Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии

Григолия, Софья Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии"

На правах рукописи

Григолия Софья Борисовна

КОРРЕКЦИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА ПРИ БОЛЕЗНЯХ ТЕЛЯТ ИНФЕКЦИОННОЙ ЭТИОЛОГИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,-эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

14 НОЯ 2013

Санкт-Петербург 2013

005538847

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ»)

Научный руководитель: Сухинин Александр Александрович

доктор биологических наук, профессор (ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ»)

Официальные оппоненты: Калишин Николай Михайлович

доктор ветеринарных наук, профессор (ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ»)

Щепеткина Светлана Владимировна кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ГНУ "Всероссийский Научно-

Исследовательский Ветеринарный Институт Птицеводства" Россельхозакадемии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ижевская государственная сельскохозяйственная академия» (ФГБОУ ВПО «ИжГСХА»); 426069, Россия, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Студенческая, 11; Тел/факс: (3412) 58-99-47.

Защита диссертации состоится » дрюоор^ш г. в часов на заседании

диссертационного совета Д_при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская

государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, дом 5, тел/факс (812) 388-36-31. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат размешен на официальном сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru «-2» ^Ы-йарЗ 2013 года и на сайте ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» http://spbgavm.ru/ « -5 » ЯосеОра? 2013 года. _

Автореферат разослан « У » /-¿0<-?<у4>201 з г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических нгццс профессор

Л.М. Белова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одна из важнейших задач современного животноводства получение здоровых жизнеспособных телят, так как от состояния их здоровья зависит последующие рост, развитие, активная адаптация к неблагоприятным факторам окружающей среды и в конечном итоге получение качественной продукции (Mebus С.А. et al., 1973; Петровская В. Г., Марко О. П., 1976; Апатенко В. М.; Коромыслов Г. Ф. и соавт., 1993; Сюрин В.Н. и соавт., 1998; Терехов В.И., 2009). В то же время во всех странах мира широко распространены инфекционные болезни новорожденных телят, наносящие значительный экономический ущерб животноводству (Сисягина Е.П., 2010; Неустоев МП. с соавт., 2010; Шилова E.H., Донник И.М., 2011).

Наиболее острые проблемы в животноводстве Российской Федерации -респираторные и желудочно-кишечные болезни новорожденных телят, протекающие чаще всего в форме смешанных инфекций и сопровождающиеся высоким уровнем заболеваемости. Отход от этих болезней может составлять более 50% от общего падежа телят. Причины и факторы, предрасполагающие и способствующие возникновению и развитию болезней, различны и могут быть как инфекционной, так и неинфекционной этиологии (Апатенко В.М., 1990;. Сочнев В .В. и соавт., 2000; Гаффаров Х.З. и соавт., 2002; Ярыгин В.Н., 2003; Молев А.И. и соавт., 2004).

Для лечения инфекционных болезней применяются антибактериальные препараты. Однако антибиотики и сульфаниламиды вызывают гибель не только патогенной микрофлоры, но и нарушение роста и развития симбионтной физиологической микрофлоры, что приводит к нарушению микробиоценоза и развитию дисбактериоза. В результате чего происходит активное заселение кишечника гнилостной и грибковой микрофлорой, снижение эффективности их применения.

Поэтому не случаен интерес к использованию пробиотиков (препаратов содержащих естественную микрофлору кишечника) с целью профилактики и

лечения животных с болезнями, вызываемыми возбудителями инфекционной

природы (Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., 2008; Сухинин А.А., Макавчик С.А., 2007; Тараканов Б.В. с соавт., 2000; Поспелова В.В., 2002; Шевелева С.А. с соавт., 2002; Панин А.Н., 2007; Ноздрин Г.А. и соавт., 2007; Данилевская Н.В., 2010).

Степень разработанности. В настоящее время предложены различные методы лечения и профилактики больных животных с использованием различных фармакологических средств. Однако инфекционные болезни молодняка крупного рогатого скота по-прежнему наносят существенный экономический ущерб животноводству.

В связи с широким применением антибактериальных препаратов, отмечается появление антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов, гибель нормальной микрофлоры, развитие дисбактериоза и, как следствие, активация условно-патогенной микрофлоры.

Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы стало изучение микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии и его коррекция. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

- провести мониторинг этиологической структуры респираторных и желудочно-кишечных болезней новорожденных телят в хозяйствах Ленинградской области;

- определить состояние микробиоценоза и неспецифической резистентности у больных телят;

- обосновать возможность применения атомно-силовой микроскопии при диагностике бактериальных и вирусных болезней телят;

- оценить профилактическую, лечебную и экономическую эффективность комбинированного препарата, содержащего антибиотик фторхинолонового

ряда - энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76, при инфекционных болезнях телят;

Научная новизна. Установлена этиологическая структура болезней новорожденных телят в хозяйствах Ленинградской области. Разработан способ борьбы с инфекционными болезнями новорожденных телят с одновременной коррекцией микробиоценоза и неспецифической резистентности с применением энрофлоксацина и лактобактерий Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76. Дана оценка лечебно-профилактической эффективности препарата, обладающего одновременно антибактериальной и пробиотической активностью, при острых респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят. Впервые в ветеринарии дано научное обоснование возможности применения атомно-силовой микроскопии для обнаружения бактерий и вирусов в содержимом кишечника у телят.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Основные результаты научно-исследовательской работы вошли в методические положения «Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии», утвержденные Координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного Регионального Научного Центра (РНЦ) Россельхозакадемии (протокол № 3 от 24 октября 2013 г.). Определена структура возбудителей респираторных и желудочно-кишечных болезней телят в хозяйствах Ленинградской области; в лабораторной практике рекомендовано применение атомно-силовой микроскопии при диагностике бактериальных и вирусных болезней телят. Отработаны доза, кратность, порядок и продолжительность применения комбинированного препарата, содержащего антибиотик фторхинолонового ряда - энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 с целью коррекции микробиоценоза и неспецифической резистентности больных телят. В производственных условиях показана его высокая антибактериальная и пробиотическая активность.

