Молекулярно-генетический и физиологический анализ нарушений моторики у мутантов дрозофилы

Федотов, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический и физиологический анализ нарушений моторики у мутантов дрозофилы
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический и физиологический анализ нарушений моторики у мутантов дрозофилы"

На правах рукописи

ФЕДОТОВ Сергей Александрович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

НАРУШЕНИЙ МОТОРИКИ У МУТАНТОВ ДРОЗОФИЛЫ

03.03.01 — физиология 03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ФЬВ 2014

005544838

Санкт-Петербург 2014

005544838

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физиологии им. И. П. Павлова Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук

Шуваев Вячеслав Тимофеевич

доктор биологических наук Камышев Николай Григорьевич

Официальные оппоненты: Саранцева Светлана Владимировна, доктор

биологических наук, заведующий лабораторией экспериментальной и прикладной генетики Отделения молекулярной и радиационной биофизики Федерального государственного бюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова»

Александров Вячеслав Георгиевич, доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии и физиологии человека и животных Российского государственного педагогического университета имени А. И. Герцена

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится "24" февраля 2014 года в 13 часов на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

Автореферат разослан "21" января 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование нервных механизмов, определяющих генерацию моторного паттерна ритмических движений, является необходимым для лечения моторных дисфункций и восстановления утерянной двигательной активности в результате повреждений нервной системы (Pearson, 2000; Marder, Bucher, 2001; Gordon, Whelan, 2006). Несмотря на определенные успехи в изучении генераторов моторного паттерна на человеке и других млекопитающих (Kiehn, Butt, 2003; Goulding, Pfaff, 2005; Andersson et al., 2012), исследования механизмов их работы на клеточном и молекулярном уровнях в составе нейронных ансамблей продвигаются крайне медленно и находятся на начальной стадии (Kiehn, 2011). В то же время для многих беспозвоночных животных дано исчерпывающее описание клеточной организации и механизмов функционирования центральных генераторов моторного паттерна (ЦГМП) различных форм ритмической деятельности (Arshavsky et al., 1998; Cymbalyuk et al, 2002; Marder, Bucher, 2007), что дает возможность проведения исследований молекулярных основ формирования и работы нервной сети генератора. Однако для модельных объектов с детально изученной морфофункциональной организацией ЦГМП, как правило, не существует готовых к использованию молекулярно-генетических методов, а также баз биоинформационных данных о генах и их продуктах. Вследствие этого сведения о молекулярных механизмах генерации моторного паттерна носят фрагментарный характер, а сама проблема остается крайне малоизученной. В последние годы появились работы, в которых были описаны отдельные молекулярные факторы, необходимые для генерации моторного паттерна разных форм ритмических движений (Marder, Bucher, 2007; Ping et al., 2010; Lu, Feng, 2012). Успех этих исследований связан во многих случаях с использованием плодовых мушек Drosophila melanogaster либо непосредственно в опытах с изучением их моторной активности (Banerjee et al., 2004; Nash et al., 2002; Ping et al., 2010), либо как источник биоинформационных данных о возможных молекулярных участниках работы и развития ЦГМП (Littleton, Ganetzky, 2000). Преимущество дрозофилы перед другими модельными объектами заключается в том, что для данного вида разработаны уникальные молекулярные и генетические методы, существенно расширяющие возможности исследования различных физиологических параметров, а также полностью секвенирован и подробнейше изучен его геном. Биоинформационный анализ позволяет оценивать функциональные свойства тех или иных структурных элементов генома и прогнозировать их роль в изучаемых процессах.

