегия, 1995);

•П-й научно-практической конференции паразитологи-ческого общества Российской академии наук "Паразитологические проблемы больших городов" (Санкт-Петербург, 1996);

•Ш-м конгрессе международной ассоциации морфологов (Тверь, 1996);

•УШ-й межгосударственной научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (Санкт-Петербург, 1996);

•межвузовской научно-практической конференции "Наука - невостребованный потенциал" (Якутск, 1996);

•1-й международной конференции "Знание - на службу нуждам Севера" (Якутск, 1996);

•Всероссийском паразитологическом обществе (Санкт-Петербург, 1996).

Диссертационная работа апробирована на межкафедральном заседании профессорско-преподавательского состава

Якутской государственной сельскохозяйственной академии (1996).

Материалы диссертации изложены в 36 научных статьях, в рекомендациях, потенте на изобретение и наставлении.

Объем работы. Работа состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического указателя использованной литературы. Диссертация изложена на_ страницах машинописного теста, иллюстрирована_рисунками и_

таблицами. Список использованной литературы включает _источника, из них_- иностранных авторов. Приложение к диссертации включает копию методической рекомендации по культивированию криптоспоридий в клетках культуры тканей и эмбрионах птиц, титульные листы о патента на изобретение и наставление.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы исследования. Работа выполнялась в 1986-1996 гг. в отделе ветеринарии Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства, на кафедре анатомии и хирургии Якутской государственной сельскохозяйственной академии, в проблемной научно-исследовательской лаборатории протозоологии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, а также в животноводческих хозяйствах Крайнего Севера (Якутии) и Ленинградской области.

Изучение криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) начинали с выяснения эпизоотической ситуации в тех хозяйствах, где ежегодно регистрировались заболевания желудочно-кишечного тракта и большой падеж новорожденных телят. Диагноз на крипто-споридиоз ставили комплексно, включая микроскопию. Диагноз подтверждали обнаружением и выделением ооцист криптоспоридий в препаратах из фекального материала, окрашенных различные методами окраски, в нативных препаратах, и

используя флотационные методы. Всего обследовано 11347 голов крупного рогатого скота в возрасте от 1 до 30 дней и старше, в 49 хозяйствах Якутии.

На экспериментально и спонтанно зараженных телятах изучали симптомокомплекс при криптоспоридиозе. Больные животные подвергались клиническому осмотру. Проводили гематологический, биохимический и иммунологический анализ крови. Павших телят вскрывали, изучали патоанатомиче-ские изменения, готовили мазки-отпечатки со слизистых оболочек кишечника и других паренхиматозных органов.

Работу по изучению симптомокомплекса болезни проводили в неблагополучных по желудочно-кишечным болезням телят хозяйствах республики Саха (Якутия) и Ленинградской области. Всего обследовано 1044 теленка 1-30-суточного возраста.

Помимо этого в экспериментах были также использованы лабораторные животные: 200 белых мышей линии СБА, 1000 куриных эмбрионов, 6 клеточных линий (эмбриональной трахеи крупного рогатого скота (ТЯ), почек теленка (ПТ), почек мышей (ЕЬ-4), аденокарциномы толстой кишки человека (Со1о-320), легкого при лейкозе человека (Ь-41), рабдомиосар-комы человека (ИХ)).

Для изыскания высокоэффективных иммунотерапевти-ческих средств в отношении криптоспоридиоза использовали: коКцидиостатики - кокцикол, фармкокцид; антибиотики - по-лимиксин, тилан; противомикробный препарат широкого спектра действия - этоний и иммуностимуляторы - Т-активин, выделенный из тимуса северного оленя (серии 204-С0 и 206-СО, синтезированные в лаборатории молекулярной иммунологии Московского НИИ ФХМ); рекомбинантный ИЛ-1р (синтезирован в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург).

Рекомбинантный ИЛ-1(3 человека представляет собой эндогенный иммуномодулятор, продуцируемый в ходе развития острофазного иммунного ответа, главным образом, клетками макрофагального ряда. Благодаря широкому спектру биологической активности ИЛ-1Р является одним из основ-

ных медиаторов развития защитных реакций организма при внедрении патогенов.

ИЛ-ip значительно повышает резистентность перезаражения летальными дозами ряда бактерий и вирусов, защищает от радиационного воздействия и токсического действия цитостатиков, обладает выраженным ранозаживляющим и иммуностимулирующим действием, эффективен при некоторых формах опухолей.

Эффективность препарата оценивали по общему состоянию животных, снижению степени криптоспоридиозной инвазии в поле зрения микроскопа (объектив х 40). За слабую интенсивность принимали в среднем 1-5 ооцист в поле зрения; за среднюю - 5-30; за сильную - более 30 ооцист.

Клинико-гематологические исследования проводили по общепринятым методикам. Содержание общего белка и его фракций, гемоглобина и глюкозы изучали методом фотоэлек-троколориметрии, описанным Ю.В.Конопатовым и др. (1994). Активность аланинаминотрансферазы определяли методом Райтмана и Френкеля (Кондрахин И.П. и др., 1985). Количественное определение Т- и В-лимфоцитов в периферической крови проводили по методике А.М.Цымбал и др. (1983). Хе-мотоксические функции нейтрофилов изучали в агарозном тесте по методу Nelson R., Juie P. (1975) и описанному В.Г.Конусовой и др. (1993). Фагоцитарную активность лейкоцитов определяли по методу, описанному А.С.Симбирцевым и др. (1993). Для оценки окислительного метаболизма применяли тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) (Rook Y., 1985). Пролиферацию лимфоцитов и индукцию синтеза ИЛ-2 определяли по методике, описанной А.С.Симбирцевым и др. (1990), Ketlinsky S. et al. (1991).

Изучение (в сравнительном плане) жизненного цикла Cryptosporidium parvum (Якутский штамм) и паразито-хозяинных отношений проводили методом электронной микроскопии с использованием ультратонких срезов и сканирования. Полученные образцы изучали в электронном микроскопе JEM-100 СХ (Япония).

Культивирование спорозоитов криптоспоридий в клетках культуры тканей и эмбрионах птиц проводили по методике Т.А.Шибаловой (1974,1977,1979), описанной для кокцидий рода Eimeria, модифицированной для Cryptosporidium parvum (Шибалова Т.А., 1988).

Цифровой материал статистически обрабатывали по Е.В.Монцевичюте-Эрингене с применением микрокалькулятора по В.А.Костенко и др. (1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эпизоотология криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии)

Разработка методов диагностики и борьбы с опасными болезнями животных, с учетом системы ведения агропромышленного комплекса в различных зоогеографических и экологических зонах является основной задачей ветеринарной науки и практики.

