Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение способности к формированию ассоциативной памяти у мутантных линий дрозофилы, полученных методом Р-инсерционного мутагенеза

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение способности к формированию ассоциативной памяти у мутантных линий дрозофилы, полученных методом Р-инсерционного мутагенеза"

I I «

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

■-——ИЛИАДИ—--

КОНСТАНТИН .ГЕОРГИЕВИЧ

Изучение способности к формированию ассоциативной памяти у мутантных линий дрозофилы, полученных методом Р-инсерционного мутагенеза

03.00.15-"Генетика"

03.00.13 - "Физиология человека и животных"

_____АВТОРЕФЕРАТ_

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург -1996

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики поведения института физиологии им. И.П.Павлова РАН и лаборатории генетики животных Тираспольского Государственно-Корпоративного Университета им.Т.Г.Шевченко

Научный руководитель: кандидат биологических наук Камышев Н.Г. соруководитель: доктор биологических наук, профессор Великсар Д.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.З. Кайданов доктор медицинских наук, профессор Л.И. Корочкин

Ведущее учреждение: МГУ им.

М.ВЛомоносова.

Защита состоится" /3 " 1996г. в " //■" часов на заседании

диссертационного совета Д.063.57.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государственном Университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9, СПбГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Автореферат разослан" Т " Мс\Я 1996г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Л.А. Мамон

Актуальность темы. Изучение механизмов обучения и памяти является интенсивно разрабатываемой междисциплинарной проблемой. Вклад генетики поведения состоит в выявлении и изучении генов, определяющих способность животных к обучению, формирование и свойства различных фаз памяти. Это необходимо для того, чтобы определить, насколько полными являются известные схемы молекулярных механизмов обучения и памяти н, обнаружив новые макромолекулы, играющие в этих механизмах существенную роль, заполнить имеющиеся пробелы. Исследования на дрозофиле, в силу наилучшей изученности этого модельного объекта среди других многоклеточных и наибольшего развития методов генетического манипулирования, прокладывают дорогу молекулярно-генетическим исследованиям обучения и памяти на млекопитающих и человеке.

Хотя наибольшее число мутаций по обучению и памяти получено именно у дрозофилы (Dudai, 1988; Heisenberg, 1989), было бы наивным полагать, что весь спектр возможных молекулярных дефектов уже исчерпан. В силу исторического развития методов искусственного мутагенеза и отбора поведенческих мутантов наиболее насыщенной мутациями по обучению оказалась Х-хромосома дрозофилы. Известен лишь один пример целенаправленного поиска аутосомных мутаций, нарушающих способность к ассоциативному обучению у дрозофилы, увенчавшийся обнаружением двух таких мутаций - latheo и linotte (Boynton.Tully, 1992; Dura et al., 1993). Поэтому дальнейшие попытки выявления новых аутосомных мутантов, дефектных по обучению и памяти весьма актуальны.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в выявлении новых аутосомных генов, определяющих обучение и память у дрозофилы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Найти или разработать надежный тест на ассоциативную память с тем, чтобы его использование позволило отобрать мутантов как по самому процессу обучения, так и по различным фазам памяти.

2. Охарактеризовать фазы формирования памяти, которая определяется в данном тесте.

3. Охарактеризовать поведение в данном тесте уже известных мутантов по обучению и памяти - dunce (dnc), rutabaga (rut) и amnesiac (amn) с тем, чтобы далее сравнить его с поведением выделенных мутантов.

4. Используя Р-инсерционный мутагенез в системе с единственным Р-элементом, получить коллекцию мутантов, несущих Р-элемент в гомозиготном состоянии в одной из аутосом.

5. Провести скрининг коллекции Р-инсерционных мутантов на дефекты обучения и памяти.

6. Охарактеризовать более подробно выделенных предполагаемых мутантов по обучению или памяти: а) проследив динамику формирования памяти (или динамику обучения, если мутация затрагивает сам процесс обучения); б) изучив способность мутантов к оперантному обучению.

Основные результаты исследования и их новизна. На основе условноре-флекторного подавления ухаживания разработан надежный тест на ассоциативную Память, который можно применять в сроки, существенно большие (до 8 часов после обучения), чем это возможно по исходному методу (Siegel, Hall, 1979).

Впервые при исследовании обучения на дрозофиле использован метод напоминания, что позволило доказать правомерность применения используемого теста как теста на ассоциативную память.

