Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервирование и морфологическая оценка эмбрионов коров мясного скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервирование и морфологическая оценка эмбрионов коров мясного скота"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи УДК 612.646.02

Байт лесов Ербупат Упиевич

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭМБРИОНОВ КОРОВ МЯСНОГО СКОТА

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

п. Дубровицы Московской области 1992

. Работа выполнена в Центре по трансплантации амбра онсв с.-х. животных Есе российского научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель - доктор бйологичзских наук,

профессор Е.И.Сергеев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор ИЛ.Шахов, кандидат биологических наук А.Е.Ковгородов.

Ведущее учреадение: Российский зоотехнический институт иовышеиая квалификации и переподготовка кадров.

Защита диссертации состоится 6 " .¿¿/¿¡^б1993 г. в № " часов, ва заседании специализированного совета Д.020.16.02 при Всероссийском научко-ссследовательском институте животноводства. .

. -Адрес инстатута: 142012, Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровацы. ■

О диссертацией иогшо ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь спешализированного Совета кандидат биологических наук

И,И,Ш1<шгик

j

î. ОБЦАЯ ХАРАКТ2И СТЛКА РАБОШ

Одним аз основных резервов увеличения производства продукции зшвотноводства является по£ш:екяв плодовитости сельскохозяйственных навотных. Однако традиционные метода повышения плодо-зптост»; не отвечает современный требованиям ускоренного воспро-:звсдства и;вотянх. Резение проблем состоит в переходе от естественных к искусственным способам воспроизводства .тавотных.

Для осуществления этой задачи болваса значение отводятся срансплантацин эмбрионов, как одной ез новейиих методов управления воспроизводством пл£.\:ет)о?о а пользовательного скота.

Программа тракеллантадш? морионов вклвчает в себя кетод 5ачоралзБакяя и длительного хранения эмбрионов выдающихся зглво-гнях, вследствие чего отпадают затрата на содержание большого юличества реципиентов, появляется возмогшоеть подбирать реца-кентов в зависимости от возраста и стадии развития эмбрионов.

Очень вазнм в сохранении яазнеспособноста энбраонов пра срлоконсерЕнроЕанаа является использование хриолротекторов,что гозволяет сказать тсч.-су замерзания, связывать внутриклегочнув зоду и защитить структуру клеток от разрушения.

На процесс успешного краоконсервирования оказывает большое »лаяние я совокупность охлаздапцнх скоростей, на основания' которых выполняется программные зачорахивания.

Бользуя актуальность я/практическую значимость й^еет таз-' ¡еспособнозть ьмбрзеноз. Так как or их качества в основном за-шезт исход зауоратлрелля л результата нехирургачесхой переса. - ;

Кесмотра на привлекательность трансплантации омбрисноз у . соров ¡/ясных пород, в практических подходах использования остался много неясного. Tait, лрз глубоком зайор&казанаи эмбрионов : использованием различных концентраций краопрогекторов, сраха-1ляемость после чехярургичзской переездка остается кизкой.С чем ¡то связано - с породой ала другима сзчгораг.сз - eçe нрсдстоаг шчекзть.

Цель исследованйГ; заключалась в усовершенствовали техно-ют гаморагавания 2 отвсаакя, мор^ояогдчзской оценка качества и нахпрургическол пересадки эмбрионов коров казахской белоголовой породи.

В задачу исследований входило:

- определить влияние концентрация краопротектора глицерина, способа его наснщеная и выведения на хазнесдособность эмбрионов после замораяиванвя а оттаивания;

- изучать зависимость жизнеспособности эмбрионов от рехи-иа замораживания а типа загораетэателя;

- установить зависимость жизнеспособности эмбрзоксв от продолжительности их хранения в транспортировки в гадком азоте;

- определить влияние некоторых факторов на принавляе.мость замороаенно-оттаянных эмбрионов при нехирургической пересадке.

Научная новизна исследований состоит в определение влияния краопротектора глицерана, его насыщеняя а выведеная,скорости охлаждения и оттаивания на вьшваемость эмбрионов.А такке в изучении влаяквя некоторых факторов на результаты нехирурги ческой пересадка.

Практическая значимость работа заключается в усовердакст-вованиа заиоралшвашш эмбрионов в газообразном азоте пра исао-льзованад краопротектора глицерина с одноступенчатым насыщена-ем я выведением его раствором сахарозы, что дает возможность упростить процесс крдоконсервлрования н использовать метод в производственных условиях степной зоны Казахстана, где часты случай отключения электроснабжения.

Апробашя полученных результатов. Основные положения диссертация доложены и получали полозательнув оцзнку на:

- кзжвузовской ваучно-пракэдчеекой конференция молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы сельскохозяйственного производства", г. Уральск, 1991 г.;

- 44-й научно-методической конференций аспирантов а молодых ученых "Проблемы интенсификации кавотяоводетва", нос. Дуброва цн, ШК, 19-20 ишя 1991 г.;

- 11-8 меареспубликанскоЗ научно-практической конференции колодкх ученых и специалистов "Резервы увеличения производства и повшешя качества сельскохозяйственной продукции", г. Оренбург, 1992 (24-25 карта).

Объем работа. Диссертация кзложепа на J03 страницах машинописного текста. Состоит из видения, обзора литература, результатов собственных исследований, su водов а практических предложений. Содержит 1Э таблиц, Z с хеш, 8 рисунка и прило-некля. Сшсок попользованной литературу включает 170нааменова-ний, в том чделе 113 иностранных.

