Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструрирование векторов для инсерционного мутагенеза растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструрирование векторов для инсерционного мутагенеза растений"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОЕЦЕЯ ГЕНЕТИКИ мм. 11. И. ВАВИЛОВА

11а правах рукописи УДК 577. 213/214: 582. 683. 2

СЛРТБАКВ Мурат Максутович

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ИНСЕРЦИОННОГО МУТАГЕНЕЗА РАСТЕНИЯ

СЗ. 00.15 - генетика АВТОРЕФЕРАТ

диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических наук

1ЮС5ГОА - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации . генома Института общей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук Е А. Тарасов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. А. Проэоров Ведущее учреждение:

Институт физиологии растений АН СССР

совета Д 002. 49.01 при Институте оби$зй гене: 1ки им. Н. И. Вавилова АН СССР по адресу: 117809 ГСП-1 Москва В-333, ул. Губкина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГеи АН СССР

доктор биологических наук

С. А. Гостимский

Защита диссертации состоится С .

в^час £>0 ыин на заседании специализированного Ученого

Автореферат равослан

1991г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г. а Полухина

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

'¿¿PT'LTH.-i J

Актуальность проблемы. Развитие генной инженерии открыло принципиально новые возможности в плане анализа и направленного изменения наследственной программы бактерий, животных и растений. Это общее принципиальное положение наиболее эффективно в настоящее время реализуется для микроорганизмов и растений. В послсдем случае, успехи в создании трансгенных форм растений связаны с разработкой эффективной системы генетической трансформации. Для класса Двудольных растений существует достаточно эффективная система генетической трансформации, основанная на использовании модифицированных специальным образом Т1- к Rl-плазмид. Несмотря на то, что в принципиальном плане проблема генетической трансформации растений для класса Двудольных решена , использование систем такого рода для специальных задач, в частности, при 'проведении инсерционного мутагенеза и последующего клонирования генов, требует дополнительных исследований, связанных с разработкой эффективной системы трансформации, применительно к конкретному виду растения, введением в систему анализа-новых маркерных генов, созданием специальных векторов, облегчающих процедуру последующего клонирования мутантных генов. Именно эти задачи решались в данной работе применительно к проблеме инсерционного мутагенеза клеток A. thaliana.

Цель и залачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования гена пуроми-цин-М-ацетилтрансферазы в качестве гена-маркера для селекции трансгенных растений, а также создание системы векторов для инсерционного мутагенеза клеток A. thaliana на основе Т-облаети Tí -плазмид агробактерий. При этом решались следующие задачи: определение чувствительности клеток N. tabacum к действ™ пу-ромицина; 2-конструирование векторов, содержащих в своей структуре г.ырагаемый в клетках растений ген пуромицин-Мтацетилтранс-

феразы ; 3-трансформация с помощью сконструированных векторов клеток N. tabacum и анализ уровня резистентности к пуромицину полученных трансгенных растений табака; 4-разработка системы эффективной регенерации и трансформации клеток A. thaliana; !j-конструирование векторов для инсерционного мутагенеза клеток растений, облегчающих клонирование инсерций Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК в клетках Е.coli.

Научная новизна На модельном объекте N. tabacum впервые показана возможность применения гена пуромицин-^ацетилтрансфера-зы в качестве гена-маркера, а антибиотика пуромицина в качестве селективного агента при трансформации растительных клеток. Разработан метод генетической трансформации клеток незрелых зародышей A. thaliana В работе получены бинарные вектора для инсерционного мутагенеза клеток растений, способные облегчить процедуру клонирования инсерции Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК в клетках Е.coli.

Практическая ценность. Сконструированные бинарные вектора, могут быть использованы для проведения инсерционного мутагенеза клеток растений и последующего клонирования мутантных генов , а ген пуромицин-И-ацетилтрансферазы в качестве гена-ыаркера для селекции трансгенных растений. Полученная коллекция трансгенных растений табака и арабидопсис может быть таю® использована для молекулярно-генетических исследований.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на YII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные меха-1 низмы генетических процессов"(Москва,1990), 1 Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений"(Пущкно,1991), мех-лабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен АН СССР (1991).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав. &ак-

дочения и выводов. Список литературы включает 190 наименований отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, содержат 41 рисунок и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Растения N. tabacum раса SR -1 (дикий, тип) и растения A. thaiiana, полученные с кпфедры генетики МГУ им. M. Е Ломоносова, расы Columbia, Dijon, Enkheim, Köln, Limburg. Blanes, Petergoph, Estland.

Штаммы бактерий и плазмидыы. Штаммы Е. coli: НВ101, JM33, S-17-1. Штаммы A. thumefaciens: С58С1, LA4404, А281. Плазмидьс pGV2260, pGV3850,рAL4404, pRK2013, pDH51, pVN3. 1, pBR225, pBI-101, pBJ-121, pBl-131.

Среды и реактивы. Для культивирования растений использовали базовые среды MC (Murashlge a Skoog,1962) и В5 (Gamborg,1968). Для культивирования бактериальных клеток использовали среду LB (Маниатис и др. ,1984) и AB (Гловер, 1988). В работе использованы отечественные и импортные реактизы.

Препаративное выделение и очистку ДНК плазмид из Е.coli проводили по стандартным методикам (Маниатис и др. ,1984) .

Трансформацию клеток E.colt плазмидной ДНК проводили по методу Кушнера (Маниатис и др. ,1984).

Конъюгацию бактерий проводили по методике, описанной у Гло-вера (Гловер, 1988).

Препаративное выделение ДНК плазмид из A. tumefaciens проводили по методике, описанной у Гелвина (Gelvin.1988).

Рестрикцию и лигиропание ДНК проводили в условиях, рекомендуемых изготовителями ферментов.

Злектрофорез ДНК проводили в трис-боратном буфере в течение 4-16 часов в горизонтальной пластине агароэного геля.

Блоттинг-гибридизацию проводили по методике, описанной у Маниатиса (Маниатис и др. ,1984).

Стерилизацию растительного материала проводили в растворе 1:1 10Z перекиси водорода и 96Z этанола в течение 3 минут■ а ватем 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой.

Трансформацию растений табака проводили методом "листовых дис! аэв" (Horsch, 1985).

Определение GUS-активности в растительных экстрактах проводили по методике, описанной у Джефферсона (Jefferson,1987).

Выделение тотальной растительной ДНК проводили по методике, описанной у Драпера(Draper,1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЦЕНИЕ

1. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА РАС И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЯ

1.1 Определение влияния пуромицина на индукцию каллуса, а также на рост и развитие проростков табака.

Для исследования чувствительности клеток табака к пуромици-ну определялось эффективность индукции каллуса из интактных двухнедельных проростков на среде, индуцируюц&й рост каллускых клеток, с добавлением антибиотика в концентрации 10, 100, 200 и 400 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля служили пророст-.ки, культивированные на аналогичной среде с добавлением 50 «кг/ мл канамииина, а в качестве положительного-проростки, культивированные на среде без антибиотиков. Для определения влияния пу-

ромицина на скорость роста и развития проростков табака стерильные семена высевались на питательную среду с добавлением антибиотика в концентрации 50, 100 и 200 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля служили семена, высеянные на питательную среду с добавлением 50 мкг/мл канамицина, а в качестве положительного - семена , высеянные на питательную среду без антибиотиков.

Ь результате этих экспериментов установлено, что пуромицин. в концентрации £00 мкг/мл блокирует индукцию каллуса, а также рост и развитие проростков табака, и может в этой концентрации использоваться для селекции растений.

1.2 Подстановка структурной части гена РАС из плазмиды pVN 3.1 под контроль промотора и транскрипционного терминатора гена 35S РНК CaMV.

Хорошо известно, что в состав транскрипционной единицы входит не только структурная часть гена (или генов в случае бактерий),- но и регуляторкые.элементы - промотор и терминатор транскрипции. Молекулярная организация регуляторных элементов имеет определенную специфику и различается у бактерий, животных и растений. Для достижения экспрессии гена РАС в клетках растений необходимо было структурную часть гена из плазмиды pVN 3.1 подстроить под контроль растительного промотора и транскрипционного терминатора. Удобно для этих целей использовать вектор pDH 51 ( Pietrzak, 1986 который содержит растительную экс-прессионную единицу как подвижную кассету,состоящую из сильного конститутивного промотора и транскрипционного терминатора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, разделенные полилинкером, содержащим несколько уникальных сайтов рестрикции.

Ген РАС в составе Hind III-BamH Г фрагмента из плазмиды pVN 3.1 переносили в полилинкер плазмиды pDH 51 следующим спосо-

бом. фрагмент ДНК, содержащий структурную часть гена РАС, выделяли электроэлюцией после обработки ДНК плааииды pVN 3.1 эндо- ; нуклеазами Hind III и BamHI и разделения фрагментов с помощь*) электрофореза в. агарозном геле. Подученную ДНК лигировали с ; с ДНК плаэмиды pDH 51, обработанной эндонуклеазами Sma I и BamHI. После этого выступающие З'-концы, образовавшиеся после> обработки зндонуклеазой Hind III, достраивали до тупых концов Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 и проводили повторное лигирование. Компетентные клетки E.coli трансформировали с по-" мощью ДНК из смеси лигирования и отбирали трансформанты на среде LA с ампициллином. В результате электрофоретического анализа , размеров плазмидной ДНК из клеток 120 клонов трансформантов .был . выделен один клон, содержащий плазмиду с увеличенной молекуляр- ; ной масссй. Проведенный рестрикционный анализ плазмидной ДНК из полученного клона показал, что эта плазмида содержит фрагмент . ДНК с РАС геном в составе полилишаэра плазмиды pDH 51. Данная плаамида названа pVI-2 ( plasmid of Vavllov Institut). Схема;, конструирования экспрессионного вектора pVl-2 представлена на рис. 1. • . ;

Таким образом, нами сконструирован экспрессионный вектор pVI-2, который позволяет экспрессироваться гену РАС в растительных клетках и может быть использован для прямой трансформации растительных протопластов.

1.3 Переклонирование гена РАС . из экспрессионного вектора pVI-2 в бинарный вектор рВ1-131. ,

В настоящее время система генетической трансформации протопластов для многих видов растений недостаточно разработана и 'трудоемка. Вместе с тем, система генетической трансформации с

Рис.I Схема переклонирования гена РАС из плаэмиды рУЫ 3.1 в экспрессионныП вектор рЯН51 и бинарный Еектор рВ1—131.

- й -

использованием И- и 1?1-плазмцд агробактерий обеспечивает высокую эффективность трансформации для многих видов .растений без привлечения протопластов. Известно также, что благодаря меньшему размеру и/иди более высокому числу копий бинарного вектора ' по сравнению с интегративнш, эффективность трансформации бинарным вектором выше. В связи с этим, очередным шагом в наших экспериментах был перенос гена РАС в бинарный вектор, способный переносить Т-область с клонированными генами в геном клеток растений. Ген РАС в составе Есо1? 1-фрагмента ДНК из плазмиды рУ I-2 пере клонировали в уникальный Есо!? I сайт Т-области бинар-. ного вектора рВ1 -131 СЛе(Гегзоп,1987). Бинарный вектор рВ1-131 является производным плазмиды рИ<252 с широким кругом хозяев, , содержит в составе плазмиды ген резистентности к канамицину, эк'Мфессг.руюшийся в клетках бактерий, а также в составе Т-ДНК ген неомицинфосфотрансферазы II и ген .р-глккуронидазы, экспрес-сирующиеся в клетках растений. В результате конструирования нами получен бинарный вектор, названный рУ1-7, содержащий в Т-об-; ' ласти гены неомицинфосфотрансферазы II и р-глюкуронидазы, экспрессирующиеся в клетках растений, а также клонированный ген пуромицин-И-ацетилтрансферазы, находящийся под контролем промотора и терминатора 353 РНК вируса мозаики цветной капусты. Схема конструирования бинарного вектора pVl-7 представлена на ч рис.1.

1.4 Конструирование штаммов А. ишвГас1епз, содержащих бинарный вектор рУ1-7.