Материалы исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами на кафедре эпизоотологии и кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ».

Методология и методы исследований. Методологические подходы в решении задач основаны на закономерностях возникновения и распространения инфекционных болезней молодняка. При выборе методов исследований и анализе полученных результатов учтены возраст животных, условия содержания и кормления, а также факторы, способствующие возникновению болезней молодняка.

Основные положения, выносимые на защиту.

респираторные и желудочно-кишечные болезни телят широко распространены, имеют сложную этиологическую структуру, протекают чаще всего в форме ассоциаций на фоне нарушенного микробиоценоза и сниженной неспецифической резистентности;

- атомно-силовая микроскопия является перспективным методом при диагностике инфекционных болезней телят;

- применение комбинированного препарата, содержащего антибиотик фторхинолонового ряда - энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 оказывает профилактическое и лечебное действие при респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных данных обоснована значительным объемом исследований, использованием современных методов, в том числе вариационной статистики по программе MS Excel 2010.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (2010-2013 г.); заседаниях методической комиссии и межкафедральном совещании профессорско-преподавательского состава ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (2010-2013 г.); на 2-ом

Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии», СПб., 2012 г.; на Объединенном Иммунологическом форуме, Нижний Новгород, 2013 г.

Реализация результатов исследований. Разработанные методические положения реализуются в комплексе лечебно-профилактических и ветеринарно-санитарных мероприятий при инфекционных болезнях телят в условиях животноводческих хозяйств. Методическими положениями «Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии» могут руководствоваться ветеринарные специалисты животноводческих хозяйств, индивидуальные предприниматели, аспиранты и студенты факультетов ветеринарной медицины вузов РФ.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, в том числе 1 статья из перечня изданий ВАК Минобразования и науки. Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом исследования автора в период с 2011 по 2013 г.г.

Соискатель лично выполнила большую часть научных исследований, в том числе экспериментальных, систематизировала и проанализировала полученные результаты. Исследования проводились под руководством доктора биологических наук, профессора Сухинина A.A. Научный руководитель оказывал организационно-методическую помощь в работе. Опубликованные в соавторстве научные статьи включают основную часть исследований, выполненных соискателем. Соавторы научных публикаций не возражают против написания в диссертации Григолия С.Б. материалов совместных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, списка используемой литературы и приложения. Список литературы включает 210 источников, в том числе 168 отечественных и

42 зарубежных. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 13 таблицами и 7 диаграммами.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая работа выполнена в период с 2010 по 2013 гг. в соответствии с планами научно-исследовательской работы кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО СПбГАВМ.

Экспериментальные исследования были проведены на телятах черно-пестрой породы 1-60-дн. возраста, содержащихся в специальных боксах. Подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов.

Материалом для исследований служили пораженные органы павших и вынуждено убитых телят разных возрастов, пробы фекалий, смывы из носовых полостей, мокрота, смывы из прямой кишки.

Выделение, видовую и родовую идентификацию культур микроорганизмов проводили согласно «Определителю зоопатогенных микроорганизмов» Сидорова М.А. с соавт. (1995), «Определителю бактерий Берджи» (1997), «Определителю грибов Берджи» (2004) и других регламентирующих документов.

При диагностике колибактериоза руководствовались «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ РФ27.02.2000 г.

Антимикробную активность антибактериальных средств в отношении выделенных возбудителей изучали методом диффузии в агар со стандартными дисками и подтверждали по методике Г.П. Першиной (1971) и методом серийных разведений (Сбойчаков В.Б., 2000).

Эффективность применения комбинированного препарата, содержащего энрофлоксацина и Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 оценивали по состоянию микробиоценоза кишечника телят, выделению микроорганизмов из внутренних органов павших и вынужденно убитых телят, из проб фекалий, смывов из носоглотки и прямой кишки, клиническому состоянию телят,

производственным показателям (среднесуточный прирост массы тела, сохранность телят).

Изучение микробиоценоза кишечника проводили по методике Р.В. Энштейн-Литвак (1982).

Для выделения различных групп микроорганизмов из фекалий телят использовали среду Блаурокка для рода Bifidobacterium; МРС-4 для рода Lactobacillus; среду Эндо для бактерий семейства Enterobacteriaceae; элективную среду для рода Enterococcus; агар с мочевиной для рода Proteus; МПА для аэробных бацилл рода Bacillus; желточно-солевой агар для рода Staphylococcus; агар Сабуро для дрожжеподобных грибов рода Candida.

Для обнаружения антител на ротавирусную и коронавирусную инфекцию, инфекционный ринотрахеит у телят применяли иммуно - ферментный анализ (ИФА) с применением соответствующих диагностических наборов.

