Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭМБРИОНОВ KOРOB МЯСНОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭМБРИОНОВ KOРOB МЯСНОГО СКОТА"

А-йоем

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (виж)

. На правах рукописи УЩ 612.646.02

БаЙтлесоа Ербулат Упиеввч'

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭМБРИОНОВ КОРОВ МЯСНОГО СКОТА

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации »а соискание ученой стелена кашшцаг биологически* наук

п. Дубровяцы Московской области 199 2

. Работа выполнена в Центре по трансплантации эмбрионов с.-х. животных ВсеросаЛсксго ваучно-жсследовательского ; института швотновсщства.

Научный руководитель - доктор биологических наук*

профессор Н.И.Сергеев, Официальные ошюненты: доктор биологических наук,

профессор И^.Шахов, вандадат бясдагаческих наук А.Н.Новгородов,

Ведущее учреждение: Российский зоотехнический институт повышения квалификации в переподготовка кадров.

Защита дасоертадаи состоится

1993 Г

в "" часов* на заседаю и спеца ал» зированн ого совета

Д.020.16.02 при Всероссийском заучи о-в сслед овательском икоп-туте животноводства. л , - 1

• Адрес гнетатута: 1420X2, Московская обл., Подольский вое* Дубровапн. ■ ' , , > :

С диссертацией мсяно ознакомиться в библиотеке нн ста тута.

Автореферат разослан ' 1931-Г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат баодогатэских наук

И.ИДкипш

I. ОКДАЛ ХАРАКТШСШКА РАБОЩ

Од.'шм из основных резервов увеличения производства прсщук-шй зи?отноводства является повышение плодовитости сельскохозяйственных -азотных., Однако традиционные метода повиеения длодо-вптостк ке отвечают современным требованиям ускоренного воспроизводства квотных. ?е:зенае проблема состоит в переходе от естественных к искусственным способам воспроизводства животных.

Лтя осуществления этой задачи больлоа значение отводится транехтантащк эмбрионов, как одюй из новейяах методов управления воспроизводством пль глет* ого и пользователи ого скота.

Программа трансплантации шэраонов включает в себя метод зачоракивання и длительного хранения эмбрионов ведаодихся животных, вследствие чего отпадает затраты на содержание большого количества решшентов, появляется возможность подбирать рецн-ядеатов з заыснмоста от возраста в стадии развития эыбрюяов.

Очень Еалгсл1 в сохранении казне способности эмбрионов при ' крюконсершрованзз является использование краолротекторов.чтп позволяет сказать точку замерзания, сачзыьать внутриклеточную воду к защитить структуру клеток от разрушения,

Еа процесс уеденного краокоысершрозэлия оказывает большоэ влияние а совокупность охлаздавдх скоростей, на основания которых шполшшгея программные заморала ваная.

Большую актуальность и ■практическую значимость имеет етз— ке способность ьмбевоноз. Так как от ах качества в основном зависит исход замораживания и результаты нехирургичесдоЗ пересадка. . ;

Квскотра на привлекательность трансплантации ембрзшоз. у . коров мясных пород, б практических подходах ьспользое-дия остается много неясного. Таз, ярй глубоком эеиоражЕванаа эмбрионов о использование!* различных концентраций кгиопротекторов, сража-' вляеиость после чехкрургаче ской пересадки остается ни экой* С чем это связано - с породой нла другими сэктората - еце пргдстсат вкясвать.

Педь исследований заключалась в усовершенствовании технологии заморагиганЕЯ и штаа¿¿шля, и ор£ол оглаской оценки качества и нй хирургической пересадки змбраоновкороа_?азакскси бело-

Е закачу исследований входило:

- определить влияние концентрации крцопротектора глицерина, способа его насыщения а выведения на жазнеспособносгь эмбрионов после замораживания в оттаивания;

- изучать зависимость жизнеспособности эмбрионов от резина замораживания в тана заморажявателя;

- установить зависимость жизнеспособности эмбраонсэ от продояаительноста их хранения а транспортировка в гадком азоте;

- определить влияние некоторых факторов на принивляемость заморожевяо-оттаянных эмбрионов щи яехирургической пересадке.

Научная новизна исследований состоит в определении влияния крйшротектора глицерина, его насыщения и выведения,скорости охлаждения и оттаивания на шжаваеиость эмбрионов.А такке в изучения влияния некоторых факторов на результаты нехирургической пересадки.

Практическая .значимость.,работы заключается в усовершенствовании заморатаваяня эмбрионов в газообразном азоте при использовании криопротектора глицерина с одноступенчатым насыщением я шведенаеы его раствором сахарозы, что дает возмокаость упростить процесс лриононсерварования и использовать метод в производственных условаях степной зоны Казахстана, где части случаи отключения электроснабжения..

Аяробастя полученных результатов. Основные положения диссертации доложены к получали поясяительнуг оден1<у на:

- иелгузовской научно-практа ческоЗ кшференцав молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы сельскохозяйственного производства", г. Уральск, 1991 г.;

- 44~Й научно-методической конференодя аспирантов я молода! ученых "Проблемы внтеясафакаюш аивотновсйства", пос. Дувром цн, Ша, 19-20 июня 1991 г.;

- 11-й межреспубликанской научно-практической конференция молодых ученых в спешаластов "Резервы увеличения производства в повышения качества сельскохозяйственной продукции"» г.'Оренбург, 1992 £24-26 марта).

Ofo-ем работ». ¿дссертагшя изложена на J03 страницах машинописного текста. Состоит из впадения, обзоре литературы, результатов собственных неследований, выводов а практических предложений. Содер?дг 19 таблиц, ? схемы, 8 рюунка и приложения. Список использованной лиературы включает ХТОнаямекове-кий, в том числе 113 иностранных.