Подобное сходство не только позволяет раскрывать ранее неизвестные молекулярные детерминанты исследуемых физиологических процессов, но и обеспечивает параллельное исследование этих процессов одновременно у млекопитающих и дрозофилы (Iijima-Ando et al., 2009; Mallik, Lakhotia, 2010; Read et al., 2009). Кроме того, стратегия развития в современной фармацевтике все больше разворачивается в сторону поиска и создания агентов, специфически влияющих на конкретные молекулярные компоненты, участвующие в патологических процессах, что связано с более высокой эффективностью лекарственной терапии и меньшим количеством побочных эффектов (Zheng et al., 2006).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является идентификация молекулярно-генетических детерминант нервных процессов, ответственных за реализацию ритмических форм моторной активности у дрозофилы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Из ранее созданной коллекции Р-инсерционных мутантов дрозофилы отобрать линии с наиболее выраженными отклонениями параметров локомоторного поведения и песни ухаживания самца для дальнейшей идентификации генов-кандидатов.

2. Проанализировать взаимосвязь отклонений параметров двух форм моторной активности в группе отобранных мутантов.

3. Идентифицировать затронутые мутациями гены и определить их молекулярные продукты по биоинформационным и экспериментальных данным.

4. Установить участие и вероятную роль отобранных генов кандидатов в процессах развития и функционирования нервных структур, определяющих генерацию и регуляцию моторного паттерна ритмических движений, используя ткане- и стадиеспецифичные нокдауны генов методом РНК-интерференции.

Научная новизна. Выявлены статистические закономерности в характере отклонений параметров локомоторной и песенной активности в группе Р-инсерционных мутантов дрозофилы. Впервые показана вовлеченность 22 генов дрозофилы в определении параметров как локомоции, так и звукопродукции, а для 10 из них подтверждено участие в нервных процессах, связанных с реализацией данных форм моторной активности. Впервые изучено влияние подавления экспрессии гена CG15630 в нейрональных и глиальных клетках на структуру моторного паттерна песни ухаживания самцов дрозофилы. Впервые выявлены структурные аномалии в центральной нервной системе (ЦНС) дрозофилы при нокдауне гена CG15630, которые могут являться причиной отклонений в моторном паттерне песенной активности наравне с функциональными нарушениями, вызываемыми нокдауном гена на стадии имаго.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенное генетическое исследование моторной активности у дрозофилы позволило определить ряд значимых молекулярных детерминант нейрональных механизмов генерации моторного паттерна ритмических движений, которые на фоне малочисленности сведений о молекулярных

процессах, определяющих работу ЦГМП, могут быть использованы в качестве отправных точек в исследованиях в данной области. Наличие у 14 из 22 описанных в работе генов-кандидатов ортологов у млекопитающих и человека предполагает возможность переноса в дальнейшем результатов исследования молекулярных механизмов работы ЦГМП на более сложноорганизованные нервные сети, что может обеспечить разработку новых стратегий лечения моторных дисфункций на молекулярном уровне. В частности, исследование влияния продукта гена Са5630 на нервные сети, опосредующие передачу сенсорной информации на моторные системы мухи, могут послужить отправной точкой в изучении молекулярных механизмов эффекта тренировок на скорость восстановления утраченной активности у млекопитающих.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Отклонения в скорости побежки и величине межимпульсного интервала (МИИ) у Р-инсерционных мутантов связаны со специфичными нарушениями моторных систем, ответственных соответственно за локомоцию и звукопродукцию дрозофилы. В то же время отклонения в параметрах длительности и частоты инициаций отражают неспецифичные нарушения, которые затрагивают регуляцию или базовые механизмы функционирования в обеих формах моторной активности.

2. Транскрипты 5 генов-кандидатов, отобранных в результате скрининга по параметрам моторной активности, вовлечены в нервные процессы, которые в трех случаях связаны с определением структуры моторного паттерна песенной активности дрозофилы (5/7^2, СО15630, С034460), и в двух случаях с определением параметров как локомоторных, так и песенных моторных актов животного (А/е/2, СС6746).

3. Экспрессия гена СС15630 в нейронах необходима как для развития, так и для функционирования структур, предположительно опосредующих регуляторные влияния на ЦГМП песни ухаживания со стороны сенсорных органов.