Охарактеризованы фазы формирования ассоциативной памяти, образуемой при условнорефлекторном подавлении ухаживания. Впервые показана зависимость образования следа консолидированной памяти от синтеза белка у Drosophila melanogasier для форм обучения, не связанных с повторением сеансов тренировки через достаточно большие интервалы.

Проведен скрининг коллекции Р-инсерционных мутантов, несущих ин-серцию Pflacw^-BeKTopa в гомозиготном состоянии в одной из аутосом.

Выделены три новых мутанта, у которых возможно выработать как классический, так и инструментальный условные рефлексы, но отличающихся от мух дикого типа динамикой памяти. У двух из них последняя обнаруживает сходство с динамикой памяти у известного мутанта по краткосрочной памяти - rut. Третий мутант нуждается в более подробном изучении, для выяснения вопроса о том, какую из фаз памяти затрагивает мутация. Четвертый выделенный мутант оказался неспособным ни к одной из двух использованных форм обучения. У него выявлены отклонения в структуре ритуала ухаживания и дефект ольфакторного восприятия.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что она создает предпосылки для выяснения роли новых макромолекул в механизмах обучения и памяти, для дальнейшего генетического расчленения различных форм и фаз памяти. Кроме того, имеющиеся данные о существенной гомологии генов, зкспрессирующихся в мозге человека и нервной системе дрозофилы, позволяют надеяться, что результаты подобных исследований внесут свой вклад в выяснение молекулярных механизмов обучения и у высших животных, включая человека, что определяет практическую значимость работы. К последней следует также отнести разработку надежного теста на ассоциативную память у дрозофилы, который уже широко используется в лаборатории сравнительной генетики поведения Института Физио-

логин им. И.П. Павлова РАН и в лаборатории М. Гейзенберга (Вюрцбург, Германия). _ • ,, . . v .

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на региональной конференции международного общества нейробио-логии беспозвоночных "Простые нервные системы" в 1994 году (Пущино); на заседании лаборатории генетики животных кафедры генетики и селекции СПбГУ .в 1995 г.; на заседании секций генетики, зоологии и физиологии человека и животных годичной научной конференции профессорско-преподавательского состава Приднестровского Государственно-Корпоративного Университета в 1996 году (Тирасполь); на 1(Х1) Международном совещании и школе по эволюционной физиологии в 1996 году (Санкт-Петербург).

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (137 наименований). Работа изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц и 17 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все линии Drosophila melanogasrer содержались на изюмно-дрожжевой среде при 25°С, с 12-часовым световым циклом.

Линии НА и ВА, селектированные, соответственно, на низкую и высокую половую активность самцов, любезно предоставлены профессором JI.3. Кайдановым (кафедра генетики СПбГУ), а мутанты, дефектные по обучению - dnc, rut и атп - профессором Вильямом Квинном (США).

Эксперименты, основанные на анализе поведения ухаживания.

Для регистрации этограммы наблюдали в течение 300 с поведение самца, непрерывно фиксируя с помощью клавиатуры компьютера время начала отдельных элементов ухаживания, а также действий, не связанных с ухаживанием. Регистрацию начинали с началом первого акта ухаживания, но не позднее 45-50 с после помещения мухи в камеру. Для опытов использовали пластиковые камеры (d - 1.5 см ; объем - 0.7 см3) с прозрачной крышкой, ензбженные выдвижной перегородкой, разделяющей камеру пополам.

Для обучения в камеру помещали наивного (не имеющего опыта общения с другими мухами) самца тестируемой линии в возрасте пяти суток и оплодотворенную самку Canton-S (C-S) на 30 мин.

Тестирование памяти ' '"

Обученного самца изолировали на необходимое время и затем помещали в другую камеру с самкой для тестирования памяти. Память тестировали

через разные интервалы времени после обучения. Скрининг Р-инсерци-онных линий на дефекты памяти проводили спустя 3 часа после обучения. Индекс обучения и статистические процедуры

Для оценки способности каждой линии к обучению мы использовали непараметрический аналог индекса обучения, используемого другими авторами: ИО=(ВУН-ВУО)/ВУН= 1-ВУО/ВУН,

где ВУН - время в ухаживании наивных, а ВУО - время в ухаживании обученных самцов.