2. :.íatk.4itt и штоин исследований

Ясслздованая прозой >- Р^Зн^аводе "Чапаевский", совхозе "Еерезозскай", СП "Зулг-г"1 с г^чо-^лчш* хозяйстве "5рунзекс-кз2я Запада о-Каэ ах ст ач с (í¡>j

В качестве донороэ бж яодользованц ПО чисто-

породных коров кгззхскоЗ бзчэтеызи'з ^'¿чда класса элита я эла-sa-psKO&i в Еозра'ла ог 3 д*' 5? «ft

В качество реципиентов телок случного возрас-

та £18-20 «(гс.) и мололкх ¿оооз (Í--3 отелов) казахской белоголовой я в отдел ышх случае мочскнэЗ аорода, юаначеска эдоро-/ бшс , без отклонена й в репрод^лчту-к: органах к нормальной половой ццкликой. Коров-докоров отбирала пэ племенной цешюсти.воспроизводительным качествам на основе данных зооветеринарного учета а по £к5:;ологичйскому состоя!шс половых органов.

При проведснлн опята максимально уставали проазводствен-нно условия л традиционную технолога» разведения и содержания мясного скота. Так, в летнее время ¡тавотные содержались в летках лагерях на пастбище, а в заг/кее - на стационара со свободные выходом на выгульный кортовой двор, Кормлеще осуществляли с учетов дгйзиолегаческого состояния и продуктивности га ватных согласно норд Е раццоиоз, установленных в хозяйстве.

После провздехия ректального исследования на намчве желтого тела у доноров осуществляли гормональную обработку препарат ССГ-ч;юллетрогкк (Литвз) в дозе 1200 ИЕ, грофаллоя в дозе 1000 ИЕ, ОСГ-л (CJÍA) в дозах 42 я 52 мг, ГСЗ! (Ч0ФР> в дозе 3003 1!Е, Обработку проводила на 8-12-й день полового цзкла по 4-дневной схеке с двукратным введением вростагландана(зстрогая) в дозе 500 миг.

Большинство коров-доноров била ни технизированы комплексным препаратом "Тетравати в доза 5 к 10 кл ка 2-й день эстраль-

кого цикла, зеред гормональной обработкой.

Искусственное осеменение коров-доноров осуществляли через 48часов после введения эстрогена двукратно с интервалом 8-10 часов двойной дозой свежепсдученной разбавленной (1:3 а 1:6),

грана влейся при 0°с спермой с активностью 5 баллов м концентрацией 6oju,j 30 млн/мл, а также заморсаенко-оттаянной спермой бы-ков-улучлателей, оцененных по качеству потомства. Змбраонн извлекали у коров-доноров нехкрургическам методом с жспользовалаем резиновых катеторов.

Морфологическую оценку жи з не сп о собностя свежеп слученных е замора» зино-оттаянных амбра онов проводила по пятибалльной шкале, разработанной в Bile. ,

При подготовке эмбрионов к эаморатаванао их насыщала раствором глицерина ъ 1,4 М концентрации многоступенчато и сдносту-пеячато.

При использовании многоступенчатого метода эмбрзсяы последовательно выдерживала по 5 иднут в каждой концентрация кра сироте ктора. После вцдержки в последнем растворе эмбрионы помещали в камеру эаморахавателя. Б одноступенчатом методе насыщения эмбрионы сразу помещали в каплю 1,4 М растшра глицерина на часовом стекле и выдерживали 20 манут,после чего подвергала замораживанию.

Замораживали эыбраоны ва программном заморажавателе ЗЭМ-4 i 33M-I без блока программного управления и б газообразной азоте.

Эмбрионы били разделены на 3 группы. Первую группу эмбрионов охлаждали от +20°с до минус 7°С со скоростью 10С/мйя. с автоматической кристаллизацией, затем со скоростью 0,3°С/мняуту до манус 35°с с поел едущим помегценавм в жядкзй азот. Бтору» -ехкаддалв от плюс 20°с до минус 40°С со скоростью от 1 ,?°С/шн, третью - со окоростью от I»5°c/mjH(

Эмбрионы оттаивали в водяной бане при температуре 25 и 30°С в течение 10 секунд, затем переносила на часовое стекло. Контролировали наличие эмбриона под бинокулярной лупой и удаляла ярвоаротектор в обратной последовательности лре многоступенчатом касыщенаи. При одноступенчатом настаеаяя отмывание осуществлялось сахарозой.

После отмывания эмбрионов от краопротекгора их подвергала морфологической оценке, и пересаживала реципиентам.

СХЕ.и ИССЛЕДОВАНИЙ Качество я стадия разватия э .Краснов до замораживания

. Заморажнвателя

шогоступенчатое . насышение я выведение криопротектора из омЗраонов

ЗЗМ-4, I

-Зр-1-Гг^-;3разный еэот-

одноступедча-тое насыщение и выведенаэ кри саротекто-ра из эмбрионов .

лнэнесЕособность и прилавляемость зам ор окенн о-от тачвшх эибрвонов

Факторы, влия.щие на шзнессособность я приаввляелюсть экСеймгу

тешйра- стадая качество тура от- раз за- эмйра о-таиванпя тая нов

время £г неняя рионов др заморак-и^ Егнвя,

транспортировка

качество желтого тела

3. СОБСТВЕННУЮ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗД. Сценка качества" эмбрясиов. 'у мясных короз .

