Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ковалентная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 5 -п-фторсульфонил-бензоиладенозином. Определение модифицируемого аминокислотного остатка и исследование его функциональной роли

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ковалентная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 5 -п-фторсульфонил-бензоиладенозином. Определение модифицируемого аминокислотного остатка и исследование его функциональной роли"

Академия Наук СССР

Институт Молекулярной Биологии им. В. А. Энгельгардта

На прайах рукописи

УДК 577. 214. 32

Акбаров Ахрор Хасановйч.

КОВАЛЕНТНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ФАГА Т7 5 -п-ФТОРСУЛЬФОНИЛ-БЕНЗОИЛАДЕНОЗИНОМ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОДИФИЦИРУЕМОГО АМИНОКИСЛОТНОГО ОСТАТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ

03. 00. 03 — Молекулярная биология

Авто ре ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в ВНК «Энзимология транскрипции» Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

ан ссср • ... : .

Научные рукрводитёлй: ' - доктор химических наук

С, Н. Кочетков

кандидат химических наук В. Л. Туницкая

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, в. н. с. М. К. Куханова кандидат физико-математических наук, в.н. с. Т. В. Булар-гина

Ведущая организация:

Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР

Защита состоится «1991 года вчас.*^_ на заседании Специализированного научного сонета Д 0027901 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР

Автореферат разослан «^¿Р » 2991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Крицын

ОБ ¡КАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Настоящая работа посвящена изучению Функциональной топографии активного центра ДНК-зависимой РНК-поли-меразы бактериофага Т? (Т7РП) с помощью аффинноп модификации,

ДНК-зависимые РНК-полинеразы некоторых фагоз, в частности Т7РП, представляют собоя удобные модели для изучения молекулярных механизмов транскрипции. К числу достоинств этих ферментов как объектов исследования относятся небольшой молекулярный вес, односубъединичныя состав, высокая специфичность в отношении промотора. В то же время фермент осуществляет полный транскрипционный цикл без участия каких-либо иных белковых Факторов. Изучение кинетики действия ферментов позволяет получить информацию о механизмах ферментативной реакции. Весьма актуально также использование ингибиторов различной природу для выяснения структуры активного центра фермента.

[¡ели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы было изучение активного центра Т7РП и возможности идентификации аминокислотных остатков, участвующих в его формировании. Научная новизна работы. Исследовано взаимдеяствие Т7РП с рядом аналогов ОТР, в том числе содержащими реакционноспособные группировки. Выявлен ряд конкурентных и необратимых ингибиторов фермента.

Обнаружено, что модификация аминокислотного остатка Ьуз 172, локализованного в междомениой области приводит к полному подавлению Ферментативной активности. Показано, что зтот остаток не принадлежит к активному центру фермента, но

пространственно сближен с последним, и его модификация создает препятствия для связывания промотора и инициирующего нуклеозид-трифосфата и, тем самым, протекания ферментативной реакции.

Выявлено, что при ограниченном протеолизе фермента присутствие промотора в среде препятствует дальнейшему протеолиэу малого N-концевого домена, что указывает на одновременное взаимодействие промотора с обоими доменами.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные позволяют составить определенное представление о некоторых особенностях Функционирования Т7РП, в частности, о топографии центра связывания СТР. С другой стороны, они позволяют сформулировать ряд требования к стуктуре соответствующих соединения, что открывает перспективы для направленного синтеза эффективных ингибиторов Т7РП.

Апробация. Материалы диссертации были доложены на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага. 19S8). Советско-итальянском Симпозиуме "Макромолекулы с функционирующей клетке" (Ленинград, 1906), VIII Двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ (Иркутск, 1989), 19 Конференции ФЕБО (Рим, 1963), Советско-британском симпозиуме "Регуляция транскрипции" (Москва, 1990). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 81 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 93 наименований. Диссертация содержит 19 рисунков и б таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объектом настоящего исследования являлась ДНК-зависимая РНК-полимераза фага Т7 (Т7РП), в течение ряда лет исследуемая в нашей группе.