Личный вклад автора. Основная часть представленных в диссертации результатов получена лично автором. Тестирование моторной активности и статистическая обработка результатов были осуществлены совместно с научным руководителем и другими соавторами научных работ, опубликованных соискателем.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации были представлены на 11 российских и международных конференциях: Шестом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Судак, 2010); Первой Всероссийской молодежной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском государственной университете (Томск, 2010); XIV школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2010); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010); Конференции молодых ученых

«Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды", посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010); Седьмом международном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Судак, 2011); XIV международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика JI. А. Орбели (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященной 120-летию создания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2011), X East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems" (Russia, Moscow, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 2 научные статьи в рецензируемых журналах, включенных в Перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 204 страницах печатного текста, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 41 рисунком. В списке литературы приведено 452 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster. В исследовании была использована коллекция мутантных линий Drosophila melanogaster (1064 линии, лаборатория сравнительной генетики поведения ИФ РАН), полученных методом Р-инсерционного мутагенеза (Cooley et al., 1988). Каждая тестируемая линия содержала случайную инсерцию Р-элемента - PdL-транспозона (Landis et al.,2001) - в одной из аутосом. В качестве контроля служила линия

дикого типа Canton-S (CS).

Ткане- и стадиеспецифичное подавление экспрессии генов-кандидатов достигалось посредством синтеза интерферирующей РНК (инРНК) в системе трансгенов GAL4/UAS (Duffy, 2002). Мух с системой GAL4/UAS получали в результате скрещивания самок GAL4-линий, в которых трансген GAL4 экспрессируется под контролем промотора нейроспецифичного гена (драйвер), и самцов UAS-RNAi-линий, которые несут трансген инРНК под контролем последовательности UAS, запускающей экспрессию при связывании GAL4. GAL4-линии были получены из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, США), UAS-mmm - из Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC-линии) и Transgenic RNAi Project (TRiP-линии). В качестве контроля в экспериментах с РНК-интерференцией брали потомков от скрещивания соответствующей GAL4-линии и линии, которая использовалась для создания RNAi-smmu и была лишена трансгена инРНК.

Для визуализации паттерна флуоресценции используемых драйверов в эмбрионах дрозофилы была использована линия UAS-GFP, полученная из BDSC.

Экспериментальные условия. Мух разводили и содержали на стандартной изюмно-дрожжевой среде при 25 °С и 12-часовом световом дне. Регистрацию двигательной активности и запись песни ухаживания проводили у трехсуточных самцов с 9.00 до 18.00 при t = 25 °С. Для измерения двигательной активности мух собирали под Холодовым наркозом и содержали до опыта в группе по 30 особей. Для регистрации звукопродукции самцов собирали без наркоза и содержали до опыта индивидуально.

Тестирование моторной активности. Запись двигательной активности одновременно 20-ти особей, каждая из которых находилась в отдельной плексигласовой камере (диаметр 15 мм, высота 5 мм), осуществляли с помощью двух веб-камер и программы Drosophila tracks (автор — Н. Г. Камышев) с частотой 10 Гц. Обработка данных выполнялась анализирующим модулем программы (Камышев, 2011), которая автоматически рассчитывала различные параметры локомоторного поведения (Таблица 1).

Таблица 1. Основные параметры, по которым проводилось сравнение моторной активности тестируемых линий дрозофилы

Параметры локомоторного поведения Параметры звукопродукции

• Индекс двигательной активности, время, занятое локомоцией, % • Длительность побежки, с • Частота побежки, N инициаций/100с • Средняя скорость побежки, мм/с • Индекс ИП, время, занятое ИП, % • Межимпульсный интервал, мс • Несущая частота импульса, Гц • Длительность отдельной посылки ИП, мс • Частота ИП, N инициаций/ЮОс

Запись звуков осуществляли при ухаживании самца за оплодотворенной самкой линии CS. Регистрацию звукопродукции проводили по методу Попова с соавт. (Попов и др., 2000). Для звукозаписи самца и самку помещали в специальные плексигласовые камеры, имеющие вместо дна тонкую решетку и располагающиеся непосредственно на микрофонах. Программа DCSA (Drosophila courtship song analysis, автор - H. Г. Камышев) автоматически распознавала импульсный (импульсная песня, ИП) и синусоидальный компоненты в записи песни самца (Рисунок 1), и рассчитывала различные параметры песни ухаживания (Таблица 1).