Б технологии трансплакгавди эмбрионов больвоэ практическое значение имеет сценка их дологической полноценности перед пересадкой алз куй окон с е ры ров ака ем. Морфологическая оценка эаклоча-ется в отОоре не ошюд отворенных яйцеклеток, норь'^ианых и дегенерировавших змбрсюнсв, определение стада 2 раз за тая з выявления повреждений отдельных ¿ластомероз ала всего зародыша.

Показатели морфологической оценка оче;а важны, так как кад-мая морфологическая разнокачественкос'ть является показателей физиологической и баодоглческоЗ неполноценностз зародите Я. Ссобое:

жимание обращал? на колебания ос5ъека яйцеклеток, ях це-

лостность, состояние прозрачной оболочки и протоплазмы.

Ев алогически волнаценкнш считают зародыша» иыеодие шарообразную $орку, гомогенную цитоклазлу, неповрежденную оболочку, адакакового размера йластомерн с плотным межклеточным кскиактсы. Эмбрионы должны соответствовать по уровня дробления возрасту от оплодотворения до их извлечения,

Различат морулы и бластоцаста на разных стадиях развития. Нормальные морулы яме к« форцу сферы. У некоторых корул отдедь-вые клетки могут выпячиваться в аеравителлановое пространство, на их поверхности допустимы неболыше цитшлазматичесхае пузырьки.

У нормальной родне £ блаетоциста просматривается небольшая полость, поверхность клеточной массы гладкая, равномерная, пери-вителлаиовое пространство маленькое.

Морфологически нормальная поздняя бластоцаста имеет утонченную прозрачную оболочку, форму правильной сфера, пол ось большая, аерйвит2ллвио®ое пространство отсутствует.

Условно-годны*® для трансплантацйя считают змбряоны со значительными морфологическими отклонениям!: сколы зоны, наличие вакуолей, гранул в перавителдияовои пространстве, выделением большой части бластоыеров, Змбрашн, отстаацае в развитии надень вымывания с асинхронным дроблением бластоыеров и наличием их грануляция относят к не да годным для трансплантанта.

Исследования показала, что из общего числа 521 свежеаоду-чеяных эибрзоаов нормальных было 326, или 62,7£, дегенярованннх 106 (20,36), веошюдотвореншх яйцеклеток S9 (1?,0£), амбрвшов отличного качества не разных стадиях развития было 20*63 от общего числа зародышей (табл. I). Меньше всего отличных эмбрионов было на стадии ранней г поздней ыорулн (13,6* и Процент

их увеличивается на стадаа ранней (23,8?) и поздней бластоцасты (68,8*). -

На стадии ранней морулы отмечен низкий процент (31,82) эмбрионов хорошего качества и относительно шеокий процент уд№-лвтеорятельшас змбраонов (54 ,е%). Более поздаке стадии характеризуйся наличием высокого чаьда хороших эмбрионов, снижением количества удовлетворительных я условно гэдакх.

Таблица I

Качество и стадия развития омСрлоноб коров кз 7-с день извлечения

П сказакелз Ьссгс Стадия развитая

корулн ; Злас толста

рЕНЙЯЯ дсэдлгл: ранняя ;позк1яя

Члсло эмбр: 0-ное 432 47 239 104 42

Процент от общего часда 10,3 55.4 24,0 9,7

Б т.ч.:

нормальних 326 22 183 84 32

проект от оэ^сго чне- , лз норма^ь-• 75,5 6,? 57,7 25,8 9,8

ГЛИН:« 106-24,5 25_53,2 51-21,3 20-19,2 10-23,8

пз !ЙХ:

огла чннх 67-23,6 3-13,6 22-11,7 20-23,8 22-68,8

Х0р0^1Х 175-53,6 7-31,3 108-57,4 52-62,0 8-25,0

удовлетворительных 84-25,8 12-54,6 '58-33,9 12-14,2 2-6,2

Стадия ргллпй бластоцесты от поздней морула отличалась небольшим процент о.* г^Срлснов хорошего качества (62,0' против 57,4*) и кекькки числом удозлет е ори тельннх (14,2 я 30,5.?),

нездаах бла стоуст характерно налачае високого процента э:,-:5рлскоз отличного (63,8,^) и хорошего качества (25,02) а небольшого чз ела уд он ло тшрп т е л ы ш х гкбрионсв . Э.мбраиш

пороз мясных пероц. л:,:елл более хыхлуэ структуру с несколько сс-лабланной сеязьз мщсу бля.ста.'лра.'.с!. Наблщались некоторые различия е скорости развит;;я одновозрасткнх акбраонов у коров до-короз молс^-и-к п м-£сльг,с пород, Есдз у молочных коров кг 7 день ЕЗЕ-лечсг-у.я '::сло позднкх корул от общего числа ;]з влеченных сос-танллл,: тогда гак у мчемых кероэ ЕЗ ,4:5, количество ранках бласгог^с? сесга^ло 24,0.». Кро,\:е поздмей морулз; и ранней блас-тоц/.стн у 'Леню: коров извлекала змбраокы на стад;!:! ршшай но-

рулы 10,3* д поздней бластописти (9,7£).

Приведенные результаты по стадиям разштвя одновоэрастных эмбрионов мясных коров согласуются с данными других исследователей.

Существует мнение, что возраст коров-доноров влияет на число и качество эмбрионов. В экспериментах использовали коров разного возраста, которые были разделены на три группы - 3-5, &-9 1 10-13 лет.

В таблице 2 показано, что у коров резного возраста число нормальных эмбрионов в неоплодотворенных яйцеклеток на донора было практически одинаковш.^Ода^ко с увеличением возраста коров число дегенерароваякых^-вещчазается. Так, в первой группе (3-5 лет) ах било 12,ЗЙ, во второй - 22,456 я в третьей - 21,52, про общем числе зародышей - 5,7, 6,7 и 7,0 а нормальных эмбрионов - 4,0, 4Д я 4,3 на донора соответственно, ¿доведенные данные позволяет заключить, что коровы в возрасте от 9 до 13 лет могут быть дспользованы в качестве доноров эмбрионов.