Практически все промоторы Т7РП устроены таким образом, что первым нуклеозидтрифосфатом, включающимся во вновь синтезируемую цепь РНК, является СТР. Имеется также ряд данных, согласно которым активный центр фермента окончательно формируется только в присутствии этого нуклеозидтрифссфата. С целью изучения нук-леоэидтрифосфат-связываюшего участка активного центра Т7РП и возможюсти идентификации аминокислотных остатков, участвующих в его формировании, нами были проведены кинетические исследования с использованием ряда аналогов СТР.

Большинство исследованных соединений (рис.1) содержало в своем составе реакционнослособные группировки различной природы, т.е. эти вещества представляли собой потенциальные аффинные модификаторы, способные ковалентно связываться с ферментом. Некоторые аналоги содержали флуоресцентные или нитрок-сильные группы (спин-метки), что дает возможность в перспективе использовать их в качестве зондов в физико-химических исследованиях РНК-полимеразы.

Среди исследованного ряда производных СТР были обнаружены ' как обратимые конкурентные ингибиторы, так и соединения, ковалентно связывавшиеся с ферментом. Соединения (У1-Х, XII, XV, XVI) являлись конкурентными с СТР ингибиторами РНК-полимеразы и не связывались ковалентно с ферментом. Для этих соединений были

R-O-CH

O

HCl

OH

0 0 0 3HC„C,,3

-Ы-о-1-о ¡T i' ¿"

1-0 • IX)

R= -P-CH2-CH2Br (V) d"

o o

J-oJ-CH -CU Br ( VI >

¿- J- 2 г

ООО

-í>-0-P-0-P-CH2-CH2Br (VII)

l J- J-

S02F (XI)

502F

Kf

■ÍO

(XII >

CH2Br (XIII)

0 0 0

-р-0-Р-0-Р-СН2С1 (VIII)

j-1- J-

О О СНэ

O-í-T) -CHí «IX)

i

СНз

ООО

HO-^-O-J-O-l-O-CHa с

Jr J- i- о

но IIH ОН

«I

о о

-l-Çj^-m-l

CH2I (XIV)

/ 110

сЛ-якО-он

-sO

C00H (XVII)

'он

(XV)

.НС сн

J эн^снз

о

Рис.1 Формулы использованных аналогов СТР.

определены константы ингибирования К, (табл.1). Гаолмиа 1. Аналоги GTP - конкурентные ингибиторы Т7РП

Соединение VI Vll VIII IX X XII XV XVI

<1. шМ >2 0,9 1,6 2.0 >2 0,4 0,9

На основании результатов обратимого ингибирования можно ;делать следующие предположения. По-видимому, основной вклад в связывание ингибитора (и субстрата) вносит "нуклеозидныа" фрагмент молекулы. При этом соединения, содержащие объемные заместители в остатке рибозы (XV, XVI), обладают невысоким сродством с ферменту, что связано, по-видимому, со стерическими факторами. Отстутствие полифосфатноп цепочки в молекуле ингибитора, <отя и приводит к понижению сродства к ферменту, но в целом не фепятствует эффективному связывание.

Соединения (V, XI. XIII, II являлись необратимыми ингибиторами Т7РП. В результате анализа кинетики инактивации Т7РП этими •.оединениями были получены величины констант связывания Kj и сонстант скорости модификации к,, в соответствии с уравнением

Kitz R., Wilson J.E. 1962):

Кт k, П>1 ■ ь. е*1 -► E-I

де E*I - нековалентныя фермент-ингибиторныя комплекс, E-I -

;овалентнил комплекс, образовавшийся в результате модификации.

Результаты приведены в табл.2.

Таблица 2. Аналоги GTF - необратимые ингибиторы Т7РП

Соединение Kj, mM к,, мин-1 -J

V. п « -Р-СН2-СН2-Вг 0,4 0,167

XI. -CO-Ph-SO„F-n 1,0 0.11

XIII. -CO-Ph-CH„-Br 1 Л 0,2

I. -CO-Ph-SOgF-n (осн. А) 2,5 0,125

Исследование взаимодействия фрагментов Т7РП с компонентами РНК-поЛимеразцоЯ ремши

Молекула Т7РП состоит из двух доменов, соединенных полипрп тидным участком, легко подвергающимся ограниченному протеолизу как in vivo, так и in vitro. Ограниченный трипсинолиэ фермента приводит к образованию двух полипептидных фрагментов: малому ■ N-концевому 120 кДа1 и большому С-концевому 160 кДа). Активный центр фермента, по-видимому, локализован в С-кониевом домене, поскольку последний может катализировать т.н. абортивную транс крипцию - синтез коротких (6-8 звеньев) нуклеотидных последова Тельйостей (iluller D.K. . Martin СЛ.. Coleman J.E.. 1908). Про теолиэ ТТРП преимущественно происходит Яехду аминокислотами Ly; 172 - Arg•173 I Ikeda H.A.. Richardeon С.С..1987).