Исходя из этих позиций, распространение криптоспоридиоза крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (в Якутии) изучали путем эпизоотологического обследования животноводческих ферм, в которых в течение ряда лет у новорожденных телят наблюдали желудочно-кишечные заболевания и большой падеж. При этом учитывали народнохозяйственные, ветеринарно-санитарные условия содержания животных, их возраст, сезон года.

Во всех обследованных хозяйствах (в период 1986-1996 гг.) установлен криптоспоридиоз крупного рогатого скота, преимущественно у телят 3-30-суточного возраста. Было зарегистрировано 4163 больных животных, в том числе до 20-дневного возраста - 3824, что составляет 91,8%. Экстенсивность инвазии колебалась от 27,8% до 100%. Наиболее высокая экстенсивность инвазии отмечалась у телят 9-20-дневного возраста. К месячному возрасту зараженность снижалась до 27,8%, а к 2-6 месяцам - до 5,2%. В зимне-весенний - осенний

периоды инв&зированность молодняка крупного рогатого скота в возрасте 2,5 года достигала 9,3%.

Возбудителем криптоспоридиозной инвазии крупного рогатого скота в регионе Крайнего Севера (Якутии) впервые установлен Cryptosporidium parvum. Ооцисты криптоспори-дий, выделенные у больных телят в животноводческих хозяйствах Ленинградской области - принципиально идентичны.

Наши наблюдения и исследования показали, что заражение телят происходит в первые дни после рождения. Подтверждением этому является совпадение клинических признаков болезни (2-4-5 сут.) и сроков латентного периода развития паразита (3-5 сут.).

Источником заражения новорожденных телят крипто-спориднями являются больные животные, а также окружающая их среда. Ооцисты криптоспоридий выделяли из предметов ухода, поилок, воды, кормов; естественным резервуаром криптоспоридий служили также дикие птицы, дикие и домашние грызуны.

Электронно-микроскопическое исследование стадий жизненного цикла Cryptosporidium

Криптоспоридии, как и другие кокцидии, имеют сложный жизненный-цикл, состоящий из бесполых и половых стадий, зиготы - ооцисты завершается эндогенный цикл развития криптоспоридий созреваний в ооцисте спорозоитов - инфекционных стадий паразитического организма, ответственных за заражение хозяина. Созревшая - спорулированная ооциста выделяется во внешнюю среду при дефекации и является инвазионной и опасной для заражения очередного хозяина.

Ооцисты и криптоспоридии всех стадий жизненного цикла мелких размеров 2,5 х 6,5 мкм - Cryptosporidium parvum и 8,4 х 6,3 мкм - Cryptosporidium' muris, поэтому изучение морфологии ультраструктурной организации стадий развивающегося паразитического организма было возможным только благодаря электронному микроскопу (Fayer R., Ungar R., 1986; Tzipori S., 1988; Бейер T.B. и др., 1990; Бейер Т.В.,

Сидоренко Н.В., 1990; Шибалова Т.А. и др., 1993; Алиев А.А., 1993; Шибалова Т.А., Бочкарев И.И., 1996). Настоящим исследованием предусматривалось решить две задачи: во-первых, установить вид Cryptosporidium, впервые выделенный от спонтанно больных телят в регионе Крайнего Севера (Якутии); во-вторых, изучить особенности ультраструктурной организации стадий жизненного цикла эндогенного развития паразита, впервые выделенного в условиях вечной мерзлоты.

Для решения первой задачи изолят ооцист криптоспоридий из фекалий больных криптоспоридиозом телят выделяли с использованием флотационных методов.

Световая микроскопия. В изученных препаратах свеже-полученных ооцист и фиксированных мазков из инвазирован-ного ооцистами криптоспоридий материала установлен возбудитель Cryptosporidium идентичный описанному ранее Cryptosporidium parvum: ооцисты округлой или слегка овальной формы, диаметром 4,8х5,3мкм.

Электронная микроскопия. Изучение ультраструктурной организации Cryptosporidium parvum различных стадий жизненного цикла, выделенного от телят из неблагополучных по криптоспоридиозу хозяйств Якутии проводили на новорожденных мышатах, которых экспериментально заражали спо-рулированными ооцистами криптоспоридий этого вида.

Исследования зараженных животных проводили методом сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии. Вскрытие мышат проводили через 48,72,96 и 108 часов после заражения. Для исследования использовали заметно гиперемированные участки подвздошной кишки.

На электроннограммах экспериментального материала в период исследования обнаруживали все стадии жизненного цикла криптоспоридий: трофозоиты, меронты, макро- и мик-рогомонты, зиготы, ооцисты, спорогония, которые находились в зоне щеточной каемки, в контакте с энтероцитами у основания микроворсинок, образуя электронно-плотную мембрану, роль которой обеспечивать питательными веществами растущего паразита.

Нашими исследованиями впервые в Якутии выделен и установлен возбудитель криптоспоридиоза крупного рогатого скота - Cryptosporidium parvum, структурная организация которого подтверждена методом электронной микроскопии.

Симптомокомплекс болезни при криптоспоридиозе крупного рогатого скота в Якутии

В настоящее время криптоспоридиоз остается актуальной проблемой, требующей глубоких исследований в направлении детализации симптомокомплекса, изучения биохимических и иммунологических изменений, происходящих в организме при криптоспоридиозе, а также выяснения механизма патогенеза при этой болезни, что является основой для лечения и профилактики криптоспоридиоза млекопитающих.

Многие исследователи убедительно доказали, что в возникновении острых желудочно-кишечных болезней определенную роль играют паразитические простейшие - криптоспо-ридии (Panciera RJ. et al., 1971; Kemp R.L., 1974; McDonald V., 1976; Прокопич Я., Павласек И., 1983; Шибалова Т.А., 1987; Горбов Ю.К., 1987; Бочкарев И.И., 1989; Алиев А.А., 1993; Небайкина Л.А., 1995). Одной из задач нашей работы было изучение симптомокомплекса криптоспоридиоза крупного рогатого скота в неблагополучных по болезням желудочно-кишечного тракта хозяйств в регионе Крайнего Севера (Якутии).

В экспериментальный опыт по принципу аналогов, было подобрано 20 телят 1-2-суточного возраста, которых заражали криптоспоридиями рода Cryptosporidium parvum в дозе 1 млн. экземпляров ооцист.

Проводили клинические наблюдения и исследование крови гематологическими, иммунологическими и биохимическими методами, а также паразитологические исследования.

