Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конверсия электролизованного растительного сырья термофильными анаэробными бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конверсия электролизованного растительного сырья термофильными анаэробными бактериями"

о 06 9'

АКАДЕМИЯ НАУК СССР.

ИНСТИТУТ БИОХИМИЙ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

БЕЛОКОПЫТОД БОРИС ФЁДОРОВИЧ

УДК 579.85.851

КОНВЕРСИЯ ЭЛЕКТРОЛИЗОВАННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ОЕРШШШШ! АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

специальноегь 03.00.07 - микробиология

Авторе фераг диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Работа выполнена в лаборатории анаэробных процессов ЙЕФ-Д АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук

В.К.ЛКЙИБШЮ,

кандидат биологических наук Я.А.ЧУШЛЬСКАЯ

Официальные ояпоненгь:: аокзор биологических наук

К.А.КОЩЕВНКО,

кандидат биологических наук

е.а.бонч-осыоловсш

Ведущее учреждение: Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР

на заседании Специализированного учёного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии к физиология микроорганизмов АН СССР по адресу: 14-2292, Московская облаешь, г.Пущине, ЦБК! АН СССР

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Института биохишш и физиологии микроорганизмов АН СССР

Автореферат разослан "Ш" и&и$С 1991 г.

УчёниП секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ВАГАЕОВ tf.il.

V I , I

i

/и :Л]

* Л/ м ^ A A í>

Актуальность проблемы. Ухудпекке экологической обстановки в стране обусловило необходимость поиска зкологичесяк частого тол-ива. bazEe^zaiiz из них являются этанол, йетан и водород, продукт сгорания которых - вода и углекислота является естест-зезн1::'.л компонентами атиос^еры. Этанол и водород являются продуктами брогения термофильных анаэробных целлшолятяческях бактерий при их росте яа целлшогосодергадих материалах.

Еюионгзрсия растительного сырья герао$ильнык2 анаэробным бактериями до этанола позволяет ке только сберечь «еанке пищевые продукты - зерно, картофель, сахарную свёклу, ндуцие в большие количествах яа получение этилового спирта, но и сохранить ограниченные запаси ископаемых видов топлива - не^ти, газа, угля, торфа, давая значительную экономическую выгоду.

Всё вкае сказанное свидетельствует об актуальности исследований, посвященных конверсия растительного сырья, предобработан-ного электрохимическим методой, термо^ильшии анаэроо'ншш бакте-рияии.

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Изучение, термофильных анаэробных бактерий, как перспективных продуцентов этилового спирта из целлюлозы, проводится в райках специальных программ многими ЕвропеЬскиыи странами. Б CUA разработан проект взвода для получения этанола из стеблей кукурузы с помощью иутакхгшх итаимов C.th.exmocellun и C.-thermoaBccherolyticua. Проектная иоцность - ICO млн. л спирта в год при переработке 1500 т сырья в день с себестоимостью этанола 28 центов за I литр.

Цель настоящей работы - изучение возможности роста и образования продуктов термофильными аназробяьш целлюлолигяческимк бактерияии C.thernocellua на опилках, обработанных электрохимически« методой.

Б задачу исследований входило:

1 - отработка метода деяигиификации растительного сырья, а имен-

но опилок различных древеснкх пород;

2 - определение физиологических параметров роста c.thennocellum

на электролизованных опилках;

3 - изучение различных способов повышения выхода этанола: снятие

лицита по субстрату; устранение ингибирования конечным продуктом; совместное культивирование двух продуцентов этанола, иеллюлолитячесного и сахаролитического;

с

4 - исследование возможности создания пролонгированного процесса

ферментации и проточного культивирования;

5 - апробирование различных способов извлечения этанола из среды

в процессе роста культуры.

Научная новизна работы определяемся геи, что:

- были изучены физиологические свойства целдюлозоразрутающих терыофилышх бакгерай с.^еимсеПит в монокультуре и а снеси с другими сахаролатичасниии термофильными бактериями при росте на делигнифацироваавои методом электролиза растительном сырье;

- показана возможность культивирования бактерий в непре'рыЕ-ных условиях на нерастворимом целлшозосодэркащеы субстрате;

- показана реальная возможность использования отходоз лесопиления' (деревообрабатывающей промышленности), делигнифяциро-ванных;злекгролизоа для получения этанола.

Практическое значение работы. Представленные в работе результаты могут служить основой для разработки лабораторного, а в дальнейшем и технического регламента производства атанола на основе термофильных анаэробных бактерий.

Апробация работы, .'материалы работы отражены в девяти публикациях и доложены на ¿-ом Всесоюзной совещании по технической биоэнергетике, Саратов, 1585; на Всесоюзном совещании по использованию целлюлозы а её производных в медицинской и микробиологической промышленности, Ташкент, 1989.

_ ' Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), экспериментальной части (одна глава), обсуждения результатов (одна глава), выводов и списка литературы.