Для прижизненной экспресс-диагностики вирусных и бактериальных болезней мы применяли наборы компании Cymedica, основанные на твердофазном ИФА. IDEXX IBR gE Ab Test - для диагностики ИРТ (Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR)/Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1)). IDEXX Rota-Corona-k99 Ag Test - для диагностики ротавируса, коронавируса и колибактериоза.

Для подтверждения диагноза мы применяли серологический метод исследования, метод полимеразно-цепной реакции.

Серотипирование выделенных из патматериала культур E.coli проводили с использованием антиадгезивных (К88, К99, F41, 987 Р, А20) и О-коли сывороток в РА на стекле.

Определение вирулентности, токсичности и токсигенности выделенных возбудителей проводили на белых мышах общепринятыми методами.

Для проведения атомно-силовой микроскопии руководствовались «Методическими указаниями по проведению атомно-силовой микроскопии биологических образцов» СПб, 2010г.

Определение биохимических показателей крови телят проводили на биохимическом анализаторе IDEXX VetTest с помощью соответствующих диагностических наборов компании Cymedica. Динамику уровня показателей крови проводили общепринятыми в гематологии методами.

Определение функциональной активности нейтрофилов крови проводили в реакции восстановления нитросинего тетразолия (А.Н. Маянский и др., 1979). Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по методу С.И. Плященко и В.Т. Сидорова (1979), лизоцимную активность сыворотки крови -по методу В.Г. Дорофейчук (1968), фагоцитарную активность нейтрофилов по П.Н. Смирнову (1989).

Об эффективности разработанных способов лечения и профилактики судили по количеству заболевших и павших животных, продолжительности течения и наличию рецидивов болезни, по показателям неспецифической резистентности телят подопытной и контрольной групп.

Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий и электронных таблиц Microsoft Excel for Windows (Г.Ф. Лакин, 1990). Для статистической обработки цифровых показателей руководствовались математическим методом Стариковой Т.Т., Троценко Л.С., 2002 г. Для статистической обработки данных были применены прикладные компьютерные программы «Statgraphics» и «Quatro pro».

Экономическую эффективность рассчитывали в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной Департаментом ветеринарии РФ (1997 года).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Этиологическая структура респираторных и желудочно-кишечных болезней новорожденных телят в хозяйствах Ленинградской области В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что в обследуемых хозяйствах респираторные и желудочно-кишечные болезни телят вызывали энтеропатогенные E.coli; вирус семейства Herpesviridae первого

вида, рода Varicellovirus (возбудитель ИРТ); вирус семейства Coronaviridae и Rotavirus (семейство Reoviridae).

Патогенные стрептококки были представлены следующими видами: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus faecalis. Ha питательных средах с добавлением крови микроорганизмы образовывали зоны альфа- или бетта-гемолиза.

Основные представители стафилококков - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus. О их патогенности свидетельствовала положительная дерманекротическая проба и биопроба (гибель лабораторных животных отмечалась в течение первых часов после заражения).

Палочковидные микроорганизмы - E.coli, Pseudomonas aeruginosa; бациллы и Cl.perfringens.

От больных телят было выделено 830 культур микроорганизмов. Видовой состав микроорганизмов представлен в диаграмме 1.

Диаграмма 1. Микроорганизмы, выделенные от больных телят

■ Escherichia coli - 64,88%

■ Proteus vulgaris - 6,32%

■ Citrobacter - 5.41%

■ Enterobacter - 5,12%

■ Klebsiella-4,32%

■ Pseudomonas aeruginosa - 4,23% Staphylococcus - 3,95%

■ Streptococcus-2,11% Clostridia perfringens - 1,12%

■ Грибы рода Candida - 2,54%

Серотипирование E.coli, выделенных из патматериала культур, проводили с использованием антиадгезивных (К88, К99, F41, 987 Р, А20) и О-коли сывороток в РА на стекле. Для РА с антиадгезивными сыворотками К88, 987Р, А20 использовали взвесь микробов из колоний, выросших на МПА, а с сыворотками К99 и F41 - на агаре Минка. Исследуемую культуру относили к той О-группе, с сывороткой которой она вступает в реакцию до титра или не ниже половины

титра сыворотки, указанного на этикетке. При отсутствии агглютинации выделенной культуры с адгезивными сыворотками их исследовали в РА на стекле и пробирочной РА с О-коли сыворотками.

В хозяйствах чаще всего циркулировали несколько серогрупп Е.соН. Патогенными для телят были 078 (27,6 %), 086 (18,0 %), 08 (17,5). 36,9 % культур не удалось типировать.

При изучении возбудителей вирусных болезней, нами было установлено, что в 45,4 % случаев инфекционные болезни телят вызывали ротавирусы, в 31,7% - коронавирусы, вирус ИРТ в 9,7% случаев, в 13,2% вирусы других семейств, которые мы не типировали (таблица 1).

Таблица 1- Вирусы, выделенные от больных телят

Возбудитель К-во проб ИФА РИГА РТГА ПЦР

титр титр титр полож. пробы %

Varicellovirus (ИРТ) 45 - 1:16 1:4 и выше 4±1,0 9,7

Rotavirus 60 10,0 log 2 - - 27+1,0 45,4

Coronavirus 60 - 1:20 5,0-11,0 log 2 19±1,0 31,7

3.2. Микробиоценоз и неспецифическая резистентность у телят

При изучении состояния микробиоценоза больных телят (таблица 2) обнаруживается преобладание гемолитических энтеропатогенных E.coli и Proteus vulgaris.