2. iimrm ч шо.цн исследований

Исследования прозо;*.<й в пгзнзазоде "Чапаевский", совхозе "Березовский", СП "Зулзт-% ^-¿ио-статном хозяйство "Фрунзенски 3й Заладно-Казахстачскдч с^-лпкЗо

В качестве дояороэ -эм&р&ие Сада яспользованы 110 чистопородных коров казахской бзяох'о'лгзий 'города класса элита и эла-та-рекорд в возраста от 3 дг- X* лм?с

В качество рещплентоэ SwtKMweaass телок случного возраста (18-20 .тес.) я молодых £о;оэз {1-3 отелов) казахской белоголовой я в отдельных случаях йокз-'яой дородн, клинически здоро-eux, без отклоненэй в репровдулч.'зких опгачах и нормальной половой цакликой. Коров-доноров отбирали по племенной ценности»воспроизводи тольнын качествам на основе дашшх зооветеринарного учета и по физиологическому состоянии половых органов.

При проведении опита максимально учитывала проазводствен-ные условия и традиционную технологии разведения я содержания мясного скота. Так, в летнее время животные содержались в летних лагерях на пастбище, а з зи:>з«е - на стационар« со свободным выходом ка нагульный кормовой двор. Кормление осуществляли с учето:.! физиологического состояния ц продуктавности животных согласно норм я рационов, установлен^« в хозяйстве.

После прОЕЭдеикя ректального исследования на наличие аел-того тела у доноров осуществляла гормональную обработку препаратам ФСГ-фоллитропак (Литва) в дозе 1200 ИЕ, грофоллоя в дозе 1000 ИЕ, ФСГ-а (СЛ) в дозах 42 я 52 кг, ГСЖ (ЧСФР) в дозе 3000 ИЕ, Обработку проведали на 8-12-й день полового цикла по 4-дневной схеме с двукратном введением простагландана(эстрофая) в дозе 500 ккг. .

Большинство коров-доноров была витаианазировазы комплексным препаратом "Тетраглт" в дозе 5 а 10 ил на 2-й день эстраль-

вого цикла, перед гормоаал: кой обработкой.

Искусственное осеменение коров-доноров осуществляли через 48часоз после введения эстрсфана двукратно с интервалом 8-10 часов двойной дозой свеязислученной разбавленной (1:3 я 1:6),

хранивлейся пра 0°с спермой с активностью 5 баллов и концентрацией болиз 30 млн/мл, а такге эаморохенно-оттаянной спергой бы-коБ-улучлателей, оцененных: по качеству потомства. Змбряокы извлекали у коров-доноров нехирургачесюш методом с использованием резиновых категоров.

Морфологическую оценку жизнеспособности свежеполученных в заыирог знно-отгаднньк эмбрионов ьрозодила по пятибалльной шкале, разработанной в В!1е. ,

При подготовке эмбрионов к заыор&чивадию их насыщали раствором глицер.на в 1,4 И концентрации многоступенчато а односту-пенчаго.

Прв исаользовзнии многоступенчатого катода эмбраоны последовательно выдергивали по 5 кинут в каздой концентрации краоп-ротектора. После выдёрккн в последнем растворе эмбраоны помещали в камеру замораживателя. В одноступенчатом методе насыщения эмбрионы сразу помещала ъ каплю 1,4 М раствора глицерина на часовом стекле я выдерживали 20 шнут .после чего подвергали замораживанию.

Замораянвали эмбраоны на программном замораэдвателе ЗЭ.\!-4 и ЗЭУ-1 без блока программного управления и в газообразном азоте.

Эмбрионы была разделены на 3 группы. Первую группу эмбрионов охлаадалк от +20°с до шнус 7°С со скорость» с автоматической кристаллизацией, затем со скоростью О.З^С/ыануту до минус 35°с с воследухщям помеданаем в яздкай азот. Еторузо -охлзлдалн от плюс 20°с до шнус 40°С со скорость п от 1,?°С/мия, третью - со скоростью от 1,5°с/шн.

Эмбрионы оттаавали в водяной бане при температуре 25 и 30°С в течение 10 секунд, затем переносила ка часовое стекло. Контролировали наличие эмбраона под бинокулярной лупой в удаляла краопротектор в обратной последовательности при мкогостуденча-тоы насыщении. При одноступенчатом насыщении отмывание осуществлялось сахарозой.

После отмывания зубраонсв от краопротектора их подвергала [ор$ологичесно2 оценке, и пересаживала реципиентам.

США ИССЛЕДОВАНИЙ

Качество и стадия разнятая э:

íбраонсв до замораживания

{огоступенчатое юыщение а выведение эиопротектора из ¿браонов

Замораяаватела

ЗЗМ-4-s

I

сбразный азот-

одноступенчатое насыщение и выведена а краопротектора из эмбрионов

Еаэнеспособность и пракавляемость заморонедао-оттаянных эыбряоаов

Фактор, вляяюязе на ннзнеспособность я прааивляеаость эмбрионГУ

пера- стадия качество а от- разви- эмбрио-ваная тая нов

время XOíi-неняя эт-раоной до ззморак*?-вання.

транс- качест- сезон порти- во кедровка того . тела

года

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Оценка качества'эмбрзонов у мясных коров

В технологии трансплантации эмбрионов большое практическое чеш;е дмеет оценка их биологической полноценности перед перекоп ила краокоисервярованаем. Морфолотческая оценка заклта-я в отборе яеоплодотзореннкх яйцеклеток, кор/ллъных и дегене-овашнх гибр-лонсз, определение стада Z разгзтая я выявлении по-адекай отдельных бластомеров или всего зародыша..