Работа содераит 187 страниц машинописного текста, 33 рисунка и 16 таблиц. Список литературы содержит 248 наименований на русском и английскоы языках.

^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. В работе использовали культуры С1о8^1(11щп 1Легтосе11ит шташы Т4, г7, 513, ^-облученные культуры С.ЬЬетосеЦит и С1ов6г1<31иш 12гешоЬу4този1й1-г1сиш зэе/ из коллекции Лаборатории анаэробных процессов ИБфЦ АН СССР, а также С .-ЫхегтоееИит С.НЬегиопуагозиХ-

Л1г1сиш 39Е, тьегтоаиаегоЫит Ьгоски ним, любезно предоставленные доктором Да.Г.ЗеЙкусом (США).

Среда к условия культивирования. Для культивирования термофильных анаэробных бактерий была использована среда следующего осгава (г/л): КН2?04 - 2,0; К2НР04 - 3,0; МеС12- бн2о - 1,о; sCig# 2H?o - 0,05j Peso4«7H2o - 0,002; дрокзевой экстракт - 5,0; .очевина - 2,0; цисгеин.нс! - 1,0; резазурия - 0,002; целлюлозой субстрат - 30,0 и микроэлементы по Буркгольдеру. В зависимос-и он целей эксперимента состав основной питательной среды пре-ерлевал необходимые изменения.

Культивирование термофильных бактерий проводили в анаэроб-ых условиях, г покое и с перемешиванием, в пробирках, колбах, лаконах и ферментёрах lkb 1601 Униферм (Швеция) и AK-2I0 СССР). Температура культивирования составляла 60°С.

Определение параметров роста. За ростом культуры следили по змененяв оптической плотности, которую измеряли на спектрофото-зтре "Спекол-II" (ГДР) при длине золям 540 ни и длине оптичес-ого пути I си. Культуру предварительно отстаивали в течение часов.

Сухой вес определяли путём фильтрования культуры через мем-ранный фильтр "Сыяпор" № 9 и внсумваниеи его до постоянного еса. Сухой вес клеток в расчете на I ед.оптической плотности ультуры составлял для c.thermoceliun - 0,595 г/л, для c.ther-ohydrosulfuricum - 0,544 г/л, для I.brockii - 590 г/л.

За физиологическим состоянием бактерий наблюдали с помощью азово-контрастной микроскопии, используя микроскоп МБИ—3 • СССР).

Препаративные методы. Щелочную делигнификацию опилок осу-ествляли путём их авюклавировакия (I атм, I ч) в I% растворе еон при весовом отношении опилок и щёлочи 1:1. '

Электрохимическую дедигнификацию опилок проводили в астворе iraci, в объёме 7 л, при соотношении соли и опилок 1:1. качестве электродов использовали платиновые пластина с плот-остьв прямого тока на аноде 40 mA/cu^. Процесс продолжзлся 5 ч при постоянном перемешивании. После 40 ч электролиза до-авляли 175 г lisCl. По окончании процесса электролиза опилки тделяли фильтрованием и промывали водой. Электролиза!•мог ис-ользоваться для приготовления питательной среды для аэробных актерий.

Кульгуральнув яидкость для исследований получали путём ентрифугирования культуры при 10 ООО об/мин 20 мин, 4°С. Су- -ернатант использовали для определения этанола, ацетата, лак-

3

raía, редуцирующих Сахаров, цзллюяазной активности, глюкозы и белка. Клеточный осадок использовали для иммунологических исследований.

Аналитические методы. Измерение редуцирующих Сахаров проводили по методу Шоыодьи-Яельсона (Kelson, 1944).

Целлюлазнув активность определяли по освобождению редуаи-руюздос Сахаров из натриевой соли карбоксиметияцеллюлозы, взя- -той в количества Реакционную сиесь инкубировали I ч при 60°С. Целлюлазную активность выражали в mkü глшозных эквивалентов редуцирующих сахароз, освобождённых из КМЦ-на за I мин в I л кулыуральгай жидкости.

Концентрацию глюкозы определяли гдюкозооксидазно-перонса-дазнш. методом (Еерезин U.A. и др., 1977).

Бело:-: определяли методом Брэдфорда (Bradford м.ы., 1976).

Этанол и ацзтат определяли методом газовой хроматографии на хроматографе "Цвет-102" (СССР).

Определение лактага проводили энзяматическиц неводом по уровню восстановления НАД* яактатдегкдрогеяазой.

Нерастворимый субстрат определяли весовш способом.

Об общем объеме газов судила по объзыу воды, вытесненной — газами из градуированной бутыли.

Технические приёмы. Вакуумную экстракцию этанола осуществ ляля с помощью водоструйного и вакуумного насосов.

Газовую экстракцию этанола вели с помощью азота, циркулирующего через ферментёр и систему конденсации паров.

Мембранный биореактор состоял из ферментёра, снабженного треля мембранными модулями с микропористыми капроновьиш меыбра наш (размер пор 0,2 ты) ("Хийу калур", ЗССР) для фильтрации культуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Рост культуры с.thermocellum на различных субстратах.