Определение локализации и направленности PdL-трапспозона в геноме. Из 20 взрослых мух выделялась геномная ДНК. Выделенную ДНК в количестве эквивалентном трем мухам расщепляли рестриктазой Taql или BstKTI, а затем проводили лигирование фрагментов ДНК самих на себя Т4-лигазой. Самолигированные образцы ДНК служили матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров HSP (CTGCAGATTGTTTAGCTTGTTC) и IRS (CGGGACCCACCTTATGTTAT). ПЦР-продукты выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле, очищали и секвенировали методом

иллпульсныи компонент: вибрация одного крыла

синусоидальным компонент

Vtf'.W

шум

Рисунок 1. Участок записи песни ухаживания самца дрозофилы. МИИ -межимпульсный интервал.

Сэнгера на оборудовании и реактивах Applied Biosystems с использованием праймера HSP (Федотов с соавт., 2012). Полученную фланговую нуклеотидную последовательность сопоставляли с базой данных о геномной последовательности ДНК D. melanogaster в программе Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Оценка уровня экспрессии генов-кандидатов. Уровень экспрессии генов-кандидатов оценивали методом количественной ПЦР с использованием флуоресцентного красителя EvaGreen (Biotium). В качестве внутреннего контроля использовали ген RpL32. Отрицательным контролем служил образец, для которого была проведена ложная реакция обратной транскрипции без транскриптазы (Федотов с соавт. 2013).

Внесение эстрадиола в питательную среду. Для осуществления индуцированного на стадии имаго нокдауна ß-эстрадиол (Sigma) растворяли в диметилсульфооксиде в концентрации 260мг/мл и смешивали в отношении объемов 1:3 с дрожжевой пастой. Отобранные для тестирования мухи с момента вылуплепия из куколок содержались в стаканчиках со стандартной изюмно-дрожжевой средой и нанесенной на ее поверхность 100 мкл дрожжевой пасты с эстрогеном, обновляемой ежедневно.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия. Эмбрионы дрозофилы, полученные от скрещивания драйверных линий и линии с трансгеном UAS-GFP, дехорионизировали (Supatto et al., 2009), помещали на предметное стекло в 50% раствор фосфатного буфера в глицерине и проводили анализ флуоресценции белка GFP с использованием люминесцентного микроскопа МикМед2 (ЛОМО, Россия) со стандартным флуоресцентным FITC-фильтром. Цифровые фото эмбрионов производились при 20-кратном увеличении камерой СХ05 Baumer Optronic и обрабатывались в программе PHOTOSHOP (Adobe Systems). В качестве контроля была использована родительская UAS-линия.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия. Анализ флуоресценции GFP в ЦНС на стадии имаго был выполнен у самцов дрозофилы с нокдауном гена CG15630 под контролем драйвера nrv2-GAL4. Флуоресценция обеспечивалась наличием в материнской линии, несущей драйвер, трансгена UAS-GFP. При этом GFP синтезировался в тех же клетках, в которых подавлялась экспрессия CG15630. Трехсуточных самцов обездвиживали Холодовым наркозом и из них извлекали ЦНС путем механического препарирования в фосфатном буфере (Fore et al„ 2011). Препараты ЦНС помещали в каплю фосфатного буфера (50 мкл) дорсальной поверхностью на покровное стекло и сканировали на конфокальном лазерном микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss) в коллективном центре пользования ФБГУН Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Анализ и обработку полученных изображений выполняли в свободно распространяемой версии ZEN 2011 (black edition, 64 bit, Carl Zeiss).