При этом уровень Bifidobacteria и Lactobacilli значительно снижен (в норме должен составлять до 90% всей флоры кишечника). Наличие гнилостной микрофлоры и грибов Candida у больных телят свидетельствует о состоянии дисбактериоза, который требует медикаментозной коррекции.

Микрофлора Группа №1 (n=30) Группа №2 (n=30)

Bifidobacteria, 1д КОЕ/г 3,94±0,42*** 6,34±0,62

Lactobacilli, lg КОЕ/г 4,21±0,85*** 7,42±0,84

E.coli, lg КОЕ/г 10,17±0,74* 9,43±0,77

Гемолитические E.coli,% 90, 34±0,69 не обнаруживаются

Proteus vulgaris, lg КОЕ/г 9,91±0,51*** 3,21±0,57

Staph, aureus, lg KOE/r 5,16±0,52** 3,7±1,11

Enterococcus, lg KOE/r 5,7±0,75** 4,22±0,96

Cl.perfringens, lg KOE/r 4,8±0,95*** 2,4±0,65

Candida, lg KOE/r 7,19±0,47*** 5,6±0,34

Примечание: *Р<0,05** Р<0,01, ***Р<0,001

У больных телят выявлен лейкоцитоз, лимфопения (таблица 3). Отмечено снижение нейтрофилов. Бактерицидная и лизоцимная активность в контрольной группе была соответственно на 4,0% и 7,2% выше по сравнению с группой больных телят.

Таблица 3 - Показатели неспецифической резистентности у телят

Показатель 1 группа (п=30) 2 группа (п=30)

Абсолютное число лейкоцитов, -10ч/л 8,2±0,67** 4,68±0,035

Абсолютное число лимфоцитов, Т07л 1,5±1,1* 2,64±1,3

Относительное содержание лимфоцитов, % 18,31±0,03** 43,6±2,2

Абсолютное содержание нейтрофилов, -10ч/л 1,62±3,56 2,45±2,87

Относительное содержание нейтрофилов, % 32,26±4,8* 46,2±2,43

Фагоцитарное число 4,69±0,63 4,63±0,07

Фагоцитарный индекс, % 2,15±0,06 2,48±0,85

Лизоцимная активность, % 5,1±0,45* 12,3±0,39

Бактерицидная активность, % 19,0±0,032* 23,0±0,055

Содержание общего белка, г/л 46,61±0,024 52,44±0,076

Примечание: *Р<0,05, ** Р<0,01, ***Р<0,001

3.3. Атомно-силовая микроскопия при диагностике инфекционных болезней

телят

Одной из задач наших исследований было определение возможности применения атомно-силовой микроскопии при диагностике инфекционных болезней. Атомно-силовая микроскопия является доступным и экономически более целесообразным методом по сравнению с электронной микроскопией.

Несложная подготовка образцов позволяет проводить исследования с нативным материалом. Практически полностью автоматизированный процесс снижает риск диагностических ошибок до минимума. Метод позволяет изучить морфологию вирусов, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Атомно-силовой микроскоп - это сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного.

Рис. 1. Скопление вирусов Рис. 2. E.coli

Рис. 3. E.coli

Для проведения атомно-силовой микроскопии нами были отобраны 25 проб от клинически больных телят в возрасте 1-5 дней. Смывы из прямой кишки помещали в стерильную дистиллированную воду и исследовали не позднее 2х часов после взятия материала. Режим работы атомно-силового микроскопа был полу контактным. Капля исследуемого материала наносилась на поверхность атомарно-гладкой кристаллической слюды. После высыхания образец помещали в зону сканирования и проводили исследования. На рисунках видны вирусы и микробные клетки (возбудитель E.coli) с отчетливо видными жгутиками.

3.4. Изучение влияния комбинированного препарата на телят 3.4.1. Влияние комбинированного препарата на микробиоценоз телят

С целью повышения эффективности лечебно-профилактических мероприятий нами было изучено влияние комбинированного препарата, содержащего одновременно антибиотик энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76, на телят по принципу аналогов были сформированы 2 группы телят. Опыт проводили по следующей схеме:

1 группа (подопытная): больные телята ежедневно получали препарат, содержащий 100 млн живых клеток Lactobacillus acidophilus в 10 мл и энрофлоксацин в рекомендованной дозе. Кратность дачи препарата 2 раза в день. Курс - 5 дней.