Культивирование C.tbermocellum проводили на растворимых субстратах - целлоблозе, карбоксиметилцеллюлозе и нерастворимых - фильтровальной бумаге, микрокристаллической целлюлозе и делигнифицированных опилках.

Рост культуры на среде с целдобиозой в рН-контролируемых условиях в ферментёре характеризовался высокими скоростью и yj асаем, аффективный потреблением субстрата, экономическим коэфф

циеятом порядка 0,50, относительно небольшим выходом продуктов и невысокой активностью ферментов целлюлазного комплекса (81,5 мкЦ/миН'Л).

Переход к культивированию на растворимом полимерном субстрате - карбоксиметилцеллюлозе-на (КЩ-Ив) приводил к некоторому снижении удельной скорости роста, значительному уменьшению уро-кая клеток, выхода продуктов и активности ферментов пеллшазно-го комплекса. Вероятно, такое снижение связано с ограниченной доступностью субстрата для ферментов в связи с его этерифика-цией.

Культивирование на нерастворимых формах целлюлозы (фильтровальная бумага, ср-11, 1Ш-зоо ) отличалось более низкими скоростями роста, чем на растворимом субстрате, невысоким накоплением биомасса и выходом продуктов. Активность же ферментов целлюлазного комплекса культур, выращенных на указанных субстратах, была значительно Еыше, чем на целлобиозе и КМЦ-На (200-400 мкЫ/ыин-л).

Некоторые физиологические параметры роста культуры С.№ег-тосеИша на различных субстратах в рН-контролируемых условиях в ферментёре представлены в табл.1.

Подбор оптимальное для роста концентрации нерастворимого субстрата проводили в колбах с перемешванием и без перемешивания, используя в качестве субстрата целлюлозу ШТ-зоо в количестве 0,5 - 5,0/о. Полученные результаты представлены в табл.2.

При культивировании в покое максимальный урожай культуры получен при содераании субстрата в среде - 2с перемешиванием - Ъ%. Концентрации субстрата выше Ъ% приводили к снижению-урокая клеток. При культивировании в покое эндоглюканазная активность культуральной тадкости с повышением концентрации, субстрата в среде, как правило, падала, что, вероятно, связано с увеличение« доли ферментов, адсорбированных на целлшозеь Подобная закономерность в условиях перемешивания выявлялась не так отчетливо. ;

Переход к культивированию сдЬегтосеПип на целлюлозосо-дераздам растительном сырье, которое было представлено: древесными опилками лиственных и хвойных пород, предобработанных методом электролиза, потребовал решения вопроса о лимитирующем действии лигнина на рост культуры.

Таблица I.

Некоторые физиологические параметры роста с.№егтосе11шя на различных субстратах в рН-котролируеыих условиях в ферментёре.

Субстрат, г/л

! са 'к »4 ! • • I го ! • I м о]яи >и I <зк « !а) ы « I | (я в и моли ао\ в : я« и

I

! Й 1 ха I

? {Накопление продуктов, .и---п-г

® о моя| «оч и : я« » «I гН ;——-1 .......1

! >а< »• I»« а <н »•! ми ^¡та® о,Р1 ¡аяя » |иияк I 1 I

1 ¿ .!§§•§ .« .18.§5 Тнс-5.1этанол |ацатат !лактат

1 ^ * ^«¡д^з® ! 1 I

* |!>» О

, к р* о о I СО «

, я га м а , а I

Целлобиоза, 10,0 5 0,38 3,82 7,5 0,51 81 17,1 45,6 9,6

1ИЦ-И8, 10,0' 0 0,23 0,2? - - ад 1,13 8,4 0,1

Целлюлоза, 10,0 16 0,18 1,2 9,5 0,13 ' 125 28,0 47,0 1,1

Злектролизованнда берёзовые опилки, 10,0 6 0,085 1.3 6,9 0,19 125 10,2 45,0 2,6

Берёзовые опилки, делигнифицировапные щёлочью, 30,0 20 0,115 1,96 18,0 0,11 55 55,6 63,3 6,1

Электролизованные еловые опилки, 30,0 . 46 0,11 1,45 21,0 0,0? - 36,6 102,4 -

Таблица 2.

Некоторые параметры роста с.-НастюсеПит VI на сложной среде, содержащей различные концентрации целлюлозы ш-зоо при культивировании в колбах без перемешивания (I) и с перемешиванием (2).