Известно; что образование фермент-субстратных комплексов разных типов в ряде случаев сопровождается изменениями доступности тех или иных участков молекулы фермента к действию различных модифицирующих агентов, в частности протеаз. Исчезновение или существенное понижение скорости ограниченного протеоли

за в присутствии субстратов может, таким образом, свидетельствовать в пользу взаимодействия последних с участками фермента,

Таблица 3. Ограниченный трипсинолиз Т7РП в присутствии компонентов РНК-полимеразноя реакции.

Фрагменты протеолиза,%

Препарат ________

ЭВООО 80000 70000 20000 неспец. 'Ч/З .мин

Т7РП

15 мин 25,0 40,9 16,2 4,7 3,2

30 мин 12,7 57,3 20,9 3,3 15,8 8

60 МИН 0,5 43,6 10.9 6,0 31 ,0 . T7FI1 ' GTP

15 мин 25,в 13,0 15,S . 15.0 29,4

30 мин 12,0 22,4 20,7 12,0 34,4 . 8

60 мин 7,3 20,4' 20,в 10,6 40,9 Т7РП ♦ ЯНК (из спермы лосося)

15 мин 55.6 33,3 нет 4,3 / 7,5* '.'

30 мин 22,7 * 51.5 нет 9.1 16,7 11

60 мин 17,4 54,3 4,9 нет 23,3 Т7РП + РНК

15 мин 53,0 36,2 7,5 3,5 нет

30 МИН 21,8 47,3 10.9 3,6 16,4 17

60 мин 8,6 47,3 10,5 3,5 31 ,6

Т7РП + pGEM-2

15 мин 55,0 28,3 нет 16.7 Het

30 МИН 26,7 35,7 Нет 37,7 IIST . . 20

60 МИН 6,5 45,5 нет 48,0 нет :

содержащими сайты растепления. В связи с этим большой интерес представляло изучение зависимости скорости ограниченного трип-синолиэа от присутствия в среде различных компонентов РНК-по-лимеразной реакции: инициирующего нуклеоэидтрифосфата - СТР, ДИК (содержащей и не содержащей промотор), а также продукта реакции - РНК. Результаты экспериментов представлены в табл.3. Из данных табл.3 можно сделать следующие выводы:

1. Присутствие неспеиифическоя ДНК или РНК несколько уменьшает скорость гидролиза, однако качественно картина не отличается от таковой для свободного фермента.

2. Присутствие промотора (т.е. возможность специфического ком-плексообразования) приводит к резкому понижению скорости образования неспецифических фрагментов растепления Т7РП.

3. Добавление СТР в смесь для протеолиза значительно увеличивает долю фрагмента с мол.весом ~70 кДа. по подвижности совпадающего с фрагментом, образующимся при расщеплении фермента, модифицированного ФСБА. Добавление промотора, напротив, полностью предотвращает образование этого фрагмента.

.4. Образующийся при протеолизе нативного фермента малый ы-кон-цевоя фрагмент, как правило, с трудом регистрируется или вообще отсутствует при анализе в ПААГ. Попытки выделить его в индивидуальном виде не приводят к успеху. По-видимому, при отделении малого фрагмента от большого первый теряет нативную компактную структуру и становится легко доступен дальнейшему действию протеазы. В то же время присутствие в среде ДНК. содержащей промотор, приводит к значительной стабилизации зтогс

рагмента <табл.3). Этот факт может быть объяснен исходя из редполоаэения, что промоторсодержащая ДНК взаимодействует дновременно с обоими пространственно сближенными доменами, !родолжая находиться с ними з комплексе и после расщепления оответствующей связи. При этом малый фрагмент сохраняет свою штивиуе структуру н- практически недоступен для дальнейшего !ротеолиза.

Ограниченный трипсинолиз модифицированной Т7РП,

Располагая набором аналогов субстрата, ми задались целью определить влияние аффинной модификации Т7РП различными необратимыми ингибиторами на ограниченны)? трипсинслиэ фермента, loлученные результаты приведены в табл.4 (Сак следует из этих данных, ограниченный трипсинолиз фермента, модифицированного ФСБА (I) или ФСБГ (XX), в целом проходит существенно медленнее, чем расщепление цативнои полимераэн. При этом изменяется и место расщепления фермента: в случае модифицированной полимеразы с пониженной скорость» происходил гидролиз с образованием более короткого С-концевого фрагмента. Следует отметить, что последний образуется и при гидролизе нативного фермента при увеличении времени проведения реакции, однако в относительно небольшом количестве (см. рис.6 и табл.3 и 1 ). По всея вероятности, этот второй сайт расщепления такте рас пологается в междоменной "перемычке".

Таблица 4. Ограниченный трипсинолиэ Т7РП, модифицированной различными ингибиторами необратимого действия.

Фрагменты протеолиэа, % Препарат __

Э8000 00000 70000 20000 неспец.Т1/2,мин*

Т7РП

5 мин 51 ,7 31 ,0 8,6 8,6 нет

15 мин 25.0 40.9 16,2 4,7 3.2 3

30 мин 12,7 57,4 20,9 3,3 15.8

Т7РП + ФСБА (Г)

5 мин 63,7 6.4 12,9 4,0 4.4

15 мин 53.3 15,2 20,3 4,0 7 .0 22

30 мин 46.7 12,5 30,8 нет 8,0

Г7РЛ ♦ ФСБГ (XI)

5 мин 74.4 9,6 16.0 нет нет

15 мин 64,3 11 .0 15.9 8,7 нет 34

30 мин 62.4 12.7 21 .7 3,3 нет

Т7РП + Вг-СН„РЬ-С и ' (XIII)

5 мин 79,9 8.5 11 ,б нет нет

15 мин 55,0 12,8 15,0 11.0 7.0 20

30 мин 35.0 15,5 28,6 10,8 10.0

Т7РП + Вг(СН„ >„Р-С (VI

5 мин 44.0 31 ,3 13,3 6.6 4,6

15 мин 28.6 29,4 21.4 7,9 12,7 4,9

30 мин 22.4 26,3 25.0 9,2 17,1

* Т1/>2 ~ время полуаизни Т7РП в условиях ограниченного трипси-нолиза

При модификации фермента 5'-(п-(бромметил )бензоил )гуанози-ном (XIII I наблюдалась аналогичная картина - снижение скорости протеолиза наряду с изменением сайта расщепления. Напротив, фермент. модифицированный гуанозин-5'-(2-бромэтилфосфонатом) (V) подвергался протеолизу в том же месте и с топ же скоростью, что и нативный фермент, что указывало на модификацию другого аминокислотного остатка, раположенного вне лабильной области (табл.4). Отметим, что XIII по пространственному строению молекулы (наличие ароматического кольца, расположение реакционно-способной группировки )'весьма схож с соответствующими Фторсуль-фонилбензоилышми производными, тогда как V обладает иным строением - в частности, реакиионноспособная группа последнего расположена на "гибкой" цепи, т.е. не столь строго фиксирована относительно гуанинового основания. Поэтому в случае последнего соединения мы могли ожидать блокирования другого остатка, на что и указывают данные протеолиза.

Таким образом, три аналога из четырех, для которых было показано необратимое ингибирование Т7РП (таблица 21, связи-, ваются с ферментом, либо непосредственно в протеолитически лабильном участке, либо изменяя структуру, фермента таким образом, что данная область становится недоступной действию трипсина.

Определение сайта а<м>инноя модификации Т7РП ФОБА

Дальнейшая работа была связана с локализацией аминокислотного остатка., подвергающегося модификации п-фторсульфонил-бензоильными производными нуклеозидов. В качестве модифицирую-mero агента был использован ( С 1фторсульфонилбензоиладенозин

(ФСБА. I). Выбор аденозинового производного был обусловлен

1 4

главным образом доступностью 1 С1аденозина, используемого в качетве исходного в синтезе аффинной метки. Реакция 154С)ФСБУ ферментом приводила к включению метки в белок, причем полном; падению активности соответствовало включение одного эквивале! метки на моль белка. Метка не удалялась в процессе длительно! диалйза, что свидетельствовало о ковалентном характере образовавшейся связи.

Как уже отмечалось выше, в результате ограниченного трип< нолиза комплекса Т7РП-{14С1ФСБА происходило изменение сайта протеолиза. Радиоактивная метка при этом находилась в Ы-кон-цевом фрагменте (рис.2).

93kDo 67k0o 15 kOa

i8k0a

Рис,2 Ограниченный трипсинолиз Т7РП (12 X ПААГ). 1 -нативная Т7РП: 2 - ТТРП, обработанная трипсином (1000:1. 30 мин): 3 - комплекс 114С1ФСБА-Т7РП. обработанный трипсином (т же условия); 4- авторадиография образца 3.

Для точной локализации модифицированного аминокислотного остатка комплекс Т7Р1Ы14С1ФСБА подвергали исчерпывающему ги ролизу трипсином. На рис.3 приведена хроматограмма первого разделения на колонке С1&. Пик 2 был идентифицирован (путем TCX) как 154С 1аденоэин, образующийся в результате гидролиза

сло.тноэфирной связи ингибитора.

время, кии

А 20 О (14С] пипЛпет 10~'

время, шга

Рис.3. ВЭЖХ т{)иптического гилролиэата комплекса 114С1ФСБА-Т7РП на колонке С1в. 1 - радиоактивный пептид: 2 - 114С1А«1о

Рис.4. ВЭЖХ (рехроматография> лика 1 (рис.3) на колонке С8

н.

В результате рехроматографии пика 1 на колонке Сд (рис.4) 1 4

был выделен гомогенный С-содержаший пептид, секвенирование которого дало структуру

Asn-Val-Clu-Clu-Cln-Leu-Asn-Xaa-Are где Хаа - аминокислотный остаток, не идентифицируемый при сек-венировании.

Анализ первичной структуры Т7РП показал, что данная структура совпадает с последовательностью 165-173, а модиифииирован-иый остаток является остатком Lys-172. Следует отметить, что именно этот остаток является сайтом расцепления при ограниченном протеолизе Т7РП In vivo, а также при действии трипсина Зп vitro (рис.5).

1 0 го 30

м N Т I N I А К N D F 40 S D I Е 1 А А I Р F 50 N Т 1 А D Н Y С Е 60

R L А R Е Q L А L Е Н 70 Е 5 Y Е М С Е А П F ао Я К и F Е R 0 L К эо

А С Е V А D N А А А К 100 Р L I Т т L L Р К М 1 1 0 I А R I М D V F Е 1 со

Е V К А К R С К R Р Т 130 А F Q F L 0 Е 1 К Р 1 40 Е А V А Y I т I К 1 50

Т т L А С L Т 5 А D N 160 Т Т V Q А V А SAI »70 С П А I Е А Е А П 1 ВО

F G R I Й D L Е А К Н F К К 11 V Е Е QUI К К V G Н V Y К К

190 £00 £ 1 0

А F М G V V Е А D М L S к G 1 L С С Е А V 5 S W >1 К Е D S I . .

Рис.5, н-концевая аминокислотная последовательность Т7ГП. В структуре выделена последовательность, соответствующая полученному пептиду.

Исследование влияния модификации остатка Ьуа-172 на взамодействие Т7РЛ компонентами РНК-полимераэноя реакции

Поскольку модификация остатка 1.уа-172, принадлежащего к Ы-концевому домену, приводила к ингибированию активности Фермента, представлялось целесообразным более подробно изучить

функциональную роль модифицируемого остатка. Прежде всего следовало выяснить влияние модификации этого остатка на способность фермента связывать субстраты реакции. В качестве нуклео-тидного субстрата был использован СТР, являющийся инициирующим МТР для подавляющей части промоторов Т7РП. В качестве матриц были использованы: расщепленная ЕсоЛ! линеаризованная Р меченная плазмида рСЕМ-2, содержащая 0-10-промотор Г?РП (1рСЕМ-2), короткий промоторсодержашия фрагмент (Рг) (110 п.н.), полученный в результате гидролиза Есой! модифицированной плазмиды рСЕМ-2М, а также (в качестве негативного контроля) - "беспромо-торный" фрагмент плазмиды рСЕМ-2М (Рг) получаемый одновременно с промоторсодержащим фрагментом. Связывание ферментом СТР и матриц определяли фиксацией на нитроцеллюлозных фильтрах. Таблица 5. Связывание СТР нативноя и модифицированной Т7РП

Образец стрсвяэ.' *моль ер *

Т7РП + СТР 4.6 2,30

Т7РПмодиф. + стр 0,05 0.02

Т7РП + рСЕМ-2 + СТР 17.0 8.60

Т7РПмодиф. + РСЕМ"2 + СТР 0.67 0.30

Т7РП + поли(ас) ♦ йтр 15,0 7,50

В пробе: Т7РГ1 (нативной или модифицированной! - 0,7 пмоль, рСЕМ-2 - 0,4 пмоль. поли!ас) - 1,3 мкг, СТР - 0,2 пмоль.

Как следует из данных табл.5, параметры связывания GTP в случае свободного фермента и в присутствии рСЕЫ-2 и лоли(йС) существенно различны.

Следует отметить, что в настоящее время вопрос о связывании РНК-полимеразой GTP в отсутствие промотора является предметом дискуссии. По наши» данным, такое связывание имеет место, хотя в присутствии промотора сродство GTP к ферменту увеличивается примерно в 3 раза. Модифицированный фермент Eq практически не способен связывать GTP и обеспечивать стадию инициации синтеза РНК Iтабл.5).

Следующий этапом работы было выяснение вопроса о связывании нативного и модифицированного фермента с матрицами разных типов. Результаты этих опытов представлены в табл.6. Как видно, промоторсодержащие матрицы обоих типов связываются с нативныы ферментом с близким сродством. Модифицированный фермент в этих условиях ведет себя по-другому - практически не взаимодействует с промоторсодержашим фрагментом, но в то же время сохраняет значительное связывание с линеаризированной формой плазмиды pGEM-2. По-видимому, это связывание носит неспеиифическия характер и осуществляется вне промоторного участка. Для проверки этого предположения мы исследовали взаимодействие нативного и модифицированного фермента с фрагментом плазмиды, получающимся в качестве побочного продукта при выделении проыо-торсодержашего фрагмента в результате гидролиза рСЕЫ-2М EcoRI.

Из табл.6 видно, что "беспроыоторный" фрагмент связывается с нативным и модифицированным ферментами примерно с одинаковым сродством, но, естественно, "не работает" как матрица.

Таблица б. Связывание пламиды рСЕМ-2, промоторсодержашего и "беспромоторного" Фрагментов нативноп и модифицированное Т7Р(1

Образец

1рСЕМ-2.

фмоль

Фрагмент Рг (промоторный), фмоль

Фрагмент Рг (беспромоторныл), Фмоль

Т7РП

39.0

42.6

15.0

Т7РП,

модиф.

18.0

3.9

12,0

В пробе: Т7РЛ (нативноя или модифицированной)- 0,7 пмоль,-рСЕК-2 и ее фрагментов - по 0.1 пмоль.

Исследование частичной реактивации модифицированной Т7РП вследствие гидролиза сложноэфирнои связи фермент-ингибиторном комплексе

Как следует из приведенных выше данных, модификация остатка 1.уз-172 приводит к существенному понижению связывания субстратов РНК-полимераэной реакции. В то же время этот остаток'по-видимому не входит в каталитический центр фермента, поскольку последний расположен в С-концевом домене молекулы. Можно предположить, что полипептидная цепь Т7РП расположена в пространстве таким образом, что участок, содержащий модифицируемый остаток. сближен с активным центром и каким-то образом взаимодействует с последним. Введение объемного заместителя по 1.уа-172 создает стерические препятствия правильному связыванию субстратов. В том случае, если эта гипотеза верна, частичное удаление ингибитора с фермента должно приводить к частичной реактивации последнего.

1В.

вреих, и№

-I

V , уса «д.