2 группа (контрольная): клинически здоровым телятам ежедневно выпаивали по 10 мл физиологического раствора 2 раза в день в течение 5 дней. Качественный и количественный состав микрофлоры фекалий телят исследовали в динамике - в суточном и 10-дневном возрасте. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Влияние комбинированного препарата на микробиоценоз телят

Микрофлора 1 сутки 10 сутки

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

Bifidobacteria, lg КОЕ\г 3,94±0,42 6,34±0,62 12,56±1,06* 6,54±1,22

Lactobacilli, lgKOE\r 4,21±0,85 7,42±0,84 9,67±0,68* 6,76±0,32

Е. Coli с норм, ферментативной активностью, lgKOE\r 10,17±0,74 9,43±0,77 7,56±0,43 9,45±0,44

Е. Coli с гемолитической активностью,% 90,34±0,69 - - -

Proteus vulgaris, !gKOE\r 9,91±0,51 3,21±0,51 2,11±0,022*** 3,9±0,52

Citrobacter, lg KOE\r 3,05±0,76 1,23±0,55 2,74±1,03 1,89±0,11

Enterococci, lgKOE\r 5,7±0,75 4,22±0,96 3,2±2,32** 4,71±1,67

Staphylococcus aureus, lgKOE\r 5,16±0,52 3,7±1,11 2,55±0,21* 3,6±0,76

Грибы рода Candida, lgKOE\r 7,19±0,47 5,6±0,34 2,56±0,56* 6,4±0,98

Clostridia perfringens, lgKOE\r 4,8±0,95 2,4±0,65 2,33±0,11*** 3,4±0,34

Klebsiella, lgKOE\r 7,21±0,74 2,11±0,62 3,24±0,28*** 2,9±0,51

Pseudomonas aeruginosa обильный рост Роста нет Роста нет Роста нет

Примечание: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001

3.4.2. Влияние комбинированного препарата на неспецифическую резистентность телят

Отмечено увеличение абсолютного числа лимфоцитов на 24,3%, относительного содержания лимфоцитов на 13,5%, абсолютного числа нейтрофилов на 42,04%, относительного содержания нейтрофилов на 13,37%, лизоцимной активности на 3%, бактерицидной активности на 6%, общего белка на 25,48%. Уровень пищеварительных ферментов - липазы и амилазы в подопытной группе был выше, чем у телят контрольной группы (таблица 5).

Таблица 5 - Влияние препарата на неспецифическую резистентность

Показатели 1 сутки 10 сутки

с препаратом без препарата

Абсолютное число лейкоцитов, • 109/л 8,2±0,67 5,69±0,49 8,6±0,46

Абсолютное число лимфоцитов, • 109/л 1,5±1,1 2,18±0,3 1,65±0,14

Относительное содержание лимфоцитов,% 18,31±3,26 34,5±3,4*** 21,0±2,66

Абсолютное содержание нейтрофилов, -109/л 1,62±0,32 2,45±0,55 1,42±0,11

Относительное содержание нейтрофилов,% 32,26±4,8 44,51±2,55** 31,14±4,63

Фагоцитарное число 4,69±0,03 6,3±0,06 5,25±0,093

Фагоцитарный индекс 2,15±0,06 2,51±0,07 1,56±0,031

Лизоцимная активность,% 5,1±0,45 9±0,67* 6±0,12

Бактерицидная активность 19±0,032 27±0,05** 21±0,1

Содержание общего белка, г/л 46,61±0,024 65,44± 0,11 48,76 ±0,23

Примечание: *Р<0,05, ** P<D,01, ***Р<0,001

Уменьшилось количество телят, у которых диагностируются вирусные болезни. Количество положительно реагирующих телят, выявленных с помощью ПЦР диагностики на ротавирус уменьшилось с 45,4% до 20,3%; на коронавирус с 31,7% до 11,15%; на ИРТ с 9,7% до 2,1%.

3.4.3. Производственные испытания При проведении производственных испытаний по принципу аналогов были сформированы 3 группы телят.

1 группа (подопытная): больные телята - ежедневно выпаивали препарат, содержащий 100 млн живых клеток Lactobacillus acidophilus в 10 мл и

энрофлоксацин в рекомендованной дозе. Кратность дачи препарата 2 раза в день. Курс - 5 дней.

2 группа (подопытная) - больные телята, которым лечебно-профилактические мероприятия проводились в соответствии со схемой принятой в хозяйстве.

3 группа (контрольная): больные телята, не получавшие препараты. Применение новорожденным телятам комбинированного препарата,

содержащего антибиотик и пробиотик в течение 5-ти дней положительно повлияло на сохранность и продуктивность телят (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние препарата на производственные показатели

Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3

К-во телят 15 15 15

Заболеваемость телят инф.болезнями, % 100 100 100

Пало телят, голов 1 3 7

Пало, % 6,66 20 46,6

Сохранность, % 93,34 80 53,33

Масса теленка в 2 месяца, кг 60-65* 50-60* 50-58

Среднесуточный прирост, кг 0,83 ±0,80** 0,71 ±0,96** 0,48±0,69**

В группе №1 процент сохранности был на 13,34 % (Р<0,05) выше по сравнению с группой №2 и на 40,01% по сравнению с группой №3. Применение препарата способствовало повышение среднесуточного прироста массы телят. В группе №1 данный показатель был на 120г или на 14,45% (Р<0,01) больше по сравнению с группой №2 и на 348 г или на 43,0% по сравнению с группой №3.

Испытание комбинированного препарата, содержащего энрофлоксацин и Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75и Д-76 в производственных условиях показало его высокую терапевтическую и профилактическую эффективность при респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что применение антибиотика - энрофлоксацина, обладающего широким антибактериальным спектром, одновременно с живыми молочнокислыми бактериями Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75и Д-76, обладающими природной резистентностью к

нему и не содержащие плазмид (постоянный видовой признак), оказывает положительный эффект. Молочно-кислые бактерии компенсируют побочное действие антибиотика.