Для сравнения уровня активности наивных и обученных самцов использовали двусторонний свободный от распределения критерий ранговых сумм Уилкоксона W (Холлевдер и Вульф, 1983, с. 86), а также критерий Манна-Уитни U. Во всей работе использован один и тот же заранее заданный уровень значимости а=0.05. Для точечного и интервального оценивания индекса обучения исходные данные преобразовывали путем деления времени в ухаживании каждой особи из обеих выборок на среднее время в ухаживании наивных самцов. В качестве точечной оценки индекса обучения в данной работе использовали примененную к преобразованным данным оценку А Ходжеса-Лемана, связанную со статистикой ранговой суммы Уилкоксона (Холлевдер, Вульф, 1983, с. 93). Для интервального оценивания индекса обучения вычисляли свободный от распределения доверительный интервал Мозеса для Д, основанный на критерии ранговых сумм Уилкоксона (Холлендер, Вульф, 1983, с. 96). Сравнение индексов обучения у разных линий основывалось на сопоставлении соответствующих доверительных интервалов (НГДИ - нижняя граница доверительного интервала; ВГДИ -верхняя граница доверительного интервала): если двусторонние 95-процентные доверительные интервалы не перекрывались, то различие в индексе обучения у двух линий считалось достоверным. Скармливание циклогексимида (по Tully et al., 1994) Мух помещали в стаканчик, на дне которого находился бумажный фильтр, смоченный 250 мкл раствора 35 мМ циклогексимида (Sigma) в 4 -процентной сахарозе. Контрольную группу мух помещали в стаканчик только с сахарозой. За 30 мин до обучения мух отсаживали индивидуально в стаканчики со стандартной питательной средой.

Эксперимент с холодовой анестезией (по Tully et al.,1994) Самцов после обучения разделили на две группы. Мух из первой группы переносили в предварительно охлажденный (до 0°С) стаканчик сразу после обучения, из второй - спустя 30 мин на 5 с. Тестирование памяти проводили через 8 часов после анестезии.

Эксперименты по оперантному обучению (по Камышев и др.. 1994)

В экспериментах использовали одновозрастных девственных самок, достигших трехсуточного возраста. До опыта всех экспериментальных особей содержали в культуралъных стаканчиках индивидуально.

Муху помещали в пластиковую камеру (диаметр 25 мм, высота 10 мм) и сразу начинали наблюдение, которое вели непрерывно в течение 300 с. Для создания групповой ситуации экспериментальную особь подсаживали к группе легко от нее отличимых 9 мутантов ebony (фенотип: черное тело). С помощью компьютера регистрировали этограмму для каждой мухи, в которой отмечали начало каждого из следующих видов поведения: активности, покоя, пршшнга, физических контактов между особями. Сравнение времени в активности у одиночных особей и у мух в группе, а также точечное и интервальное оценивание индекса обучения проводили методами непараметрической статистики аналогично тому, как это делали для времени в ухаживании и рассчитанного на его основе индекса.

Тестирование ольфакторной чувствительности

Исследование остроты ольфакторного восприятия проводили по методу Квинна и др. (Quinn et al., 1974). Статистические сравнения проводили с использованием критерия хн-квадрат для проверки независимости номинальных переменных с поправкой Йетса.

Методика получения Р-инсерционных линий

Линии:

1. Sp/Cy;SbA2-3/TM-6 - содержит стабильный Р-элемент (Д2-3) и доминантные маркированные инверсии, запирающие кроссинговер. Д2-3 элемент кодирует функциональную транспозазу, но не способен к транспозиции из-за качественных изменений в его фланкирующих областях.

2. w11 lg, Р[!sew*]/Р[!acw*] - содержит неавтономный Р-элемент (вектор), маркированный mini-white+последовательностью. Длина P[lacw*] вектора составляет Ю.бкЬ. На 5' конце этого транспозона находится последовательность Р-элемента, соединенная с lacZ бактериальным геном, кодирующим фермент бета-галактозвдазу (Tps-lacZ) которая служит гисто-хими-ческим маркером. За ним следует mini-white4" ген, который обеспечивает появление красного глазного пигмента и является фенотипическим маркером. На 3' конце находится плазмидное начало репликации (Origin) и ген устойчивости к ампицилину (AmpR). Плазмидная последовательность ограничена с одной стороны сайтами рестрикции EcoRI и SacII, с другой стороны по-лилинкерным участком (Hindlll); (Xbal); (Bglll); (PstI);(BamHI).

wi l is мутация была выделена как делеция в white локусе которая захватывает практически всю структурную часть этого гена.