г

Проявление клинических признаков у телят наблюдали на 2-3-й день после заражения. Первым выраженным симптомом болезни была водянистая диарея, которая свидетельству-

ет о повышении задержания воды в просвете кишечника. Выделение ооцист криптоспоридий начиналось на 4-5-й день и достигало максимума на 7-9-е сутки. Температура тела животных оставалась в пределах физиологической нормы.

Тяжелую форму отмечали на 7-9-й день после заражения, которая сопровождалась прогрессирующим исхуданием и обезвоживанием организма, профузной диареей с прожилками крови. Пало 3 теленка.

При гематологическом исследовании на 10-й день после заражения отмечено достоверное увеличение в крови эритроцитов (7,5± 0,11х1012/л). Одновременно устанавливали снижение лейкоцитов (5,7 ± 0,22x109/л). Регистрировали повышение эозинофилов (до 2,3± 0,3%) и лимфоцитопению, при незначительном увеличение нейтрофилов.

При биохимическом исследовании сыворотки крови телят наблюдали достоверное уменьшение общего белка (от 5,9± 0,09 до 2,3+_0,2 г%) и у-глобулина (от 1,06± 0,01 до 0,56+ 0,05 г%) при незначительном увеличении а- и (3-глобулинов. Содержание глюкозы в крови уменьшалось до 1,7 ммоль/л (Р<0,05).

При иммунологическом исследовании периферической крови отмечали снижение Т- и В-лимфоцитов (23,9±1,1% -15,8±0,3% и 5,9±0,3% - 4,7±0,3%, соответственно).

Патоанатомическая картина при криптоспоридиозе

При экспериментальном и спонтанном криптоспоридиозе крупного рогатого скота погибали новорожденные телята в возрасте 7-11 суток после рождения. Павших телят подвергали патологоанатомическому вскрытию для подтверждения поставленного прижизненного диагноза на криптоспоридиоз и изучали патологоанатомические, гистологические и уль-трастуктурные изменения органов и тканей, главным образом кишечника.

Основные патологоанатомические изменения при экспериментальном и спонтанном криптоспоридиозе отмечались в кишечном тракте.

При осмотре кишечного тракта наблюдали развитие катарального воспаления от желудка до прямой кишки. На всем протяжении серозная оболочка гиперемирована. Слизистая оболочка подвздошной кишки с многочисленными кровоизлияниями и местами с изъязвлениями. В некоторых случаях наиболее сильное поражение отмечалось в тощей кишке.

На гистологических и электронно-микроскопических срезах наблюдали характерное изменение ворсинок, их атрофию. Отмечали прямую зависимость между тяжестью болезни и степенью пораженности кишечника криптоспоридиями.

Культивирование Cryptosporidium в клетках культуры

Значимость модельной системы хозяин-паразит-клетка культуры для изучения in vitro возбудителя-зооноза млекопитающих Cryptosporidium объясняется целым рядом факторов: необходимостью изучения биологических, морфологических характеристик стадий жизненного цикла паразитических простейших разных видов, разных штаммов из различных экологических зон; выяснением отношений паразита в системе хозяин-паразит-клетка в культуре различных тканей. До настоящего времени нет надежных специфических средств для лечения и профилактики криптоспоридиоза. Решение этой проблемы, в значительной степени может быть облегчено предварительной экспресс-оценкой антикриптоспоридийной активности фармакологических средств, с использованием клеточных культур в лабораторных условиях.

В серии проведенных экспериментов по культивированию возбудителя криптоспоридиоза крупного рогатого скота Cryptosporidium parvum впервые выделенного в регионе Крайнего Севера (Якутии) изучали в клеточных культурах в сравнительном аспекте, с целью выяснения особенностей развития криптоспоридий в культурах клеточных линий: эмбриональной трахеи крупного рогатого скота (TR), почек те-

ленка (ПТ), почек мышей (EL-4), аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320 ), легкого при лейкозе человека (L-41), рабдомиосаркомы человека (RD).

Эффективность культивирования определяли по числу внедрившихся и развившихся эндогенных стадий жизненного цикла паразитического простейшего через 48,72,96 и 108 часов после инокуляции спорозоитов на клеточный монослой культуры. Исследование проводили на свето-оптическом и электронно-микроскопическом уровне. .

В результате установлено, что все эндогенные стадии Cryptosporidium parvum развивались в используемых клетках культуры. Лучшие результаты по числу развившихся и завершенных стадий цикла Cryptosporidium parvum наблюдали в клетках культуры: аденокарциномы толстой кишки человека, легкого при лейкозе человека, рабдомиосаркомы человека.

Результаты исследований позволяют считать, что получена удобная модельная система хозяин-паразит-клетка культуры, которая дает возможность контролировать экспериментальный процесс в стерильных строго контролируемых и экономически выгодных условиях; расширяет наши представления об интимных механизмах, лежащих в основе паразито-хозяинных взаимоотношений, что может быть одним из условий при разработке мер борьбы с болезнями, вызываемыми зоонозами - криптоспоридиозами.

Культивирование Cryptosporidium parvum в эмбрионах птиц

Последние десятилетия эмбрионы птиц стали признанными экспериментальными объектами для самых различных биологических исследований, в том числе и для изучения паразитических простейших. Можно с уверенностью сказать, что природа многих тяжелых болезней человека и животных, которые вызваны вирусами и другими инфекционными агентами, осталась бы неопознанной, а, следовательно, была бы

невозможной и профилактика этих болезней, если бы не применяли методы культивирования.

В практических целях, касаясь проблемы криптоспори-диоза, весьма важным представляется поиск и синтез новых высокоэффективных средств из различных химических классов и их быстрое испытание для оценки антикриптоспори-дийных свойств.

До настоящего времени имеются только единичные сведения, свидетельствующие о возможности культивирования Cryptosporidium в эмбрионах птиц. В нашей стране разработка метода культивирования Cryptosporidium в эмбрионах птиц принадлежит Т.А.Шибаловой (1988).

Учитывая, что объектом нашего исследования являются возбудители-зоонозы млекопитающих, получение лабораторной модели - эмбриона птиц - для целей культивирования и изучения возбудителя криптоспоридиоза и другие вопросы, с ним связанные, в лабораторных, строго контролируемых условиях, трудно переоценить.

В этой связи, настоящими исследованиями предусматривали разработку метода культивирования и изучение Cryptosporidium parvum в эмбрионах птиц, впервые выделенного от больных криптоспоридиозом телят в регионе Крайнего Севера (Якутии).