Статистические методы. Статистический анализ параметров локомоторной активности и звукопродукции проводили тестом рандомизации (Welch, 1990) в аналитическом модуле программы Drosophila courtship Lite (автор - Н. Г. Камышев), корреляционным и кластерным анализами в программе Statistica 8.0 (StatSoft). Статистическая обработка данных по количественной ПЦР выполнялась рандомизационным тестом в свободно распространяемом программном обеспечении REST 2009 (Pfaffl et al„ 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика моторных отклонений у Р-иисерционных мутантов. По

результатам проведенного ранее в лаборатории поведенческого тестирования коллекции Р-инсерционных мутантов дрозофилы (1064 линии) отобраны 82 линии с ярко выраженными и воспроизводимыми отклонениями по параметрам локомоторной активности при сравнении с линией дикого типа CS. На Рисунке 2А показано распределение значений индекса двигательной активности (процент времени, занятого побежками) в группе отобранных линий. Анализировали также частоту инициаций побежек за 100 с, средние значения длительности и скорости побежки.

Для отобранных 82 мутантных линий была выполнена запись песни ухаживания самцами этих линий за самками линии Canton-S. Песня является частью ритуала ухаживания самца дрозофилы за самкой перед спариванием и представляет собой звуки, издаваемые вибрациями одного из крыльев. Анализ записей осуществляли по пяти параметрам импульсного компонента песни. Рассчитывали индекс импульсной песни, длительность посылки, частоту инициаций посылок, межимпульспый интервал, несущую частоту импульса (величину обратную его длительности). На рисунке 2Б представлены значения МИИ в протестированных линиях мутантов.

Индекс двигательной активности (%)

100 80 60 40

алМАМ,»М¥гММММ'М'.¥

■ СО Ю N СО ■

Межимпульсный интервал (мс)

о со со -з-

ГО Ю N. СГ>

СО^Г-СЯт-СОЮ^СПт-СО

Рисунок 2. Индекс двигательной активности (А) и МИИ (Б) у 82-х Р-инсерциоиных линий и линии дикого типа Св (темно-серый столбик №58). Показаны средние и стандартные ошибки. По горизонтальной оси - числовой идентификатор линии, совпадающий с порядковым номером при ранжировании линий по индексу активности.

Серые столбики - достоверные отличия параметра от такового для линии СЪ (двусторонний тест рандомизации, Р<0.05). Белые - отличия недостоверны.

Для оценки того, насколько специфично анализируемые параметры характеризуют тестируемые формы активности, были изучены корреляционные зависимости между значениями параметров в группе из 82-х отобранных мутантов. Были рассчитаны коэффициенты корреляции (КК) между всеми независимыми параметрами моторной активности и определены значения достоверно отличные от нуля (Таблица 2).

Таблица 2. КК между параметрами двигательной активности и импульсной песни, вычисленные по их средним значениям у 82-х исследованных линий. Включены только те

параметры, которые не имеют между собой априорной математической зависимости. Достоверно отличные от нуля значения КК выделены серым цветом (1 критерий, Р<0.05).

Частота побежек (ЧП) Длит-сть Скорость побежки 1 побежки (ДПоб) | (СП) Частота инициации посылок ИП (ЧИПИП) Длительность посылки ИП (ДПИП) М еж-импульсный интервал (МИИ) Несущая частота импульса (НЧИ)