й 1 Концентрация ! целлюлозы, п/п! Р/л i Длительность ! ! лаг-фазы, ! ! час ! ! Удельная ! ! скорость т! ¡роста.М . ч -Ч Урожай, X, г/л ! Редуциру-I щие са-Гхаса, мМ •! КМЦ-азная ¡активность, 1шШ/шш • л

0,5 8 1,24 0,043 0,74 5,7 94

1,0 18 0,90 0,050 0,53 7,4 53

1,5 9 1,12 . 0,046 0,67 6,7 49

I . 2,0 12 1,44 0,052 0,86. 5,4 42

3,0 14 1,02 0,051 0,61 4,5 37

4,0 0 0,40 0,020 0,24 4,3 12

. _ _5,0____ 0 0,48 ___- 0,023 _ _ _ Q,29_ . ____ 16

0,5 25 2,90 0,128 1,72 5,5 1,1

1,0 22 2,41 0,329 1,43 14,2 2,5

1.5 25 з,и 0,115 1,85 15,8 5,2

2 2,0 20 3,16 0,115 1,88 ?,5 2,4

3,0 31 6,20 0,144 3,69 58,1 10,9

4,0 25 4,66 0,100 2,77 11,0 2,3

5,0 ••-... 25 4,54 0,077 '2,70 / 7,3 2,1

s) - максимальная оптическая "йлотность культуры при 540 ни.

Степень делигнификации определялась временем электролиза. Исходно опилки содержала 27,7$ лигнина, через 80 час элекгролиэа - 0,1%. В пределах 70 час экспозиции дзлигнификация протекала пропорционально времени со скорость» убыли лигнина 1,4$ в час (рис.1). __ "

При культивировании с.^егаюсеЦша на опилках, не подвергавшихся электролизу, рост культуры бал минимален, субстрат культурой не потреблялся и незначительный рост, по-видимому, был обусловлен яеболышы количеством растворимых Сахаров, присутствующих в среде. С возрастанием степени делигнификации до 64$ пропорционально увеличивался урогай клеток, а увеличение пс требления субстрата шло пропорционально убыли ллгняна до Ю0;5 делигнификации (рис.2).

Рост с.яьегаоееИиш в колбах без контроля рН на. опилках различных древесных пород, делигнифицированных различными способами, имел, как правило, худшие физиологические характеристики,: чем рост в рй-контролируешх условиях в ферментёре.

Суммируя данные экспериментов по культивированию с.«гег-посеНиш на целлюлозосодергащеы растительном сырье, мокко сказать, что культура способна расти на опилках различных древес- ных пород, делипшфицировзнных электролизом. Рост бактерий был сопоставим о ростом на коммерческих чистых препаратах целлюло-зычи ростом на сырье, предобработанном с помощью целочного гидролиза. Урожай культуры в значительной ыере зависел от степени делигяификацая целлюлозного субстрата. Однако, рост С.^етао-оеИиш в монокультуре независимо от штамма, условий культивирования, природы субстрата, его концентрации и способа получения не обеспечивал высоких уровней накопления биомассы и выход; ародуктоз. Соотношение этанол/ацетат не превышало!. Невысокой была и активность ферментов целлюлазкого комплекса. По всей вероятности, это обусловлено особенностями энергетического обмена данной группы микроорганизмов, спецификой набора ферментов катаболизма пирувата, обеспечивающего распределение электронных потоков,в сторону преимущественного образования ацетата Одним из способов повышения выхода этанола при сбраживании целлюлозосодераадих материалов с.^епаосеПша является его совместное культивирование с другими термофильными сахаро-лизичешшш партнёрами, специфика энергетического обмана которых способна обеспечить более высокие уровни накопления этанола.

е

к к

я

>э к

к

я к ю КС

■ 30 ;

100- 20 - «Ч >--

60- к я я й 10 " ^ у»

200 г 1 "1 1 1 <-Г---- » 1 Т

о

20

40 60 Ьремя, Ч£С

Рис.1. Зависимоеи между временем электролиза и степенью делигнификации еловых опилок. А - степень делигнификации, Б - содержание лигнина.

80

«

р<

я ш о, н о хз

о

10

О 20 ад 60. 80

Степень делигнифинации, % :

Рис.2. Зависимость потребления субстрата (Б) и .

накопления биомассы (А) культурой С.-ЬЬегтосе!-1ии Р7 ог степени делигнификации еловых опилок

100

2. Рост экстремально термофильных сахаролитических бактерий на глшозе.

В наших экспериментах в качестве сахаролитическах партнёров были использованы экстремально термофильные бактерии С.thermohydrosulfuricum 39Е И T.brockii НТЗЗ-4, которые были вырадены в аналогичных с целлюлолитическица бактериями условиях на слоеной среде, содержащей I$ глюкозы. Результаты этих экспериментов приведены в табл.3. Существенное различие этих культур/ошракалось в образовании конечных продуктов. Основным конечным продуктом с .thernobydrosulfurlcum был этанол, Т.ЪгоскИ - лактат.

3. Исследование роста сиеыанной культуры целявлолитической

/ и сахаролитичсской анаэробных термофильных бактерий.

3.I-. Периодическая культура.