В серии проведенных экспериментов на 8-10-суточных куриных эмбрионах, где в качестве заражающего материала были использованы спорозоиты Cryptosporidium parvum ("Якутский штамм"), установлен полный жизненный цикл развития паразита преимущественно на хорионаллантоисных (ХАО) и амниотических (АМО) оболочках. При гистологическом исследовании выявлены все стадии жизненного цикла: трофозоиты - меронты, гамонты - зигота - ооциста.

Таким образом, нами впервые показана возможность развития в эмбрионах птиц Cryptosporidium parvum , полученных от спонтанно больных криптоспоридиозом животных в регионе Крайнего Севера (Якутии). Впервые заражающим началом использованы спорозоиты, полученные in vitro.

На основании проведенных экспериментов на куриных эмбрионах, можно утверждать, что полученная лабораторная биологическая модель - куриный эмбрион - позволяет изучать криптоспоридии на светооптическом, электронно-микроскопическом и молекулярном уровнях. Имеется возможность использования удобной и экономически выгодной модели для экспресс-оценки эффективности фармакологических и биологических средств, с целью изыскания эффективных антикриптоспоридийных и иммунорегуляторных препаратов, а это, в свою очередь, открывает возможность для решения основной проблемы криптоспоридиоза млекопитающих - лечения и профилактики.

Изыскание эффективных фармакологических и иммунорегуляторных средств при криптоспоридиозе

Несмотря на значительное достижение в изучении проблемы криптоспоридиоза, разработка эффективных методов борьбы и профилактики криптоспоридиоза остается актуальной до настоящего времени, так как нет надежных лечебно-профилактических средств.

Борьба с криптоспоридиозом осложняется тем, что возбудители обладают высокой устойчивостью к различным фармакологическим средствам и вызывают иммунодефицит-ное состояние в организме хозяина.

Последние годы многие авторы при инфекционных и инвазионных заболеваниях животных рекомендуют иммуностимуляторы (Коромыслов Г.Ф. и др., 1985; Шибалова Т.А.,1987; Воронин Е.С. и др., 1991; Даугалиева Э.Х., Филиппов В.В., 1991; Урбан В.П. и др., 1992; Решетников И.С., Боч-карев И.И., 1995; Бочкарев И.И., Шибалова Т.А., 1995; Ноздрин Г.А., 1996; Шибалова Т.А. и др., 1996).

В этой связи нами изучена терапевтическая эффективность некоторых антибиотиков кокцидиостатических и антимикробных препаратов в сочетании с новыми перспективными иммуномодуляторами при криптоспоридиозе.

Опыты проводились в экспериментальных и производственных условиях при наличии восприимчивых и зараженных животных в животноводческих хозяйствах в регионе . Крайнего Севера (Якутии) весной в период массового отела.

В серии экспериментов проведены испытания антикок-цидийных препаратов - фармкокцида, кокцикола; антибиотиков - полимиксина, тилана, а также противомикробного препарата - этония, как с лечебной целью при острой форме криптоспоридиозной инвазии у новорожденных телят, так и с целью профилактики криптоспоридиоза.

Помимо этого, параллельно проведены испытания эффективного, широкого спектра действия антикокцидийного препарата - кокцикола в сочетании с общепризнанным имму-номодулятором Т-активином, полученным из тимуса северного оленя при экспериментальном криптоспоридиозе новорожденных телят.

Условия экспериментов предусматривали изучение: симпотомокомплекса болезни, исследование гематологических, биохимических и иммунологических показателей крови опытных животных.

Анализ проведенных экспериментов показал, что лучшие результаты были отмечены у подопытных животных, леченных кокциколом в сочетании с иммуномодулятором Т-активином. Существенные улучшения симптомокомплекса болезни и снижение степени интенсивности криптоспоридиозной инвазии происходили в течение 10-15 суток после лечения.

Изучая влияние кокцикола в дозе 30 мг/кг и Т-активина в дозе 1,5 мл на животное при однократном введении в течение 7 дней на гематологические, биохимические и иммунологические показатели получили положительные результаты аналогичные данным исследований в контроле.

На 20-е и 30-е сутки при исследовании крови отмечено: увеличение количества лейкоцитов, уменьшение эритроцитов и гемоглобина. Показатели лейкограммы свидетельствовали о том, что у телят подопытных групп в указанный период

уменьшалось содержание нейтрофилов и увеличивалось количество лимфоцитов.

У животных подопытных групп в сыворотке крови зарегистрировали некоторое увеличение содержания глюкозы и ферментов, по сравнению с таковыми в контроле. После применения указанных препаратов наблюдали увеличение количества Т- и В-лимфоцитов.

У телят контрольной группы болезнь протекала в острой форме с прогрессирующей интоксикацией и выраженной диареей; одновременно происходило снижение гематологических, биохимических и иммунологических показателей крови. У таких больных криптоспоридиозом телят отмечалась иммунодепрессия.

Результаты исследования показали, что испытанные антибиотики, противомикробные и антикокцидийные препараты при криптоспоридиозе новорожденных телят не оказали желаемого терапевтического эффекта. Обнадеживающие результаты получены при сочетанном применении кокцикола с иммуностимулятором Т-активином. Это объясняется тем обстоятельством, что течение криптоспоридиозной инвазии сопровождается стойким снижением иммунитета. Учитывая, что в настоящее время иммунодефициты новорожденных телят превратились в проблему, которая требует своего решения, мы считали необходимым продолжить поиск высокоэффективного естественного иммуностимулятора для решения проблемы криптоспоридиоза.

Изучение лечебной и профилактической эффективности рекомбинантного ИЛ-1р при криптоспоридиозе

Лечение и профилактика криптоспоридиоза является актуальной проблемой в настоящее время, так как ни один из многочисленных испытанных антимикробных агентов, включая кокцидиостатики, антибиотики широкого спектра действия и сульфаниламиды, оказались малоэффективными для борьбы с этой болезнью.

Течение криптоспоридиоза в большинстве случаев протекает с развитием иммунодефицитных состояний, сопровождающихся стойким снижением иммунитета и невозможностью адекватной борьбы с проникшим в организм возбудителем заболевания. Возбудители криптоспоридиоза способствуют развитию тяжелого заболевания при дисбалансе хозяина, повышающего его восприимчивость к болезням, и к инфекционным в частности. Применение антибиотиков и других антиинфекционных средств на этом фоне могут еще более усугубить иммунодефицит и привести не к излечению, а к хрониза-ции или прогрессированию заболевания.

