Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование векторов для инсерционного мутагенез растения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструирование векторов для инсерционного мутагенез растения"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР'

ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИНИ ИМ. Я И. ВАВИЛОВА

САРТБАКВ иурат Максутович

ДШСТРУИРОВАНИВ ВЕКТОРОВ ДЛЯ КНСЕРЩГОННОГО МУТАГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ

СЗ- 00.15 - генетика АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени пандвдага биологических 1иук

На правах рукописи УДК 577. 213/214: 582. 683. 2

МОСКВА - 1991

/ .Л

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации генома Института общей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук В. А. Тарасов ' Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. А. Гостимский

доктор биологических наук, профессор А. А. Прозоров Ведущее учрелщение: '

Институт физиологии растений АН СССР

Защита диссертации состоится " " 1991г.

в час мин на заседании специализированного Ученого совета Д СЮ2. 49.01 при Институте общрй гене: 1ки им. Е И. Вавилова АН СССР по адресу: 117809 ГСП-1 Москва В-333, ул. Губкина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен АН СССР

Автореферат разослан " " . 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г. К Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Развитие генной инженерии открыло принципиально новые возможности в плане анализа и направленного изменения наследственной программы бактерий, животных и растений. Это общее принципиальное положение наиболее эффективно в настоящее время реализуется для микроорганизмов и растений. В последем случае, успехи в создании трансгенных форм растений связаны с разработкой эффективной системы генетической трансформации. Для класса Двудольных растений существует достаточно эффективная система генетической трансформации, основанная на использовании модифицированных специальным образом Т1- и 1?)-плазмид. Несмотря на то, что в принципиальном плане проблема генетической трансформации растений для класса Двудольных решена , использование систем такого рода для специальных задач, в частности, при проведении инсерционного мутагенеза и последующего клонирования : генов, требует дополнительных исследований, связанных с разработкой эффективной системы трансформации, применительно к конкретному виду растения, введением.в систему анализа новых маркерных генов, созданием специальных векторов, облегчающих процедуру последующего клонирования мутантных генов. Именно эти задачи решались в данной работе применительно к проблеме инсерционного мутагенеза клеток А. ЬИаНапа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования гена пуроми-цин-М-ацетилтрансферазы в ' качестве гена-маркера для селекции трансгенных растений, а также создание системы векторов для инсерционного мутагенеза клеток А. ^аПапа на основе Т-области Т1 -плазмид агробактерий. При этом решались следующие задачи: 1-определение чувствительности клеток N. 1аЬасиш к действию пу-ромишша; 2-конструирование векторов, содержащих в своей структуре гыракаемый в клетках растений ген пуромицин-Нтацетилтранс-

феразы ; 3-трансформация с помощью сконструированных векторов клеток N. tabacum и анализ уровня резистентности к пуромицину полученных трансгенных растений табака; 4-разработка системы эффективной регенерации и трансформации клеток A. thaliana; Ь-конструирование векторов для инсерционного мутагенеза клеток растений, облегчающих клонирование инсерций Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК в клетках Е.coli.

Научная новизна. На модельном объекте N. tabacum впервые показана возможность применения гена пуромицин-М-ацетилтрансферазы в качестве гена-маркера, а антибиотика пуроыицина в качестве селективного агента при трансформации растительных клеток. Разработан метод генетической трансформации клеток незрелых зародышей A. thai lana. В работе получены бинарные вектора для инсерционного мутагенеза клеток растений, способные облегчить процедуру клонирования инеерции Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК в клетках Е.coli.

Практическая ценность. Сконструированные бинарные вектора могут быть использованы для проведения инсерционного мутагенеза клеток растений и последующего клонирования мутантных генов , а ген пуромицин-N-ацетилтрансферазы в качестве гена-маркера для селекции трансгенных растений. Полученная коллекция трансгенных растений табака и арабидопсис может быть также использована для молекулярно-генетических исследований.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на YII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов'Ч Москва, 1990), I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии раетений"(Цущкно,1991), мэж-лабораторноы семинаре "Молекулярные и клеточные основь генетических процессов" ИОГенАН СССР (1991). ' - /

• Обт>ем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав» &ак-

лючения и выводов. Список литературы включает 190 наименований отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, содержат 41 (эисунок и 9 таблиц.

. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Растения N. tabacum раса SR -1 ( дикий, тип) и растения A.thaliana, полученные с кафедры генетики МГУ им. М. В. Ломоносова, расы Coluirbia, Dijon, Enkheim, Köln, Limburg, Blanes, Petergoph, Estland.

Штаммы бактерий и плазмидыы. Штаммы Е.coli: НВ101, JM33, S-17-1. Штаммы A. thumefaciens: С58С1, LA4404, А281. Плазмиды: PGV2260, pGV3850,pAU4Û4, pRK2013, pDH51, pV«3. 1. pBR325, pBI-101, pBI-121, pBI-131.

Среды й реактивы. Для культивирования растений использовали базовые среды MC (Murashlge S Skoog,1962) и B5 (Gamborg,1968). Для культивирования бактериальных клеток использовали среду 1В (ífeiiиатис и др. ,1984) и AB (Гловер,1988). В работе использованы отечественные и импортные реактизы.

Препаративное зыделение и очистку ДНК плазмид из Е. col i проводили по стандартным методикам (Машагкс и др. ,1984).

Трансформацию клеток Е. col i плазмидной ДНК проводили по методу Кушнера (Маниатис и др. ,1984).

Конъюгацию бактерий проводили по методике, описанной у Г .го-вера (Гловер.1988).

Препаративное выделение ДНК плазмид из A. tumefacieris проводили по методике, описанной у Гелвина (Gelvin,1988).

Рестрикцию я лигировалие ДНК проводили в условиях, рекомендуемых изготовителями фгрментов.

Электрофорез ДНК проводили в трис-боратном буфере в течение 4-16 часов в горизонтальной пластине агарозного геля.

Блоттинг-гибридизацию проводили по методике, описанной у Маниатиса (Маниатис и др. ,1984).

Стерилизацию растительного материала проводили в растворе 1:1 10% перекиси водорода и 96% этанола в течение 3 минут, а. затем 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой.

Трансформацию растений табака проводили методом "листовых ÄKCKOB"(Horsch,1985). ; '

Определение 6US-активности в растительных экстрактах проводили по методике, описанной у Джэфферсона (JefTerson.1987). .

Выделение тотальной растительной ДНК проводили по методике, описанной у ДрапераСDraper, 1988). ;

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА РАС И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЯ

1.1 Определение влияния пуромицина на индукцию каллуса, а также на рост и развитие проростков табака.

Для исследования чувствительности клеток табака к пуромици-ну определялось эффективность индукции каллуса из интактных двухнедельных проростков на среде, индуцирующей рост каллусных клеток, с добавлением антибиотика в концентрации 10, 100, 200 и 400 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля служили пророст-.ки, культивированные на аналогичной среде с добавлением 50 мкг/ мл канамииина, а в качестве положительного-проростки, культиви-•рованные на среде без антибиотиков. Для определения влияния пу-

ромицина на скорость роста и развития проростков табака стерильные семена высевались на питательную среду с добавлением антибиотика в концентрации 50, 100 и 200 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля служили семена, высеянные на питательную среду с добавлением 50 мкг/мл канамицина, а е качестве положительного - семена , высеянные на питательную среду без антибиотиков.

В результате этих экспериментов установлено, что пуромицин в концентрации 200 мкг/мл блокирует индукцию каллуса, а также рост и развитие проростков табака, и может в этой концентрации использоваться для селекции растений.

1.2 Подстановка структурной части гена РАС из плазмиды pVN 3.1 под контроль промотора и транскрипционного терминатора гена 35S РНК CaMV.

Хорошо известно, что в состав транскрипционной единицы входит не только структурная часть гена (или генов в случае бактерий),- но и регуляторкие элементы - промотор и терминатор транскрипции. Молекулярная организация регуляторных элементов имеет определенную специфику и различается у бактерий, животных и растений. Для достижения экспрессии гена РАС в клетках растений необходимо было структурную часть гена из плазмиды pVN 3.1 подстроить под контроль растительного промотора и транскрипционного терминатора. Удобно для этих целей использовать вектор pDH 51 ( Pietrzak, 1986 ), который содержит растительную экс-прессконнум единицу как подвижную кассету,состоящую из сильного конститутивного промотора и транскрипционного терминатора 35S РНК вируса мозаики цзетной капусты, разделенные полилинкером, содержащим несколько уникальных сайтов рестрикции.