; Исследование роста смешанной культуры с .-thermoceiium и с.thermohydrosrulfuricura в условиях периодического культивирования в ферментёре с контролем рЯ на злектролизованяых еловых опилках (30 г/л) выявило некоторые характерные особенности. В большинстве случаев наблюдался начальные небольыой рост, вероятно,счёт сахаролитического партнёра, сменявшийся довольно продолжительной лаг-фазой, которая в значительной мере зависела от величины и состояния инокулюка,. а также от состава среды. Удельная скорость роста смеаанной культуры и потребление субстрата мало отличались от этих параметров у монокультуры С«the пю се Ниш (табл.3, строка 3). Накопление биомассы и экономический коэффициент у сиеаанных культур были выше. Наблюдалось такне увеличение КЩ-азной активности и снихсние концентрации глюкозы в среде роста. Снижение концентрации глюкозы в среде роста объясняется присутствием сахаролитического партнёра. Более чем в 2 раза увеличивалось накопление этанола, а соотношение этанол/ацетат приближалось к единице (0,4 у монокультуры С.-fchermocellum). .

Концентрация этанола в среде роста смешанных культур в большинстве случаев составляла около 0,5%. Технологически значимый уровень этилового спирта в зрелой бражке сульфитных щелоков составляет 0,5-1,0^. Следовательно, этот уровень этанола вполне достижим при росте смешанных культур на делигнифици-рованном растительном сырье. 10

Таблица 3.

Некоторые физиологические характеристики роста с.гиегтоЬуйгоеи1£иг1сии (I), Т.ЪгоскИ (П) И смешанной культуры С.-1}гегтосе11ит и СЛЬегтоЬуагози1:Ги:г1сиш (Ш) при периодическом культивировании в ферментёре.

й 1Куль- Особенности !т „а (Ь» ч ! {*. г/л 1 {з, Г/л 1 ШЛЦ-аза, ¡Накопление продуктов, ЧШ

1 I I

п/п|тура |культивирования| ¡^И/ьшн-л ¡этанол 1ацетат !лактат

I. I - 9 0,32 1.1 10,0 0,11 - 71,4 0 6,6

г. и - 10 0,46 0,8 12,4 0,07 - 16,0 7,3 110,0

з. ш -- . 146 0,05 0,8 14,4' 0,05 58 40,0 50,0 4,а

4. Вакуумная экст- 166 0,05 1,6 25,5 0,06 115 92,7 (расчет) 62,7 3,0

ракция этанола

5. Газовая экстракция этанола 60 0,15 2,9 27,9 0,10 260 100,0 100,0 3,7

б. " Исходное содер- 142 167 •104,7

жание еловых 0,02 1,2 43,0 0,03 213,3 2,6

опилок, 50,0 г/л

7. " Дробное ввздениэ субстрата 120 0,08 1,2 46,0 0,02 119 ' 94,0. 84,0 8,7

8. " Дробное введение

субстрата + вакуумная экстракция этанола 230 0,08 2,0 . 38,4 0,05 93 120,8 расчёта. 120,0 6,0

и м

к) - обозначения то же, что в тгбл.1.

Увеличение исходного содергания опилок в среде роста, с целью снятия лимита по субстрату, до 50 г/л сказалось существенным образом на выходе и соотношении продуктов, которое достигло 2 (табл.3, строка 6). Потребление субстрата составило 87,3$. Однако экономический коэффициент был невысок.

Была предпринята попытка дробной подачи субстрата з ферментёр по пере роста смешанной культуры. 6-ти краткое добавление элекгрояизозаЕных еловых опилок порциями по 40 г через каа-дые 24 часа, вероятно, позволило снять ланит по субстрату, поскольку концентрация опилок а среде роста не опускалась ¡швее 15,8 г/л. В процессе роста культуры было потреблено 46 г/л опилок, что составило примерно половину ог.добавленного субстрата (20 г/л). Однако экономический коэффициент и выход продуктов оставались невысокими (табл.З, строка 7). Средняя скорость потребления субстрата за период подтитрозки составила 0,22-0,28 г/л в час.

Учитывая высокую чувствительность к этанолу с.ыхенаосеЦиш было сделано предположение, что другим фактором, лимитирующим рост исследуемых саеаанных культур, моает являться накопление этанола в среде роста.

Извлечение этанола из среды роста осуществляли с поноцьв вакуумной или газовой экстракции (продувка азотом). Благодаря этны приёмам удавалось сникать концентрации этанола в растущей культуре до 32-34 иШ, при этой накапливая значительные количества спирта з конденсатах ( 330-560 ши). Удаление этанола из среды роста, по-видимому, позволяло устранять ингибирование роста з«ш продуктом и получать в конденсатах технологически значимые концентрации спирта - 2,3-2,5$, что в 4-5 раз выае, чей в кулмуральной среде. Этому способствовала такге селективность удаления этанола поскольку ацетат в конденсатах не обнаружен.

Поскольку скорость накопления спирта в среда роста смешанной культуры, как правило, была сопоставима со скоростью роста, то скорость извлечения этанола из среды культивирования должна превышать' константу скорости роста культуры.