В настоящее время группой авторов (Шибалова Т.А., Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Бочкарев И.И., 1995) разработан принципиально новый способ профилактики и лечения криптоспоридиоза с использованием иммуностимулирующего вещества - ИЛ-Iß, синтезированного Государственным научно-исследовательским институтом особо чистых биопрепаратов, АМН г.Санкт-Петербурга, который защищен патентом на изобретение. Благодаря широкому спектру биологической активности, ИЛ-Iß является одним из основных медиаторов развития защитных реакций организма при внедрении в организм патогенов и не обладает видовой специфичностью.

Использование ИЛ-lß имеет преимущество перед антибиотиками и другими химикофармацевтическими средствами, так как данный препарат являясь по своей природе эндогенным медиатором иммунитета, и стимулируя защитные силы организма, не обладает токсическими и аллергизирующими свойствами.

Экспериментальной моделью для воспроизведения и изучения профилактической и лечебной эффективности эндогенного иммуномодулятора ИЛ-Iß при криптоспоридиозной инвазии служили белые мыши линии СВА, а также экспериментально и спонтанно зараженные телята.

Лабораторные опыты проводили на 100 белых мышах линии СВА 20-дневного возраста. Паразитологическими исследованиями исключал! спонтанный криптоспоридиоз у

мышей и заражали последних ооцистами криптоспоридий, выделенными от больных криптоспоридиозом телят в хозяйствах Якутии и Ленинградской области, в дозе 15-20 тыс. экземпляров на животное. Иммуномодулятор ИЛ-ф иноку-лировали подкожно в различные сроки до и после заражения с профилактической и лечебной целью в дозах 0,001 и 0,0001 мг/кг массы животного. У всех животных определяли изменение клеточного состава периферической крови и показатели иммунитета по пролиферативной активности лимфоцитов селезенки и продукции основного медиатора иммунитета - ИЛ-2.

Паразитологические исследования на наличие ооцист криптоспоридий у экспериментальных животных проводили ежедневно.

, - Результаты исследований показали, что у мышат зараженного контроля количество лейкоцитов в периферической крови было низкое (2,5±0,06х 109/л) по сравнению с таковым в группе незараженных животных (9,0±1,6х109/л); низкими, по сравнению с показателями в контроле, были также показатель бластной трансформации лимфоцитов селезенки, индуцированной конканавалином А (4170±374 и 9004±803 мкг/мл) и показатель продукции ИЛ-2 лимфоцитами селезенки (15,1±5,9 и 67,5±14,8 мкг/мл). Максимальное выделение ооцист криптоспоридий отмечали на 7-9-е сутки после заражения.

Значительно лучшими были показатели крови у животных подопытных групп. Так, у животных, получавших ИЛ-1Р за сутки до заражения с профилактической целью, количество лейкоцитов в периферической крови было 7,9±1,0х109/л, а у инвазированных - 2,5±0,6х109/л; показатель бластной трансформации оставался 8886±246 и 4170±374 мкг/мл; уровень продукции ИЛ-2 был равен 24,2±0,7 против 15,1+5,9 мкг/мл. Эти животные не заболевали криптоспоридиозом, а ооцисты выделялись в единичных экземплярах.

Показатели клеточного состава периферической крови, бластной трансформации лимфоцитов в селезенке и уровень продукции ИЛ-2 у подопытных мышей, получавших ИЛ-1р

одновременно с заражением были выше, чем у животных, которых лечили при наличии криптоспоридиоза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что криптоспоридиозная инвазия способствует снижению защитной системы организма. Применение ИЛ-ip положительно влияет на иммунологическое состояние больных животных и существенно изменяет клеточный состав крови мышей. Значительно возрастала доля нейтрофильных гранулоцитов. Число лимфоцитов в периферической крови несколько увеличивалось. Следовательно, изменение формулы крови под действием ИЛ-ip затрагивает, главным образом, гранулоциты. В дальнейшем выяснилось, что под действием препарата увеличивается не только число циркулирующих лейкоцитов, но и их функциональная активность.

При анализе пролиферативного ответа клеток селезенки, полученных от мышей, которым был инъецирован ИЛ-ip, выяснилось, что ответ клеток на стимуляцию поликлональ-ным активатором конканавалином-А существенно увеличен по сравнению с пролиферацией клеток контрольных животных. Кроме того, отмечалось дозозависимое увеличение уровня продукции спленоцитами ИЛ-2. Согласно приведенным результатам под действием ИЛ-1р происходит активация клеток лимфопдных органов. После введения ИЛ-1р лимфоциты приобретают способность гораздо эффективнее пролиферировать при стимуляции митогенными пектинами, имитирующими антигенную стимуляцию иммунокомпетент-ных клеток. Как известно, размножение клонов антиген-специфичных Т- и В-лимфоцитов является одним из решающих этапов развития иммунной реакции.

Иммуностимулирующие свойства ИЛ-1р, отмечавшиеся при введении in vivo , во многом связаны именно с усилением этого этапа развития иммунного ответа. Судя по полученным нами данным, механизмы стимуляции пролиферации иммунокомпетентных клеток заключаются в увеличении под действием ИЛ-1р продукции ИЛ-2, считающегося главным ростовым фактором лимфоцитов. В проведенных исследованиях показано, что после введения животным ИЛ-ip

лимфоциты селезенки интенсивнее продуцируют ИЛ-2 и эффективнее пролиферируют в ответ на один лишь ИЛ-2 без их преактивации лектинами или антигенами.

Таким образом, введение препарата ИЛ-1 животным приводит к активации иммунокомпетентных клеток, заключающейся в усилении ИЛ-2 зависимой пролиферации лимфоцитов.

Нами была изучена лечебная и профилактическая эффективность ИЛ-ip при криптоспоридиозе телят. В эксперименте по принципу аналогов были отобраны телята в возрасте 1-3 суток.

Телятам подопытных групп применяли ИЛ-ip в дозе 510 нг в разные периоды заражения Cryptosporidium parvum: до заражения, в период заражения и спустя сутки после заражения.

В течение всего опытного периода (20 дней) за телятами вели клиническое наблюдение, проводили паразитологиче-ское, гематологические, биохимическое и иммунологическое исследования.

Результаты исследований показали, что применение препарата приводило к увеличению числа лейкоцитов, общего белка и его фракций, а также изменениям формулы крови, с приближением показателей к показателям физиологической нормы.

Значительно сокращалось паразитирование возбудителя криптоспоридиоза у телят, леченных ИЛ-ip в период течения криптоспоридиозной инвазии. Применение ИЛ-ip с целью профилактики криптоспоридиоза снижало развитие крипто-споридий.