1 000000 0.436720 0 162615 10.3842«» 0.301006 -0.201783 -0.212928 ЧП

................... 1.000000 0.657140 0.321975 0.309653 -0.161900 -0.188101 ДПоб

............................ | 1.000000 0.141009 0.005769 | 0.035576 0.008612 СП

1.000000 0.563524 -0.305159 -0.501383 ЧИПИП

1.000000 -0.378174 -0.6SSi.58 ДПИП

" .............|......... 1.000000 0.294543 МИИ

1 1.000000 НЧИ

По результатам статистического анализа моторной активности Р-инсерционных мутантов был сделан ряд обобщений о закономерностях в отклонениях тестируемых параметров, а именно:

• параметры каждой из форм моторной активности демонстрируют корреляционную зависимость друг с другом, что особенно выражено для импульсной песни;

• частота инициаций и длительность побежек имеет положительные корреляции с частотой и длительностью посылок ИП;

• скорость побежки не зависит от значений параметров импульсной песни, а МИИ и несущая частота не зависят от параметров локомоторной активности, т.е. данные параметры характеризуют специфичные для конкретных форм моторной активности отклонения.

Проведенный анализ показал специфичность и относительную независимость МИИ, параметра, непосредственно характеризующего работу песенного генератора. В дальнейшей работе обращалось особое внимание на отклонения именно в данном параметре.

Идентификация и характеристика генов-кандидатов, затронутых мутациями в линиях с моторными отклонениями. Для 3 5 из 82-х отобранных линий была проведена процедура определения фланговой геномной последовательности, примыкающей к инсерции Р-элемента. Путем сопоставления последовательности фланговой ДНК с геномной базой данных по дрозофиле для 22 мутантных линий были успешно определены локализация и направленность /У£-транспозопа. Каждая из 22 проанализированных линий имела уникальную точку инсерции Лй-транспозона в одной из аутосом. В 15 линиях вставка транспозона произошла в некодирующих участках интронов и экзонов генов С/2, Dgp-1, Ext2/CG10731, lola, MESR4, Мар205, Mefl, Sps2, Treh, wdp, yps, CG1943, CG5807, CG6746, CG15630; в двух линиях в кодирующей области генов jumu, CG8708; в одной линии в кластере транспозонов в перицентромерной области; в четырех остальных линиях в той или иной степени удаленности от 5'-конца генов drl.jing, Hsrco, CG34460.

На основе анализа экспериментальных и биоинформационных данных по генам, затронутым вставкой Л/£-транспозона, были определены или предположены функции продуктов этих генов и их роль в развитии и функционировании организма. Результаты анализа отображены в сводной Таблице 3. В состав кодируемых генами-кандидатами продуктов вошли различные факторы транскрипции и трансляции, регуляторные РНК, белок, связывающий микротрубочки, рецепторные компоненты клеточной поверхности, а также различные ферменты клеточного метаболизма. Для 20 из 22 генов-кандидатов участие в моторных функциях показано впервые. При этом для 14 из этих 22 генов выявлены ортологи в классе млекопитающих, что делает перспективным использование данных, полученных на дрозофиле, для исследований на человеке, как, например, в случае с ранее описанным в литературе геном drl, также выявленным в текущем скрининге.

Таблица 3. Характеристика генов-кандидатов, предположительно затронутых у мутантов с измененными показателями моторной активности.

№ - числовой идентификатор _

Линия/ № Ген- кандидат Продукт гена Функция гена Локализация продукта гена в клетке Гомолог у человека

6225а/ 1 ... предположительно пиРНК —

3404а/ 2 CG15630 предположительно рецепториый компонент клеточной поверхности ЫСАМ

3328Ь/ 3 CG5807 предположительно мембранный рецептор гидрофобных агентов в составе липокалина развитие половых клеток, регуляция секреции ЬМВШ

3724/ 4 CJ2 транскрипционным фактор РНК-полимеразы II развитие мышечных органов ядро

5433-t3/12 Hsrco РНК, предположительно связывающаяся со сплайсосомой и рибосомой регуляция созревания пре-мРНК и белкового синтеза ядро, цитоплазма

5769/ 15 Sps2 предположительно синтетаза моноселенофосфата 2 синтез селеноцистеина цитоплазма ЯЕРНЗ