В целой ке удаление этанола из среды роста сиеианных культур, мало сказывалось на характере их роста, накоплении биомассы и продуктов (табл.З, строки 4 и 5), Здесь могло оказать влияние лимитирование по субстрату, так как в этих эксперимег

тах субстрат (30 г/л) был потреблен на 85 и 93^.

Однако и в опытах с сочетанием дробной подачи субстрата а вакуумной экстракцией этанола значительного улучшения физио-- логических параметров и пролонгирования роста достичь ке удалось (табл.З, строка 8).

Таким образом, ни добавление целлюлозного субстрата, ни удаление этанола з процессе роста смешанной культуры в условиях периодического культивирования ецё не являются достаточными для существенного продления процесса ферментации. Причина этого явления могла быть связана с несбалансированностью питательной среды по некоторым факторам. Не исключена танке возможность, что в условиях удаления этанола из среды роста начинает сказываться ингибируюдее действие инах продуктов.

Таким образом, изучение процесса прямой конверсии дедиг-шйицпрованных опилок ноко- к смешанными культурами термофильных анаэробных бактерий в условиях периодического культивирования показало, что з случае совместного культивирования С.-Ь'аегяосеПит ?7 И СДЬегиоЬуйуогиа^иггсит 392 происходит более полный гидролиз полисахаридов и потребление продуктов гидролиза, наблюдается повышение образования этанола к газообразных продуктов, а такне более высокая активность эндоглюка-наз (1ЫЦ-аз) по сравнению с монокультурой с.-ььохшосеПив ??.

Однако, при очевидном преимуществе совместного культивирования на растительном сырье целлюлозолптических и сахароля-тических бактерий, дополняюдих друг друга недостающими свойствами, существует ряд факторов, подавляющих рост, как моно-, так и смешанных культур на подобных субстратах. Среди них -лимитирование роста по субстрату, витаминам и другим факторам среды, а Tar.se ангнбированке конечным продуктом. Ряд призов, позголяадих преодолеть это препятствие, в частности, повышение содержания субстрата в среде (одномоментное или дробное), обогацзняе среды витаминами, избирательное извлечение этанола из ^еразнтера в процессе роста смешанной культуры (газовая и вакуумная окстракция), применение этанолтолераятных штаммов, з целом существенно улучшая ростовые характеристики периодических культур, не позволят всё зе достичь заметного пролонгирования процесса биоконверсии.

Для решения задачи пролонгирования процесса бпоконверсии цедлшозосодеряадего растительного сырья термофильными сме-

шакныыи культурами были проведены исследования в условиях и проточного культивирования.

3.2. Проточная культура.

Проточное культивирование позволяет устранить ингибирова-ние конечными продуктами, избеаать лимитирования культуры ке только по субстрату, но и по растворимым компонентам среды.

Особенностью нааих экспериментов по проточному культивировало являлось то, что целлюлозный субстрат не удалялся из ¿¿размера, и тем самый в протоке не участвовал.

Культивирование смеаанной культуры с.theiraocellun F7 к С.thermohydroзчIfuriсип ЗЭЕ в отъёыно-додивном реииме проводили в ферментере г,KB 1601, в объёме 4 л, при 60°С и перемешивании со скоростью оборотов мешалки 100 об/мин, на слоаной среде с.добавлением витаминов, исходно содержавшей 30 г/л электроли-зованшх еловых опилок.

В ходе ферментации было осуществлено 5 отъёмно-доаивных циклов, заключавшихся в замене половины объёма кидкой части культуры после её отстаивания для осагдения опилок на тот же объём свееей среды. Во время каждого цикла в ферментёр добавляли 40 т опилок, в связи с чем концентрация их в культуре не опускалась ниже 5,9 г/л. Всего за время ферментации было потреблено 73,2 г/л субстрата. Таким образом, по-видимому, удалось избежать лимита пс субстрату.

С noiioqbn огьёыно-долизного культивирования удалось поддерживать смешанную культуру в физиологически-активном состоя-пии более б суток, то есть значительно дольше, чем при периодическом культивировании при всех его модификациях.

Расчётная суммарная оптическая плотность культуры (с учётом клеток оттока) составляла 5 ед. OR^t теоретический суммарный урогай её 2,9 г/л.

Максимальная концентрация этанола составляла 141 тм, ацетате Iu& пГ., а расчётное общее накопление этанола составляло ЗВ8 nil, ацетата 294 ям. Отношение общего накопления этанола к ацетату было равно 1,3.

Зндоглшаназная активность исследуемой культуры изменялась циклйчзске и максимальное её значение составляло 150 мкЦ/иин-л.

Экономический коэффициент"был ниг;е, чем при периодическом культивировании,

Таблица 4.

Некоторые физиологические характеристики роста смешанных культур с.«1егпюс<Шша И С ЛНегтоЬуйгоаи1Х\1Г1сиш (I), С .ШегтосеПит 15 Т.ЪгоскИ (2) И Гамма-ОблучёШШХ С.№еггаосо11ит ^ и С.№егтоЬувгоаи1Гиг1си1П ^ (3) при проточной культивировании.