При расчете экономической эффективности было установлено, что применение данного препарата является рациональным и позволяет снизить экономический ущерб от инфекционных болезней молодняка.

4. ВЫВОДЫ

1. В хозяйствах Ленинградской области широко распространены респираторные и желудочно-кишечные болезни телят, протекающие чаще всего в форме ассоциаций. Развитие болезней сопровождается нарушением микробиоценоза, обусловленного действием возбудителей различной инфекционной этиологии, в структуре которых ведущую роль среди микроорганизмов занимают Escherichia coli серогрупп 078 (27,6%), 086 (18,0%), 08 (17,5%) (36,9% - не типировали); среди вирусов - ротавирус (45,4%), коронавирус (31,7%), вирус инфекционного ринотрахеита (9,7%), (13,2% возбудителей не типировали).

2. У больных телят выявлено значительное снижение Bifidobacteria и Lactobacilli до 6,7 lg КОЕ/г и 4,7 lg КОЕ /г соответственно, увеличение количества гнилостной микрофлоры и грибов рода Candida. Отмечено преобладание гемолитических энтеропатогенных E.coli и Proteus vulgaris.

3. На фоне дисбактериоза и снижения неспецифической резистентности респираторные и желудочно-кишечные инфекции протекают сложнее, выздоровление наступает медленнее и продуктивность животных снижается.

4. Атомно-силовая микроскопия является доступным и экономически целесообразным методом при диагностике инфекционных болезней телят. Для обнаружения вирусов и микробов возможно исследование как нативного материала, так и выделенных культур возбудителей.

5. Применение комбинированного препарата, содержащего антибиотик -энрофлоксацин и Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 положительно влияет на организм телят, повышает их сохранность на 13,34% и

среднесуточный прирост массы на 14,45%. Побочное действие антибиотика компенсируется положительным эффектом молочно-кислых бактерий Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76.

6. Проведение лечебных и профилактических мероприятий с применением комбинированного препарата способствует оздоровлению неблагополучных хозяйств от инфекционных болезней, позволяет получить экономический эффект в размере 3,52 руб. на 1 рубль затрат.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Утвержденные Координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного РНЦ Россельхозакадемии методические положения (протокол №3 от 24 октября 2013 г.) «Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии» рекомендуются для ветеринарных специалистов животноводческих хозяйств.

2. При проведении лабораторной диагностики инфекционных болезней молодняка рекомендуется применение атомно-силовой микроскопии.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при проведении лечебно-профилактических мероприятий в хозяйствах, а также в учебном процессе на кафедре эпизоотологии и кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сухинин А.А. Перспективы применения атомно-силовой микроскопии при диагностике инфекционных болезней телят/ Сухинин А.А., Буракова С.Б., Данко Ю.Ю.// Международный вестник ветеринарии. - 2012. - №4. С. 6-9.

2. Буракова С.Б. Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии/ С.Б. Буракова// Материалы 2-го Международного конгресса фармакологов и токсикологов, посвященного 80-летию заслуженного деятеля науки Российской Федерации профессора Соколова В.Д.. «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии». Санкт-Петербург. - 2012, г.

3. Григолия С.Б. Применение комбинированного препарата при инфекционных болезнях телят/ С.Б. Григолия// Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых «Аграрная наука 21 века, актуальные исследования и перспективы» г. Пушкин. - 2013 г.

4. Grigholia S.B. Perspectives of atomic forse microscopy in infectious deseases of calves/ S.B. Grigholia// Материалы конкурса Altech Young Scientist. - 2012.

5. Григолия С.Б. Этиологическая структура массовых инфекционных болезней телят/ С.Б. Григолия// Материалы Международной научно-практической конференции «Молодежь и инновации 2013», г. Горки.

6. Григолия С.Б. Иммунологический статус телят при массовых инфекционных болезнях телят/ С.Б. Григолия// Российский иммунологический журнал. - Том 7. - №2-3. - С. 184.

7. Сухинин A.A. Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии/ Сухинин A.A., Григолия С.Б.// Методические положения. -2013. - 27 стр.

Подписано в печать «02» ноября 2013 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 735

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Григолия, Софья Борисовна, Санкт-Петербург

ФГБОУ ВПО САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ.

На правах рукописи

04201452766 [М

Григолия Софья Борисовна

КОРРЕКЦИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА ПРИ БОЛЕЗНЯХ ТЕЛЯТ ИНФЕКЦИОННОЙ ЭТИОЛОГИИ.

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Специальность:

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Сухинин Александр Александрович

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................... 4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 9

2.1. Этиологическая сруктура респираторных и желудочно-кишечных болезней телят................................................9

2.2. Респираторные болезни телят инфекционного генеза....... 11

2.3. Инфекционные болезни телят, сопровождающиеся синдромом диспепсии.............................................. 15

2.3.1. Колибактериоз....................................................... 18

2.4. Лечение и профилактика инфекционных болезней новорожденных телят.............................................. 22

2.5. Общая характеристика, механизм действия и перспективы применения пробиотиков на основе бактерий вида Lactobacillus acidophilus в животноводстве..................... 31

2.6. Антибиотик фторхинолонового ряда - энрофлоксацин и научное обоснование его сочетанного применения.......... 39

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................... 42

3.1. Материалы и методы................................................ 42

3.2. Этиологическая структура респираторных и желудочно-кишечных болезней новорожденных телят в хозяйствах Ленинградской области............................................ 48