2169/ 20 MESR4 негативная регуляция Яая/МАРК сигнальных каскадов ядро

3389/ 27 CG6746 Тирозиновая фосфатаза — __ РТРЬ

4653/ 33 CG8708 бета-1,3- галактозилтрансфераза О-гликозилиро-вание белков аппарат Гольджи с юлил

2248/ 34 Drl предположительно тирозинкиназный рецептор направление роста нервных окончаний, \УШ-сигналш1г ЯУК

5180-t3/37 CG1943 — — —

5493/ 38 Jumu предположительно транскрипционный фактор Нейрогенез ядро РОХЫ1

7081/ 39 Yps трансляционный репрессор распределение факторов в формирующемся яйце и эмбрионе цитоплазма УВХ

663/ 51 Meß предположительно транскрипционный фактор развитие скелетных, гладких и сердечных мышц, регуляция активности ядро МЕР2

нейронов, определяющих суточные ритмы

3494/ 59 Jing предположительно транскрипционный фактор развитие трахейной и центральной нервной системы ядро АЕВР2

3290/ 63 CG34460 предположительно секретируемый защитный белок

843К/ 65 Dgp-1 предположительно трансляционный фактор элонгации ответ на стрессорные воздействия GTPBP

6387а-S2/67 Ext2/ CG10731 предположительно глюкуронозилтранс-фераза/компонент АТФсинтазы биосинтез протеогликанов/ре-гуляция транспорта протонов на мембране аппарат Гольджи и эндоплазма-тическая сеть /митохондрия ЕХТ2/ ATP5S

3979а-S2/69 Wdp предположительно рецептор клеточной поверхности направление роста аксонов плазматическая мембрана

5567а/ 71 Map205 белок, связывающий микротрубочки участие в ремоделировании тубулиновой сети цитоплазма МАР4

4262с-s2/80 Treh Трегалаза расщепление трегалозы мембрана TREH

5282Ь/ 82 Lola предположительно транскрипционный фактор регуляция роста нервных окончаний ядро

Локомоторная активность линий с локальным нокдауном генов-кандидатов. В

целях установления вовлеченности отобранных генов-кандидатов непосредственно в нервные механизмы реализации моторных функций проведено тестирование локомоторной и песенной активности линий дрозофилы со сниженной экспрессией генов-кандидатов в нервной системе дрозофилы.

Параметры локомоции были оценены у мух с нейроспецифичным нокдауном 10 генов: Sps2, CG15630, Dgp-1, CG6746, CG8708, CG34460, Meß, lola, jing, drl; параметры звукопродукции для 5 из этих 10 генов-кандидатов (Sps2, CG15630, CG6746, CG34460, Meß). Нокдаун генов осуществлялся посредством инРНК, синтезируемой через систему трансгенов GAL4/UAS. Было использовано 4 основных драйвера, определяющих синтез инРНК в нервной системе дрозофилы: elav-GAL4, appl-GAL4, nrv2-GAL4, tsh2-GAL4. Нейроспецифичный нокдаун каждого из анализируемых генов приводил к достоверным изменениям в локомоторной активности по одному или нескольким параметрам. Влияния нокдауна на моторную активность животных сильно зависели от супрессируемого гена и используемого нейроспецифичного драйвера (Рисунок 3). В большей степени варьировали

Длительность побежки, с

Ме/2

Частота инициации побежек, п за 100 с

Скорость побежки, мм/с

12 10 8 6 4 2

е^ ппй арр! »зЪ 663

е!ау пп/2 арр! гзЬ 663

12 10 8 6 4 2

СС6"46

V] ей_

тггСН 1 № Ж

е!ау пп/2 арр! 1вЬ 663

ХТГОР

пгу2 арр! <5Ь 3389 е^ пгу2 арр1 3389

СС34460

еи^пп/2арр! 151т 3389 хУРЯС

1 1

а р > Х/Ж- ПГГ

е!ау пгл/2 арр| 3290 е!ау пгу2 арр! гвЬ 3290

е!ау пп/2 арр! гзИ 3290

х УОРЧС

Е?