Показатели морфологической оценка очень важны, так как када-мор5олсгичеекая разнокачествешос'ть является показателем фа-доги ческой и биологической неполноценности зародшей. Ссобсз;

внимание обрадаиг на колебания объема яйцеклеток, их фор.у, целостность, состояние прозрачной оболочки и протоплазма,

Еа алогически полноценными считазл зародыши, имеыцне шарообразную форму, гомогенную цитоплазму, неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомзры с плотным межклеточным кошактом. Эмбраоны должны соответствовать по уровню дробления возрасту от оплодотворения до их извлечения.

Различают морулк и бластоцисты на разных стадиях развития. Нормальные ыорулы имеют форму сферы. У некоторое ыорул отдельные клетки могут выпячиваться в перявителлиновое пространство, на их поверхности допустимы небольшие дитоплазматичеекке пузырьки.

У Еор,ильной ранней бластоцасты просматривается небольшая полость, поверхность клеточной массы гладкая, равномерная, пера-вителлановое пространство маленькое.

Морфологически нормальная поздняя бласгоцяста имеет утонченную прозрачную оболочку, форму правильной сферы, полось большая, пераватяллиновое пространство отсутствует.

Условно-годными для трансплантации считают эмбрионы со значительными морфологическвш отклонениями: сколы зоны, наличие вакуолей, гранул в перавлтеллиновом пространстве, выделением большой части бластоыеров. Эмбрионы, отегащае в развитии на день вымывания с асинхронным дроблением Сластомеров и наличием их грануляций относят к непригодным для трансплантация.

Исследования показали, что из общего числа 521 свегеполу-ченных эмбрионов нормальных было 32$, или 62,7^, дегенярованных 106 (20.3£), не оплодотворенных яйцеклеток 89 (17.0Я, эмбрионов отличного качества на разных стадиях развития было 20,6% от общего числа зародышей (табл. I). Меньше всего отличных эмбрионов было на стадии ранней и поздней ыорулы (13,6% и II,7$). Процент ях увеличивается ва стадия ранней (23,81) и поздней бластоцисты (68,8$).

На стадии ранней морулы отмечен низкий процент (31,8:2) эмбрионов хорошего качества и относительно васокай процент удовлетворительных эмбрионов (54,б£), Более поздние стадии характеризуются наличием высокого числа хоредах эмбрионов, снигенае» количества удовлетворительных я условно годных.

Таблица I

%ачс-с-во и стадия раз ел тля оибрзонов коров ка 7-Г день извлечения

казатела Всего Стадия развитая

корулн : бластоцкстн

ранняя поздняя: • ранняя "'поздняя

ело э?.;бр::о- е 432 47 239 104 42

сцент от с-б-го числа 10,9 55,4 24,0 9,7

т.ч.:

ормальннх 326 22 188 84 32

рецэкт ог З^его чпе-з нормз.'ь- 75,5 6,7 57,7 25,8 9,8

106-24,5 25-53,2 51-21,3 20-19,2 10-23,8

з к:;х:

глл чньис 67-20,6 3-13,6 22-11,7 20-23,8 22-68,8

эродх 175-53,6 7-31,3 108-57,4 52-62,0 8-25,0

юглетво-5тельных 84-25,8 12-54,6 58-30,9 12-14,2 2-6,2

Статья рглнеП бластоцасты от поздней морулы отличалась петы:;;!:.! процекто..! с?.:бр;ю.чоз хорошего качества (62,0'А против ,4 2) л кеныим числам удовлетворительных (14,2 и 30,2%).

Для поздаах (5л аст сдаст характерно наллчяе высокого процеп-эьЗронов отличного (£8,8,1) и хорового качества (25,02) и Зольеого 42ела удовлетворительных зкбрионсв (6,2л). Эмбраоии >ов .'/ясных пород п.'лела более рыхлу» структуру с несколько сс-'лекной связью :.:еэду блаезегдергмз. Наблвдаялсь некоторые раз-ия в скорости разлитая одковозраеткых зг-:бр;:сноз у коров до-юз г:олсчй:-ос л пород. Есла у «олочшх коров ка 7 день

тчойхя число поздних кору.ч от общего часна извлеченных сос-жы тогда 1'лк у ячошх коров 53,Количество ранках югоцзст сос гадало 24,0.1, Кро;,:о поздаеЗ морулн и ранней блас-ксгн у глачлх коров нэвлакали эмбраоан на стадия рзшгоЛ мо-

рулы 10,9-2 а поздней бластоцнсты (9,7?).

Приведенные результата по стадиям разштия одновозрастных эмбрионов мясных коров согласуется с данными других исследователей.

Существует мнение, что возраст коров-доноров влияет на число и качество эмбрионов. Б экспериментах использовали коров разного возраста, которые была разделены на три группы - 3-5, 6-9 и 10-13 лет.

В таблице 2 показано, что у коров разного возраста число нормальных эмбрионов в неоплодотворенных яйцеклеток на донора было практически одинаковом.. Однако с увеличением возраста коров число дегенерированных'у'вгличлзается. Так, в первой группе (3-5 лет) ах было 12,3$, во второй - 22,4$ и в третьей - 21,52, при общем числе зародышей - 5,7, 6,7 и 7,0 и нормальных эмбрионов - 4,0, 4,1 и 4,3 на донора соответственно. Приведенные данные позволяют заключать, что коровы в возрасте от 9 до 13 лет могут быть использованы в качестве доноров эмбрионов.