Прл проведении трансформации растений с использованием би-. парной векторной системы необходимо иметь штаммы А. 1итеГас1епз, состоящие из векторной плазмиды, несущей Т-область, и плазмиды-• помоэдыка, представляющей собой производную Г ¡-плазмиды у кото-

рой отсутствует Т-область, но имеются гены vir-оперона, обеспечивающие перенос Т-области в транс-положении. Векторная плазми-да, как уже упоминалось, является производной плазмиды рЧК252 с широким кругом хозяев. По понятным причинам Есе генно-инженерные манипуляции проводились в клетках Е. coll. В связи с этим , следугадим этапом эксперимента был перенос сконструированного бинарного вектора pVI-7 и исходного рВ1-131, который использовался в качестве контрольного, в клетки агробактерий. В связи а тем, что межвидовой перенос плазмид в процессе трансформации затруднен и в сконструированной плазмиде гены ответственные за конъюгативный перенос удалены, в наших экспериментах для конь-югативного переноса плазмид в клетки агробактерий использовали штамм для мобилизации плазмид S-17-1, который содержит в хромосоме nob и tra опероны, необходимые для мобилизации и переноса-плазмид, активные в транс-положении. После трансформации клеток штамма 3-17-1 с помощью ДНК плазмид pVI-7 и рВ1-131 клетки трансформантов скрещивались с клетками реципиентного штамма A. turre fací ens C58C3(pGV 2260) и отбирали конъюганты по приобретенной устойчивости к канамицину.

В результате конструирования получены штаммы A. tumefaciens .C5SCl(pGV 2260;pVl-7) И C58Cl(pGV 2260 ;pBI-131), способные трансформировать Т-ДНК бинарных векторов в клетки растений.

1.5 Трансформация клеток N. tabacum с использованием штаммов ' A. tumefaciens C58Cl(pGV 2260;pVl-7).

Для проверки функциональной полноценности клонированного в Т-области бинарного Еектора pVI-7 гена РАС мы, трансформировал!: этим вектором клетки листовых дисков табака. В качестве контроля проводили трансформацию бинарным вектором pBÎ-131. В резуль-

тате генетической трансформации нами получена коллекция фер-тильных трансгенных растений табака, содержащих в геноме от 1 до 3 копий Т-ДНК бинарных векторов (таблица 1).Эти результаты Таблица I • Результаты расщепления трансформированных растений N. 1аЬасиш по признаку резистентности к канамицину

Вариант Чувствительные Резистентные Всего Значение Кол-во к канамицину к канамицину растений вставок

Т-ДНК

131 4 344 348 0,38606 3

. 1 39 687 736 0,95537 3

. 3 97 330 427 1,18735 1

. 4 9 382 391 1,38939 3

.13. 71 212 .283 1,17785 1

.17 13 511 524' 2,87362 3

. 19 86 . 291 377 0,96286. 1

.20 . 21 326 347 2,32468 2

.24 92 285 367 0,01098 1

.25 25 298 323 0,15869 2

.28 68 234 302 0,93652 ' 1

. 41 8 364 372 0,83632 3

подтверждены с помощью метода блоттинг-гибридизации ДНК.

Для определения чувствительности трансгенных растений к пу-ромицину семена растений, трансформфованных штаммом A. turne fao i ens C5SCl(pGY 2260;pVI-7), внсеваяись на питательную

среду, содержащую 100,150", 200 и 250 мкг/мл пуромицина, и культивировались в течение 3 недель. На рис. 2 видно, что растения, содержащие в геноме ген РАС в составе Т-области, которые получены в результате трансформации сконструированным нами вектором pVI-7, обладают более высокой резистентностью к пуромицину по сравнению с контрольными растениями.

Таким образом, в результате исследования нами показана возможность применения гена РАС в качестве генетического маркера ири транс.!ормации клеток растений, а также установлено, что пу-ромицин в концентрации 150-200 мкг/мл может быть использован как селективный агент для отбора трансгенных растений.

2. ИНСЕРЦИОННЫЯ МУТАГЕНЕЗ КЛЕТОК А. THALI ANA

2.1 Трансформация клеток незрелых зародышей A. thajlana с использованием штамма A. tumefaclens C58Cl(pGV 2260;pVI-7).

Инсерционные мутации по сравнению с другими типами мутаций, индуцированными химическими мутагенами или радиацией, имеют ряд преимуществ -. Одна из этих преимуществ связана с относительной простотой клонирования мутантных генов, имеющих в своей структуре инсерцию, в частности Т-область Ti-плазмиды, в том случае, когда речь идет о клетках растений. Эффективность получения мутаций при проведении инсерционного мутагенеза связана не только с эффективностью процесса трансформации клеток растений, но и с особенностями организации генома конкретного вида растения. И в этом плане чрезвычайно удобным объектом является A. thai lana, поскольку обладает. одним из- наименьших геномов :реди высших растений с малым количеством повторяющихся последовательностей, что определяет достаточно вы сокую вероятность встрэдвания ин-серции в функционально значимые и фенотипически выражаем:«

Рис.2 Проростки, культивированные на среде с пуромицином 100,150 и 200 мкг/ -л. 2,4,6-кснтрольные растения (не трансформированные), 1,3,5-трансгенные растения.

Рис.3 Схема регенерации растений A.thaliana.

участки генома арабидопсис. Трудности использования A. thai i ала в молекулярно-генетических исследованиях связаны с недостаточной разработанностью , применительно'к этому виду, быстрого и эффективного метода регенерации фертильных растений из клеток трансформированных тканей. В связи с этим, нами разработан метод генетической трансформации клеток незрелых зародышей A. thai lana. Этот метод по эффективности трансформации (по выходу растений трансформантов) не уступает, описанным в литературе, системам генетической трансформации клеток A. thai lana и составляет 20Х , где в качестве эксплантата использовались листовые диски и корни. Однако, разработанная нами система генетической трансформации превосходит другие по продолжительности времени регенерации фертильных растений из трансформированных клеток. Схема регенерации растений A. thaiíana представлена на рис. 3.

В результате агробактериальной трансформации клеток незрелых зародышей A.thaliana штаммом C58Cl(pGV 2260;pVI-7) получены устойчивые к канамицину растения; трансгеиная природа которых была подтверждена определением активности в-глюкуронидазы и методом блоттинг-гибридизации ДНК

2.2 Конструирование векторов для клонирования интегрированной Т-ДНК и прилегающей к ней области растительной ДНК в клетках Е. coll.

Как уже отмечалось, экспериментально полученные инсерцион-ные мутанты содержат в мутировавшем гене определенную последовательность (инсерцию). Это обстоятельство позволяет вылелить из банка клонированной ДНК растений эту инсерцию с прилегающей последовательностью мутантного растительного гена Однако эта процедура достаточно трудоемка и технически сложна, особенно

если речь идет о видах, клетки которых имеют значительный по размерам геном. Для облегчения процедуры клонирования мутантных генов при проведении инсерционного мутагенеза в последние несколько лет начали конструировать специальные вектора В частности, нами сконструированы вектора на базе хорошо известных бинарных векторов рВ1-101 и рВ1-121, которые в Т-области содержат 1 или 2 экспрессирующихся в клетках растений маркерных ге-.на. Э^о обстоятельство позволяет проводить отбор клеток транс-• формантов и, соответствующих трансгенных растений в геном которых встроена Т-область. Мы осуществили включение в Т-об-ласть отих плазмид фрагмедтов ДНК, несущих маркерные гены, выражающиеся в клетках Е. coli. В дальнейшем это позволит клонировать интегрированную в геном растений Т-ДНК в космидах путем прямой селекции клеток бактерий на соответствующих антибиотиках. В качестве маркерных генов, экспрессирующихся в клетках Е. coli, использовали гены резистентности к хлорамфениколу и тетрациклину m плазмиды pBR 325, которые были клонированы в полилинкер Т-области бинарных векторов рВ1-101 и рВ1-121.

В результате нами сконструированы бинарные вектора: pLD-2 , содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансферазы И, хло-рамфениколацетилтрансферазы и без промотора ген р-глюкуронида-зы; pLD-З, содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансферазы И, хлорамфениколацетилтрансферазы и ^-глюкуронидааы; pLD4, содержащий в Т-области гены неомицинфосфотрансферазы II, р-глхку-рсшидазы, а также ген резистентности к тетрациклину. Гены неомицинфосфотрансферазы II и ^-глюкуронидазы находятся под контролем растительных транскрипционных сигналов и экспрессиру-ютсн в (слетках растений. Веиду сходства процедур клонирования генов резистентности к антибиотикам в Т-ДНК бинарных векторов приводим, в качестве примера, схему конструирования бинарного

- iS-

Ркс.4 Схема конструирования бинарного вектора рÍ-D 4.

вектора pLD-4 (рис. 4).

2.3 Конструирование штаммов A. tumefaciens, содержащих бинарные вектора pLD-2, pLD-3 и pLD-4.

Для переноса сконструированных бинарных векторов в клетки A. tumefaciens проводили трипариентальное конъюгативное скрещивание. В качестве донора служили клетки штамма Е. col i JM33, содержащие векторную плазмиду, а в качестве реципиента - клетки штамма A. tumefaciens LA4404. В качестве штамма-помощника использовали штамм Е. coll НВ101, содержащий плазмиду pRK2013 с tra-onepoHO.M, обеспечивающим транспортные и мобилизационные функции в транс-положении. Неонкогенный шташ A. tumefaciens LA4404 содержит ген резистентности к фифампицину в хромосоме и плазмиду pAL4404, у которой Т-область дёлетирована и она имеет лишь viг-гены, активные в транс-положении.

В результате нами сконструированы штаммы A. tumefaciens LA4404 ( pAL4404 ; pLD-2), LA4404 (pAL4404 ; pLD-3 ) И LA4404 (PAL4404;pLD-4), которые в дальнейшем предполагается использовать для трансформации клеток A. thai i ana с целью получения коллекции инсерционных мутантов и последующего клонирования интегрированной Т-ДНК с прилегающей областью растительной ДНК i клетках Е. coll.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .

В представленной диссертационной работе решен ряд задач связанных с проведением илсерционного мутагенеза растений. Слу; чайность процесса мутирования, в том числе возникновение инсер ционных мутаций, требует большого выхода инсертантов и, соот сетсгвенно, наличия эффективной системы генетическо

трансформации растений. Кроме того, существенным параметром является доля среди полученных инсертантов фенотипически выраженных мутанантов. Уникальным объектом' в этом плане является A. thai iana, геном которого является одним из наименьших среди высших растений, а доля повторяющихся последовательностей относительно мала. Однако особенности строения этого вида растения, например относительно небольшие размеры листьев, делают затруднительным использование достаточно эффективно метода трансформации растений с помощью "листовых дисков", как это имеет место в случае табака. Это ставит проблему разработки для клеток A. thaiíana других методов трансформации, обеспечивающих массовый выход инсертантов. В плане трансформации нами опробированы клетки семян и незрелых зародышей. В последнем случае, детально разработана схема генетической трансформации, превосходящая существующие системы по.времени, затрачивающем на ее проведение. При массовом проведении трансформации весьма существенной является система первичного отбора. В случае использования бинарных векторов рВ1-121 и рВ1-131 для трансформации растений Т-область содержит 2 выражаемых в клетках, растений гена: неоми-' цинфосфотрансферазы 11 и .р-глюкуронидазы . Первый из этих генов обеспечивает первичную селекцию на среде с канамицином, второй является индикаторным геном, позволяющем уточнять результаты первичного отбора при индивидуальном анализе отобранных на первом этапе растений. Однако первичный отбор растений на среде с антибиотиком не является жестким и большая часть отобранных растений в дальнейшем не показывает глюкуронидазной активности. Все это усложняет работу. В связи с этим возникла проблема введения дополнительного селективного маркера в Т-область бинарного вектора рВ1-131. В работе нами показана, во-первых, возможность использования пуромицина в качестве селективного агента.