Таблица 2

Количество и качество зародышей у коров резного возраста

Показатели Возраст (лет)

;3-5 : • 6-э : • 10-13

Обработано животных 17 . 44 18

Число овуляций &а донора 8,4±1Д2 9,8^1,20 9,2^,86

Получено зародышей 5,7+0,62 6,7±0,64 7,$¿0.60

В том числе:

нормальных 4,0^0,60 4,1$0,62 4,3*0,56

процент от числа зародышей 70,2 61,2 61,4"

дегенерврованных . 0,7+0,18 1,5^0,40х х.бчр.за*

неоплодотворешшх яйцеклеток 1,0±р,21 1Д±0,23 1.2^,26

Р > 0,95.

3.2, Влияние скорсста охлаждения а отогрева на жяэнессособность и праянвляемость эмбрионов

Для эФ1«ктиеного использования метода трансплантации большое практическое значение имеет круглогодовое получение эмбрионов от ценных в племенном отнесении коров с последующей сезонной их пересадкой реципиентам. В связи с этим усовершенствование существуппих и разработка новых методов кри оконсервирования эмбрионов приобретает особое значение.

Основным направлением исг^г-сований ® области замораживания является поеск наиболее простых л экономичных, но в то же время эффективных методов креоксксервацаи я оттаивания зародышей, возводящих максимально сохранить их жизнеспособность.

В последние года появились сообсения о возможности упрощения технология криоконсершрования гмбраонов путем использования ускоренного ревака охладдения. Применение в качества кришротек-, тора глицерина я так называемого быстрого метода замораживания дает возможность существенно упростить технологию крцокснсерви-рованкя биообъекта. Особый ингерес представляет введение раствора сахарозы в различных комбинациях в зависимости от концентрация краопротектора.

Главным в нааих исследованиях било определение влияния ускоренного з&уоразаванвя в газообразном азоте на кизнеспособность и прЕП'Лвляемость эмбрионов, а также сравнение эффективности различных режимов охлаждения а програ'лзшх заыораяивателей.

Проведенные испытания разеах замораздвателей показала, что жизнеспособность эыбрлояов после отогрева в грушах была почта одинаковой. Так, пра эаморатаваниа на заморашвателе ЭЗМ-1 анз-неспособкцх зыбрасног было 81,2%; газообразном азоте - 60,65 а на замораЕквателе 351.1-4 - 83,2.? (табл. 3).

Стельность после пересадки заиорояенно-огтаянных эмбрионов составила 34,8^, 35,2,? я 39,2;', соответственно.

Сравнительные результаты испытаний 3-х моделей замораяява-телей показали, что лэбое яз испытанных устройств может Зыть яс-пользовано с равной дачей услзха в практической криобиологии.\ Иыеюздеся различая, вероятно, связаны о качеством эмбрионов пе-

ред замораживанием,

Таблица 3

Влияние способа замораживания на жизнеспособность я драживляемость эмбрвонов

Показатели

Замораживатели

ЗЭЬ!-4 : ЗЭМ-1 : газообразный : : азот

Заморожено > оттаяно эмбри шор

Жизнеспособных эмбрионов

Процент

Пересалено эыбрсснов Стельных реципиентов Процент стельности

79

85,2 79

3¿

39,2

95

69 81,2 69 24

34,8

68

55

80,8

55 20

36,2

Сравнительные испытания замораживаяи-i эмбрионов на мобильнее зам орала ьат еле 33US-I и в газообразном азоте показывает, что этот технологический прием может быть эффективно применен в экстремальных условиях ферм с неустойчивым электроснабжением.

Зетним в сохранении жизнеспособности эмбрионов является их оттаивание, которое зависит от температуры водяной бани. Выживаемость эмбрионов, оттаянных при температуре водяной бани +30°С составила 64,655, ала на 6,8í больше, чем upa отогреве ^"температуре +25°с (77,8$). Оцнако процент стельности был няне на 5,4Í в первом случае [табл. 4),

Финальной ступенью краоконсерва реванш* является разбавление криопротектора в ембрионат после и оттаивания, Пра кного-ступончатсы насыщении кропротектором сохранность эмбрионов после оттаивания и стельность после пересадка была практически одинаковой (табл. 5).

При одноступенчатом насыщении крзопротектором и выведение его аз клеток раствором сахарозы а дм ступени показало,относительно равные результаты (табл. 6).

Таблица 4

Влаякие температуры оттаивания на жизнеспособность г преяивляемость эмбрзонов

Показателя

Температура оттаивания

* * +25 : +зо

Оттаяно эмбрионов 99 149

Жизнеспособных эмбрионов 77 126

Процент от числа оттаянных 77,8 84,6

Пересажено змбряонов 77 126

Стельных реципиентов 31 44

Процент стельно«и 40,3 34,9

Таблица 5

Удэнесцособчооть и приживаемость эмбрюнов при многоступенчата* иг еще ни в криопротекторсм

Показатели

Замоттатаватели

ззл-г

газообразный азот

Заморожено и оттаяно эмбрионов 55 45 30 Кг.э неспособных эм-Зряонов 44 35 29 Процент ■ • ■ 80,0 ?7,8 76,3 ¡'эресат.ело эг/5рмонов 35 29 Птелт::ых 18 П XI 1|рвд.ч<т 10,9 о7,1 3?,9