3.2.1. Характеристика культурально-биохимических свойств основных культур микроорганизмов, выделенных от больных телят........................................................ 49

3.3. Характеристика хозяйств, где проводились исследования.. 56

3.4. Микробиоценоз и неспецифическая резистентность......... 58

3.5. Атомно-силовая микроскопия.................................... 61

3.6. Профилактическая, лечебная и экономическая

эффективность комбинированного препарата при

инфекционных болезнях телят....................................................................64

3.6.1. Характеристика компонентного состава............................................64

3.6.2. Чувствительность лактобактерий моноштаммов и биокультуры к антибиотикам........................................................................68

3.6.3. Определение чувствительности микроорганизмов к энрофлоксацину..........................................................................................................69

3.6.4. Чувствительность к энрофлоксацину культур различных микроорганизмов, выделенных от телят..............................................72

3.6.5. Контроль комбинированного препарата, содержащего энрофлоксацин и Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75

и Д-76..................................................................................................................................73

3.6.6. Определение безведности препарата......................................................74

3.7. Изучение влияния комбинированного препарата на телят.. 76

3.7.1. Влияние препарата на микробиоценоз телят....................................76

3.7.2. Влияние комбинированного препарата на неспецифическую резистентность телят................................................78

3.8. Производственные испытания......................................................................82

3.9. Экономическая эффективность....................................................................83

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ............85

5. ВЫВОДЫ............................................................................................................................93

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ........................................................94

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................95

8. ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................115

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одна из важнейших задач современного животноводства получение здоровых жизнеспособных телят, так как от состояния их здоровья зависит последующие рост, развитие, активная адаптация к неблагоприятным факторам окружающей среды и в конечном итоге получение качественной продукции (Mebus С.А. et al., 1973; Петровская В. Г., Марко О. П., 1976; Апатенко В. М.; Коромыслов Г. Ф. и соавт., 1993; Сюрин В.Н. и соавт., 1998; Терехов В.И., 2009). В то же время во всех странах мира широко распространены инфекционные болезни новорожденных телят, наносящие значительный экономический ущерб животноводству (Сисягина Е.П., 2010; Неустоев М.П. с соавт., 2010; Шилова E.H., Донник И.М., 2011).

Наиболее острые проблемы в животноводстве Российской Федерации -респираторные и желудочно-кишечные болезни новорожденных телят, протекающие чаще всего в форме смешанных инфекций и сопровождающиеся высоким уровнем заболеваемости. Отход от этих болезней может составлять более 50% от общего падежа телят. Причины и факторы, предрасполагающие и способствующие возникновению и развитию болезней, различны и могут быть как инфекционной, так и неинфекционной этиологии (Апатенко В.М., 1990;. Сочнев В.В. и соавт., 2000; Гаффаров Х.З. и соавт., 2002; Ярыгин В.Н., 2003; Молев А.И. и соавт., 2004).

Поэтому не случаен интерес к использованию пробиотиков (препаратов содержащих естественную микрофлору кишечника) с целью профилактики и лечения животных с болезнями, вызываемыми возбудителями инфекционной

природы (Петров JI.H., Вербицкая Н.Б., 2008; Сухинин A.A., Макавчик С.А., 2007; Тараканов Б.В. с соавт., 2000; Поспелова В.В., 2002; Шевелева С.А. с соавт., 2002; Панин А.Н., 2007; Ноздрин Г.А. и соавт., 2007; Данилевская Н.В., 2010).

Несмотря на перспективность применения пробиотиков, отказаться от антибактериальных средств, сложно. Поэтому наилучшим выходом, по нашему мнению, является применение такого комплексного препарата, который бы содержал в своем составе одновременно антибактериальный препарат и пробиотик, устойчивый к сочетанному антибактериальному компоненту. Степень разработанности. В настоящее время предложены различные методы лечения и профилактики больных животных с использованием различных фармакологических средств. Однако инфекционные болезни молодняка крупного рогатого скота по-прежнему наносят существенный экономический ущерб животноводству.

- определить состояние микробиоценоза и неспецифической резистентности у больных телят;

ряда - энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76, при инфекционных болезнях телят.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Основные результаты научно-исследовательской работы вошли в методические положения «Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии», утвержденные Координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного РНЦ Россельхозакадемии (протокол № 3 от 24 октября 2013 г.). Определена структура возбудителей респираторных и желудочно-кишечных болезней телят в хозяйствах Ленинградской области; в лабораторной практике рекомендовано применение атомно-силовой микроскопии при диагностике бактериальных и вирусных болезней телят. Отработаны доза, кратность, порядок и продолжительность применения комбинированного препарата, содержащего антибиотик фторхинолонового ряда - энрофлоксацин и пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 с целью коррекции микробиоценоза и неспецифической резистентности больных телят. В производственных условиях показана его высокая антибактериальная и пробиотическая активность.

Материалы исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами на кафедре эпизоотологии и кафедре

микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Основные положения, выносимые на защиту.

- атомно-силовая микроскопия является перспективным методом при диагностике инфекционных болезней телят;

«Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии»,СПб., 2012 г.; на Объединенном Иммунологическом форуме, Нижний Новгород, 2013г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, в том числе 1 статья в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом исследования автора в период с 2011 по 2013 годы.