Ген РАС в составе Hind III-BamH t фрагмента из плазмиды rVN 3.1 переносили в полилинкер плазмиды pDH 51 следующим спосо-

бом. Фрагмент ДНК, содержаний структурную часть гена РАС, выделяли электроэлюцией после обработки ДНК плавмиды pVN 3. i эндо- ; нуклеазами Hind III и BamHI и разделения фрагментов с помощью электрофореза в. агароаном геле. Полученную ДНК лигировали с , с ДНК плазмиды pDH 51, обработанной эндонуклеазами Sma I и BamHI. После этого выступающие 3'-концы, образовавшиеся после; обработки эндонуклеазой Hind III, достраивали до тупых концов Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 и проводили повторное лигирование. Компетентные клетки Е. col i трансформировали с по-" мощью ДНК из смеси лигирования и отбирали трансформанты на сре- >' де LA с ампициллином.. В результате электрофоретичсского анализа размеров плазмидиой ДНК иа клеток 120 клонов трансформантов .был выделен один клон, содержащий плаамиду с увеличенной молекулярной массой. Проведенный рестрикционный анализ плазмидиой ДНК ira полученного клона показал, что эта плазиида содержит фрагмент ДНК с РАС геном в составе полилинг^ра плазмиды pDH 51. Данная плаэмида названа pVI-2 ( plasmid of Vavilov Institut). Схема 'конструирования экспрессионного вектора pV 1-2 представлена ' на рис. 1. • . 1 . '.

Таким образом, наш сконструирован экепрессионный вектор pVI-2, который позволяет зкспрессироваться гену РАС в растительных клетках и может быть использован для прямой трансформации растительных протопластов. .

1. 3 Переклонирование гена РАС . иа экспрессионного вектора pYI-2 в бинарный вектор рВ1-131.

. В настоящее время система генетической трансформации протопластов для шогих видов растений недостаточно разработана и ' трудоемка. Вместе с тем, система генетичгекой трансформации с

_ ? -

Рис.1 Схема переклонирования гена РАС из плазмиды рУН 3.1 в экспрессяонный вектор рДН51 и бинарный вектор рВ1—131.

- в -

использованием Ti- и Ri-плазмид агробактерий обеспечивает высокую эффективность трансформации для многих видов .растений без привлечения протопластов. Известно также, что благодаря меньшему размеру и/иди более высокому числу копий бинарного вектора ' по сравнению с интегративным, эффективность трансформации би-иарным вектором выше. В связи с этим, очередным шагом в наших экспериментах был перенос гена РАС в бинарный вектор, способный переносить Т-обласгь с клонированными генами в геном клеток растений. Ген РАС в составе EcoR I-фрагмента ДНК из плазмиды pV1-2 переклонировали в уникальный EcoR I сайт Т-области бинарного вектора рВ1 -131 (Jefferson, 1987). Бинарный вектор рВ1-131 является производным плазмиды pRK252 с широким кругом хозяев, , содержит в составе плазмиды ген резистентности к канамицину, зк^прессирующийся в клетках бактерий, а также в составе Т-ДНК; ген неомицинфосфотрансферазы И и ген _р-глшуронидазы, экспрес-. сирующиеся в клетках растений. В результате конструирования нами получен бинарный вектор, названный pVI-7, содержащий в Т-об- ; ласти гены неомицинфосфотрансферазы II и /1-глккуронидазы, экспрессирующиеся в клетках растений, а также клонированный ген пуромицлн-N-ацетилтрансферазы, находящийся под контролем промотора и терминатора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Схема конструирования бинарного вектора pVI-7 представлена на Ч рис. 1.

1.4 Конструирование штаммов A. tumefaoiens, содержащих бинарный вектор pVI-7. /

При проведении трансформации растений с использованием би-.нарной векторной системы необходимо иметь штаммы A. tumefaclens, состоящие из векторной плазмиды, несущей Т-область, и плазмиды-■ ломоэдыка, представляющей собой производную fi-плазмиды у кото-!

рой отсутствует Т-область, но имеются гены vír-оперона, обеспечивавшие перенос Т-области в транс-подозрении. Векторная плазми-да, как уж упоминалось, является производной плазмиды рр!<252 с широким кругом хозяев. По понятным причинам Есе генно-инженерные манипуляции проводились в клетках Е. col i. В связи с этим , следующем этапом эксперимента был перенос сконструированного бинарного вектора pVI-7 и исходного рВ1-131, который использовался в качестве контрольного, в клетки агробактерий. В связи с. тем, что межвидовой перенос плазмид в процессе трансформации затруднен и в сконструированной плазмиде гены ответственные за конъюгативный перенос удалены, в наших экспериментах для конь-югативного переноса плазмид в клетки агробактерий использовали штамм для мобилизации плазмид S-17-1, который содержит в хромосоме nob м tra опероны, необходимые для мобилизации и переноса-плазмид, активные в транс-положении. После трансформации клеток штамма S-17-1 с помощью ДНК плазмид pVI-7 и рВI-131 клетки трансформантов скрещивались с клетками реципиентного штамма A. tainsfac i ens C58C1 ( pGV 2260) и отбирали конъюганты по приобретенной устойчивости к канамицину.

В результате конструирования получены штаты A. tumefaciens ,C58Cl(pGV 2260;pV1-7) и С58С1(pGV 2260 ; рВ1-131), способные трансформировать Т-ДНК бинарных векторов в клетки растений.

1.5 Трансформация клеток N. tabacum с использованием штаммов ' A. tumefaciens C58Cl(pGV 2260;pVI-7).

Для проверки функционал!ной полноценности клонированного в Т-области бинарного вектора pVI-7 гена РАС мы, трансформировал: этим вектором клетки листовых дисков табака. В качестве контроля проводили трансформацию бинарным вектором pBi-131. В р^зуль-

тате генетической трансформации нами получена коллекция фер-тильных трансгенных растений табака, содержащих в геноме от 1 до 3 копий Т-ДНК бинарных векторов (таблица 1).Эти результаты

Таблица I . Результаты расщепления трансформированных 1 растений N. ЬаЬасиш по признаку

резистентности к канамицину

Вариант Чувствительные Резистентные Всего Значение Кол-во к канамицину к канамицину растений вставок

Т-ДНК

131 4 344 348 0,38606 3

. 1 39 687 736 0,95537 3

. 3 97 330 427 1,18735 1

.4 9 382 391 1,38939 3

.13. , 71 212 283 1,17785 1

.17 13 511 524' 2,87362 3

.19 86. 291 377 0,96286. 1 ,

.20. 21 326 347 2,32468 ■• 2

.24 92 285 367 0,01098 1

.25 25 298 323 0,15869 2

.28 68 234 302 0,93652 ' 1

. 41 3 364 372 0,83632 3

подтверждены с помощью метода блоттинг-гибридизации ДНК.

Для определения чувствительности трансгенных растений к пу-ромицину семена растений, трансформированных штаммом A. tumefaclens C6SCl(pGV 2260; pVI-7), высевались на питательную

реду, содержащую 100,150.200 и 250 мкг/мл пуромицина, и куль-ивировались в течение 3 недель. На рис. 2 видно, что растения, одержащие в геноме ген РАС в составе Т-области, которые полу-¡еиы в результате трансформации сконструированным нами вектором iVI-7, обладают более высокой резистентностью к пуромицину по ¡равнению с контрольными растениями.

Таким образом, в результате исследования нами показана воз-южность применения гена РАС в качестве генетического маркера ¡ри трансформации клеток растений, а также установлено, что пу-юмицин в концентрации 150-200 мкг/мл может быть использован сак селективный агент для отбора трансгенных растений.

2. ИНСЕРЦИОННЬШ МУТАГЕНЕЗ КЛЕТОК А. THAL I AN А

2.1 Трансформация клеток незрелых зародышей A. tha¡L i aria с «пользованием штамма A. turne fact ens C58Cl(pGV 22Ö0; pVI-7).

Инсерционные мутации no сравнению с другими типами мутаций, мдуцированными химическими мутагенами или радиацией, имеют ряд зреимуществ -. Одна из этих преимуществ связана с относительной 1ростотой клонирования мутантных генов, имеющих в своей структуре инсерцию, в частности Т-область Tí-плазмиды, в том случае, тогда речь идет о клетках растений. Эффективность получения мутаций при проведении инсерционного мутагенеза связана не только : эффективностью процесса трансформации клеток растений, но и с особенностями организации генома конкретного вида растения. И в этом плане чрезвычайно удобным объектом является A. thai i ana, поскольку обладает , одним из- наименьших геномов -зреди высших растений с малым количеством повторяющихся последовательноетей, что определяет достаточно вы сокую вероятность встраивания ин-серции в функционально значимые и фенотипически выражаема

Рис.2 Проростки, культивированные на среде с пуромицином 100,150 и 200 мкг/"л. 2,4,6-кснтрольные растения (не трансформированные), 1,3,5-траясгенше растения.

Рис.3 Схема регенерации растений A.^haliana

тетки генома арабидопсис. Трудности использования A. thai i ала колекулярно-генетических исследованиях связаны с недостаточна разработанностью , применительно'к этому виду, быстрого и Активного метода регенерации фертильных растений из клеток эансформированких тканей. В связи с этим, нами разработан ме-эд генетической трансформации клеток незрелых зародышей thai iana. Этот метод по эффективности трансформации (по.выхо-/ растений трансформантов) не уступает, описанным в дитерату-э, системам генетической трансформации клеток A. thai lana и. эставляет 202 , где в качестве эксплантата использовались лис-эвые диски и корни. Однако, разработанная нами система генети-гской трансформации превосходит другие по продолжительности ремени регенераций фертильных растений из трансформированных леток. Схема регенерации растений A. thai i ana представлена на

ИС.З.

В результате агробактериальной трансформации клеток незре-ых зародышей A.thaliana штаммом C58Cl(pGV 2260;pVI-7) получены стойчивые к канамицину растения, трансгенная природа которых ыла подтверждена определением активности в-глюкуронидазы и ме-одом блоттинг-гибридизации ДНК

2.2 Конструирование векторов для клонирования интегрирован-ой Т-ДНК и прилегающей к ней области растительной ДНК в клет-ах Е. col i.

Как уже отмечалось, экспериментально полученные инсерцион-[ые мутанты содержат в мутировавшем гене определенную последо-ательность (инсерцию). Это обстоятельство позволяет выделить is банка клонированной ДНК растений эту инсерцию с прилегающая госледовательностью мутантного растительного гена Однако эта 1роцедура достаточно трудоемка и технически сложна, особенно

если речь идет о видах, клетки которых имеют значительный по размерам геном. Для облегчения процедуры клонирования мутантных генов при проведении инсерционного мутагенеза в последние несколько лет начали конструировать специальные вектора. В частности, нами сконструированы вектора на базе хорошо известных бинарных векторов рВ1-101 и рВ1-121, которые в Т-области содержат 1 или 2 зкспрессирующихся в клетках растений маркерных ге-. на. Это обстоятельство позволяет проводить отбор клеток транс-• формантов и, соответствующих трансгенных растений в геном которых встроена Т-область. Мы осуществили включение в Т-об-ласть этих плазмид фрагментов ДНК, несущих маркерные гены, выражающиеся в клетках Е.coli. В дальнейшем это позволит клонировать интегрированную в геном растений Т-ДНК в космидах путем прямой селекции клеток бактерий на соответствующих антибиотиках. В качестве маркерных генов, зкспрессирующихся в клетках Е. coli, использовали гены резистентности к хлорамфениколу и тетрациклину иа плавииды pBR 325, которые были клонированы в полилинкер Т-области бинарных векторов рВ1-101 и pßl-121.

В результате нами сконструированы бинарные вектора; pLD-2 , содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансферазы II, хло-рамфениколацетилтрансферазы и без промотора ген ^-глюкуронида-зы; pLD-З, содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансфераз! И, хлорамфениколацетилтрансферазы и £-глюкуронидазы; pLD4, содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансферазы II, глюку-ронидазы, а также ген резистентности к тетрациклину. Гены неомицинфосфотрансферазы II и ^-глюкуронидазы находятся по; lioHTpoJieM растительных транскрипционных сигналов и экспрессиру юг ся в клетках растений. Ввиду сходства процедур клокировани генов резистентности к антибиотикам в Т-ДНК бинарных векторе приводим, в качестве примера, схему конструирования бинарног

- i5-

Рис.4 Схема конструирования бинарного вектора ptO 4.

вектора pLD~4 (рио. 4).

2. 3 Конструирование штаммов A. tumefacieris, содержащих 6í парные вектора pLD-2, pLD-3 И pLD-4.

Для переноса сконструированных бинарных векторов в клет) A. tumefaciens проводили трипариентальное конъюгативное скревд вание. В качестве донора служили клетки штамма Е. col i JMB3, а держащие векторную плазмиду, а в качестве реципиента - клет! штамма A. tumefaciens LA4404. В качестве штамма-помощника и< пользовали штамм Е. coli НВ101, содержащий плазмиду pRK2013 tra-onepoHOM, обеспечивающим транспортные и мобилизационн; функции в транс-положении. Неонкогенный штаьм A. turrefacie LA4404 содержит ген резистентности к .рифампицину в хромосоме плазмиду pAL4404, у которой Т-область делегирована и она име лишь vtr-гены, активные в транс-положении.

В результате нами сконструированы штаммы A. tiunefacie LA4404 ( pAL4404 ; pLD-2), LA4404 (pAL4404 ; pLD-3 ) И LA44 (pAL4404; pLD-4), которые в дальнейшем предполагается исподьз вать для трансформации клеток A. thai iana с целью получения ко лекции инсерционных мутантов и последующего клонирования инте рированной Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК клетках Е. coli.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .

В представленной диссертационной работе решен ряд задг связанных с проведением иасерциснного мутагенеза растений. С: чайность процесса мутирования, в том числе возникновение инс( ционных мутаций, требует большого выхода инсертантов и, coi сетственно, наличия эффективной системы генетичес!

реформации растений. Кроме того, существенным параметром явится доля среди полученных инсертантов фенотипически выражен-¡ix мутанантов. Уникальным объектом • в этом плане является thaliana, геном которого является одним из наименьших среди jcmx растений, а доля повторяющихся последовательностей отно-ателыга мала. Однако особенности строения этого вида растения, апример относительно небольшие размеры листьев, делах» затруд-ителькым использование достаточно эффективно метода трансфор-адии растений с помощью "листовых дисков", как это имеет место случае табака. Это ставит проблему разработки для клеток .thaliana других методов трансформации, обеспечивающих массо-нй выход инсертантов. В плане трансформации нами рпробированы летки семян и незрелых зародышей. В последнем случав, детально азработана схема генетической трансформации, превосходящая су-ествуюцие системы по.времени, затрачивающем на ее проведение, ри массовом проведении трансформации весьма существенной явля-тся система первичного отбора. В случае использования би-арных векторов рВ1-121 и рВ1-131 для трансформации растений Т-бласть содержит 2 выражаем в клетках, растений гена: неоми-инфосфотрансферазы 11 и .р-глюкуронидазы . Первый из этих генов беспечивает первичную селекцию на среде с канамициноы, второй вляется индикаторным геном, позволяющем уточнять результаты ервичного отбора при индивидуальном анализе отобранных на пером этапе растений. Однако первичный отбор растений на среде с мтибиотиком не является жестким и большая часть отобранных (астений в дальнейшем не показывает глюкуронидазной активности, ice это усложняет работу. В связи с этим возникла проблема внешний дополнительного селективного маркера в Т-область бинарно-•о вектора рВ1-131. В работе нами показана, во-первых, возмож-locib использования пуромицина в качестве селективного агента.

во-вторых, сконструирован бинарный вектор pVl-7, несущий i Т-области кроме генов неомицинфосфотрэнсферааы И и р-глюкуро-нидазы ген пуромицин-М-ацетилтрансферазы. Установлено, что наличие в геноме табака Т-области, содержащей эти гены, обуславливает резистентность трансгенных растений не только t канамицину, но и к пуромицину.

Мы уже упоминали, что надичие инсерции позволяет в принципиальном плане проводить клонирование мутантных генов. Однакс эта процедура сопряжена с созданием клонотеки ДНК мутвнтньЕ растений, ее скринингом, то есть процедур достаточно дорогостоящих и трудоемких. Для облегчения процедуры клонирования мутантных генов нами создана серия плазмид, у которых в Т-област1 наряду с генами,' экспрессирувдимися в клетках растений, содержатся маркерный ген, зкспрессирупцийся в кчетках Е.coll. В результате использования этой серии плазмид в процессе трансфер маши растений оказывается возможным клонирование вставки Т-ДН путем простой селекции на среде с соответствующими антибиотика ми.

ВЫВОДЫ

1. Показан ингибирующий эффект пуромицина на индукцию ка луса и развитие проростков табака, что указывает на возможное использования этого антибиотика в качестве селективного аген при трансформации клеток растений.

2. На базе плазмиды рВ1-131 сконструирована плазмида pVI несущая в Т-области наряду с генами неомицинфосфотрансферагы и f-глккуронидазы ген пуромшин-К-ацетилтрансферазы, подстрое ный под контроль промотора и терминатора гена 35S РНК вируса м заики цветной капусты.

. 3. Установлено, что наличие Т-области из сконструированной яазмиды pVI7 в геноме трансгенных растений табака обеспечивает х резистетность к пуромйцину, в концентрациях, летальных для энтрольных растений.

4. С использованием бинарной векторной системы разработан ффективный метод генетической трансформации клеток незрелых за-эдышей A-thalíana.

5. Сконструированы бинарные вектора на базе плазмид серии BI, несущие в Т-области гены резистентности к хлорамфениколу и етрациклину, удобные для проведения инсерционного мутагенеза леток растений и способные облегчить процедуру последующего локирования мутантных генов.

6. Получена коллекция трансгенных растений табака, имеющих геноме от 1 до 3 копий Т-ДНК, входящей в структуру сконструи-

ованного бинарного вектора pVI7.

' СЛИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С APT БАЕВ М.М.; МУХАМЕДШИН Э. К., ТАРАСОВ В. A. 1&Т0Д реге-1ерации растений из клеток незрелых зародышей Arabídopsis hallaría. Тезисы YII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные меха-1измы генетических процессов" (Москва, 1990).

2. МУХАМЕДШИН Э. К. , САРТБАЕВ Ы. М,, ТАРАСОВ В. А. Использова-ше гена РАС в качестве маркера при трансформации растений. Те-1Исы YII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные "механизмы •енетических процессов" (Мэсква, Í990).

3.САРТБАЕВ М.Ы., ТАРАСОВ'RA. Регенерация фертильпых pac-re ний из трансформированных клеток^ незрелых зародышей irabidopsis thai lana (L.). -Генетика, 1992 (в печати). •

to -

4. ОАРТБАЕВ M. M., ТАРАСОВ В. A. Экспрессия гена РАС в клет-кга табака. Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Новые методы би отехнологии растений" (Пущино,1991).

Б. ЛУКИН A. JL , С APT БАЕВ Ы. М. , ДЕНИСЕНКО Е R , ТАРАСОВ Е А Конструирование векторов для прямой селекции рекомбинантны космид, содержащих инсерцию Т-области и ее растительного окру жения в клетках Е.coll. Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Новы методы биотехнологии растений" (Пущкно.1991).

6. ЛУКИН А. Л , С APT БАЕВ Ы. М., ДЕНИСЕНКО KL В. . ТАРАСОВ В. А Инсерционяый мутагенез A. thai lana Тезисы I Всесоюзного симпо зиума "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991).

7. ЛУКИН A. JL , САРТВАЕВ М. М., ДЕНИСЕНКО КХ R . ТАРАСОВ Е А Получение новых векторов для трансформации растений.-Генетика, 1992 (в печати). .