! Таблица 6 Еаичеспссобность я арчзяЕЛяемость эмбрионов при одкоступеичатси клсы^сная и гнведеная краопротектора

Показатели

Замораживатгла

зэи-л

газообразный азот

Зачорокено а оттаяно эмбрионов 40 40 лазнеспоссбных оубрзояов 35 ■.'Л -Проект ч 87,о 85,0 Пео:сажено эмбркшов ■ Стёльнах рещпнентов 13 II Процент стельности о7,1 32,4

00

ГЙ , 66,7 . 2 ;> 9

34,6

Не было отмечено эаывтннг морфологических измененай в процессе многоступенчатого повышения конпентрапии глицерина. Лишь отдельные йластсшсты слегка сжимались, что сопровождалось появлением узхото поравгтелланового пространства. Число жизнеспособных интактных эмбрионов составило 73,35 (103 из 138), с поврежденной прозрачной оболочкой или с выделе нныш бластоыарачи представлено 17, &%. Пере численные повреждения чаше наблщалнсь у морул (25,4 в 18,6Я), чем у бластсдаст (табл. 7).

Таблица 7

Влияние отдельных нарушений в морфология на жизнеспособность и приживляемость эмбргояов при многоступенчат сы насыщения криопротектора

• Показателя : * • Бсс^'о ; Стадия эмбриона

морула : бластоцаста

Заморожено и оттаяно эмбрионов 138 89 49

жизнеспособных после оттаивания (с-0 108-78,3 59-66,2 49-100

Повреждения прозрачной оболочка 19-17,6 15-25,4 4-8,2

Стельных решив ентов 6-31,6 4-26,7 2-50,0

Бвделенные бластомеры 19-17,6 II-18,6 8-16,3

Стельных рецвпнентов 5-26,3 2-18,2 3-37,5

Стельность после пересадка эмбрионов с поврездеккой прозрачной оболочкой составила 31,6'?, что на 5,32 больше, чем у эмбрионов с выделенными бластш ерами (26,3л). Прц наличии таких повреждений у бластогшст ах приживляемость была высокой по сравнению с морулама.

При однократном добавлении криопротектора я выведения его после оттаявакая сахарозой лязнеспособных эмбраонов было 66,3,1. Количество эмбрионов с поврежденной прозрачной оболочкой ила с ввделеь*ныма бласт оме рами составило 28,4,« и 21,0;= (табл. 3). Такие повреждения так^е чза;е встречались у моруд (31,3 и 25,СЙ), чем у бластоцист (22,6 и 12,9л)

Стельность после пересадка зыбааовоз с повременной обаю-

экой составила 33,3«, что на 8,35 больше, чем у эмОреонсЕ с выделенными Сдастоыерама (22,03), Стел.-ность рецнннентов бала Со-.тыге после пересадки бластоааст, чем ыорул.

Таблица 3

от.якае отдельных нарушений в иоо1>ологии на тазнеспособность ¿'¿О¡ненов пра Ьднэстуаеячат ом насыщении а выведении крао^рстекторь

Показателе

¿сего

Стадия раззатия

мору .га ; бластоцаста

Заморожено я оттаяно

эмбрионов ПО 74 36 жизнеспособных посла

оттаивания (п-1) 95-86,3 64-86,5 31-66,1

Поврегдена прозрачная оболочка

Стельных редагшентоз Выделены бластздеры Стельных реципиентов

27-26,4 20-31,3 7-22,6

9-33,3 6-30,0 3-42,8

20-21,0 16-25,0 4-12,9

5-25,0 3-18,7 2-50,0

Преведенные данные позволяет сделать заключение, чго прм одноступенчатом введены и выведении нряопротектсра э'/Орсонов с поврежденной прозрачной оболочкой с выделенными бласт оыераш значительно балые, чем пра многоступенчатом.

Продолжительность хранения экбрвонов от извлечения до зе-моратавання отрицательно сказывается на их казнеспособности и призявляеиости после замораживания и оттаивания (табл. 9),

Таблица 9

Ьлйянзе продолжительности хранения от извлечения до захоранивания на жизнеспособность ж яраяавляеыость эмбрионов

Показатели

Продолжительность хранения (час.)

до 2-х ; 2-з : 3-4

32 35 28

29 30 20

90,6 За,7 71,4

29 30 20

14 13 4

43,3 43,3 20,0

Заморожено и оттаяно эмбрионов

Число жизнеспособных эмбрионов

Процент от числа оттаятаа Пересажено эмбрионов Стельных р^шпизнтов Процент стельности

После оттаивания и пересадки наивысшая процент стелы ¡ост? рецяшентсв был 48,31 при хранения эмбрионов до замораживания не более 2-х часов. С увеличением продолательноста хранения эмбрионов от извлечения до зауоратаваная снижалась их жизнеспособность и прШБЛяемость после пересадки. Из приведенного ел «дует, что хранение эмбрионов более 2-х часов от извлечения до замораживания нецелесообразно,

3,3. й алогические факторы, влляадае на к;зноспособность эмбрионов при замораживании и оттаивании

В яазах исследованиях еэ 248 ааморсйеннкх змбркснов Э из них находились на стадия ранней, 154 - поздней мсрулн, 87 - ранней а 18 поздней бластоцдсты. Пригодных для пересадка оказалось 203 (81 ,£>), в том числе 2 ранних и 121 (78,62) поздних

корул, 67 (35,Ъ%) ранних и 16 (88,3л) поздних бластоцлст (табл. 10).

Из таблицы 10 видно, что хорошие и отличные эмбрионы на стадии ранней бластоцистм значительно лучж се ре носила процесо заморажньания (65,7^). Сравнительно одинаковыо результаты ^чли получены при замораживании эмбрионов отличного и хорошего качества на стадии поздней морулы я поздней бластошсты (58,6 л 55,62).

