Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инсерционный мутагенез в клетках Arahidopsis thaliana (L.) Heynh.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Инсерционный мутагенез в клетках Arahidopsis thaliana (L.) Heynh."

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи

УДК:575.11.582.232.7:581.132:577.113:579.254

ГАПЕЕВА Тамара Александровна

ИНСЕРЦИОНПЫЙ МУТАГЕНЕЗ В КЛЕТКАХ АгаЫйорш ИшИапа (Г.) НеупЬ

03. 00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1996

Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и в лаборатории биофизики и фотобиолопш реценторных процессов Института фотобиологии АН Беларуси.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

В.А. Тарасов; О.А. Огаркова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

В.А. Пухальский; И.В. Гулина.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: кафедра генетики и селекции биологического факультета Московского государственного университета им. М.В .Ломоносова.

Защита состоится "_"_1996 г. в_часов на

заседании специализированного Учёного совета Д 002.49.01. при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Учёный секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы при проведении

генетического и молскулярно-генетического анализа всё большее значение преобретает метод шгсерционного мутагенеза. Это и понятно, поскольку в данном случае мутантный ген оказывается маркированным инсерцией, которая представляет собой хорошо охарактеризованную последовательность ДНК и, кроме того, может нести маркерные гены, экспрессттрутощиеся как в клетках, растений, так и в клетка\E.coli. Это существенно облегчает проведение генетического и молекулярно-генетического анализа, в частности, процесс клонирования мутантных генов. В результате, в настоящее время в качестве реальной, по крайней мере, в случае растений стоит задача получения представительной коллекции ипсершюнных мутантов и, соответственно, исследования структуры и функций всех генов, составляющих геном растительной клетки. В силу особенностей организации генома, ею малых размеров и небольшой доли повторяющихся последовательностей ДНК особое место в этих исследованиях занимает ЛгаЬШоряич ¡ЬаНапа. В случае этого объекта коллекция мутантов, в которой с 95% вероятностью будут представлены мутации в каждом гене, по оценкам составляет величину порядка 50000 100000 независимо полученных трансформированных растений. К созданию такого рода коллекций приступили в ряде лабораторий мира. Понятно, что успех в решении проблемы исследования организации генома высших растений на примере ЛгаЬкЬрь/.%■ с помощью инсерционного мутагенеза в значительной степени связан с решением таких проблем, как конструирование удобных для проведения ансерционного мутагенеза и последующего клонирования мутантных

генов векторов, повышение эффективности процесса трансформации и, соответственно, выхода мугантных трансгенных растений и, наконец, создание системы селекции, позволяющей отбирать не только рецессивные, но и доминантные мутации, в частности, мутации в генах, участвующих в контроле морфогенеза растений. Решению этих задач посвящена данная работа и этим определяется её актуальность.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в разработке метода проведения инсерционного мутагенеза в клетках АгаЫ-¿орьчя и получении трансгенных растений с использованием специально сконструированных векторов для агробакгериальной трансформации, которые облегчают процедуру последующего клонирования мутантных генов.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Конструирование векторов для агробактериальной трансформации, облегчающих процедуру последующего клонирования мутантных генов.

2. Разработка метода селекции с целью отбора не только рецессивных, но и доминантных инсерционных мутаций, связанных с развитием растений и формированием генеративных органов.

3. Получение устойчивых к канамицину морфологически изменённых вариантов растений и исследование их возможной трансгенной природы.

4.Увеличение эффективности инсерционного мутагенеза на этапе трансформации клеток прорастающих семян

Научная новизна. В работе на базе вектора рВ1121, являющегося элементом бинарной векторной системы для генетической трансформации двудольных растений, получена серия модифицированных векторов. Эти векторы существенно облегчают процедуру клонирования мутантных генов за счёт включения в Т-область исходного вектора фрагментов ДНК,

имеющих в своём составе маркерные гены, экспрессирующиеся в клетках E.coli и обеспечивающие последним устойчивость к одному из трёх антибиотиков - ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину. Впервые разработан метод, позволяющий проводить отбор и последующее клонирование генов, мутации в которых влияют на морфогенез и приводят к гибели либо стерильности трансформированных растений.

Практическая значимость. Сконструированные векторы могут применяться для агробакгериалыюй трансформации не только Arabidopsis, но и других двудольных растений. Модифицированный метод генетической трансформации прорастающих семян Arabidopsis, дающий увеличение выхода трансформированных растений по сравнению с оригинальной методикой, может быть использован в дальнейших экспериментах по проведению инсерционного мутагенеза с целью получения полноразмерной коллекции иисерционных мутаций в геноме Arabidopsis.

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы был» представлены на Международном симпозиуме " Plant Biotechnology and Genetic Engineering"' (Киев, 1994), Первом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (БОФБ) (Минск, 1994). научном межлабораторном семинаре ИОГен РАН "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" (Москва, 1996).

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 3-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, а также выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 26 рисунков,

содержит 1 приложение. С anco к использованных источников включае 341 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена Arabidopsis thaliana (L.) Heynh экологических рас Köln и Со lumbia были получены из коллекции Института общей генетики им Н.И.Вавилова РАН.

Штаммы и плазмиды. В работе использовали штаммы: E.coli НВ101 (F r b, m b, recA, ara,proA, lacY, galK, str, xyi, mil, supE), JM83 (K-12 несущий интегрированный в геном 0 80, lacZ Ml 5), C600 (F ", sup E44 thi-1, leu B6, lac Yl, ton A21, X '), S17-1 (E.coli 294 с делецией recA содержащий tra- и mob- гены RP4, интегрированные в хромосому. Thi, pro hsdR -, hscM + , recA, Tp R, Sm R); A.tumcfaciens LBA4404 ( A136 содержащий плазмиду pAL 4404) и плазмиды: pAL4404 (производная октопиновой плазмиды pTiAch5, имеющая делению в Т-области): pRK2013 ( СоП-производная RK2, несущая ira-гены, KmR) ; pBR325 ( 6.0 тан, Ар R, Cm R, Тс R); pACYC184 (4.0 тпн, Cm \ Te R); p74.4 (рекомбинангаая плазмида на основе pACYC 184, несущая фрагмент ДНК Synechoçystis РСС6803 размером 5.7 тпн, Cm R) [Шестаков и др., 1988]; р74.4Т (производная р74.4, содержащая транспозон Tnl) [Гапеева и др., 1995]; рВ1121 (производная pBIN19, Km R, содержащая в Т-области ген GUS (ß-D-глюкуронидазы с промотором ВМЦК 35S).

Среды. Для культивирования клеток E.coli использовали среду LB [Маниатис, 1984], для культивирования агробактерий среды ТУ [Мазин и

др., 1990]; AB, YEB [Гловер, 1988]. Растения in vitro выращивали на среде BMA [Feldmann and Marks,1987].

Выделение ДНК. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli и A.lumcfacicns проводили методом тепловой денатурации в сочетании с применением цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) [Маниатис, 1984; Гловер, 1988], а также методом щелочной денатурации [Birnboim & Doli, 1979; Харли, 1990]. Суммарную ЛПК ю клеток A.iumefaciens выделяли с использованием проназы (протеиназы К) [Дрейпер, 1991]. Суммарную растительную ДНК для блот-гибридизациошгого анализа по Саузерпу выделяли с применением ЦТАБ или протеиназы К [Дрейпер,)991], при препаративном выделении ДНК очищали в градиенте хлористого цезия [Гловер, 1988].

Рестрикцию энлонуклеазами, лигирование. достраивание липких 3'-

концов двухцелочечкой ДНК до тупых, рядиоактишгое меченпе фрагментов ДНК проводили в условиях, рекомендуемых изготовителями ферментов. Фрагменты ДНК из агарозного геля выделяли методом "замораживания-оттаивания"

Трансформацию клеток E.coli проводили по метод)' Симантиса, изложенному в руководстве Гловера [Гловер, 1988].

Копътогаютонньта перенос плазмидной ДНК из клеток E.coli в клетки агробактерий проводили по методике, описанной в руководстве Гловера [Гловер,1988] и в работе Симона с соавт. [Simon et al.,1983].

Трансформацию клеток Arabidopsis проводили путём заражения прорастающих семян агробактериями на основе метода, предложенного Фельдманом и Марксом [Feldmann & Marks,1987].

Блот-гибридизацию проводили на нитроцеллюлозпых фильтрах по методу Саузерна [Southern, 1975].

Активность р -D-глюкуронцдазы определяли в гомогенатах тканей листьев Arabidopsis флуориметрически на основе метода, описанного Джефферсоном с соавт. [Jefferson et al., 1987].

Каллусы получали, как описано в работе Сартбаева с соавт. [Сартбаев и др., 1992].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование векторов

Для проведения инсерционного мутагенеза были сконструированы векторы (pGOl, pLD3, pLD4) на основе бинарного вектора для агробакгериальной трансформации рВИ21 [Jefferson et al.,1987], Т-область которого содержит гены nptll и uidA, кодирующие соответственно неомицинфосфотрансферазу (NPTII) и p-D-глюкуронидазу (GUS) и экспрессирующиеся в клетках растений. Векторы были получены путём встраивания в Т-область вектора рВ1121 фрагментов ДНК, несущих гены устойчивости к антибиотикам, экспрессирующиеся в E.coli. Общая схема конструирования векторов представлена на рис. 1. При получении вектора pGOl донором гена, определяющего устойчивость к ампициллину, служила плазмида р74.4Т, а именно, HindUI-Hindlll фрагмент размером 6.5 тпн, несущий ген Р-лакгамазы в составе транспозона Till. При конструировании векторов pLD3 и pLD4 использовали гены, определяющие устойчивость к хлорамфениколу и тетрациклину, содержащиеся соответственно в Pstl-Hindin (2.4 тпн) и PvulI-PvuII (3.4 тпн) рестрикционных фрагментах из плазмиды pBR325. Фрагменты ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам, выделялись из агарозного

НШШ

Йта!

ВатШ^/ Р 74.47 НЫН1 —( 14.6 тпн

рмцкззз

сиэ ВотН). Эта!

Есога

ю. 1. Схема конструирования бинарных векторов рвСП, рШЗ, р1_04.| -границы транспозона Тп1; ^-повторы длиной 25 пн на границах Т-области; ИВ-праеая, Ш-левая границы; полилинкеру.

геля методом "замораживания-оттаивания" и встраивались в полилинкер Т-областа вектора рВИ21 между генами, кодирующими NPTII и GUS. Клонирование Hindlil-Hindlll и PvuII-PvuII фрагментов осуществляли по сайту рестрикции Hindin. При встраивании PvuII-PvuII фрагмента липкие концы ДНК вектора достраивались до тупых при помощи фрагмента Клёнова ДНК полимеразы I. Встраивание Pstl-HindHI фрагмента проводили по соответствующим сайтам полилинкера. В этом случзе по сайту Pstl проводили неполную рестрикцию ДНК вектора рВИ21, так как этот сайт не является уникальным для полилинкера. После проведения реакции дотирования с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и трансформации клеток штамма JM83 (E.coli) отбирали клоны на среде, содержащей специфичные для каждого из конструируемых векторов антибиотики. Из этих клонов выделяли плазмидную ДНК и проводили её рестрикционный анализ. Общие характеристики полученных, векторов приведены в табл. 1,

Таблица 1.

Векторы для инсерционного мутагенеза

Вектор Ген устойчивости к антибиотику в Т- области, экспрессирующийся в клетках E.coli Бинарный вектор, на базе которого создан данный вектор Размер, тпн Гены, экспрес-сирующиеся в клетках растений

pGOl Ыа (ген р- D - лакта-мазы) рВИ21 19.6 nptU, uidA

pLD3 cat (ген хлорамфе- шнсолацетшпранс- феразы) рВИ21 15.4 nptll, uidA

pLD4 tet (ген устойчивости к тетрациклину) рВ1121 16.4 nptll, uidA

2. Конструирование агробакгериальных штаммов

Сконструированные векторы путём конъюгации переносили в клетки

агробактсриального штамма LBA4404, несущие плазмиду pAL4404 с системой у/>-генов, для получения бинарной зекторой системы для агробактери&тьной трансформации. Так как векторы, сконструированные на основе плазмиды рВП21, не способны к самотрансмиссии, то конъюгатйвный перенос этих векторов осуществляли при транс-действии продуктов экспрессии генов ira- и mob-, локализованных в плазмиде рИК2013 или в хромосоме пггоммл S 17-!, соответстветпго в тптг- п диродительских скрещиваниях. В клетки штамма S17-1 плазмиды вводили путём транформации. Трансконъюганты отбирали на агаризованных средах AB, на которой не способны расти клетки E.coli, или TY, содержащих специфичные для конкретной бинарной векторной системы антибиотики. В результате 2-3 пересевов отобранных колоний на среды с антибиотиками были отобраны клоны, содержащие бинарную векторную систему. Наличие бинарных векторов в клетках LBA4404 было подтверждено выделением и рестрнкционным анализом ДНК, выделенной из клеток агробактерий.

3. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana

3.1. Определение оптимальной концентрации и времени воздействия канамицина при отборе трансформированных проростков Arabidopsis экологической расы Köln

Отбор растений, геном которых содержит инсерции Т-ДНК, при использовании метода трансформации семян проводится в следующем после трансформации семян (втором или Т2) поколении на среде, содержащей канамицин. Известно, что устойчивость к канамицину зависит

от экотипа (расы) растения. В связи с этим в специальных опытах нами были подобраны условия отбора на среде с канамицином применительно к растениям экологической расы Köln (табл. 2). В дальнейшей работе использовали концентрацию канамицина равную 50 мкг на мл и время роста на среде с антибиотиком -14 и 21 сутки.

Таблица 2.

Влияние концентрации канамицина на скорость обесцвечивания проростков Arabidopsis

Время воздействия антибиотика, сутки Концентрация канамицина, мкг на мл

0 20 | 30 40 50 60 70 80 90 100

Д оля полностью обесцвеченных проростков, %

7- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 64 89 94 95 98 100 100 100 100

21 0 68 92 98 100 100 100 100 100 100

Примечание:

Представлены средние значения для трёх параллельных опытов, в каждом из которых высевали примерно по 300 семян (5ЕМ<5%).

3.2. Схемы селекции

В работе использовали два варианта селекции. В первом случае (вариант 1) отбирались морфологически нормальные растения, характеризующиеся зелёной окраской, у которых начинала формироваться первая пара настоящих листьев во время их экспозиции на среде с канамицином. Эта схема фактически совпадает с описанной ранее Фельдманом и Марксом [Feldmann & Marks, 1987]. Однако, при таком варианте селекции растения, у которых замедлен или изменён морфогенез, могли оказаться исключёнными из числа потенциальных трансформированных растений. Вследствие этого, мы использовали и другую схему отбора (вариант 2), когда отбирались растения, не начавшие

формировать к 14 суткам культивирования на среде с канамицином первую пару настоящих листьев, но не потерявшие либо лишь частично потерявшие зелёную окраску (растения с замедлением развития).

3.3. Анализ растений, отобранных по признаку налнч> 1я зеле!Iой

окраски и первой пары настоящих листьев (вариант Г) Доля устойчивых к канамицину проростков поколения 12 при отборе по варианту 1 составляла примерно 0.4%, что совпадает с данными Фсль/1М»нл и Мч».«-ея 1 нт>г>рпг"тт.тс вг-рпаити нп ^¡ЖПУ >лез

канамицииа. На рис. 2 приведен пример отобранного устойчивого к канамицину растения после 30 суток выращивания на среде без канамицина.

Рис.2. Пример устойчивого к канамицину растения поколения Т2.

о)«бранного по варианту 1' внешний вид растения после 21 суток роста на среде с канамицином и 30 суток - на среде без антибиотика Бледные проростки соотвекпвуют контрольным (^трансформированным) растениям

«

В большинстве случаев растения, отобраиные таким образом являются фенотшшчески нормальными, однако, нами был обнаружь один карлик, который оказался стерильным. При измерении GUS ■ активности оказалось, что у большинства исследованных растений ei уровень статистически значимо превосходит уровень GUS-акшвности i контроле (рис. 3). Дополнительно был проведён блот-гибридизационньп анализ по Саузерну и выяснено, что в геноме растений содержать вставки ДНК, гомологичные используемому 32Р-меченому зонду полученному на основе фрагмента Т-области бинарного вектора. Такиш образом, отбираемые растения, по крайней мере, преимущественнс являются трансгенными.

3.3.1. Анализ расщепления в поколении ТЗ

Анализ полностью не потерявших окраску и способность к морфогенезу растений, отобранных в поколении Т2 на среде с канамицином, в следующем (ТЗ) поколении показал, что в большинстве случаев наблюдается расщепление по признаку устойчивости к канамицину. Эти данные совпадают с результатами, полученными ранее [Feldmann & Marks, 1987]. Таким образом, подавляющая часть растений, отбираемых описанным выше способом ( вариант отбора 1 ), в поколении Т2 представляет собой гетерозиготы по инсерции, несущие в своём составе ген nptll, который обусловливает устойчивость растений к канамицину. Низкий уровень гомозигот отличает инсерционный мутагенез от, например, радиационного , для которого показано, что использование такого метода отбора мутаций приводит, в основном, к выявлению гомозиготных рецессивных мутаций [Li & Redei,l969]. В случае инсерционных мутаций, по-видимому, акт собственно трансформа-

Рис. 3. Определение активности гена GUS в листьях устойчивых к канамииину растений Arahidopsis. Представлены 7 вариантов трансформированных растений поколения ТЗ (1-7), отобранных в поколении Т2 по варианту 1 и группа контрольных (нетрансформированных) растений (К). Пунктирная линия соответствует верхней границе доверительного интервала с 95% уровнем значимости

mm происходит не в первичных генеративных клетках зародыша, а на более поздних , стадиях развития растений, когда первичные генеративные клетки уже успели поделиться несколько раз. Во всяком случае, при трансформации зрелых растений с помощью вакуумной инфильтрации показано, что преимущестгенно поражаются клетки уже сформированных генеративных органов растения [Bechtold et al., 1993). В результате, отбирая морфологически нормальные растения в поколении Т2, мы, в основном, сталкиваемся с мутациями, которые имеют

рецессивный характер. И, действительно, был получен, по крайней мере, один вариант растения (N16) фенотипически нормального в поколении Т2, но показавшего расщепление по морфологически регистрируемым признакам в поколении ТЗ (табл. 3).

Таблица 3.

Анализ растепления в потомстве (поколение ТЗ) растения N 16 по

морфологически регистрируемым признакам

Регистрация через 2 недели

Всего семян Количество проросших семян Зелёные проростки,%** Полностью обесцвеченные проростки, %

457 261 82 18

Регистрация через 6 недель***

Растения с нормальной морфологией розеток, % Растения с изменённой морфологией розеток, %

3 35

Регистрация через 10 недель

Растения нормальной морфологии, % Морфологически изменённые растения, %

3

Примечания:

* Анализ проводили при высеве семян на среду без канамицмна.

**Все значения рассчитаны как отношение количества растений данного типа к общему количеству проростков (в%).

***Растения нормальной морфологии имели розетки с 6-8 парами листьев, растения изменённой морфологии-розетки с 2-4 парами листьев как зелёных, так и полностью обесцвеченных

****Морфологически измененные растения полностью или частично потеряли зелёную окраску.

Из данных, представленных в таблице, видно, что расщепление касается нескольких морфологически регистрируемых признаков, а именно, жизнеспособности (летальности), окраски, морфологии розеток. Доля нормальных растений независимо от того, регистрируются ли они на

стадии розетки, либо на стадии зрелого растения, по отношению к числу проросших семян составляет величину около 3%. Эта величина заведомо меньше ожидаемой в случае наличия одной инсершш и, соответственно, одной мутации, находящейся с гетерозиготном состоянии и обусловливающей расщепление в следующем (ТЗ) поколении. На наш взгляд, наиболее вероятно, что наблюдаемый фенотип обусловлен несколькими мутациями, возникшими в результате индукции в процессе трансформации нескольких инсерций. Известно, что индукция множественных инсерций в ходе трансформации происходит с досгаючно высокой частотой.

3.4. Анализ растений с замедлением развития (вариант отбора 2)

При отборе растений, не сформировавших к 14 суткам роста на среде с канамицином первой пары настоящих листьев (растения с замедлением развития), селекцию проводили в два этапа. На первом этане отбирались проростки, не потерявшие, либо лишь частично потерявшие зеленую окраску после 14 суток проращивания на среде с канамицином. На втором этапе осуществляли перенос отобранных растений на среду без антибиотика и отбор среди них вариантов, восстановивших способность к морфогенезу.

В этом случае на нервом этапе было отобрано примерно 10% растений но отношению к общему количеству проростков.

На втором этапе отобранные варианты растений пересаживали на среду без канамицина. Параллельно анализировали контрольные, частично обесцвеченные на среде с канамицином проростки. После переноса опытных и контрольных растений на среду без канамицина и 15-30 суток культивации без антибиотика среди опытных бледно-жёлтых

проростков начинали появляться растения с зелёными розетками. Контрольные же проростки на среде без антибиотика продолжали терять окраску, их листья и корни не развивались и растения погибали. В результате после 30 суток роста на среде без антибиотика доля отбираемых потенциально трансформированных растений составила величину порядка 1.3%. Отобранные варианты растений медленно росли и имели малый диаметр розетки (0.3-0.8 см за месяц культивирования по сравнению с 1.5-2.0 см в контроле). Форма листьев была округлой, почти без черешков, розетка, как правило, представляла собой компактное образование с одним или несколькими апексами зеленого цвета. Листья более старшего возраста имели жёлто-зелёный или жёлтый цвет. По краям молодых листьев и у основания черешков часто наблюдалась антоциановая пигментация. Опушенность листьев была слабой, часто листья были втрифицованы. Около трети таких растений имели корни до 2-3 см и более, тонкие, ветвящиеся.

Все растения с морфологическими отклонениями постепенно теряли хлорофилл и погибали, не достигнув стадии цветения. С целью сохранения материала часть морфологически изменённых растений была переведена в каллусную культуру. Для этих растений проведено измерение СиЗ-активности. Оказалось, что 2 из 4 проанализированных растений имеют уровень ОиБ-активности, превышающий таковой для контрольных растений (рис. 4). Таким образом, и при такой системе отбора если не все, то, по крайней мере, существенная часть растений имеет трансгенную природу. Частота индукции таких вариантов оказалась неожиданно высокой (около 1.3%), то есть примерно в 3-4 раза выше, чем доля растений, отбираемых по варианту 1. Возникает вопрос, с чем связана высокая частота индукции морфологически изменённых вариантов рас-

Время,ч

Рис.4. Кинетика накопления МСГ для зелёной ткани растения (поколение Т2) с морфологическими отклонениями, отобранного по варианту 2 (М1). К1 - значения флуоресценции для ткани растения дикого типа, выращеиого в почве. К2,3 - значения флуоресценции для ткани двух растений, отобранных по варианту 2, но не показавших статистически значимых отличий от уровня 0118-активности в тканях (^трансформированных растений.

тений, выявляемых в поколении Т2. На наш взгляд, в основе этого явления может лежать избирательность при встраивании ттсерции Т-ДНК в геном растительной клетки. В настоящее время в ряде работ, в том числе выполненных на клетках показано, что встраивание

Т-ДНК происходит преимущественно в активно транскрибируемых областях генома [Копсг е1 а!., 1989; Неппап е». а1., 1990; КегЛипсШ с! а1., 1991], Семена Л гаЛ/с/о/шл содержат 2 первичные генеративные клетки, на основе которых и формируются все семена в следующем поколении. Понятно, что эти семена содержат не все инсерции, возникшие в клетках

трансформированных проростков, а лишь те, которые возникли I клетках генеративного пути. В этих условиях инсерции буду] преимущественно локализоваться в генах, активно функционирующю в процессе формирования генеративных органов и, в конечном счёте семян следующего поколения.

3.5. Модификация метода трансформации проростков Ещё одной задачей, которая решалась в данной работе, былс увеличение эффективности самого процесса трансформации прорастающих семян ЛгаЫйорк 'м. Известно, что агробакгерии проникают в растения через микроповреждения. На этом принципе, в частности, построен метод трансформации путём обработки целых растений агробактериями под вакуумом. В данной работе использован другой приём. Замоченные семена обрабатывали ультразвуком в присутствии окиси алюминия (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние предварительной обработки семян на эффективность отбора

устойчивых к канамицину растений

Доля отобранных растений, %* Без предварительной обработки семян Обработка УЗ Обработка УЗ +А1203

по варианту 1 0.1 0.4 3.2

по варианту 2 1.3 3.6 9.4

Примечание:

*Часготы рассчитаны как отношение жизнеспособных вариантов (после переноса в почву для растений, отбираемых на среде с канамицином по варианту 1 или после восстановления способности к морфогенезу для растений, отбираемых по варианту 2) к общему количеству анализируемых проростков поколения Т2. Приведены средние значения, полученные в трёх опытах (8ЕМ<10%).

Оказалось, что предварительная обработка семян ультразвуком перед проведением агробактериальной трансформации и, особенно, ультразвуком в присутствии окиси алюминия увеличивает число растений, обладающих устойчивостью к канамищшу, по крайней мере, примерно на порядок. При этом увеличиваются частота появления растений как-нормального фенотипа, так и морфологически изменённых вариантов. Наличие зависимости между условиями проведения трансформации в поколении Т1 и возникновением устойчивых к канамицину растений в поколении Т2 (вне зависимости от того, проводится ли отбор по варианту 1 или 2) является ещё одним аргументом в пользу того, что, по крайней мере, существенная часть отбираемых морфологически изменённых вариантов является трансгенными растениями.

ИТОГИ

Уже давно известно преимущество Arabidopsis как объекта генетических исследований. Тем не менее в последние несколько лет это растение вновь привлекло внимание исследователей, и фактически мы опять переживаем "арабидопсисный бум". Скорее всего, Arabidopsis станет первым объектом среди высших растений, для которого уже в ближайшее время будет изучена структура и функции большинства генов. Это, в основном, определяется разработкой методов проведения эффективного инсерционного мутагенеза клеток Arabidopsis. Во всяком случае, в качестве реальной в настоящее время стоит задача получения полной коллекции инсерционных мутаций генома Arabidopsis [Schmidt & Dean, 1992], и к выполнению этой задачи приступили многие лаборатории из различных стран. Понятно, что её выполнение сталкивается с определёнными техническими трудностями. Главным ограничивающим фактором при решении этой проблемы является низкая эффективность процесса индукции инсерционных мутаций и создание систем селекции, позволяющих отбирать мутации с различным фенотипическим проявлением. Понятно также, что на современном этапе развития науки необходимо, наряду с генетическими, использовать и молекулярно-генетические методы, применение которых предполагает клонирование мутантных генов. В свете решения этих задач в данной работе созданы векторы, обеспечивающие инсерцию в мугантные гены маркеров, экспрессирующихся не только в растительной клетке, но и в клетках E.coli. Последнее существенно облегчает процедуру последующего клонирования мутантных генов. Проведённая в работе модификация условий селекции позволяет эффективно отбирать варианты трансгенных

растений, у которых мутации проявляются уже во втором поколении после трансформации и являются, по крайней мере, преимущественно доминантными. Доминантные мутации, связанные с нарушением процесса развития растений, в большинстве случаев приводят либо к их гибели на различных этапах развития, либо к полной или частичной их стерильности. Исследование мутаций такого рода представляет особый интерес, поскольку их изучение чрезвычайно затруднено при использовании традиционных методов анализа и в силу этого они исследованы значительно хуже по сравнению с рецессивными мутациями. С целью проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа стерильных растений либо растений, погибающих в процессе развития в поколении Т2, на их основе получена коллекция каллусных культур. И, наконец, разработан метод предварительной обработки прорастающих семян АгаЫ<1ор$1$, позволяющий не менее, чем на порядок увеличить эффективность процесса трансформации при использовании полученных векторов, входящих как элемент в бинарную систему трансформации двудольных растений.

ВЫВОДЫ

1. На базе плазмиды рВ1121 получена серия векторов дай генетической трансформации растений. Сконструированные векторы в Т-области, наряду с генами, экспрессирующимися в растениях, содержат гены устойчивости к антибиотикам (ампициллину, хлорамфениколу тетрациклину), облегчающие последующую процедуру клонированш мутантных генов.

2. Обоснованы два варианта отбора устойчивых к канамицину растений во втором поколении после трансформации семян ЛгаШо/т? Отбираемые в поколении Т2 на среде с канамицином растения нормального фенотипа с относительно высокой частотой содержат рецессивные мутации, дающие расщепление в следующем поколении пс морфологически регистрируемым признакам. При отборе растений, не потерявших либо лишь частично потерявших зелёную окраску на среде с канамицином, но с замедлением развития, с высокой частотой обнаруживаются растения с изменёнными морфологическими признаками.

3. Показано, что, по крайней мере, часть морфологически изменённых в поколении Т2 вариантов растений имеет трансгенную природу.

4. Получена коллекция каллусных культур для летальных либо стерильных вариантов растений поколенц»Т2, необходимая для проведения их дальнейшего молекулярно-генетического анализа.

5. Разработан метод трансформации прорастающих семян АгаЫ<1ор-.ш, включающий в себя обработку ультразвуком в присутствии окиси алюминия и обеспечивающий увеличение выхода трансформированных растений, по крайней мере, на порядок.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лысенко Е.С., Гапеева Т.А., Ермакова С.Ю., Еланская И.В., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Гомология клонированных фрагментов ДНК цианобактерии Synechocystis 6803 с хлоропластной и ядерной ДНК высших растений // Генетика. 1991. Т. 27, N4. С. 581 - 587.

2. Gapeeva Т.А., Lookin A.L., Ogarkova O.A., Tarasov V.A. The vectors for T-DNA insertional mutagenesis // Plant Biotechnology and Genetic Enginneering. Abstr. Kiev, 1994. P.127.

3. Гапеева T.A., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Гомология клонированного фрагмента ДНК цианобактерии Synechocystis 6803 с ядерной ДНК Arabidopsis thaliana II Первый съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков. Тез.докл. Минск, 1994. С. 29.

4. Гапеева Т А., Огаркова O.A., Тарасов В.А., Волотовский И.Д. Новые векторы для трансформации двудольных растений //Генетика. 1995. Т. 31, N8. С. 1085 - 1091.

5. Огаркова O.A., Хадеева Н.В., Гордон Н.Ю., Гапеева Т А., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana-. получение морфологических мутантов//Генетика. 1996 (в печати).