во-вторих, сконструирован бинарный вектор pVI-7, несущий в Т-области кроме генов неомицинфосфогрансферазы II и jî-глюкуро-нидазы ген пуромицин-И-ацетилтрансферазы. Установлено, что наличие в геноме табака Т-обйасти, содержаний эти гены, обуславливает резистентность трансгенных растений не только к канамицину, но и к пуромицмну.

Мы уже упоминали, что наличие инсерции позволяет в принципиальном плане проводить клонирование мутантных генов. Однако эта процедура сопряжена с созданием клонотеки ДНК мутантных растений, ее скринингом, то есть процедур достаточно дорогостоящих и трудоемких. Для облегчения процедуры клонирования мутантных генов нами создана серия плазмид, у которых в Т-области наряду с генами, зкспрессирующ'.мися в клетках растений, содержится маркерный ген, зкспрессирующийся в клетках Е.coll. В результате использования этой серии плазмид в процессе трансформации растений оказывается возможным клонирование вставки Т-ДНК путем простой селекции на среде с соответствующими антибиотиками.

ВЫВОДЫ

1. Показан ингибирующий эффект пуромицина на индукцию каллуса и развитие проростков табака, что указывает на возможност] использования этого антибиотика в качестве селективного агент< при трансформации клеток растений.

2. На базе плазмиды pBI-131 сконструирована плазмида pVI? нееущдя в Т-области наряду с генами неомицинфосфотрансферазы I и /-глюкурснидазы ген пуромицин-Ы-ацетилтрансферазы, подстроен ний под контроль промотора и терминатора гена 35S РНК вируса мо заики цретноЯ капусты.

| 3. Установлено, что наличие Т-области из сконструированной плазмиды pVI7 в геноме трансгенных растений табака обеспечивает их резистетность к пуромицину, в концентрациях, летальных для контрольных растений.

4. С использованием бинарной векторной системы разработан эффективный метод генетической трансформации клеток незрелых зародышей A. thai íana.

5. Сконструированы бинарные вектора на базе плазмид серии рВ1, несущие в Т-области гены резистентности к хлорамфениколу и тетрациклину, удобные для проведения инсерционного мутагенеза клеток растений и способные облегчить процедуру последующего клонирования мутантных генов.

6. Получена коллекция трансгенных растений табака, имеющих в геноме от 1 до 3 копий Т-ДНК, входящей в структуру сконструированного бинарного вектора pVI?.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. САРТБАЕВ М. М. ; МУХАМЕДШИН Э. К , ТАРАСОВ В. А. Штод регенерации растений из клеток незрелых зародышей Arabldopsls thailana. Тезисы YII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990).

2. МУХАМЕДШИН Э. К., САРТБАЕВ М. М,, ТАРАСОВ В. А. Использование гена РАС в качестве маркера при трансформации растений. Те-эисы YII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные "механизмы генетических процессов" (Москва, 1990).

3. САРТБАЕВ Ы. Ы., ТАРАСОВ' R А. Регенерация фертилъпых растений из трансформированных клеток незрелых зародышей Arabldopsls thaliana (L.). -Генетика, Í992 (в печати). •

to -

4. (J APT БАЕВ M. M.. ТАРАСОВ Е А. Экспрессия гена РАС в клетках табака. Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Вэвые методы биотехнологии растений" (Пущино,1991).

б. ЛУКИН A. JL , САРТБАЕВ М. М. , ДЕНИСЕНКО Kl Е , ТАРАСОВ Е А. Конструирование векторов для прямой селекции рекомбинантных космид, содержащих инсерцию Т-области и ее растительного окружения в клетках Е. coll. Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений" ( Пущино,1991).

6. ЛУКИН А. Л. , САРТБАЕВ М. У. . ДЕНИСЕНКО Kl Е , ТАРАСОВ Е А. Инсерционяый мутагенез A. thai lana. Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино,1091).

7. ЛУКИН A. JL , САРТБАЕВ Ы. М. . ДЕНИСЕНКО Ю. Е , ТАРАСОВ Е А. Получение новых Еекторов для трансформации растений.-Генетика, 1992 (в печати).