Исследования показали, что г^знеспособность эмбр^онс-а мясных коров после замораживания и оттаивания непосредственно зависит от ах '*дчесала до зачор.^гльа^.л, , амбри^чи отличного качества -осле оттрлвзния сахражи! езое пь рве л.палках; качество в '¿7,3-Х к большая ах часть (50,?) перешла ь группу хорошие (табл. II). В целом все эмбраонн оти'.чного качества сохраняя свею Еизнеспособность после отхаи&эния,

Зкбрзонн хорошего качества после оттаивания 33,с охрили жизнеспособность, Остальные эмбриону (11,5*) иы;„а морфологического состояния и ь„; вызлзас^осгь после оюгрова 6:1-ла низкой. Змбрйоны удовлеткори'£ е."1 ы; ог о каюста только 32,6;? сохраняли назкеспособиость после отщр=га. Поэтому эмбриона удовлетворительного качестна нецелесообразно подгергать крлоконсер-вированзю, Такие эмбриона не обходи но тран сшл нта рогат ь о ¡азу после извлечения.

Таблица 10

Жизнеспособность эмбрионов после оттаивания на разных стадиях развитая и качества

Качество эмбри онов

до 1 после оттаивания

зачорзда ванця ; отличные г хорошие ; удовлет- ! дегенерв-:ворите льние рованные

Уор^лы ранние

в том числе:

хорошие (п=4) - - 2-50,0 2-50,0

удовлетворительные (п=5) — — — 5-100,0

Морулн поздние (п=154)

в том числе:

отличные (п=27) 7-25,9 15-55,6 5-1^,5 —

хорошие (п=89) - 46-51,7 34-3(3 9-10,1

удовлетворительные (п=38) 14-36,8 24-63.?

Ыастоцисты ранние (п=67)

в том числе:

отличные (п=26) 9-34,6 12-46,2 5-19,2 -

хорошие (п=41) . - 23-56,0 . 15-36,7 . г-7,з

Еластоцисты поздние (п=19)

в тем числе:

отличные (п=13) 2-15,4 6-46,1 5-38,5 -

хорош е (п=5) - 2-40,0 1-20,0 2-40,0

Для успешного получения стельности от пересадки эмбрионов вакную роль играет стадия развития и качество эаморокенно-отта-янкых эмбраоноз. После пересадка удовлетворительная првзавляе-«ость была пра пересадке ранних бластоцаст отличного я хорошего качества 52,3®. '

Несколько шке бнла прижавляеыость от пересадка поздних ■ норул - 45,61 я бластоцаст - 40,0,? (табл. 12).

Таблица II

Вазнеспособвость эмбрионов после оттаивания в завасамости от их качества до эаморазиваная

Качество эмбрионов после оттаявандя

нов до эаыоража-:-

ваняя ; отличные ■= . хорошие ;удовлетвор, :дегенераров

Отличные, п=66 13-27,3 30-50,0 15-22,7 -

Хорошие, п=139 71-51,1 52-37,4 16-11,5

Уд овлетвозж тель- 14-32,6 29-67,4

ные, п=43 -

Итого, п=>248 18-7,3 104-41,9 81-32,5 45-13,2

Таблица 12

Прякивляемость заксроженно-оттачнных эмбрионов в

зависимости от стадии развития и их

качества

Стадая развития я качество: Пересажено : Стельных ! Процент

эмбрионов ; эмбрионов ¡реципиентов; стельности

Уорулн ранние: *

удовлетворительные 2 - -

Морулы поздние:

отличные 7 4 57,1

хорошие 61 27 44,3

удовлетвори тельные 53 II 20,8

Еластоцисты ранние:

отличные .9' 7 77,8

хорошие 35 16 45,8

удовлетворительные 20 5 25,0

Еластоцисты поздние:

отличные 2 . I 50,0

хорозие 8 3 37,5

удовлетворительные 6 I 16,7

Приведенные данные показывав, что высокая ^неспособность эмбрионов после заиоражаваная и оттаивания, а такке пряживляе-ыость ях после пересадки наблщается на стадии раиной бластоцас-ты отличного и хорошего качества.

В технологии трансплантации эмбрионов большое значение ща-

дают гормональной обработке коров-доноров, от которой во »ногой зависит уровень суперовуляции, число нормальных эмбрионов, стадия развития и их качество, а также пряживляемость после пересадки,

Васокае показатели жизнеспособности эмбрионов после замораживания и оттаивания были получены при обработке коров фол-. латропиком (83,1^) и 5СГ-п (80,9£), несколько ниже пра обработке грсфолледсм (73,63). Отличных и хороших' было наибольшим пре использования фолли тропа на и ФСГ-а (60,5^ а 63,53!), соответственно (табл. 13), При обработке гро$оллоном эмбрионов отличного качества не было зарегистрашно, а процент эмбрионов хорошего качества был очень низкий (23,6%), число дегенерирован-ных эмбрионов было наиболее высоким (29,4?).

Таблица 13

Влияние ФСГ на газнеспсюобность замороженно-оттаянкых эмбрионов (п-£)

Показателя ФСГ

; грофоллон | фоллатрошн; ФСГ-п (США)

Заморожено и оттаяно эмбрионов 17 69 142

Жизнеспособных после оттаивания 12-70,6 76-83,1 115-60,9

в том числе:

отличные 6-6,8 11-7,7 "

хорошие 4-23,6 40-44,9 62-43,7

удовлетворительные. . 8-47,0 . 30-33,7 42-29,6

дегенерарозанные 5-29,4 13-14,6 • 27-19,0

От пересадка эмбрионов отличного,'и хорошего' качества полученные от коров, обработанных ФСГ, была относительно высокая пркЕивляемосгь. Так, пра обработке гро$оллоном она составила 50,0.в, фоллитропаном - 43,52 и ФСГ-п - 49,3^ (табл, 14), При пересадке эмбрионов удовлетворительного, качества, количество стельных реципиентов было низкам я составило 23,3 я 21,4.?, со-, ответственно.

Различия в качестве эмбр)онов после замораживания а оттаивания и их пралавляемости после пересадки объяснятся, вероятно, разнокачественностью препаратов, что было характерко для '

гророллона.

Проявляем ость заморсженно-оттаяккых э."<:йглснсе в

завдсамоста ЗСГ разе их ф^рм г^гстомш*.

Х-СГ

Показатели

гро$оялон : ^олдэтрогнн

4'СГ-п (С_А)

качество эмбрионов (балл)

1 * 4 : з \ 5 : 4 :з : 5 : 4 1 3

Пересажено эмб-Р2030Е 4 8 6 40 30 II 62 42

Стельных рецяш-ентов 2 1 4 16 ? 8 26 с

Пэоиент стальнос-Т2 53,0 12,5 66,7 40,0 23,3 72,7 45,2 21,4

Установлено, что дальняя транспортировка экбрасков не оказывает существенного влияния на zz сохранность и ир2;.азлче:дость после оттааваняя и пересадка. Поел1; от та:! ганад аз зкбрзскюв мзне способным оказалось 77, яга 77,8.3, ^з :-ах э^бр-оноЕ отличного и хорошего качества било 71 (22,2%), а удовлетворительного - 6 (7,8,1).

При пересадке эмбраозов оглачиого з хорошего качества зар-ксарована стельность у 21 рещшента (45,1;?), что на 26,33 больше, чем при трансплантации э.'.йркскоб удовлетворительного качества (табл. 15), В целом стельность ст пересадка транспортированных заморояенно-оттаянных эмбрионов составила 35,С^,

Таблзца 15

Результаты пере сад га транса орте рованкцх за'.юао-'енко-оттаянкых эмбрионов

Пскгзатела Качество

; отличные :хоро.и е ¡удовлетворит.; Всего

Транспорта ровано змбраояов

¿л энсспособных после оттаивания Процент от числа оттаяш;ис

Пересажено эмбрао-н: ;;т стельности

33 44 22 99

33 38 6 77

100 88,4 27,3 77,8

5 37 31 77

6 15 6 27

ее,7 40,5 1&.4 33,0

3.4* Результата нехарургаческой пересадки вибрионов с пеяыо получения двойн&гых столов

СйноЗ из вавдых задач трансплантация эмбрионов в «ясном скотоводстве является получение двоен, Уетод получения двойве-воста вгшгшет в себя пересади по одному звбриоау в' каждая рог иатки реципиента или пересадку одного эмбреона в коатрлатераль-кыЗ рог катка по отношении к желтому телу, предварительно осе-иенеяному реципиенту.

Проведенные опыты показала, что при правильной выборе метода в учете необходимых услала яехврургической пересадке реально можно получать праеияеьие результаты (табл. 16).

Таблица 26

Результаты пересадки заморешенно-отгаявшх эмбрионов : грушш

Показателя "'подсадка одно-:два эмбриона ь:два эибраона в ___.то эмброна : один рог : разные рога

Число рецензентов 30 14 18

Пересажено эмбрионов 30 36 36

Число стельных ре* . ципиентов 12 , '. 6 9

Процент стельности 40,0' 42,8 50,0

Процент стельности от числа пересажен- , них эмбрионов 40,0 > 21,4 25,0

Число отелов двойнями • 3 I 3

Процент двойвегых ■ отелов 25,0 16,7 33,3

Подучено телят' . ¿5 6 12 '

Наилучшая Прагавляемость наблвдалась щи траясплаятацвж двух эмбрионов отличного г хорошего качества г разные para мат* ха (50,OS). Отмечено, что при пересадке двух вибрионов, сдав яг которых удовлетворительного качества, либо дегенервроваишй, яражавляеыость также может бкть достаточно высокой (42,32),

Стельность от числа пере сажен ню; змбрпснов состашла 40,0, 21,4 я 25,СЙ, соответственно. Отелы двойнями зарегистрированы в первой.группе - 3 (25,С£), во второй - I (16,7,?) и в третьей - 3 (33,3«), Следовательно, хороших показателей двойневостя у мясных коров можно добиться при трансплантации двух эмбрионов в разные рога катки, а таклк при контрлатеральной пересадке предварительно осемененным коровам-реципиентам.

Пратавляемость эмбрионов находится в прямой зависимости от качества желтого тела в яичнике на день пересадки. Так при отлично« качестве желтого тела получена высокие показатели стельности при пересадке двух эмбрионов в один рог и в два рога матка (66,7 и 75,0*)« Показатель отела двойнями в группах колебался от 40,0 до 66,75, Высокие результаты стельности (50,0^) зарегистрированы при трансплантации двух зачороженно-оттаянных эмбрионов в разные рога матка реципиента с хорошим желтым телом. При подсадке эмбриона осемененным реципиентам о хорошим желтым телом получено 46,стельностей и 16,71 отелов двойнями. При пересадке двух эмбрионов в один рог матка животным с хорошим желтым телсм стельность составила 42,92 при отсутствии отелов двойнями (табл. 17).

Таблица 17

Првживляемооть при пересадке заморсишно-оттаянннх эыбриояовв зависимости от качества желтого тела

: Качество желтого тела

Показатели ; отличные : хорощее:удовлетворэтеяьное

Число реципиентов 10 28 16

Стельных реципиентов 10 13 4

10 28

10 13

55,6 46,4

5 2

50,0 15,4

Процент стельности 55,6 46,4 25,0

Число отелов двойнями Процент отелов двойнями

Неудовлетворительные результаты бшш у рецапиентов с удовлетворительными яелтша телами в дачниках. Стельность составила 16,7, 25,0 и 33,соответственно.

Нёйаловахну» роль в технологии трансплантации зародышей играет сезон года.'У коров шеного направления период полозок активности приходятся на летнее я первые 2 месяца осеннего пе-

раода. При пересадке одного эмбриона телкам получено наибольшее число стельностей в летнее время и начало осени (47,52) я коровам 1-3 отелов (43,5£) по срашендп с гимнам пере сдои (тайл.18). Поэтому сщной яз проблем в разведении мясного скотоводства до сих пор остается вызывание синхронвзироваяной охоты, тая как праход в спонтанную охоту значительно ограничен из-за понижения половой активности в отдельные периоды.

Поэтому все работы по имплантанта эмбрионов целесообразно проводить планомерно по периодам года, начиная с конца августа текущего года до карта месяца следующего года.

Таблица 18

Влияние сезона года на пдахавдяемость заморсженно-оттаянних

эмбрионов

Показателя

Сезон года

январь-февраль

телка

коровы

ашь-сентябрь

телка : коровы

Число реципиентов 20 8 80 62

Пересажено эмбрионов 20 12 80 94

Отельных реципиентов 6 2 38 27

Процент стельности 30,0 - 25,0 ' 47.5 43,5

4. ШВОЯЫ .

1. Па 7-й день извлечения экбраоны у коров мясшг пород в основное находятся на стадгги поздней морулы (55,4,?) в ранней бластодасты £24,0;?). Для свежецолученных эмбрионов характерны более рыхлая структура а слабая связь ыеаду бластомеращ. Дан получения качественных эмбрионов наиболее подходшйимз являются корош в возрасте 6-13 лет.

2. Зачоракаванае экбрлонов на мобильном эаморадагвателе без блока программного управления и в газообразном азоте не сказывает отрицательного влияния на их лизяеспособеость а дает' возможность проводить замораживая«е в полевых условиях без ао-

пользования электричества.

3. Замораживание и оттаивание эмбрионов с использованием криопротектора глицернна в 1,4 молярной концентрации пр1 многоступенчатом введении и выведекги я одноступенчатом нас^ценив и удалении его 0,7 М раствором сахарозы в две ступени обеспечивает сохранение их жизнеспособности до 50,0:1-37,5».

4. Для трансплантация мага о эффективно использовать за\:о-рсаенно-оттаяннне эмброны с нарушенной прозрачной оболочкой при условии, если бластомера интактны. Замер ояенн о-отгаяннке эмбрионы по сравнений со свезеполученнывя имеют темный цвет, в большинстве случаев везикулярные включения.

5, Эффективность ишлантацки заиорояенно-оттаянных эмбрионов зависит от их качества до зам орали валля и после оттазваняя. При пересадке эмбрионов на стадии поздней морулы и ранней блас-тоцисты отличного и хорошего качества иоано полупить до 45 и 52? стельностей у реципиентов. Для заморозиваная наиболее подходяща ми является эмбриошз на стздаа поздней морулы к ранней, бластоцисты в возрасте 7-7,5 дней отличного и хороизго качества.

6, Высокие показатели двойневости (до 331) у ьисных коров можно получать при вехирургаческой пересадке двух эмбрионов в разные рога матки и пра пересадке одного с-мбрвша в*<штрлате-раяьннй рог матка предварительно осемененному рйцщщенту (24%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДСШЫЯ

Для трансплантации рекагездуется использовать заморатава-ние эмбрионов в газообразном азоте с использованием криопротектора глицерина в I,4 молярной концентрация с одноступенчатом насыщением и двухступенчатым его выведением 0,7 расгвором сахарозы, что дает возможность сократить процесс крксконсгрваро-вания и использовать метод в полевых условиях при отсу-гстеяи или нестабильном электроснабжении.

Основные положения диссертации опубликована в следуэдах работах.

1. Абуов А.Г., БаЯлесов Е.У., Канат бае в С.Г. Резулыатк трансплантации эмбрионов в мясном скотоводствз.//Еаотехнолога-

ческа в щнеш в технологии трансплантации эмбрионов. Бшг. науч. работ. ЕИН, шп. 104, 1991, С, 56-59*

2, Байтлесов Е.У,, Абуов А.Г., Кдаатбаев С.Г. Замораживание экбрсонов мясного скота казахской белоголовой породы.//Бел. кауч. тех, информации аспарантов и молодых ученых. - Дубровида, 1992 г. С. II9-I20.

3, Штлесов Е.У., Абуов А.Г. Морфологическая оцеяяа эыд-рионоз коров казахской белоголовой породы.//Тезаса докладов XI межреспубликанской научно-практической конференция молодых ученых и специалистов. - Оренбург, 1992 (24-26 марта). С. IIS-I20.

4, Влияние гонад от ропи нов m суоеровуляцию я внхсд нормальных эмбрионов у шсннх коров-донорсз./Абуоэ А.Г., Еайтлесоз Е.У. Канат бае в С.Г., Аглмоз ü.M. ///нформацаоншй листок. - Алма-Ата, 1992. - 4 с.

Подписано к печати 18.12.1992 г. Заказ 770.

Тираж 80 экз. Объем 1,0 уч.-изо. п.

ПМП ВИЖа