Согласно полученным данным введение ИЛ-ip вызывает изменение функциональной активности периферической крови телят - одним из основных показателей резистентности к введению чужеродных агентов. Под влиянием препарата увеличивались показатели фагоцитарной активности, возрастала адгезия и миграционная способность клеток, как показателей способности лейкоцитов активно проходить в очаг воспале-

ния для борьбы с инфекцией; наблюдалось увеличение активности в тесте восстановления нитросинего тетразолия, как показателя переваривающей способности патогенов в процессе фагоцитоза. Приведенные данные свидетельствуют о способности препарата эффективно стимулировать разные стороны функциональной активности лейкоцитов.

Продукция ИЛ-2, служащего основным ростовым фактором для лимфоцитов, является одним из главных показателей состояния клеточного иммунитета, играющего ключевую роль в борьбе с инфекцией. Как показали проведенные нами исследования, препарат обладает способностью усиливать синтез лимфоцитами этого важнейшего медиатора иммунитета. По сравнению с аналогами контрольной группы телят было отмечено значительное возрастание продукции ИЛ-2 и при лечебном и при профилактическом применении препарата.

Анализ полученных данных показал, что применение ИЛ-Ip до заражения, одновременно с заражением и после заражения животных криптоспоридиями приводит к улучшению общего состояния животных и оздоровлению, при существенном возрастании иммунологической реактивности организма. Препарат восстанавливал нормальное содержание лейкоцитов в периферической крови, а также усиливал бласт-ную трансформацию лимфоцитов и продукцию ими ИЛ-2. Наблюдаемые под действием препарата изменения иммунной системы обуславливают значительное усиление защитных сил организма животных, эффективную борьбу с инвазионными агентами и препятствуют развитию заболевания, ведут к выздоровлению организма.

Полученные положительные результаты экспериментальной проверки лечебно-профилактической эффективности ИЛ-ip при криптоспоридиозе крупного рогатого скота позволили нам провести исследования в условиях производства.

В этой связи, производственные опыты по испытанию терапевтической эффективности ИЛ-ip проводили на телятах, спонтанно зараженных возбудителями Cryptosporidium parvum, при наличии выраженного острого гастроэнтерита, в животноводческих комплексах Ленинградской области.

Эксперименты показали, что ИЛ-ip способствовал повышению показателей естественной резистентности организма при криптоспоридиозной инвазии, а также и в случаях ассоциативных болезней с эшерихиозом и др.

На основании полученных нами данных можно утверждать о целесообразности использования иммуномодулятора ИЛ-Ip при криптоспоридиозной инвазии не только с лечебной целью, но и с профилактической, до выделения возбудителя в экзогенной стадии. Это можно объяснить тем, что животные сразу после рождения находятся в критическом периоде, когда даже при минимальном действии негативных факторов у них развиваются иммунодефицитные состояния. При этом, следует учитывать, что нарушение иммунного состояния макроорганизма создает благоприятные условия для развития патогенных возбудителей, которые отягощают общее течение болезни. Эта роль принадлежит и возбудителям криптоспори-диоза - криптоспоридиям.

Полученные результаты в выполненной работе позволяют определить один из реальных путей в системе лечебно-профилактических мероприятий при криптоспоридиозах животных, а также при болезнях новорожденных телят, страдающих гастроэнтеритами и иммунодефицитами.

ВЫВОДЫ

1. В условиях Крайнего Севера (Якутия) в результате негативных природно-климатических, технологических, хозяйственно-экономических и ветеринарно-санитарных условий, широко распространены, преимущественно в зимне-весеннее время, массовые заболевания новорожденных телят, с тяжелым течением болезни желудочно-кишечного тракта и с высокой летальностью. На основании изучения морфобиологиче-ских исследований возбудителя болезни, впервые установлен вид криптоспоридии Cryptosporidium parvum , соответствующий описанному ранее Tyzzer (1910). Экстенсивность инвазии у новорожденных телят отмечалась в пределах 27,8-100%. Источниками инвазии являлись больные криптоспоридиозом

животные, а факторами передачи возбудителя в окружающей среде: предметы ухода, поилки, вода, корма. Естественным резервуаром криптоспоридий служили дикие птицы, домашние и дикие грызуны.

2. Симптомокомплекс болезни телят при криптоспори-диозе, с учетом анализа паразитарной реакции, гематологических, биохимических и иммунологических изменений свидетельствовали, что в организме происходили комплексные изменения, характеризующиеся угнетением окислительно-восстановительных процессов, снижением внутриклеточного метаболизма, закономерным формированием и изменениями иммунного статуса как общего признака патогенеза животных при криптоспоридиозной инвазии.

3. При культивировании Cryptosporidium parvum "Якутский штамм", со стадии спорозоитов, полученных in vitro воспроизведено развитие стадий жизненного цикла возбудителя. Выявлено внутриклеточное развитие паразита в несвойственных для него условиях - клетках эмбриональной трахеи крупного рогатого скота (TR), почек теленка (ПТ), почек мышей (EL-4), аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320), легкого при лейкозе человека (L-41), рабдо-миосаркомы человека (RD). Установлено, что лучшее внедрение и развитие стадий жизненного цикла криптоспоридий происходило в клетках культуры: аденокарциномы толстой кишки человека (Colo-320), легкого при лейкозе человека (L-41), рабдомиосаркомы человека (RD). В этих клетках число развившихся паразитов превышало таковое в других использованных нами клетках культуры.

4. Отработан метод культивирования Cryptosporidium parvum со стадии спорозоитов, полученных in vitro в эмбрионах птиц. Показан полный жизненный цикл развития паразита на хорионаллантоисных и амниотических оболочках.

5. В результате культивирования Cryptosporidium parvum в различных клеточных культурах и эмбрионах птиц получена модельная система хозяин-паразит-клетка-эмбрион, открывающая возможность более детально контролировать экспериментальный процесс в строго контролируемых и экономически выгодных условиях, расширяет наши представле-

ния об интимных механизмах, лежащих в основе паразит-хозяинных взаимоотношений, что может быть одним из условий при разработке мер борьбы с болезнями-зоонозами, вызываемыми криптоспоридиями. Модельную систему хозяин-паразит-клетка-эмбрион можно использовать в качестве тест-объекта для предварительной экспресс-оценки антикрипто-споридийной активности фармакологических средств в отношении возбудителя криптоспоридиозной инвазии.

6. При криптоспоридиозе новорожденных телят показана целесообразность сочетанного применения антикокцидий-ного препарата кокцикола с иммуномодулятором Т-активином.

7. Впервые в ветеринарии испытан рекомбинантный иммуномодулятор ИЛ-1Р в экспериментальных и производственных условиях при криптоспоридиозной инвазии.

8. Рекомбинантный иммуномодулятор ИЛ-1Р, испытанный на лабораторных животных, показал высокую биологическую активность и отсутствие побочных явлений негативного характера. При введении препарата подкожно в различные сроки - до и после заражения животных криптоспоридиями - в дозах 0,001-0,0001 мг/кг массы уровень неспецифической защиты организма мышей повышался. В крови возрастала доля нейтрофильных гранулоцитов. Число лимфоцитов в периферической крови увеличивалось. Под действием препарата увеличивается не только число циркулирующих лейкоцитов, но и их функциональная активность. Разработана и апробирована коррекция иммунного статуса больных крипто-споридиозом животных и профилактика болезни ИЛ-1Р в экспериментальных и производственных условиях, с учетом специализации зональных и экологических особенностей ведения животноводства. Показано, что препарат ЛЛ-1Р обладает многогранным биологическим действием, заключающимся в активации различных типов клеток-мишеней; стимулирует неспецифическую резистентность, вызывая выход нейтрофильных гранулоцитов в кровоток, усиливает их миграцию и функциональную активность, а также способствует ускоренному созреванию предшественников лимфоцитов и усиливает пролиферативный потенциал иммунокомпе-

тентных клеток - бластнуго трансформацию лимфоцитов и продукцию ими ИЛ-2.

9. Иммуномодулятор - ИЛ-1Р в организме телят вызывает комплексные изменения позитивного характера в течение 1-2-месячного наблюдения. Активность препарата зависела от дозы, кратности, периода инвазированного процесса, индивидуальных параметров организма. С профилактической целью препарат вводят животным, начиная с первых суток после рождения, в дозе 5-10 нг/кг массы 1 раз в день трехкратно с интервалом 48 часов. С целью лечения препарат применяют в дозе 10 нг/кг массы 1 раз в день в течение 3 суток. Определена возможность коррекции иммунного статуса больных крипто-споридиозом животных и их профилактики.

10. Механизм стимуляции под действием ИЛ-1р, лежащий в основе противоинфекционного действия препарата, заключается в повышении функциональной активности нейтро-фильных гранулоцитов, индукции дифференцировки предшественников иммуноксмпетентных клеток, усилении пролиферации лейкоцитов и увеличении антителообразования. Препарат имеет преимущество перед, антибиотиками и друга-ми химиксфармакологическими средствами, так как данный препарат, являясь по своей природе аналогом естественного медиатора иммунитета, стимулирует защитные силы организма, не обладая токсическими и аллергизирующими свойствами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные данные могут служить научно-теоретической основой для разработки мероприятий по профилактике и иммунокоррекции иммунодефицитных состояний у телят при криптоспоридиозной инвазии.

Материалы диссертации включены в следующие нормативные документы:

•Методические рекомендации "Профилактика вирусных и протозойных болезней (парагриппа-2, аденовирусной ин-

фекции, инфекционного ринотрахеита, криптоспоридиоза) молодняка крупного рогатого скота": Утвержденные ученым советом Якутского НИИСХ (1991);

•Рекомендации "Система ведения агропромышленного производства Республики Саха (Якутии), производство и переработка продуктов животноводства": Утвержденные НТС МСХ и П Республики Саха (1992);

•Методические рекомендации "Культивирование крип-тоспоридий (Cryptosporidium) в клетках культуры тканей и эмбрионах птиц": Рассмотрены и одобрены президиумом академии Нечерноземной зоны Российской Федерации и ученым советом Санкт-Петербургской государственной академией ветеринарной медицины (1995).

•Патент на изобретение "Способ профилактики и лечения паразитарных и инфекционных болезней с использованием интерлейкина-1": Заявка N 95-112605/15 (022333) от 03.08.95.

•"Временное наставление по применению ариветина в ветеринарии (в порядке широкого производственного испытания)": Утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ и П России N 13-5-2/665 от 27.06.96 г.

Список опубликованных работ, отражающих содержание диссертации

1. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Развитие Eimeria bovis в клетках культуры тканей // Тез. докл. 4-го съезда Всесоюзн. обществ, протозоол. "Современные проблемы протозоологии",- Л., 1987.- С.35-36.

2. Бочкарев И.И. Распространение криптоспоридиоза телят в Якутии// Профилактика и лечение болезней животных: Науч.-техн. бюлл./ЯНИИСХ,- Новосибирск, 1989,- С.3-5.

3. Шибалова Т.А., Бочкарев И,И. Ультраструктурная организация интактных спорозоитов // Профилактика и лече-

ние болезней телят в Якутии: Науч.-техн. бюлл. / ЯНИИСХ. -Новосибирск, 1989,- С.9-11.

4. Бочкарев И.И., Ларионов Г.М. Криптоспоридиоз телят // Краевая патология сельскохозяйственных животных Якутии: Сб.науч.тр. /ЯСХИ. - Якутск, 1990.- С.20-23.

5. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Эксцистирование спорозоитов эймерий крупного рогатого скота // Лечебно-профилактические мероприятия по охране здоровья животных в Якутии: Сб.науч.тр. / ЯНИИСХ.- Новосибирск, 1990.-С. 17-20.

6. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Роль криптоспоридий в диареи телят // Вузовская наука сельскохозяйственному производству: Сб.нау.тр./ЯСХИ.-Якутск, 1991.- С.28-31.

7. Бочкарев И.И. Криптоспоридиоз телят II Профилактика вирусных и протозойных болезней (парагриппа-2, аденовирусной инфекции, инфекционного ринотрахеита, крипто-споридиоза) молодняка крупного рогатого скота: Ме-тод.реком,- Новосибирск, 1991,- С. 19-23.

8. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Электронно-микроскопические исследования Eimeria bovis в норме и под действием химических препаратов // Тез. докл. 5-го съезда Всесоюзн. общ. протозоол.- Цитология.- 1992, N4,- Т.34,-С.31-32.

9. Бочкарев И.И. Криптоспоридиоз крупного рогатого скота // Система ведения агропромышленного производства Республики Саха (Якутия) производство и переработка продуктов животноводства: Рекомендации.- Новосибирск, 1992.-С.95.

10. Бочкарев И.И. Испытание химиотерапевтических препаратов при криптоспоридиозе телят // Селекция, разведение и болезни сельскохозяйственных животных Якутии: Сб.науч.тр./ЯНИИСХ. - Новосибирск, 1993.-С.80-83.

11. Бочкарев И.И., Решетникова И.С. Влияние Т-активина на иммунную систему телят, больных криптоспори-диозом // Эпизоотология и профилактика болезней животных

в условиях Якутии: Сб.науч.тр. / ЯНИИСХ.- Новосибирск,

1994.- С.54-61.

12. Решетникова И.С., Бочкарев И.И. Задачи производственной апробации серии Т-активина из тимуса северных оленей и якутских лошадей // Сб. науч.тр. / ЯСХИ.- Якутск,

1995,-С.27.

13. Решетников И.С., Бочкарев И.И. Иммуномодуля-торы при экспериметальном криптоспоридиозе телят // Тез. докл. регион, конф. "Экологические и генетические исследования в Якутии".- Якутск, 1995.-С.94.

14. Бочкарев И.И., Решетников И.С. Криптоспоридиоз крупного рогатого скота // Тез. докл. междунар. конф. "Актуальные проблемы ветеринарии".- Барнаул, 1995.- С.119.

15. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Изучение эффективности иммуностимулятора с кокцидиостатиками при криптоспоридиозе телят // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб.науч.тр. / СПбГАВМ.- СПб, 1995, N124.- С.9-10.

16. Шибалова Т.А., Бочкарев И.И. Эксцистирование оо-цист Cryptosporidium parvum // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб.науч.тр. / СПбГАВМ.- СПб., 1995, N124.- С.40-42.

17. Шибалова Т.А., Бочкарев И.И. Культивирование Cryptosporidium parvum в клетках культуры тканей И Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб.науч.тр. / СПбГАВМ.- СПб., 1995, N124.- С.43-44.

18. Бочкарев И.И. Криптоспоридиоз и его распространение в Якутии // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб.научн.тр./ СПбГАВМ. -СПб., 1995, N124.- С.44-45.

19. Шибалова Т.А., Бочкарев И.И. Культивирование криптоспоридий (Cryptosporidium) в клетках культуры тканей и эмбрионах птиц: Методические рекомендации. -СПб., 1995.14 с.

20. Шибалова Т.А., Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Бочкарев И.И. Решение о выдаче патента на изобретение "Способ профилактики и лечения паразитарных и инфекци-

онных болезней с использованием интерлейкина-I". Заявка N 95-112605/15 (022333), МПК6А61К 39/108 от 03.08.95.

21. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Криптоспоридиоз крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия) // Тез. докл. науч. - практ. конф. "Паразитологические проблемы больших городов".- СПб., 1996.- С.17.

22. Касаткина Н.В., Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Изучение механизмов действия кокцидиостатических и имму-норегуляторных средств в отношении Cryptosporidium parvum в организме инвазированных мышей // Тез. докл. науч. -практ. конф. Паразитологические проблемы больших городов",-СПб., 1996,-С.45.

23. Шибалова Т.А,, Бочкарев И.И. Развитие Cryptosporidium parvum в клетках тканей и экспресс-оценка фармакологических средств in vitro // Тез. докл. науч. - практ. конф. Паразитологические проблемы больших городов".-СПб., 1996.- С.113-114.

24. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А., Владимиров Л.Н. Новый способ профилактики инфекционных и инвазионных болезней II Тез. докл. Межвуз. науч. - практ. конф. "Наука -невостребованный потенциал".- Якутск, 1996,- С.67-68.

25. Шибалова Т.А., Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Бочкарев И.И. Перспективность использования цитокинов в ветеринарии // Тез. докл. Межвуз. научн. - практ. конф. "Наука - невостребованный потенциал". - Якутск, 1996.- С.69-70.

26. Шибалова Т.А., Бочкарев И.И. Ультраструктурное изучение механизма действия испытуемых средств в отношении криптоспоридий в организме экспериментальных животных II Тез. докл. Межвуз. науч. - практ. конф. "Наука - невостребованный потенциал".- Якутск, 1996.- С.68-69.

27. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Взаимоотношения в системе паразит-хозяин при криптоспоридиозе // Тез. докл. III конгресса междунар. ассоциации морфологов. Морфоло-гия.-СПб., 1996.- N2.-C.38-39.

28. Решетников И.С., Бочкарев И.И. Апробация лечебной

эффективности Т-активина, полученного из тимуса северного оленя // Тез. докл. 1-ой междунар. конф. "Знание - на службу нуждам Севера". - Якутск, 1966,- С.104.

29. Шибалова Т.А., Решетников И.С., Бочкарев И.И., Владимиров JI.H. Механизм действия кокцикола и Т-активина в отношении криптоспоридий на экспериментальной модели // Тез. докл. 8-ой

межгосуд. науч. - практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии".- СПб, 1996.- С. 60-61.

30. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А., Владимиров Л.Н. Механизм защиты инфицированного макроорганизма биостимуляторами // Тез. докл. 8-ой межгос. науч. - практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии".- СПб., 1996.- С.67-68.

31. Шибалова Т.А., Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Бочкарев И.И., Владимиров Л.Н. Использование цито-кинов в ветеринарной медицине // Тез. докл. 8-ой межгос. науч. - практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии".- СПб., 1996.- С.81-82.

32. Бочкарев И.И. Цитомедины для коррекции иммунодефицита у животных // Сб. науч.тр. СПбГАВМ.- СПб., 1996.- N125.- С.17-18.

33. Шибалова Т.А., Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Бочкарев И.И. Изучение влияния эндогенного иммуно-модулятора интерлейкина-ip для профилактики и лечения криптоспоридиоза животных // Сб. науч.тр. СПбГАВМ.-СПб., N125.- С.82-83.

34. Временное наставление по применению ариветина в ветеринарии (в порядке широкого производственного испытания до 01.07.98 г). Утвержден Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 27.06.96. N13-5-2/665.

35.Reshetnikov I.S., Botckarev I.I., Vladimirov L.N. Obtalning and testing normonal prepation on sick animals suñering from an irnmune deficiency // 2 nd circumpolar

agricultural conference. Agriculture as a Fundament for Rural Development in Circumpolar Arcas.- Tromso, Norway, 1995.-P.10.

36. Reshetnikov I.S., Bochkarev I.I The aprobation of medicinal effectiveness of the T-activin, obtained from the northern reindeer thymus // Northern knowledge serves northern needs. The first international conference.- Yakutsk, 1996.- P.94.

Подписано к печати 21.11.96 г. Объем 2,0 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Формат 84х10\8 Тип. СКБ "Иникатор" 197000, Санкт-Петербург, ул. Шкапина 32/34