Эти две линии были любезно предоставлены нам доктором J.M.Du-

га из Centre de Genetique Moleculare du C.N.R.S. Gi sur Yvette, France.

3. w(C-S8) - "кантонизированная" white линия.

4. w/w,Cy/Sp;Sb/D - эту линию использовали как балансерную для выявления хромосомы, в которую встроился Р-вектор и для вывода Р-инсер-ционных линий в гомозиготное состояние.

Схема скрещиваний

Гомозиготных по P[lacw+] виргинных самок скрещивали с самцами, несущими единственный на геном Р-элемент (Д2-3). В Fi отбирали самцов, несущих в своем геноме оба Р-элемента (Д 2-3 и P[lacw*]). Посредством транс позазы, кодируемой Д2-3 элементом, Р[1ас\у*]-вектор может совершать транспозицию в любую хромосому. Данная схема скрещиваний позволяет выявлять инсерции Р-вектора во всех аутосомах дрозофилы. Индивидуально скрещивая самцов, несущих оба Р-элемента, с самками линии w(C-S8) mi получили в F2 самцов, лишенных маркеров и с единственным на геном неавтономным Ppacw^-вектором. В дальнейшем каждый такой самец стал основателем одной линии. Скрещивания этих самцов с самками балансер-ной линии проводили с целью обнаружения аутосомы с инсерцией Pflacw*] вектора и вывода линии в гомозиготное состояние.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Модификация метода тестирования памяти в парадигме условнорефлек-торного подавления ухаживания

Для осуществления скрининга коллекции Р-инсерционных мутантных линий на дефекты обучения и различных фаз памяти, включая консолидированную память, тест должен быть достаточно отсрочен от момента обучения. Обычно в экспериментах с консолидированной памятью, проводимых на дрозофиле, используют тест через 3 часа после завершения обучения. Поэтому первая задача, которую мы для себя поставили, состояла в поиске или разработке метода, позволяющего тестировать память через 3 часа на минимальном количестве особей и с хорошо повторяемыми результатами. В поисках подобного метода мы обращались ко многим формам обучения. В конце концов мы остановились на одной из хорошо охарактеризованных форм ассоциативного обучения - условнорефлекторном подавлении ухаживания самцов (Siegel, Hall, 1979; Gailey et al., 1984).

Суть этой формы обучения состоит в следующем. Ухаживание самца запускается стимулирующим ухаживание (привлекающим) феромоном, который выделяют и девственные, и оплодотворенные самки. В отличие от девственных, оплодотворенные самки продуцируют также подавляющий ухаживание (аверсивный) феромон и выделяют его в ответ на ухаживание

самца. Таким образом, ухаживающий за оплодотворенной самкой самец получает от нее два стимула: его ухаживание стимулируется привлекающим феромоном, но, начав ухаживание, он получает отрицательное подкрепление в виде аверсивного феромона. В результате вырабатывается условный рефлекс: условный стимул (привлекающий феромон) ассоциируется с безусловным (аверсивным феромоном) и приобретает его аверсивные свойства, становясь менее привлекательным для самца. Для регистрации условного ответа, как и положено, самцу предъявляют только условный стимул, т.е. девственных самок, у которых присутствует только стимулирующий ухаживание феромон.

Первый эксперимент был направлен на воспроизведение результатов, описанных в литературе.

Динамика ухаживания самца С-8 за иммобилизованной девственной самкой после 30-минутного опыта ухаживания за оплодотворенной самкой представлена на рис. 1, А. У обученных самцов (имеющих предварительный опыт ухаживания за оплодотворенной самкой) время в ухаживании (ВУ) в тесте сразу после завершения обучения существенно ниже, чем у наивных (не имеющих такого опыта) самцов. В течение трех часов после завершения обучения происходит постепенное восстановление исходного уровня ухаживания. Соответственно изменяется и индекс обучения (ИО), сразу после обучения он составляет 0.60 и постепенно снижается до 0.11 спустя 1 час после обучения (рис. 1, Б). Таким образом, наши исследования подтвердили результаты, полученные ранее другими авторами.

Вместе с тем, анализ вышеприведенных экспериментальных данных показал необходимость модификации исходного метода. Так как значение ИО через 3 часа после обучения статистически не отличалось от нуля, было ясно, что использовать данную методику для тестирования обучения и памяти, при скрининге Р-инсерционных линий, не перспективно. Динамика памяти при использовании теста с оплодотворенными самками

Суть введенной нами модификации состоит в использовании для регистрации условного ответа не обездвиженных девственных самок (предъявление только условного стимула), а живых оплодотворенных, т.е. повторное после обучения предъявление одновременно и условного, и безусловного стимулов, где последний должен был служить ключом, облегчающим извлечение информации из следа памяти.

На рисунке 1, В представлена динамика ухаживания самцов за оплодотворенными самками в стандартном 300-секундном тесте, проводимом в разное время после 30-минутного периода обучения. В данном случае ис-

ходная половая активность наивных самцов восстанавливается лишь спустя 16 часов после обучения. Исходный ИО (0.67) сохраняется практически без изменений до 8 часов, а к 16 часам снижается до -0.05 (рис. 1, Г).

Таким образом, поставленная цель была достигнута. Использование в тесте оплодотворенных самок действительно привело к очень существен-

В

■ и —

5 в 7

в) я

2.

300 т 200 100 0

наивные О 15 зо 60 180 Время после обучения (мин)

II • ®

Ч У

X >1 А ЗЕ Ю V о

X 200 т X

| 150..

1 100 х

>ч

в 50 к

£ о

О 0,25 0.5 1 3 8 16 24 Время после обучения (часы)

Г

^-ГЬ г 1 | £ 0,5 г-г-

60 180 X (С о -0,5 0 0,25 0,5 1 3 8

* * * *

«с 24

Время после обучения (мин)

16

Время после обучения (часы)

1

Рис. 1. Динамика времени в ухаживании (А) и индекса обучения (Б) самцов С-Э после 30-минутного опыта ухаживания за оплодотворенными самками (тест с иммобилизованными зрелыми девственными самками) и динамика времени в ухаживании (В) и индекса обучения (Г) самцов С-Б после 30-минутного опыта ухаживания за оплодотворенными самками (тест с оплодотворенными самками)

Примечание. Здесь и далее вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего времени в ухаживании (А) и границы 95-процентного доверительного интервала для индекса обучения (Б). Звездочкой отмечены достоверные отличия индекса обучения от нуля (Р<0.05).

ному расширению периода, в течение которого сохраняются изменения поведения, достигнутые в результате ассоциативного обучения. Однако этот эффект мог быть связан и с неассоциативными модификациями поведения, такими как изменение чувствительности к безусловному стимулу. Чтобы выбрать одну из этих альтернатив, был поставлен опыт, в котором использовалось напоминание в его традиционном понимании, т.е. воспроизведение в небольшом объеме части усвоенных реакций или повторение пережитого опыта, которого достаточно, чтобы поддерживать ранее сформированные реакции на высоком уровне, но недостаточно, чтобы вызвать ка-

:ой-то эффект у животных, которые не имели такого предшествующего шыта. - - _______________

Упоминание как ключ, облегчающий извлечение информации из следа ас-оциативиой памяти

Результаты эксперимента с напоминанием показали, что непродолжительное предъявление безусловного стимула (напоминание) существенно гвеличивает ИО ранее обученных самцов в последующем тесте с предъяв-(еннем только условного стимула как по сравнению с контролем без напо-ганания, так и по сравнению с контролем, где претест с безусловным стимулом применялся к наивным самцам.

Это свидетельствует о том, что использование в тесте на память безус-ювного стимула приводит к улучшению ИО путем облегчения извлечения :леда ассоциативной памяти, а не посредством связанных с ним неассоциа--ивных модификаций поведения. Характеристика формирования памяти

Нами были охарактеризованы фазы формирования памяти, образуемой 1ри условнорефлекторном подавлении ухаживания.

Применение холодового шока как сразу, так и через 30 минут после за-5ершения обучения, т.е. в срок, когда обычно консолидация памяти у дро-юфилы уже завершается, не оказывало влияния на ИО через 8 часов после обучения. Эти данные свидетельствуют о том, что сразу после завершения 30-минутного периода обучения память уже, в основном, консолидирована.

В экспериментах по обнаружению действия циклогексимида (ингибитор лштеза белка) на консолидацию памяти у линии С-Б установлено, что в ;лучае, когда самцы до обучения находились на сахарозе, наблюдается нормальное сохранение памяти при тестировании сразу и через 3 часа после обучения. Совершенно иная динамика обнаружилась при тестировании :амцов, которым до обучения скармливали циклогексимид: ИО сразу после обучения, составил 0.65, а через 3 часа после завершения обучения, когда память представлена, в основном, ее консолидированнной формой, ИО достоверно не отличался от нуля. Таким образом, для консолидации следа памяти в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания, по-видимому, необходим синтез белка.

Скрининг коллекции Р-инсерционных линий на дефекты обучения или памяти

Для скрининга коллекции Р-инсерционных линий на дефекты обучения и памяти по причинам, изложенным выше, была выбрана 3-часовая точка после завершения обучения. Всего были протестированы 33 линии, несущие инсерцию Р-элемента в гомозиготном состоянии в одной из аутосом.

Результаты скрининга представлены на рис. 2. Линии располагаются по ме ре возрастания индекса обучения. На том же рисунке для сравнения представлены данные для линии дикого типа C-S и известных мутантов по обучению: dnc, rut, атп. С целью выяснения вопроса о зависимости индекса обучения от исходного уровня ухаживания наивных самцов в анализ также были включены линии, отселектированные на низкую (НА) и высокую (ВА) половую активность самцов (Кайданов и др., 1994). Таким образом, всего было изучено 39 линий.

Из 33 Р-инсерционных линий достоверно не отличались значениями ИО от нуля 9 линий, причем у трех из них (р95, р 124 и р171) ИО был достоверно меньше, чем у линии C-S. Среди этих 9 линий три мутанта (рЗ, р901, и р97) обладали низкой исходной половой активностью наивных самцов. Результаты тестирования линий, селектированных на высокую (ВА) и низкую (НА) половую активность, показали, что линия ВА обладает высоким индексом обучения (0.65), тогда как ИО линии НА достоверно не отличается от нуля. Поэтому мы решили воздержаться от дальнейшего изучения линий с низким уровнем ухаживания самцов. Отсутствие способности к обучению в этом случае могло быть обусловлено такими тривиальными причинами, как недостаточная стимуляция самки к выделению аверсивного феромона, недостаточное получение или невозможность восприятия стимулов от самки и т.п. В связи с этим окончательно для дальнейшего анализа были отобраны 4 линии с предполагаемыми дефектами обучения или памяти: р95, р171, р153 (с инсерцией Р-вектора во второй хромосоме) и pi 24 (с инсерцией в третьей хромосоме). Все они обладают не меньшим, чем у линии C-S, исходным уровнем половой активности наивных самцов, показывают через 3 часа после завершения обучения ИО достоверно не отличающийся от нуля и по величине ИО в ряду всех изученных линий занимают положение ниже мутанта dnc. Дальнейшее изучение менее перспективных линий (р31 ир21) было оставлено на будущее. Характеристика четырех выделенных предполагаемых мутантов по обучению или памяти

У четырех выделенных мутантов низкий ИО через 3 часа после обучения мог наблюдаться как вследствие нарушения самого процесса обучения, так и из-за дефектов разных фаз памяти. Как видно из рис. 3, динамика сохранения памяти у линий р171 и р95 сходна с динамикой памяти, обнаруженной при тестировании мутантов rut: они также способны к обучению и помнят, по крайней мере, на протяжении 30 минут. Через час после завершения обучения ИО резко падает и уже не отличается от нуля. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что у мутантов

5 2

1 .

о

5. 1

Ю

о

2 О «>

ч

х

X -1

рз

р0О1

* * * *

=ь

m р07 p31 I ^ р211 р21 р132

W р153 dnc „ р!2 рЗО ^Р100 arm

гЬгЫ-rbirfrb

rutP95

Р171

р124

| 1,5

х о

3. 1

о

о

ё 0,5

а> 1

Ч

х

* О

""pio. Cs реор14р11б^р71р12

Р142 pi 72 Р34 ''"pttPHi

Рис. 2. Индексы обучения, измеренные через 3 часа после завершения обучения, у Р-инсерционных линий, линии дикого типа C-S, известных мутантов по обучению (dnc, rut, amn) и линий, различающихся по половой активности самцов (НА и ВА). Звездочкой обозначены линии достоверно отличающиеся по

индексу обучения от линии дикого типа C-S. Незаполненные стопбики соответствуют линиям с индексом обучения, не имеющим достоверных отличий от нуля. Штриховкой выделена линия C-S

р 171 и р95, подобно мутантам rut, нарушена кратковременная память.

Значение ИО у мутанта р 153 сразу после обучения составляет 0.66, а через 3 часа после обучения не отличается от нуля. Возможно, что этот мутант также затрагивает кратковременную память, вместе с тем относительно большое значение ИО (0.19) через 3 часа после завершения обучения (хотя и недостоверное) может свидетельствовать о его большей близости к мутантам типа amn, (нарушения средневременной памяти). Для решения этого вопроса необходимы более детальные исследования динамики памяти у этого мутанта.

У линии р 124 обнаружилась совершенно другая динамика памяти. У самцов этой линии не наблюдается подавления ухаживания самца за оплодотворенной самкой уже сразу после обучения. Эти данные дают основание предполагать, что линия р 124 дефектна по обучению.

Изучение динамики обучения непрерывно в течение 30 минут показало, что мутант pi 24 оказался неспособным к обучению. У него выявлены отклонения в структуре ритуала ухаживания, которые заставляют подозревать у него неспособность к восприятию аверсивного феромона оплодотворенных самок.

dunce

Ю 0,5

О

S 0

-0,5

1

0,5 О

г -0,5 S

IS 0,5 о

о 0

0 30 60 180 Время посла обучения (мин)

rutabaga

b±tfc

0 30 во 180 Время после обучения (мин)

amnesiac

-f-

±=L

4-

5 -0,5 J.' 0 3 8

s Время после обучения (часы)

р 171

0,5 0

? -0,5 S

1

0.5 О

*

0 30 60 180 Время после обучения (мин)

р95

4 -0,5 х

5

1 --

0 30 60 180

Время после обучения (мин) P1S3

5 1

У

Ю 0,5

О

о о

X ф

5 -0,5 S

о

Время после обучения (часы)

Рис. 3. Динамика времени в ухаживании и индекса обучения после 30-минутного опыта ухаживания за оплодотворенными самками у четырех мутантов с внедрением Р-элемента во вторую хромосому (р95, р153 и р171) и уже известных мутантов по обучению: dunce, rutabaga, amnesiac

Однако, следует отметить, что неспособность к восприятию запахов у самцов р124 не может быть абсолютной, так как по крайней мере чувствительность к феромону, стимулирующему ухаживание, у них сохранена, о чем свидетельствовала их высокая интенсивность ухаживания.

Вместе с тем, в специальных экспериментах у него бьшо обнаружено нарушение ольфакторного восприятия - отсутствие чувствительности к окта-нолу, хотя чувствительность к другому запаху - метилциклогексанолу - не была нарушена. Это соответствует сделанному нами предположению, что мутанты р 124 могут обладать избирательным дефектом восприятия авер-сивного феромона и родственных ему запахов, в то же время сохраняя чувствительность к другим запахам, включая феромон, стимулирующий ухаживание.

Изучение способности обучаться в парадигме оперантного взаимообучения мух в фуппе

Ранее в лаборатории была разработана методика оперантного взаимообучения мух в группе (Камышев и др., 1994, 1995). Суть метода сводится к

:ледующему. Муха дикого типа, впервые помещенная в группу, пытается «бежать столкновений с другими особями, убегая от них или прерывая на-штую побежку. Это отражается в увеличении частоты и уменьшении длительности побежек в опыте по сравнению с контролем. Но, поскольку активность чаще наказывается столкновениями с другими особями, чем по-сой, со временем муха методом проб и ошибок обучается не реагировать тобежками на близость других особей и даже на контакты с ними. В результате у мух в группе устанавливается существенно меньший уровень активности, чем у контрольных одиночных особей.

Результаты изучения способности к обучению по этой методике у четырех выделенных мутантов показали, что в первом периоде (100 с) различия в активности между опытом и контролем невелики. Во втором периоде активность мух в группе резко снижается как по сравнению с первым периодом, так и по сравнению с контролем (одиночными особями). Процессы, происходящие во втором и третьем периоде, касались только первых трех пиний и не относились к линии р 124. У этой линии наблюдалась стабильная активность мух в группе во всех периодах. Линия р 124 оказалась единственной, у кого индекс обучения во втором и третьем периодах не отличался от нуля.

Таким образом, полученные экспериментальные данные показывают, что мутанты р 171, р95 и р153 способны к оперантному обучению. У мутанта р 124 способность к оперантному обучению нарушена.

Сходство поведения мутанта р124 в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания, основанного на ассоциации ольфакторных стимулов, и в парадигме оперантного взаимообучения особей в группе может означать три вещи. Либо ольфакторные стимулы играют важную роль и в последней форме обучения, о чем ранее не подозревали. Либо у этого мутанта затронута "эмоциональная сфера" т.е. не происходит адекватной оценки аверсивных стимулов разных модальностей. Либо ольфакторное восприятие и способность к обучению изменены в этой линии независимо друг от друга вследствие действия разных генов или вследствие независимых эффектов одного и того же гена, обусловленного, например, альтернативным сплайсингом. Второй и третий из возможных случаев представляют несомненный интерес для нейрогенетики.

Таким образом, в результате проведенного скрининга выявлены мутации, нарушающие как сам процесс обучения, так и динамику памяти.

Эти мутации не могут быть аллельными большинству известных мутаций дрозофилы по обучению и памяти, так как последние локализованы в Х-хромосоме. Дальнейшее изучение выделенных мутаций должно привести

к выявлению роли ранее неизвестных генов, необходимых для обучения и формирования следа памяти.

ВЫВОДЫ

1. На основе условнорефлекторного подавления ухаживания самца за оплодотворенной самкой модифицирован тест на ассоциативную память, позволяющий надежно и на небольшой выборке тестировать ее в сроки, существенно большие (до 8 часов после обучения), чем это возможно по исходному методу.

2. Охарактеризованы фазы формирования памяти, образуемой при условнорефлекторном подавлении ухаживания. В опытах с применением холодовой анестезии показано, что у самцов дикого типа консолидация следа памяти полностью завершается уже через 30 минут после завершения обучения. В опытах со скармливанием, циклогексимида показана зависимость образования следа консолидированной памяти от синтеза белка.

3. Получена коллекция Р-инсерционных мутантов, несущих инсерцию Р[1ас\у*]-вектора в гомозиготном состоянии в. одной из аутосом. Тридцать три мутанта из коллекции протестированы на память через 3 часа после завершения обучения. Для дальнейшего изучения отобраны 4 мутанта, занимающие по величине индекса обучения более низкое положение, чем мутант dnc, но обладающие столь же или более высоким исходным уровнем ухаживания наивных самцов, что и самцы дикого типа C-S.

4. Показано, что у трех выделенных мутантов р171, р95 и р153, возможно выработать.как классический (условнорефлекторное подавление ухаживания), так и инструментальный (оперантное подавление двигательной активности мух в группе) условные рефлексы, но эти линии отличаются от муз дикого типа динамикой памяти. У мутантов р 171 и р95 последняя обнаруживает сходство с динамикой памяти у известного мутанта по краткосрочной памяти - rutabaga. Для установления фазы памяти, затрагиваемой мутацией р153, нужны более детальные исследования.

5. Мутант р 124 оказался неспособным ни к одной из двух указанных форм обучения. У него выявлены отклонения в структуре ритуала ухаживания и дефект ольфакторного восприятия.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Илиади К.Г., Великсар Д.С., Камышев Н.Г. Р - инсерционныи мутагенез у дрозофилы в системе с единственным на геном неавтономным Р- J элементом // BulLAcad.Sti. Rep.Moldova. Sti.Bio.LC.him- 1993. N £ С*. 29-31

2-.Ilia.di K.G., Kamyshey N.G. Discriminative classical learning of a courting mabin Drospphila//Тез. региональной к<энф. м.ежд.об-ва нейробиоло-

яя беспозвоночных "Простыв нервные системы". Пущино. 1994. СЛ5. 3« Илиади г .Г., Братина Ю.В., Переслени А.И., Савватеева Е.В., ашаев Н.Г. Выделение и изучение Р-инсерционных мутантов дрозо-илы дефектных по ассоциативно^ обучению и памяти // Тез. 1{Х) Международного совещания и школы по эволюционной физиологии". 996. С.85-86.

4. Камышев Н.Г., Илиади К.Г., Братина Ю.В. Простой и надежный ест на ассоциативную память у дрозофилы: модификация парадигмы словнорефлекторного подавления ухаживания самца за огогодотворен-ой самкой // Тез. 1(Х) "Международного совещания и школы по зволю-лонной физиологии". 1996. С.91-92.