Таблица 2

Количество и качество зародышей у коров разного возраста

Показатели Возраст (лет)

.3-5 : 6-э. ! 10-13

Обработано животных 17 . •44- 18

Число овуляций на донора 8,4±1,12 9,8+1,20 9,2+0,86

Получено зародышей 5,7+0,62 6,7Ю,64 7,С®),60

В том числе:

нормальных 4,0+0,60 4,1+0,62 4,3^0,56

процент от числа зародышей 70,2 61,2 61,4

дегенерированных 0,7+0,18 1,5+0,40х 1,5+р,38х

не оплодотворенных яйцеклеток 1,0+0,21 1,1+Р,25 1,2+0,26

Р > 0,95.

3.2, Влияние скорости охлаждения а отогрева на жизнеспособность и праздвляемость эмбрионов

Для эффективного использования метода трансплантации больное практическое значение имеет круглогодовое получение эмбрионов от ценннх в племенном отношении коров с последующей сезонной их пересадкой реципиентам. В связз с этим усовершенствование сутцествущих и разработка нових кетодов краокоясервирования эмбрионов приобретает особое значение.

Основным направлением асги-^тоЕанай в области замораживания гвляется поаск наиболее простых а эк он сшчкых, но в то хе время эффективных методов краоксксервации я оттаивания зародаяей, позволяющая максимально сохранить их жизнеспособность.

В последние годы появились сообщения о возможности упрощения технологии крзоконсергироваяая змбраонов путем использования ускоренного рекиг/л охлаздения. Применение з качестве кра опротек-гсра глицерина я так называемого быстрого метода замораживания цает возможность существенно упростить технологию краокснсерва-рования биообъекта. Особый интерес представляет введение раствора сахарозы в различных комбинациях э зависимости от концентрата краопротектора.

Главным в наших исследованиях было определение влияния ускоренного зачорагявания в газообразного азоте на казне способность з праглвляемость эмбрионов, а также сравнение эффективности различных режимов охла*деш:я и программных заморанаватеяэй.

Проведенные испытания раз них замораяавателей: показали, что етзнеспособность эмбраонов после отогрева в группах была почти одинаковой. Так, при заморажаванаа на заыоразявателе ЗЭМ-1 жизнеспособных зыбраснсв было 81,2/5; газообразная азоте - 80,6* и га заморакавателе 331Л-4 - 83,2? (табл. 3).

Стельность после пересадка о алюро.т.ешо-оттаянных эмбраонов составила 34,8,?, 36,2,1 а 39,23, соответственно.

Сравнительные результаты испытаний 3-х моделей з ам орана ва-гелей показала, что любое яз испытанных устройств может быть использовано о равной долей успеха в практической криобиологии.' <1;,:е:о;:;леея различая, вероятно, связаны с качеством эмбрионов _пе-

ред замораживанием

Таблица 3

Влияние способа замораживания на жизнеспособность и щинивляемость эмбрионов

Показатели

Заморагавагели

ЗЭМ-4 : ЗЭМ-1 : газообразный : : азот

Заморогено и оттаяло эмбрионов

Еазнеспособных эмбрионов

Процент

Пересаяено эмбрпснов Стельных реципиентов Процент отельноета

79

83,2

79

31

39,2

95

69 81,2 69 24

34,8

35

68

55 80,8 55 20 38,2

Сравнительные испытания замораживали.; эмбрионов на мобильном заморалавателе ЗЭМ-1 и в газообразном азоте показывают, что этот технологический прием может быть э$фективно применен в экстремальных условиях ферл с неустойчивым электроснабжением.

Всгьицм в сохранении жизнеспособности эмбрионов является их оттаивание, которое зависит от температуры водяной бани. Выживаемость эмбрионов, оттаянных при температуре водяной бани +30°С составила 84,6^, или на 6,8$ больше, чем пра отогреве при'температуре +25°с (77,8$). Оцнако процент стельности был ннке на 5,4;? в первом случае (табл. 4).

Финальной ступенью краоконсерЕироэания является разбавление крзопротектора в о.чбриона-г после их оттаивания. Пра многоступенчатой насыщений краопротектород сохранность эмбрионов после оттаивания и стельность после пересадка была практически одинаковой (табл. 5).

Пр одноступенчатом насыщении краояротектором и выведение его аз клеток раствором сахарозы в две ступени показало,относительно равные результаты (табл. 6).

Таблица 4

Влияние температура оттаивания на жизнеспособность и прсгавляемость э«брзонов

оказатели : Температура оттаивания

; +25 ; +30

»гтаяно эмбрионов 99 149

йзнеспособншс эмбрионов 77 126

процент от числа оттаянных 77,8 84,6

[ересаяено змбраонов 77 126

■тельных реикыентов 31 44

'роцент стельности 40,3 34,9 Таблица 5

Хчзнеспособчость и лриетвлкемость э.мбри онов пря

кногостуиьнчат м и?.едена а кряопротекторсм

1ою?.затели ! Замораливатели

: ЗЗМ-4 : 33.'ч-1 « * : газообразный ; азот

Заморожено и оттаяно экбрзо-

10В

^неспособных эмбрионов 1роцент -

¿зресажеяо эмбрионов ^телтзых оя.