Соискатель лично выполнила большую часть научных исследований, в том числе экспериментальных, систематизировала и проанализировала полученные результаты. Исследования проводились под руководством доктора биологических наук, профессора Сухинина A.A. Научный руководитель оказывал организационно - методическую помощь в работе. Опубликованные в соавторстве научные статьи включают основную часть исследований, выполненных соискателем. Соавторы научных публикаций не возражают против написания в диссертации Григолия С.Б. материалов совместных исследований.

42 зарубежных. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 13 таблицами и 7 диаграммами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Этиологическая структура респираторных и желудочно-кишечных

болезней телят

Причины и факторы вызывающие респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота могут быть как инфекционной, так и неинфекционной этиологии. Чаще всего они протекают в виде ассоциаций на фоне снижения неспецифической резистентности организма. Хозяйства несут значительные экономические потери, поэтому в современном животноводстве по-прежнему актуальна проблема сохранности новорожденных телят.

К постнатальной гибели молодняка в условиях интенсивного производства приводит действие бактериальных и вирусных агентов, грибковой флоры, патогенных простейших. Сопутствующими факторами являются: нарушение качественного и количественного состава естественной микрофлоры кишечника, наследственные заболевания, наследственный и приобретенный иммунодефициты, несовершенство ферментативной системы

пищеварительного тракта в раннем возрасте, нарушение обмена веществ, авитаминозы, нарушение зоогигиенических нормативов содержания и другие причины.

При эпизоотологических обследованиях животноводческих хозяйств, массовые респираторные и желудочно-кишечные болезни телят регистрируются практически в 95,5% хозяйств. В 32% диагностируют бактериальные инфекции, в том числе смешанные; в 68,1% - вирусно-бактериальные. В 97,9% случаев при болезнях телят выделяется E.coli; Enterococcus faecalis - 70, 2%; Salmonella tiphimurium, S. Dublin - 6, 4%; P. aeruginosa - 8, 5%; Proteus, Citrobacter - 8, 5%; CI. perfringens - 2, 1%; Act. lignieresi - 2,1%; Man. haemolytica - 2,1%; Staph, aureus - 2.1%; ВД-БС - 38,3%; ротавирусы - 29,8%; аденовирусы - 10,6%; ИРТ - 2,1%; коронавирусы - 2,1%;

ГТГ- 3 - 1,0%; хламидии - 1,0%; патогенные микоплазмы - 38,3% (Ефанова Л.И., Манжурина O.A., Свиридов М.М., Давыдова В.В., 2012). Данные представлены в таблице 1 и 2.

Таблица 1 - Видовой состав микроорганизмов, изолированных от павших

телят, %

Бактериальные инфекции, n=35 Вирусно-бактериальные инфекции, п=86

Микроорганизмы моноинфекции ассоциированные всего | бактериальные ассоциации с вирусами всего

Энтеропатогенные E.coli 23,1 53,8 76, 9 12,8 70,9 83,7

Salmonella tiphimurium, S. Dublin 7,7 15,4 23,1 - 2,5 2,5

Enterococcus faecalis - 38,5 38,5 1,2 53,2 54,6

Proteus vulgaris - 7,7 7,7 - 7,0 7,0

P. aeruginosa - 15,4 15,4 1,2 9,3 10,5

Citrobacter diversus, freundi - - - - 4,7 4,7

Cl. Perfringens типа А - - - 2,4 - 2,4

Act. lignieresi - - - - 2,4 2,4

Man. haemolytica - - - - 3,5 3,5

Микоплазмы (ПЦР) - 30,8 30,8 31,4 15,1 46,5

Staph, aureus - - - - 2,4 2,4

Таблица 2 - ПНР-диагностика патматериала от павших и больных телят из неблагополучных по вирусным болезням хозяйств (Ефанова Л.И. и др., 2012)

Патоген Исследовано проб Число проб, % положительных

С монопатогеном С ассоциацией вирусов,микоплазм всего

ВД-БС 157 30/19,1 17/10,8 47/29,9

ИРТ 90 0 2/2,2 2/2,2

Аденовирус 69 4/5,8 7/10,1 11/15,9

Ротавирус 110 22/20 15/13,6 37/33,6

Коронавирус 110 2/1,8 1/0,9 3/2,7

ПГ-3 79 0 0 0

Микоплазма 80 27/33,7 13/16,2 40/50

Хламидии 93 0 0 0

Недостаточность иммунной системы, связанная с морфологическими и функциональными особенностями развития новорожденных, углубляет тяжесть течения заболеваний, способствует частым рецидивам, обуславливает слабую эффективность специфических методов лечения и профилактики, провоцирует патогенность банальной микрофлоры (Блохин A.A., 2009).

Одной из причин распространения инфекционных заболеваний является контаминация объектов окружающей среды патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

В последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению числа факторов, способствующих развитию дисбактериозов, с трудом поддающихся лечению (Куликовский A.B., Костин В.В., Айвазян М.А., 1991; Тараканов Б.В., 1995; Субботин В.В., 1999; Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., 2005; Baines D., Masson L., McAllister Т., 2008). При рождении кишечник теленка стерилен. Его заселение нормальной (ре

Информация о работе

Григолия, Софья Борисовна
кандидата ветеринарных наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Коррекция микробиоценоза при болезнях телят инфекционной этиологии - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы