Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Векторы для инсерционного мутагенеза и создание тестерных линий трансгенных двудольных растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Векторы для инсерционного мутагенеза и создание тестерных линий трансгенных двудольных растений"

6 од

Г I " п

п лЫ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н. И, ВАВИЛОВА

На правах рукописи

ЛУКИН

Алексей Леонидович

УДК 577.29:58

ВЕКТОРЫ

ДЛЯ ИНСЕРЦИОННОГО МУТАГЕНЕЗА И СОЗДАНИЕ ТЕСТЕРНЫХ ЛИНИЙ ТРАНСГЕННЫХ ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1993

Работа вьшблнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, проф. В. А. Тарасов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. М. М. Асланян; доктор биологических наук Г. Г. Порошенко.

Ведущее учреждение — НИИ .профилактической токсикологии и дезинфекции Госкомсанэпиднадзара.

Защита диссертации состоится « // » 1993 г.

в час мин на заседании специализированного Ученого совета Д 002.49.01. при Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 117809 ГСП-1 Москва В-333, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ИОГен РАН.

Автореферат разослан « /7 »

1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г. Н. Полухина

---------* ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.Принципиапьная возможность направленного изменения наследственности, являющаяся центральной проблемой генетики на протяжении всего времени ее существования, реализована в результате развития идей и методов генной инженерии и молекулярного клонирования.

Внедрение этих< методов в практику генетических исследований позволяет не только создавать организмы с заданными свойствами, но и значительно более эффективно проводить исследования структур и функций геномов различных видов, объединяя классический генетический анализ и молекулярно-генети-ческие методы.

Однако успехи в использовании этих общих принципов применительно к конкретным задачам и клеткам конкретных видов организмов непосредственно связаны с созданием специальных, адаптированных к решению конкретных задач векторов и развитием эффективны* методов трансформации для клеток различных видов организмов. В частности, при проведении инсерционного мутагенеза наиболее удобными векторами являются бинарные векторы серии рВ1, которые, однако, необходимо было модифицировать для существенного облегчения процедуры клонирования мутантных генов. Эта задача решена в процессе данной работы путем ?ве-дения в структуру перемещающейся в геном Т-области плазмид этой серии различных хорошо селектируемых в клетках E.coli маркерных генов. Наиболее перспективными при поведении инсерционного мутагенеза являются клетки A. thai lana, у которых не-

достаточно разработана система генетической трансформации, особенно в связи с задачами инсерционного мутагенеза, требующими высокой частоты получения инсертантов. ° И наконец, в настоящее время отсутствует эффективная система, регистрирующая процессы амплификации в клетках растений.. Создание такой системы необходимо как для исследования особенностей протекания этого процесса как такового, так и при проведении скрининга загрязнения среды на генотоксичную активность j °

Цель и задачи исследования. В связи с вышесказанным нами п{М выполнении работы поставлены следующие задачи:,

I 1. Созданий векторов для инсерционного мутагенеза двудольных растений, позволяющих осуществлять прямую селекцию ! • при клонировании в E.coli'генов растений.

! 2. Разработка эффективной системы генетической трансформации клеток Arabidopsis thaliana наиболее адаптированной для целей инсерционОого мутагенеза.

, ,3: Конструирование вектора для получения тестерных линий двудольных растений для регистрации индуцированного процесса рекомбинации по прямым повторам ДНК растений °

Научнаяновизна. Впервые на базе бинарных векторов рВ 1-101 и рВЫ21 получена серия их производных, позволяющих осуществлять прямую селекцию мутантных генов растений при проведении инсерционного мутагенеза растений с помощью Т-об-ласти этих векторов. "Разработана эффективная система генетической трансформации клеток семян A.thaliaria, , обеспечивающая 'высокий выход трансгенных растений-инсертантов при использо-Ъащти полученных нами векторов. . ; •

Впервые сотаана путем модификации структурной части.гена

3 - глюкуронидазы плазмиды рВ 1-121 векторная пл^змида для получения тестерных трансгенных линий двудольных растений, регистрирующих процесс рекомбинации по прямым повторам ДНК цу-тем измерения а - гдюкуронидазной активности.

Практическая ценность. Использование при проведении ин-серционного мутагенеза полученных в работе производных п$аз-мид рВ1-101 и рВ1-121 существенно упрощает и удешевляет процедуру клонирования мутантных растительных генов.

Создание плазмиды рЬТ-5 является'решающим этапом в. получении тестерных линий трансгенных растений, регистрирующих рекомбинацию по прямым повторам ДНК. Использование, в свою

I

,'очередь, этих тестерных линий растений перспективно при выявлении мутагенной • активности и количественном определении

(

|прогностической эффективности канцерогенности загрязнителей окружающей среды.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущина 1991), мелиабороторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" Ш-Ген РАН Москва (1993).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, итогов и выводов. Список литературы включает I1.!;' наименований отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на 138 страницах-машинописного текста, содержат 32 рисунка и 9 таблиц.

- 4

j МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе использовались растения A.thaliana экотипа (Köln), полученные с кафедры генетики МГУ им. М.В.Ломоносова.

Штаммы бактерий и плазмиды. Штаммы E.coli: HB 101, JM 83. Штаммы A.tumefaciens: LBA 4404. Планиды: pUC-19, pTZ18-R, pBR325, pRK-2013, pAL-4404, pBI-101, pBI-121.

Среды и реактивы..Для культивирования растений использовали базовую среду MS (Murashige fir Skoog,1962). Для культивирования бактериальных клеток использовали cpejjy LB (Маниатис и др.1984) и AB (Гловер,1988). В работе использованы отечественные и импортные реактивы.

. Выделение и очистку ДНК плазмид из E.coli проводили по стандартным методикам (Маниатис и др. 1984).

Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК проводилась по методике, предложенной Кушнером ( Маниатис и др., 1984).

Коныогацию бактерий проводили по методике, описанной у Гловера (Гловер,1988).

Рестрикцию и датирование ДНК проводили в условиях, рекомендуемых изготовителем ферментов.

Электрофорез ДНК проводили в трис-боратном буфере в течение 4-16 часов в горизонташсюй пластине агарозного геля.

Влоттинг-гибридизацию проводили по методике,, описанной у Саузерна (Southern 197F.)- .

Стерилизацию растительного материала проводили в растворе 1:1 10Х перекиси водорода и 96Х этанола в течение 3 минут,, аатем 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой.

Трансформация растений проводилась по методики, разработанной Фелдманом с-соавторами (Feldmann arid Marks" 1987) .

Определение QUS-активности в растительных экстрактах про-а •...■••

водйли по методике, описанной Джефферсоном с соавт (Jefferson

et.al.1987).

Выделение тотальной ДНК из растений проводили по методике Драпера с соавт. (Draper et.. al., 1988). >

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение векторов для инсерционного мутагенеза растений, обеспечивающих 'прямую селекцию при клонировании мутантных генов

В настоящее время для двудольных растений наибольшее распространение получила система трансформации, созданная на основе Т1-плазмиды, которая содержит в своей структуре так называемую Т-область, способную после проникновения .этой области в растительную клетку встраиваться в ДНК хромосом!. Очевидно, что само по себе это событие является мутагенным, и в связи с этим процесс трансформации с помощью Т1-плазмиды и ее производных может быть использован и используется не только для переноса генетической информации в растительную клетку, но и для инсерционного мутагенеза. > ■ . .< /.

Наличие инсерции в пределах мутантного гена принципиаяь-позволяет провести клонирование . этих, мутантных генов с Целью их последующего анализа. Однако эта процедура является

достаточно трудоемкой и дорогостоящей. Для:ее упрощения конструируются специальные вектора, имеющие, например, cos сайт. Для этих же целей может быть испольвовак метод включения в •робласть хорошо выражаемых бактериальных мар'керньк генов.

В связи с этим целью первого раздела данной работы явилось создание векторов, несущих в Т-обдасти бактериальные гены устойчивости к.антибиотикам хлорамфениколу (pLD-2, pLD-3) и тетрациклину (pLD-4), на базе хорошо известных плазмид рВ1-101 и рВ1-121, входящих в fбинарную систему генетической трансформации растений (Jefferson et al._, 1987). На рис.1 представлена схема конструирования бинарных векторов pLD-2,

pLD-3, pLD-4. ''Используя метод "замораживания-оттаивания" из

i '

агарознбго геля, выделялся фрагмент Pstl+Hindlll плазмиды pBR -325 размером 2,5 т.п.н. ,• несущий ген резистентности к хлорамфениколу, в случае создания плазмид pLD-2,pLD-3 либо PvuII фрагмент размером 3,0 т.н.п., несущий ген резистентности к тетрациклину, q случае плазмиды pLD-4. При конструировании' вектора pLD-2 этот фрагмент переклонировался сначала в полилинкер плазмиды pUC]Q по сайтам HindiII и Psfcl, и после выделения из промежуточной плазмиды pLD-1 фрап&нта Hindi 11. и ВагоН 1 он по этим же. сайтам клонировался в полилинкер плазмиды pBI-101. При конструировании плазмиды pLD-3 Pstl+Hindlll фрагмент размером 2,5 т.п.н. непосредственно переклонировался ' в полилинкер плазмиды рВ1-121. Однако в связи с тем, что сайт PstI не яг-ляе'^я уникальным, использовался метод неполного перевара по этой рёстриктазе. При конструировании плазмиды pLD-4 использовался метод лиги'рования но тупым концам. Липкие .концы ДНК плазмиды рВ1-121, рестрицированной по HindiII сайту, достраиваясь до тупых с помощью фрагмента Кленова и за-

PSU

Hindi

Etofcl

ШМИ* MUAlfclA / « i WL

' ' ^ n Л / i (|

'•ra fttuii/ p L D -tí 1

t iSt.a-н. £«ыД 15 r. n.rt. f\wy \ $ . «PT ij1 í^m- l

^írpaí^

T(f-)

plC-ó

Рис.1. Схема конструирования бинарных векторов pLD-2, pLD-3, pLD-4. " о

H P

,иязя4 - Hindi 11 + Pstl фрагмент, несущий ген устойчивости к хлораифешжолу. PvuII PvulI

- PvuII -ърь -«гит, iiecvauiíi пп •/стой.чйсостл ч

'ЯП

тетрациклину. .

I - a -

тем в этот сайт переносился PvuII фрагмент размером 3,0 т.п.н., выделенный из плазмиды pER-325. ■

После процедуры лигирования с помощью ДНК-лигазы фага Т4 проводилась трансформация клеток E.coli (JM-83), причем трансформанты отбираслись на среде, содержащей канамицин и хлорамфеникол в случае плазмид pLD-2, pLD-З и канамицин, тетрациклин для плазмиды pLD-4.

г

В результате трансформации клетки, штамма JM-83 приобрели

плазмиды, содержащие как маркер исходного вектора (Km ), так

и маркер, связанный с клонируемым фрагментом.

' ■ ' t

Действительно, анализ ДНК после электрофореза в агароз-

•

ном геле показал, что клетки трансформантов содержат плазмиды размером 14,2 т.п.н. в случае pLD-2 и 15 т.п.н. в случае pLD-З и pLD-4.

1.2: Конструирование штаммов A. tumefaciens, содержащих полученные векторные плазмиды

В настоящее время для перемещения векторных плазмид, используемых при трансформации растений из клеток E.coli в клетки A.tumefaciens, разработаны специальные методы, обеспечивающие высокую эффективность этого процесса. В большинстве случаев для бинарных векторов, в основе которых лежит ori сайт плазмиды RK-2, в ячестве плазмиды помощника используется плазмида pRK-2013.

Мобилизация коньюгативного переноса в этом случае осуществляется в два этапа. Вначале хелперная плазмида путем коньюгации передается в клетки Е-coll, имеющие интересующий нас вектор, а затем из э.тих клеток обе плазмиды передаются в

процессе конъюгации в клетки A.tumefaciens. Однако хелперная плазмида не способна реплицироваться в клетках А.tumefас i ens и поэтому элиминируется. В связи с тем, что реципиентные клетки А.tumefaci ens несут плазмиду с функционально активными vir генами, при реализации этой процедуры мы имеем агробакте-рйальяый штамм клетки которого содержат две плазмиды: первая - вектор, имеющий интересующую нас Т-область, и вторая - ре-, зидентная плазмида с функционально активным vir опероном.

При передаче всех трех полученных векторных плазмид (pLD-2, pLD-3, pLD-4) нами была использована одна и та же схема триродительского скрещивания. Полученные плазмиды находились в клетках штамма JM-83. Клетки этого Штамма скрещивались. с клеткамй штамма HB-lOl E.coli, имеющими плазмиду pRK-2013, и клетками A.tumefaciens, содержащими плазмиду PAL4404. После проведения коньюгации в течение 24 час. конь-югаЦионная смесь высевалась на среду ÄB, содержащую канами-цин, хлорамфениксу1 йли тетрациклин, а также рифэмпицин. Последний антибиотик использован для отбора реципиентных ' клеток A. tumefacienS LBA 4404. Оценка частоты коньюгативного переноса показала величину 1СГ2 - 10_3 во всех случаях, что соответствует данным по эффективности коньюгативного переноса RK-2 - производных плазмид.

В дальнейшем один из сконструированных штаммбв LBA4404 (PAL4404; pLD-З) был использован для трансформаций семян A. thai 1 ana.

• í

1.3. Трансформация прорастающих семян A. thai lana

- ' - - -1

l.S*. 1. Схема отбора трансгенных растений

. Лишь в последние 5-6 лет появились работы, в которых осуществлена генетическая трансформация клеток A. thai i ana. Для массового получения инсертантов, являющихся необходимым условием при проведении инсерциоййого Мутагенеза и получении ^представительной выборки инсерционных мутантов нами использовался переспектийный метод трансформации прорастающих семян,

впервые описанный в работе. Фелдмана с соавт. (Feldmann et

i • '

al., 1987).

- Для процедуры трансформации мы брали 1,5 тыс. семян A.thailana экотипа Köln. Семена, полученные в первом поколении, высевались на синтетическую среду MS, которая' содержала канамицин в концентрации 50 мкг/мл. На этой среде контрольные растения погибали на стадии формирования первой пары настоя. щих листьев. Семена из опытлых растений резко различались по . эффективности развития. В результате, были отобраны 69 растений, сформировавших . первую пару настоящих листьев и давшие развитую корневую систему через 2-3 недели после начала куль-' тивирования на среде с канамицином. Эти растения были пересажены в почву и подвергнуты анализу на наличие 0 - глюкурони-дазной активности--в листовых экстрактах. Оказалось, что толь- • . ко 13. из 69 растений, отобранных на первом этапе, показали четко выраженную ß - глюкуронидазную активность.

0Таким образом, . использование. полученной нами плззмиды ' pLD-З поглоляет ¡Г> осуществлять генетическую трансформацию и

производить отбор ин;ертантов с эффективностьл 0.8 - 0.9% в _ пересчете -- на- общее число трансформированных семян Эта" эффективность по порядку величины совпадает с таковой, когда в качестве инсерционного элемента использовалась Т-область плаз-миды рАКЮОЗ (Feldman et al., 1987).

1.3.2. Анализ трансгенных растений A. thaiiana

В настоящее время показано, что гены, выражаемые в растениях и интегрированные в их геном ведут себя, как мендели-рующие признаки (An et. al.,1985, Andre et al, 1986, Loyd et al., 1986) причем понятно, что функционально активные гены NPT II и 6US являются-доминантными признаками. В связи с этим при исследовании локализации инсерций, а также их числа корректным является использование методов генетического аналилр Нами путем использования метода хг, оиепена ::пачи.с,-сть v. чий между ''Кепериментальним и георот.ччески г.лздчс-мнм pact' *• -делением растений по признаку -¡уьстьител^ао! п--y^aacvcHTiio- а к канамициыу. 3 основе ожидаемого р.асцрс-счгь; -к? «гг :*п\ расщепления ЬО втором поколении яри аыОСЯйНЪЖИ О аааЛ'ЛЧХ'/,.; числами не сцепленных доминантных признаков ( резистентность к канашшипу i. соотьетсгзуса;!;!:-: чмсч, ?"т-цй; ■ • ее ' ■

пил Т-области нлаэмиды pLD-з. В табл. представлены резуль-

о

таты расщепления четырех вариантов трансформированных растений A.thaliana n« np',i?!ia:r; "Т'л .. .

Таблица . Результаты расщепления трансформированных растений A.thailana по признаку резистентности к канамицину

Вариант Чувств.к . канамицину Резистентные к канамицину Всего растений Значения X2 Кол-во вставок Т-ДНК

Л ' 18 . 45 63 0.428 1

2 . 10 80 90 9,220 2

3 9 52 ' С61 3,460 1

4 15 ! 29 .44 1,930 1

| • ,е-

Дополнительные подтверждения трансгенной природы полученных растений, а также числа копий Г-ДНК в их геноме получены при использовании метода блот-гибридизации.

2.'Конструирование бинарного'вектора для создания тестерных линий-двудольных растений, регистрирующих-рекомбинацию по прямым повторам ДНК

В настоящее время практически . отсутствуют 'удобные тест-системы для учета хронического действия генотоксикантов , в малых концентрациях, • а также краткосрочных тест-систем для выявления канцерогенов среды, регистрирующих эффект химических соединений на стадию промоции опухоли. Вместе с тем существуют данные о связи этоги процесса с процессом амплификации генов (ВгоЫег е1. а!., .1984)Достаточно естественно полагать, что процесс амплификации включает в себя в качестве первого этапа рекомбинацию по прямым повторам ДНК, сцепленным в пределах относительно небольшой по протяженности области

хромосомы. В результате, создание удобной системы Для регистрации процесса , в том числе_и индукции при действии различных экзогенных факторов, рекомбинации по прямым повторам ДНК может оказаться полезным не только для увеличения эффективности использования краткосрочных тестов на генотоксичность. при выявлении канцерогенной активности загрязнителей среды, но и окажется удобным инструментом для выяснение роли этого процесса в изменчивости и эволюции генома.

В связи с этим, ■ целью данного раздела работы являлось конструирование удобного для трансформации двудольных растений вектора , Т-ДНК которого содержит прямые повторы части О-глюкуронидазного гена, расположенные таким образом (рис.2), что рекомбинация по ним восстанавливает структуру этого гена и, соответственно, способность выражаться в клетках растений.

В результате того, что любая схема создания интересующей нас конструкции представляет сложную в техническом отаешении задачу и не было полной уверенности в ее реализации нами параллельно осуществлялись две схемы представленные на рис.3 и рис.4 .

к. 1.. Реализация, варианта I '" ■ :

Конкретная схема реализации варианта I представлена на рйс. 3'. Видно, что эта схема имеет четыре этапа. Два перй« связаны с перемещением интересующих нас фрагментов ЛИК в полилинкер плазмиды рТ218-(? с целью создания удобных для последующего переклонирования концевых рестрикционних сайтов.

В-качестве источника структурной с&ласти Сиз гои<? нлаз-. миды нами была использована плазмида рВ1-121, откуД по сай-

тМ i Ь_ t!r)

Рис.2. Принципиальная схема тест-системы на амплификацию генов

растений.,

1- функционально активный ген NPT JJ, выражаемый в рас-

• • тениях; •

2- растительный промотор. CaMY35S;

3- дёлетированная структурная часть GUS гена (6US");

■ 4- ген, определяющий устойчивость бактерий к антибиотикам;

-5- полйоценная структурная часть GUS гена T(R); T(L) -границу Т-области вектора для трансформавди растений. П - прямые повторы проксимальной части SUS гена. .

'], 11, Ш - этапы протекания процесса рекомбинации по прямым, повторам ; .

там EcoR I, BamH I выделялся фрагмент размером около 2.0 т.н.п., несущей структурную область 6US гена, и клонировался по этим же сайтам в полилинкер плазмиды pTZ18-R.

В Ячестве донора, несущего ген,1 определяющий устойчивость к тетрациклину, нами была использована широко известная плазмида pBR-325, из которой по сайтам Pvu И был выделен фрагмент размером 3,2 т.н.п., несущий ген резистентности к тетрациклину, и после выделения нужной зоны из агарозного геля методом "замораживания оттаивания" этот фрагмент был клонирован с использованием ДНК лигазы фага Т4 в полилинкер плазмиды (PTZ18-R) по сайту Hlnc II. Трансформанты с новой рекомбинантной плазмидой отбирались на среде содержащей 10 мкг/мл тетрациклина и 60 мкг/мл ампициллина. . '

Третий этап связан с сцеплением необходимых последовательностей структурной части GUS гена и бактериального маркера в составе плазмиды pTZ18-R. При этом,в качестве донора, несущего ген, определяющий устойчивость к тетрациклину, нами была использована полученная плазмида (pTZ18-R :Тс), из которой по сайтам Xba 1, Pst. 1 был выделен фрагмент размером 3,2т.н.п., несущий ген резистентности к тетрациклину, и после выделения нужной зоны из агарозного геля методом "замораживания-оттаивания" этот Фрагмент был клонирован с использованирм ДНК лигазы фага 14 в полилинкер плазмиды, (PTZ18-R : 6US ) по сайтам Pst I, Xba-I. Трансформанты с новой рекомбинантной плазмидой (pT218-R : Тс : GUS) отбирались на средесодержащей 10 мкг /мл тетрациклина и 60 мкг/мл ампициллина.

И, наконец, четвертый этап связан с выделением из этой плазмиды EcoR 1 + Pvu I1 Фрагмента в условиях неловара при гидролизе рестриктазой EcoR I и перемещением этого фрагмента

о

Рис.3. . Общаа схема i конструирования ветора

pBI-121:6US:Tc.

в Hinc II и EcoR I сайты плазмиды pBI-121, расположенные в

Т-области.

В качестве источника связки генов ( Тс : GUS ) служила промежуточная плазмида (PTZ18-R : Тс : 6US), из которой выделялся фрагмент Pvu II,EcoR I размером около 5,5 т.н.п., несущий генную связку (Тс : GUS), и клонировался по сайтам .yinc 11 и EcoR I в структурную область GUS гена плазмиды рВИ21.

Выделение фрагмента, несущего связку генов (Тс : GUS», основано на недорестрикции по одному из сайтов EcoR I с полным переваром по сайтам Pvu II, участвующим в переклонировании. Полученные варианты недорестрикции плазмиды (PTZ18-R : Тс : GUS ). по сайтам EcoR I, Pvu 11, несущие фрагмент размером около 5,5 т.н.п., мы клонировали во фрагмент плазмиды pBI-lSl, полученной при рестрикции по сайтам Hinc. II + EcoR I в условиях недорестрикции по сайту Hinc И.

При конструировании на последнем этапе и последующем анализе полученных рекомбинантных плазмид наличие шести сайтов Hinc II в реципиентной плазмиде pBI-Ш, а также тот факт, что в полученных клетках бактерий невозможно определение активности 6US гена, находящегося под контролем растительно го промотора, вызывал опасение, что отобранные нами плазмиды не соответствуют ожидаемым. Окончательный ответ может быть получен лишь после анализа ожидаемой функциональцрй активности дачной конструкции в клетках растений.

4.3.3. Реализация варианта II

При реализации Варианта!I (рис.4) необходимо было сце-

G

пить проксимальную часть GUS гена с последовательностью ДНК,

Jaö §mL

Kenl

«am Hl Sroal

oriI fF&r? ---'S mal C-US TU) ; .

Рис.4. Общая схема конструирования вектора pLT-5.

несущей выражаемый в бактериях маркерный ген, в пределах Вс'.пН I ♦ BamH I фрагмента в составе плазмиды, удобной для последующего переклонирования из нее этого фрагмента. В качестве такой плазмиды, как и в случае первого варианта, мы использовали плазмиду pTZ18 -R. В результате, этап перекло-" нирования структурной части GUS гена из плазмиды рВ1-121 в плазмиду pTZlS-R является общим для двух использованных нами в работе вариантов-. В качестве маркерного' гена , выражаемого в бактериях, в данном варианте служит ген CAT из плазмиды pBR;325. Этот ген может быть вьйелен в составе Hlnc 11 + Hinc II фрагмента, имеющего, в отличие от гена, определяющего резистентность клеток к тетрациклину, из этой же плазмй- • да, BamH 1 сайт, расположенный вне маркерного гена.

В результате, второй этап конструирования интересующей нас плазмиды сводился к перемещению Hlnc II + Hinc II фрагмента с CAT геном из плазмиды pBR-325 размером 2,5 т.н.п. в EcoR V рестрикционн^й сайт структурной части GUS гена, расположенного в плазмиде pTZ18-R:GUS, и отбору рекомбинантных плазмид с необходимой ориентацией вставки.

ДНК донорнрй плазмиды pBR-325 и реципиентной pTZ18-R:GUS выделялись' тепловым методом. После выделения и очистки ДНК донорной плазмиды обрабатывалась рестриктазой Hinc .II, ДНК реципиентной плазмиды - рестриктазой.EcoR V. Из ресрицирован-ной ДНК методом эллюции из агарозного геля после электрофореза выделялись интересующие нас фрагменты (фрагмент размером 2,5 т.н.п. для донорной плазмиды -размером 4,8 т.н.-п. 'для реципиентной плазмиды). После лигирования и трансформации ли-гирувдей смесью клеток E.coli штамма JM-83 трансформанты . отбирались на среде с.хлорамфениколом и ампициллином.

. ' - 20 Последний этап конструирования вектораjpLT-5 заключался в переклонировании BamH I + ВатН I фрагмента, имеющего проксимальную часть SUS гена и выражаемый в бактериях ген CÂT из шгазмады pTZ18-R:GUS:CAT в BamH I сайт, расположенный между промотором CaMV35S и стартовым кодовом GU3 гена. . Понятно, что BamH i + ВатН I фрагмент может встроиться в

обеих возможных ориентациях и поэтому необходимо вдентифици-

| - . ■ .

ровать варианты встраивания .(в прямой и обратной ориентации).

При реализации . этого & этапа ДНК донорной (pTZ18-R:GUS:CAT) и реципиентной плазмид гидролизовались. рестриктазой BamH I . Из гидролизованной этой рестриктазой ДНК донорной плазмид!: выделялся фрагмент размером 3,6 т.н.п., как

и в 'предыдущем случае, методом зллюции из агарозного геля

1

после электорофореза. После дотирования этого фрагмента с гидролизованной этой же рестриктазой ДНК реципиентной плазми-ды pBI-121 и трансформаций в клетки Е.со1i штамма JM- 83 трансформанты отбирались на среде с канамицином и хлорамфени-колом. Клетки отобранных трансформантов имели плазмиду размером около 1Б т.н.п.. Отбор вариантов рекомбинантной плазмиды, в которой повторены участки 6US гена, находящиеся в Ирямой ориентации проводился по определению размера Sma 1 + Sma 1

рестрикционного фрагмента. В случае прямой ориентации этот ' », фрагмент составляет 3,6 т.н.п.,в противоположной ориентации

i

Sma I сайты разделены лишь несколькими нуклеотидамй. ;

итоги

Как мы уже говорили, развитие методов генной инженерии

позволяет создавать генетические конструкции и организмы с

заданными интересующими нас свойствами, в частности, расши-

о

рять инструментарий используемый как в научных уелях, так и решении народохозяйственных задач. Этот общий тезис реализован нами в данной работе, во-первых, в случае создания серии векторов, существенно облегчающих процедуру клонирования ленов двудольных растений после проведения, с помощью этих векторов, инсерционного мутагенеза. Во-вторых, в случае векторной плазмиды,' инсерция Т-области которой позволит создать тестерные линии трансгенных двудольных растений, которые регистрируют рекомбинацию по прямым повторам ДНК, и которые могут быть использованы, как для исследования механиков такого рода рекомбинации и амплификации, так и при проведении скрининга загрязнителей среды на мутагенную и канцерогенную активности.

В работе также осуществлена трансформация клеток семян АЛЬа11апа, разработка методов которой является важным звеном для получения массового выхода трансформантов, являющихся необходимым условием для успешного осуществления инсерционного

. . о

мутагенеза и создания коллекции инсерционных мутантов этого чрезвычайно важного для молекулярной генетики растений вида.

- 22 - .

I ВЫВОДЫ

■ ' I

1 -

I .

■ I

I •

1. На базе бинарных векторов рВ1-101 и рВ1-121 поручена' серия векторных плазмид, имеющих в Т-области маркерные гены, выражаемые в бактериях и в результате этого существенно упрощающие процедуру клонирования мутантных генов при проведении инсерционного мутагенеза. г

2. На базе полученных векторов и клеток штамма АЛитеГас1епз ЬВА 4404 получена бинарная система генетической трансформации двудольных растений. с

3. Путем трансформации клеток семян МтПапа с использованием созданной системы генетической трансформации растений получена серия трансгённых растений-инсертантов..

4. При использовании методов генетического и блот-гибри-дизационного анализов определено число копий Т-ДНК в геноме полученных растений-инсертантов.

5. На базе плазмиды рВ1-121 создана векторная рекомби-нантная плазмида рЬТ-5 имеющая прямые повторы размером 1,2 т.н.п. '■ проксимального района структурной части гена а - глю-куронидазы находящегося в Т-ДНК этой плазмиды.

СПИСОК РАБОТ ОПУШИЮВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ •

1. Лукин А.Л., Ояртбаев М.М., Денисенко К). В., Тарасов В.А. Конструирование векторов для прямой селекции рецомби-нантных космид, содержащих инсерщш Т-области и ее раститель-

ного окружения в клетках E.coli. Тезисы I Всесоюзного симпозиума " Новые методы биотехнологии растений " (Пущино 1991)

Лукин А.Л., Сартбаев М.М,, Денисенко Ю.В., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез A.thailana. Тезисы 1 Всесоюзного симпозиума " Новые методы биотехнологии растений " (Пущино 1991)

I 3. Лукин А.Л. , Сартбаев М.М., Денисенко Ю.В., Тарасов В. А. Получение новых векторов для трансформации растений. // Генетика.1992. Т. 28. N. 12.С.181-185.

. 4. Лукин А.Л., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Вектор для создания тестерных линий трансгенных двудольных, растений, регистрирующих рекомбинацию по прямым повторам ДНК.- Генетика, 1993 (ß печати).