Культура ! Редаш ! Время '¡культивирования',11]?01®113' ¡Скорость ! ¡разведе- т !ния, И,ч ! х ! х, ! г/л 1 \ э ! г/л 1 ! У 1 (КМЦ-аза, ¡ыкИ/иин'Л ¡Средняя концентрация,мМ ■¡этанол ¡ацетат ¡лактат

I отьёмно-долигяой т 0,017 0,749 14,13 0,053 120 86,47 60,14 6,70

I проток 288 0,010 1,09 10,05 0,041 90 102,29 90,41 23,09

2 проток 0 разной скоростью 191 ■ 0,021 0,010 0,784 14,15 0,035 115 106,91 56,86 29,18

3 проток, мембранный биореактор 95 0,010 0,620 14,64 0,030 155 92,49 55,29 38,29

к - х, б, У - средние знача гая указанных параметров.

В целом же отъёмно-долизное культивирование обеспечивало и пролонгирование процессе ферментация и преобладавшую продукцию этанола, его хороший выход.и отношение к ацетату.

К недостаткам подобного культивирования следует отнести не однородность условий при периодической замене среды и добавлении субстрата.

С целью создания более постоянных условий для пролонгированного роста смешанных культур осуществлена ферментации в проточном решме с постоянной подачей свежей питательной среды, удалением жидкой части культуры без опилок и 'периодический добавлением целлюлозного субстрата. Исходная концентрация субстрата составляла 30 г/л. Добавление опилок производилось 12 раз по 30 г. Объём среды протока 12 л. Скорость протока составляла 0,042 л/ч для первой культуры, а для второй 0,083 л/ч в первые 95 час культивирования, затем - 0,042 л/ч.

3 экспериментах использовали дзз смешанные культуры: С.^егиосеИгив Р7 И С.1ЬегьоЬуй.госи}.гиг1сии 39В; С ."Шеппосе1-1ит Т7 и Т.Ъгоскзл НИ)4. Результата опытов представлены з табл.4.

Оказалось, что обе смешанные культуры вели-себя сходным образом и по величине накапливаемой биомассы и потреблению субстрата (105 г/л а 106 г/л, соответственно, или 88,5$ всего субстрата) имели сходные значения экономического коэффициента. Концентрация опилок в культурах не опускалась ниже 4 и 6 г/л и, по всей вероятности, лимит по субстрату был исключен. Культуры мало отличались по количеству накапливаемых продуктов. Максимальная концентрация этанола была равна 136ш у первой и 125 вы у второй. Но соотношение этанол/ацетат у С,1;Ьетосе11ит и т.ЪгоскИ было всё ке значительно выше. У этой культуры отмечен также более высокий выход газообраз-' ных продуктов и более высокая эндоглшаназная активность.

В процессе проточного культивирования происходило удаление не только продуктов обмена, но и части активной биомассы. С целью сохранения её часто используют мембранные биореакторы, в которых обеспечивается отделение культуральпой среды от клеток.

Проточное культивирование двух &-облученных культур С.ЪЪепаосеПит И С .^еэтк>Ьуйгоеи1ги*асит 392 ¡^ было проведено в ферментере М-210, работавшем в режиме мембранного

биореакгора. Культивирование вели на слозной питательной среде, обогацеяной бактотриптонои (1С г/л) я витаминами. Исходное содержание субстрата - 30 г/л. Длительность протока составляла S6 час. За враия протока было добавлено 120 г ьлектролизован-шх елозых опилок по 30 г каздые 24 час. Результаты представлены в табл.4.

За время протока было потреблено всего 58,5 г ошглок, что составляет 48,7$ от добавленного субстрата. Концентрация его не опускалась нота с,в г/л.

лонцентрация продуктов во время фильтрации колебалась: этанола от 75 им до IG2 ¡пи; ацетата от 46 мМ до 64 ulï а лакта-та от 35 и« до 42 ыМ.

Зндоглюкаяазная активность во время протока была в среднем равна 155 икН/мян-л.

Учитывая, что время протока в данном случае было в 2-3 раза ыеньаа, чем в предыдущих экспериментах, субстрат был потреблен наполовину, а исследуемая смешанная культура резистентна к этанолу и способна расти при его содержании в среде порядка 20-25 г/л, ингябирование конечным продуктом мало вероят-:го, то лрл гоотззтсгвуздем увеличений скорости а времени протека uosHo надеяться на значительно более высокие показатели выхода бяоыассы, потребление субстрата и накопление этанола. Обрадзет на себя внимание довольно высокая зндоглаканазная активность указанной культуры и з периодическом и проточном рекимах культивирования.