Рис,6. Гидролиз сложнозфирной связи в ФОБА в составе фермент-ингкоиторлого комплекса. А. Удаление 1^С-метки в процессе ; диализа модифицированной Т7РН, Б. Определение кинетических Параметров для натийноя 11 ) и "полумодифииированной" Т7РП.

Как указывалось выше, сложноэфирная связь межлу 5'-гидрок-силом аденоэина и бенэоильным остатком в ФСБА относительна лабильна при рН >8. В тп же время Т7РП полностью сохраняет активность вплоть до рН 9,5. Проведение интенсивного диализа 11/!С)-меченого фермент-ингибиторного комплекса при рН 9,0 приводило к постепенному удаленно радиоактивной метки, локализованной в "апеноэиновоо" части ингибитора (рис.бА), причем этот процесс г.упюственно ускорялся в присутствии СТР.

Поскольку сульфамидная связь между 1_ув-172 и "сульфобеМзо-илыю!'" частью ингибитора в этих условиях абсолютно стабильна. Фермент, пвобожденный от метки, содержит в положении 172 остаток нп-сульфооенэоиллизина. Такой "полумодифиииропашшй" Фермент облапал существенной Ферментативной активностью. Сравнение К и V для нативной и "полумодифинированной" Т7РП (рис.бБ!

ГЛ ПУлл

показало, что у последнего сродство к СТР близко к таковому для мативного фермента, в то время как Т^ отличается примерно в 10 раз. Таким образом, гидролиз сложюэфирной связи'й аналоге приводит к восстановлению способности фермента "к связыванию СТР. однако наличие остатка сульфобензоата продолжает препятствовать нормальному протеканию реакции. На рис.7 суммированы предполагаемые взаимодействия Т7РП с ФСБА.

С-!*ггг.!па1 ^сгпв(п С-1егт1оо1 йгтсЬ

йото'п

со.

выводы

1. Исследовано взаимодействие ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 с аналогами инициирующего нуклеоэидтрифосфата - СТР. Выявлен ряд конкурентных и необратимых ингибиторов фермента. Определены кинетические параметры взаимодействия.

2. Исследовано влияние компонентов РНК-лолимеразнои реакции и модификации фермента на протекание ограниченного гидролиза трипсином. Показана устойчивость н-кониевого домена Т7РП к протеолизу в присутствии промотора, что предполагает взаимодействие с последним обоих доменов фермента. Установлено влияние типа аффинной метки на процесс трипсинолиза..

3. Установлено место специфической модификации Т7РП п-фтор-сульфонилбензоиладенозином - остаток Ьув-172, совпадающий

с саитоы ограниченного трипсинолиза фермента и находящийся в междоыенном участке.

4. Показано, что модификация этого остатка приводит к • подавлению специфического связывания фермента с субстратами РНК-полимеразной реакции. Мягкий гидролиз сложноэфирной связи в ФСБА и удаление нуклеозидной части ингибитора вызывает частичную реактивацию фермента.

5. Предложена и экспериментально подтверждена схема, согласно которой в результате модификации нуклеозидная часть ФСБА фиксируется в активном центре фермента, а близко расположенный 1ув-172 служит "якорем" для связывания ингибитора.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. А.Х. Акбаров, В.Л. Тупицкая, Л.А. Баранова. Ю.В. Хропов, М.М. Красилыжкова, С.Н. Кочетков

Исследование нуклеозидтрифосфатсвяэывающего центра ДНК-зависимои РНК-полимераэы фага Т7 с помошы? аналогов GTP, -Биохимия. 1990, т.55, Но.5, с.829-635.

2. V.L. Tunitskaya, A.Kh. Akbarov and S.N. Kochetkov.

T7 RNA polymerase: Use of limited proteolysis for the study of enzyme's Interaction with substrates and inhibitors. -Blochera. International, 1990, v.20, p.1033-1040.

3. V.L. Tunitskaya, A.Kh. Akbarov, S.V, Luchin, L.V. Memelova, V.O. Rechlnsky and S.N. Kochetkov.

Inactlvatlon of bacteriophage T7 DNA-dependent RNA polymerase by 5'-p-fluorosulfonylbenzoyladenosine. Identification of the modification site and the effect of the modification on the enzyme action. - Eur. J. Biochem, 1990. No.191 p.99-103.