процент с^олькизгл

55 44 80,0 44 . 18 ■10,9

45

25

77,8

35

ТУ

37,1

33 29

76,3

29

II

37,9

Жизнеспособность- и прзетвляе: одноступенчатом насыщении и

■ ' . Таблица 6 ]Ость змбраонов при хыв^дениа краоттрствктсра

Показателя

Заморажаватэлн

ЗЙ.'.-

газообразней азот __

Захоронено я оттаяно эмбрао-

коз 40 &изнеспоссбаых эмбрзоксв • 35

Произн? 87,5

Пеоесааеио эмбрионов 35 -

Стёлышх роцап&ентов ХЗ

Процент стельности 37,1

40

34 . 85,0 'К И

32,4

00

"6 . 86,7

г:>

9

34,6

Не было отмечено заметках ыоргрологаческюс изменений в процессе многоступенчатого познавшая конпентрацан глицерина. Лишь отдельные блаотошсгн слегка снималась, что сопровождалось появлением узкого перивителланового пространства. Число жизнеспособных ингактшсс эмбрионов составило 78,3« (108 из 138), с поврежденной прозрачной оболочкой ила с наделенными бластсыереш представлено 17,6%. Перечисленные повреждения чаше наблодались у морул (25,4 и 18,6^), чем у бластоцаст (табл. 7).

Таблица 7

Влияние отдельных нарушений в морфологии на аэзнеспособкость в праживляеыосгь эмбрионов пра много-ступенчатоы насыщении криопротектора

Показатели : Всса'О : Стадия эмбриона

ыорула бластоцаста

Заморожено и отгаяко эмбрионов 138 89 49

Жизнеспособных после оттаивания (с-,«) 108-78,3 59-66,2 49-100

Повреждения прозрачной оболочки 19-17,6 15-25,4 4-8,2

Стельных реципиентов 6-31,6 4-26,7 2-50,0

Выделенные бластомеры 19-17,6 11-18,6 8-16,3

Стельных реципиентов 5-26,3 2-18,2 3-37,5

Стельность после пересадки эмбрионов с поврезденной прозрачной оболочкой составила 31,что на 5,3? больше, чем у эмбрионов с взделеннкш бласгоыерами (26,3|). Прц наличии таких поврежден;- й у бластоцист их лрнжгвляемость была высокой по сравнений с морулаьа.

Прв однократном добавлении криопротектора и выведении его после оттайЕания сахарозой жизнеспособных эмбрионов было 86,3!. Количество змбраоков с повременной прозрачной оболочкой ила с выделенными бластомерача составило 28,4$ и 21,0? (табл. 8). Такие повреждения такяе чаще встречал!оь у морул (31,3 и 25,05?), чем у бластоцаст (22,6 в 12,9,?)

Стельность после пересадки эмбраоноз с повреэденной обало-

чкой составила 33,3«, что на 8,3.» больше, чем у эмбронсв с выделенными бластоыераш (25,03). Стельность реципиентов была больше после пересадки бластоцист, чем иорул.

Таблица 8

Влияние отдельных нарушений в могфолсгия на газнеспособность эмброяов прз одноступенчатого насыцекик и выведении крполротектора

Показателя

^сего

Стадия разза тая

морула ; бластониста

Заморожено я оттаяно эмбрионов

1аэнеспособ.чых после оттаивания (п-.2)

Повреждена прозрачная оболочка

НО

95-86,3

74

64-86,5

36 31-86,1

Стельных реципиентов Выделены бластсиера Стельных реципиентов

27-28,4 20-31,3 7-22,6

9-33,3 6-30,0 3-42,8

20-21,0 16-25,0 4-12,9

5-25,0 3-18,7 2-50,0

Приведенные данные позволяет сделать заключение, что при одноступенчатом введен1.:* и выведении кропротектора змбтнонов с поврежденной прозрачной оболочкой с выделенными бластоыераш значительно болыз, чем дра многоступенчатом.

Продолжительность хранения эмбрионов от извлечения до замораживания отрицательно сказывается на их кззнеспособноста и призавляемости после замораживания а оттаивания (табл. 9).

Таблапа 9

Влияние продола тельное та хранения от извлечения до замораживания на жизнеспособность и пра.тавляеыость эмбрионов

Показатели

Продолжительность хранения (час.)

до 2-х : 2-з : 3-4

32 35 28

29 30 20

90,6 85,7 71,4

29 30 20

14 13 4

48,3 43,3 20,0

Заморожено а оттаяно эмб-гаонов

Число аязнеспособных эмб-таояов

Процент от чнела оттаянных Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Процент стелънос~.

После оттаивания а пересадки наивысший процент стельности реципиентов бил 48,3.2 пра хранения эмбрионов до замораживания не более 2-х часов. С увеличением продолжительноета хранения эмбрионов от извлечения до зачоратаваняя снижалась их газнеспособ-ность и прикавляемость после пересади. Из приведенного следует, что хранение эмбрионов более 2-х часов от извлечения до замораживания нецелесообразно.

3.3. Вюлогическне фактора, влзяэдие на .тазнеспссобносгь эмбрионов при замораживании и оттаивании

В налах исследованиях из 248 замороженных эмбрионов 9 из них находились на стадии ранней, 154 - поздней морулы, 67 - ранней и 18 поздней бластоцисты. Пригодных для пересадки оказалось 203 (81,9£), в том числе 2 (п,э,2) ранних и 121 (78,6;?.) поздних модул, 67 (95,5;?) ранних и 16 (83,9,2) поздних бластоцист (табл. 10).

Из таблицы 10 видно, что хорошие и отличные эмбрионы на стадии ранней бластоцисты значительно лучше переносили процесс заыораавханая (65,72). Сравнительно одинаковые результаты были получены пр замора.тгшании эмбрионов отличного к хорошего качества на стадии поздней морулы и поздней бластоцисты (58,6 з 55,62)'.

Исследования показали, что,адзнеспособность омбрионса мясных короз после замораживания и оттаивания непосредственно зависит от их гачеслева до згаор.»зтван:;я, 'Гак, эмбриочи отличного качества аосле оттаивания сохраним слое порвсалчаль.чое качество в 27,3$ г. большая их часть (50$) перешла ь группу хорошие (табл. II). В целом все эмбрионы отличного качества сохранял! -свою жизнеспособность после отхаиьания.

Эмбрионы хорошего качества после оттаивания 88,5,1 сохранили жизнеспособность. Остальные эмбриона (II ,5/0 иые^л ухудшение морфологического состояния «. ь;: вггаззаы.юсть после отогрева била низкой. Змбраоны удовлетворительного качества только 32,6% сохраняли жизнеспособность после отогр=:а. Поэтому эмбрионы удовлетворительного качества нецелесообразно подвергать крцсконсер-вировани». Такие эмбриона необходимо трансплантирова-гь сразу после извлечения.

Таблица 10

Еиэнеспособность эмбрионов после оттаивания на разных стадиях развитая и качества

Качество эмбрионов

до ; после оттаивания

замораязвання : отличные : хороляе • : удовлет- : дегенера-:вори тельные рованные

Мор^лы ранние

в том числе:

хорсше (п=4) - - 2-50,0 2-50,0

удовлетворительные (п=5) _ _ 5-100,0

Морулн поздние (п=154)

в том числе:

отличные (п=27) 7-25,9 15-55,6 5-11:, 3 -

хорошие (п=8Э) - 46-51,7 Э4-за,> 9-10,1

удовлетворительные (п=38) 14-35,8 24-63,?

Еластоцасты ранние (п=67)

в том числе:

отличные (п=26) 9-34,6 ■ 12-46,2 5-19,2 -

хорошие (п=41) - 23-56,0 , 15-36,7 3-7,3

Еяастоцисты поздние (п=18)

в тем чясле:

отличные (и=13) 2-15,4 6—46,1 5-38,5 -

хорояпе (п=5) - 2-40,0 1-20,0 2-40,0

Для успешного получения стельностя от пересадка змбраонов вакную роль играет стадия развития и качество заморокенно-отта-янных эмбрионов. После пересадки удовлетворительная пражавляе-мость была лрл пересадко ранних бластощст отличного я хорошего качества 52,32.

Несколько нике была праха вляемость от пересадка поздних ■ корул - 45,62 а бяастоцаст - 40,0,? (табл. 12).

Таблица II

дизнеспособкость змбраонов после оттаивания в зависимости от ах качества до замораживания

Качество эмбраонов до замораживания

Качество эмбрионов после оттаивания

отличные* ; Хорога е '.удоьлетвор.:дегенеряров.

Отличные, п=66 13-27,3

Хорошие, п=139

Удовлетворительные , п=43

Итого, п=248 18-7,3

30-50,0 71-51,1

15-22,7 52-37,4

16-11,5

14-32,6 29-67,4 104-41,9 81-32,5 45-13,2

Таблица 12

Прижавляемость за«срожекло-оттаянннх эмбраонов в зависимости от стадии развития и их качества

Стадия развития и качество эмбра онов Пересажено: Стельных : эмбраонов ;рецашентов; Процент стельности

Морулы ранние:

удовлетворительные 2 - -

Морулы поздние:

отличные 7 4. 57,1

хорошие .61 . 27 44,3

удовлетвори тельные 53 II 20,8

Еластоцасты ранние:

отличные .9 7 77,8

хорошие 35 16 45,8

удовлетворительные 20 5 25,0

Еластоцасты поздние:

отличные 2 I 50,0 •

хорошие 8 3 37,5 '

удовлетвори тельные 6 I 16,7

Приведенные данные показывают, что высокая жизнеспособность эмбраонов после замораживания и оттаивания, а также пркживие-ыость их после пересадка наблздается на стадии раиной бластоцис-тн отличного и хорсшего качества.

В технологии трансплантации эмбраонов балывое значение пра-

1£от гормональной обработке коров-доноров, от которой во многой зависит уровень суперовуляции, число нормальных эмбрионов, сга-цая развития и их качество, а такяе приетвляеность после пере-гадка.

Высокие показатели жизнеспособности эмбрионов после замо-рагивания и оттаивания была получены пра обработке коров фол-литропяном (83,в ФСГ-п (80,, несколько ниже при обработке гроЬоллонон (,70,6%). Отличных я хороших было наабольлазм прк использования фоллатрошка и ФСГ-п (60,5$? п 63,5£), соответственно (табл. 13). Пра обработке гророллонем эмбрионов отлачно-го качества не было зарегасгрра^ано, а процент эмбрионов хорошего качества был очень низкий (23,6^), число дегенерировании эмбрионов было наиболее высоким (29,4;?).

Таблица 13

Влияние ЗСГ на жизнеспособность заморогенно-оттаянных эмбрионов (п-%)

1оказателя

ФСГ

гро|юллон : фолллтропан: ФСГ-п (ОНА)

Зауосогено и оттаяно эмбрионов

Еязнеспособных после оттаивания

в том числе:

отличные

хорошие

удовлетворительные дегенерарозанные

17

12-70,6

83 76-83,1

142 115-80,9

6-6,8 40-44,9 30-33,7 13-14,6

Н-7,7 62-43,7 42-29,6 27-19,0

4-23,6 8-47,0

5-29,4

От пересадка эмбрионов отлачного.и хорошего качества полученные от коров, обработанных ОСГ, была относительно высокая призавляемость. Так, пра обработке гро$оялоноа она составила 50,02, фоллитропином - 43,5$ а ФСГ-п - 49,3£ (табл. 14). Пра пересадке эмбрионов удовлетворительного, качества, количество стельных реципиентов было низкая я составило 23,3 я 21,4.1, соответственно.

Различия в качестве'эмбраоков после заморагивания а оттаивания и их празшвляемости посую пересадка объясняются, вероятно, разнокачествзнкосгьи препаратов, что было характерно для ■'

гросоллона.

т-

1ряаавляемость за.чорскенно-оттаякккх э.'.:бр;юксв г

занлсдуостй 2СГ разкг»г. форм и^ггтсвлени*.

Показатели

гро£оллов : .^оллзтроагк

¿сг-п (са)

качество эмбтаонов (балл)

• * 4 : з ; 5 ? 4 ¡3 1 5 ; 4 3

Пересажено эмб- ри оное 4 8 6 40 30 II 62 42

Стельных рецапа-ектов 2 т 4 16 7 8 28 с

Пооиент стельности 50,0 12,5 66,7 40, С 23,3 72. 7 45,2 21,4

Установлено, что дальняя транспортировка эмбрионов не ока-зазает существенного влияния на их сохранность к прдк:< зляемость после оттаивакяя и пересадка. После оттаивания аз £9 э.\:бр::онов жизне способным оказалось 77, или 77,8,1. ;!з них эмбрионов отличного и хорошего качества было 71 (92,2%), а удовлетворительного - 6 (7,8.4).

При пересадке эмбрионов отличного и хорошего качества зафиксирована стельность у 21 реципиента (45,1;?), что на 26,3? больше, чем при трансплантации эмбрионов удовлетворительного качества (табл. 15). Б цело« стельность от пересадки транспортированных заморохенно-оттаянных эмбрионов составила 35,02,

Таблица 15

Результаты пересадка транспортированных за\:ород:енно-оттаянных эмбрионов

Показатели

Качество экбхпозов

отличные гхороаие ¡удовлетворит,

Всего

Тран сп орта роЕан о зкбраонов

Жизнеспособных 'после оттаивания Процент от ч^! ела оттаянных

Пересажено э:-.;6рао-

С:сл^чкх реципиент. пГ'лГ'НТ стельности

33 44 22 99

33 38 6 77

100 83,4 27,3 77,8

9 37 31 77

6 15 6 27

60,7 40,5 15,4 35,0

3.4. Результаты нехпрургаческоЯ пересадки эмбрионов с целью получения ДЕОйяёвых отелов

Одной яз важных задач трансплантации эмбрионов в мясном ¡котоводстве является получение двоен. Метод получения двойне-зоста вклвчает в себя пересадку по одному эмбриону в каждый рог «атки реципиента ила пересадку одного эмбриона в контрлатераль-шй рог матка по отношению к желтому телу, предварительно осе-генекному реципиенту.

Проведенные опыты показали» что ара правильном выборе метода и учете необходимых услог^л яехарургаческой пересадка ре-1Льно можно получать приемлемые результаты (табл. 16).

Таблица 16

Результаты пересадка заморохенно-оттаянных эмбрионов

Указатели

Группы

подсадка одно-:два эмбриона ьгдва эмбриона в го эыораона : одан рог ; разные рога

лсло реципиентов 30

ересажено эмбрно-

ов 30.

исло стельных ре-

ипиентов 12

роцент стельности 40,0'

роцент стельности т часла пересаженых эмбрионов 40,0

нсло отелов двоЯ- .

яма 3

роцент двоЁнеЕых ■ телоэ . 25,0

случено телят 15

14 28 6

42,8

21,4 I

16,7 6

18 36 9

50,0

25,0 3

33,3 12

Наилучшая пряжавляемость наблюдалась пра трансплантации вух эмбрионов отлачного и хорошего качества в разные рога нат-а (50,01). Отмечено, что пра пересадке двух эмбрионов, одан из оторых удовлетворительного качества, либо дёгенерированный, раживляеыость также может быть достаточно высокой (42,85).

Стельность от числа пересаженных яыбраонов составила 40,0, 21,4 и 25,02, соответственно. Отелы двойнями зарегистрированы в первой-группе - 3 (25,02), во второй - I (16,72) и в третьей - 3 (33,32). Следовательно, хороших показателей двойневости у мясных коров можно добиться при трансплантации двух эмбрионов в разные рога матка, а таысе яра конгрлатеральной пересадке предварительно осемененным коровам-реципиентам,

Приживляемость эмбрионов находится в прямой зависимости от качества желтого тела в яичняке на день пересадки. Гак при отличном качестве гелтого тела получены высокие показатели стельности при пересадке двух змбраонов в один рог и в два рога матка (66,7 я 75,02). Показатель отела двойнями в грушах колебался от 40,0 до 66,72. Высокие результаты стельности (50,02) зарегистрированы при трансплантации двух зачороженно-оттаянных змбраонов в разные рога матки реципиента с хорошим желтым телом. Пра подсадке эмбриона осемененным реципиентам с хорошим желтым телом получено 46,22 стельностей а 16,72 отелов двойняш. При пересадке двух эмбрионов в один рог матка кивотнш/, с хорошим желтым телом стельность составила 42,92 при отсутствии отелов двойняш (табл. 17).

Таблица 17

Прагивляемость при пересадке заморшанно-оттаянных эмбрионов в зависимости от качества келтого тела

- : Качество желтого тела

Показатели • : отличные : хорошее :удовлетворательное

Число реципиентов 18 28 16

Стельных реципиентов 10 13 4

Процент стельности 55,6 46,4 25,0

Число отелов двойняш 5 2

Процент отелов двойняш 50,0 15,4

Неудовлетворительные результаты была у реципиентов с удовлетворительныма келтыка телами в яичниках. Стельность составила 16,7, 25,0 и 33,32, соответственно,

Немаловажную роль в технологии трансплантации зародышей играет сезон года. "У коров г/л слог о направления период половой активности приходится на летнее я первые 2 месяца осеннего пе-

риода. При пересадке одного эмбриона телкам получено наибольшее число сгельностей в летнее время и начало осени (47,5£) и коровам 1-3 отелов (43,5^) ло сравнению с зимним периодом (табл.18). Поэтому одной из проблем в разведении мясного скотоводства до сих пор остается вызывание синхронизированной охоты, так как приход в спонтанную охоту значительно ограничен из-за понижения полоеой активности в отдельные neja оды.

Поэтому все работы по имплантации эмбрионов целесообразно проводить планомерно по периодам года, начиная с конца августа текущего года до карта месяца следующего года.

Таблица 18

Влияние сезона года на прялавляемость замореженно-оттаянных

эмбрионов

Сезон года

Показатели : январь-февраль : ишь-сентябрь

! * ■ телки : коровы i телка ; коровы

Число рецзгшентоз 20 8 80 62

Пересажено эмбрионов 20 12 80 94

Стельных реципз-ентоз 6 2 38 27

Процент стельности 30,0 ' 25,0 47,5 43,5

4. ШВОДИ .

1. На 7-й день извлечения эмбрионы у коров мясных пород в основном находятся на стадии поздней морулы (55,4,?) и ранней бластоцясты (24,С$). Для свеяеполученных змбриснов характерны более рыхлая структура и слабая связь мегду бластомерами. Для получения качественных эмбраонов наиболее подходящими являются коровы в возрасте 6-13 лег.

2. Зачюражаванае экйщонов ка мобильного заморакавателе без блока программного управления и в газообразном азоте не оказывает отрщательного влияния на их ¿шзнеспссобность и дает' возможность проводить заыораяаванне в долевых условиях без ис-

пользования электричества.

3. Замораживание и оттаивание эмбрионов с использованием криопротекгора глицерина в 1,4 молярной концентрации пр; многоступенчатом введении и выведении и одноступенчатом насыщении и удалении его 0,7 И раствором сахарозы в две ступени обеспечивает сохранение их жизнеспособности до 80,С>!-87,5;?.

4. Для трансплантаций можно аффективно использовать зал:о-роненно-оттаянные эмбрионы с нарушенной прозрачной оболочкой прв условии, если бластомерл интактны. Заморохенно-оттаяшше эмбрионы по сравнению со свехеполученныьк имеют темный цвет, в большинстве случаев везикулярные включения.

5. Эффективность имплантации зашрокенно-оттаянних эмбрионов зависит от их качества до зачорааизания и после оттаивания. При пересадке эмбрионов на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты отличного и хорошего качества ко:хно получить до 45 и 52.« стельностей у реципиентов. Для зидорахиваная наиболее подходящими является эмбрионы на стадии поздней морули к ранней, бластоцисты в возрасте 7-7,5 дней отличного и хорошего качества.

6. Высокие показатели двойяевосги (до 33%) у мясных коров можно получить при нехарургической пересадке двух эмбрионов в разные рога матка и при пересадке одного эмбрнона в,\снтрлате-ральный рог матка предварительно осемененному реципиенту ( 25а) .

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПЕВДМШШ

Для трансплантации рекомендуется использовать заморатава-ние эмбрионов в газообразна,! азоте с использованием криопротек-тора глицерина в I,4 молярной концентрации с одноступенчатым насыщением и двухступенчатым его выведением 0,7 Ы раствором сахарозы, что дает возможность сократить процесс криококсервиро-вания и использовать метод в полевых условиях при отсутствии или нестабильном электроснабжении.

Основные положения диссертации опубликованы в следупда работах.

I. Абуов А.Г., Байтдесов Е.У., Канатбаев С.Г. Результаты трансплантации эмбрионов в мясном скот овод ствз. //Ей от ехн ологи-

•ческае пряемы в технологии трансплантация эмбрионов. Бая. науч. работ. ЕИ2, вип. 104, 1991. С. 56-59.

2. БаГгглесов Е.У., Абуов А.Г., Конатбаев С.Г. Заморагшва-наа экбрпоноз г/ясного скота казахской белоголовой порода.//Бпл. кауч. тех. информации аспирантов и колодах ученых. - Дубровнцы, 1992 г. С. 119-120.

3. Еайтлесов Е.У., Абуов А.Г. Морфологическая оценка эмбрионов коров казахской белоголовой породы.//Тезиса докладов XI межреспубликанской научно-практической конференции молодых ученых а специалистов. - Оренбург, 1952 (24-26 марта). С. 119-120.

4. Влзяндс гонадотропинсв ¡л суперовулявдо я выход нормальных эмбрионов у млсных коров-донорсз./Абуоз А.Р., Еайтлесоз Е.У. Канатбзев С.Г., Аглмоз л. 1.1. //Информационный листок. - Алма-Ата, 1992. - 4 с.