Таким обраэои, культивирование з проточном рези*е~ обеспечивает пролонгирование процесса ферментации целлкмозосодер-..:зцвго растительного сырья. При этом значительно повышается количество потребляемого субстрата, суммарное накопление биомасс:: :: выход продуктов, Соотноаение яаиашшваеакх этанола я ацетата превышает I. Пролонгированное культивирование обеспечивает выход.на технологически значимые уровни получения зтанола. Учитывая величину константы скорости роста смешанной культуры, скорость протока и связанную с ней интенсивность процесса деградации целлюлозы аожяо повысить до 3-4,5 г/л в сутки.

1. Электролитическая дед^гнификация опилок различных древесных пород позволяет использовать их в.качестве субстрата роста для термофильных анаэробных целлюлолитических бакте-

' рпй с.ШегтосеИша как в монокультуре, так к для совместного культивирования С С.^егтоЬуйгоаи.1:Сцг:1сиг! я 1.Ьгоск11.

2. Уронай культуры с.-ШетаосеИшз зависел:

а) от степени делкгшгфикации целлюлозного субстрата, увеличиваясь пропорционально возрастанию степени делигнафикации • до

О).от концентрации целлюлозы в среде роста, возрастая с увеличением её до 20 г/л при культивировании е покоз ::.до 30 х'/л при культивировании с перемешиванием.

3. Совместное периодическое культивирование целлюлолити-чссклх и сахаролитических бактерий позволяет повысить выход этанола, отношение зтавол/ацетат и достичь минимального технологического уровня накопления этанола - 0,5£,

4. С поыоцью газовой и вакуумной экстракции этанола .из среды роста иоаао устранять его иягабируюцее действие на культуру, а в конденсатах получать технологически значимые

_ концентрации спирта - 2,3 - в 4-5 раз превышавшие его

концентрацию в культуре.

5. Проточное культивирование смешнних кулмур обеспечивает возможность пролонгирования процесса биодеградации целлюлозного субстрата с уровнем накопления этанола, сопоставимым с периодическим культивирование« и достаточным для технологического использования. Сьёи зтаяола от 1,02 до 1,74 г

с I л ферментера в сутки.

6. Использование капроновых микропористых мембранных фильтров делает возможным создание мембранного биореактора, обеспечивающего отделение конечных продуктов обмена и ферментов при сохранении активной биомассы.'

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО ЕЕ ИССЗРТА1Щ2

I. Белокопытов Б.Акименко ЬЛ, Влияние способа предобработки растительного сырья на физиологи» роста термофильных анаэробных бактерий // Тезисы докл. 2 ¿сесоазн. совещания по технич. биоэнергетике, Саратов, ЪьЬ.

2. Белокопытов Б.Ф., Щербакова З.А., Дкимепко В.К. Рост О'актеря/. Clostridium themoceiiun на опилках, делигнифаци-розанных электрохимическим методом // Приял, биохимия и микробиология. - 1989. - 'Г.25, ¿ып.2. - С.204-210.

3. Белокопытов Б.4., Акиыенко В.К. Биоконверсия еловых опилок, предобработанных электролизом, термофильными анаэробными бактериями //' Использование целлюлозы и её производных

в медицинской и микробиологической промышленности. Тез. докл. Бсесовзн. совещания, Ташкент, I98S.

Белокопытов Б.0., Щербакова З.А., Акиыенко В.К. Биоконверсия опилок, делигяифнцнровашшх методом электролиза, ко-кулмурой бактерий Clostridiim th'ermocellum и Clostridium thercohydrosulfuricura // Прпкл. биохимия И микробиология. -1990. - 1.26, Вып.2. - С.195-201.

5. Головченко Н.П., Акямеако В.К., Чувильская H.A., Бело-копытов Б.Ф. Конверсия целлюлозы термофильными анаэробными бактериями // Тезисы докл. 2'Зсесоюзн. совещания по технической биоэнергетика, Саратов^ 1985.

6. Головченко Н.П., Чувильская H.A., Белокопытов Б.Ф., Акиыенко В.К. Пряная биоконверсия целлюлозы в этанол термофильными анаэробными бактериями Clostridium thermocellun // Тезисы докл. конференция: "Новые направления биотехнологии", Яущияо, 198%.

7. Чувильская H.A., Головченко Я.П., Белокопытов Б.Ф., Акименко Б.К. Выделение, идентификация и некоторые физиологические свойства Clostridium -¿hemocellum ]/ Прикл. биохимия

а микробиология. - ISS6. - 'Г.22, Вып.6. - С.800-805.

8. Чувильская H.A., Образцова А.й., Белокопытов Б.Ф., Лауринавячус Х.С., Акиманко S.S. Иммунологический анализ сер-ио5и:.;цел.талолитяческих микробных сообцеств // Тезисы Бее союза, конференции "Теоретические основы микробной конверсии", Рига, 1988.

9. Чузильская H.A., Образцова А.Я., Белокопытов Б.5., Лауринавячус К.С., Атааиыиева Я.Ю., Акиыенко З.К. Иммунологические исследования термофильных анаэробных бактерий // Микробиология. - 1989. - Т.58, Вап.З. - СЛ69-393.