е!ау пп/2 арр! 3404а

8р$2

elav пгу2 арр! 3404а

х УОНС

1 - йя= Ж-

1 Л

......Я Шт

ю 8 6 4 2 0

"Х1Т11Г1 йзн

! ■ т пй г 1

е!ау пг\/2 арр! «бИ 5769 е!ау пп/2 арр! 5769

е!ау пгу2 арр1 гвЬ 5769

х УйЯС

Рисунок 3. Параметры локомоторной активности линий с нейроспецифичным нокдауном генов-кандидатов. Представлены данные по мухам, полученным от скрещивания драйверных линий е1т/арр1/п™2/1хИ-ОЛ 1Л с интерферирующими \ТЖС/ТКтР-линиями. Показаны средние значения и стандартные ошибки. Контрольные значения отмечены штриховкой. Два последних столбика на каждом графике соответствуют значениям параметра у Св и мутантной линии, в которой затронут соответствующий ген. Достоверно отличные значения представлены серыми столбиками (двусторонний тест рандомизации, Р<0.05). Отсутствующие значения на графиках соответствуют летальному эффекту нокдауна.

длительность и частота инициации побежки. РНК-интерференция генов-кандидатов часто вызывала противоположные изменения в этих параметрах под управлением разных драйверов. Скорость побежки в экспериментальных линиях оказалась менее вариабельным параметром. Для всех генов-кандидатов РНК-интерференция либо не вызывала изменений, либо приводила к снижению скорости побежки под управлением какого-либо одного из четырех драйверов. Исключением является ген CG6746, нокдаун которого под управлением сразу трех драйверов сопровождался снижением скорости побежки как и у мутанта по этому гену.

Анализ работы систем GAL4/UAS. На примере генов-кандидатов Sps2, CG15630 и Mefl было показано, что РНК-интерференция под контролем всех используемых драйверов приводит к снижению уровня экспрессии каждого из трех проанализированных генов у трехсуточных самцов дрозофилы (Рисунок 4). Однако величина супрессии существенно варьировала в различных комбинациях «драйвер-ген».

Sps2 CG15630 Mefl

1 7.....................................................................- £ 1 I------ х

0-8 I ^ 0-8 j j 0.jj j " I

° ! ' 2 1' « Я ° i > 1 1 I 1 > 1 §

«> с ra S " c 4 " c ™

Рисунок 4. Относительный уровень экспрессии генов CG15630, Sps2 и Mefl.

Представлены средние значения и стандартные ошибки по мухам с нокдауном и с Р-инсерцией, затрагивающей соответствующий ген. Достоверные относительно контроля (равного 1) отличия представлены серыми столбиками (двусторонний тест рандомизации,

Р<0.05, программа REST 2009).

Также была подтверждена нейроспецифичность экспрессии под контролем всех драйверов. Экспрессия гена флуоресцентного белка GFP под контролем elav- и appl-GAL4 обнаруживалась в мозге и брюшной цепочке, а под контролем tsh-GAL4 - только в брюшной цепочке (Рисунок 5).

Для Sps2 и CG15630 было установлено, что противоположные изменения в параметрах моторной активности при нокдауне этих генов под контролем разных драйверов не связаны с особенностями экспрессии нейроспецифичных драйверов в клетках глии. Нокдаун под контролем драйвера repo-GAL4, запускающего экспрессию инРНК локально в глиальпых клетках, не приводил к изменениям в моторной активности за исключением снижения частоты побежек в случае с геном CG15630.

В целом можно заключить, что все протестированные гены-кандидаты вовлечены в нервные процессы, ответственные за локомоцию. Однако реализация генами их функций обеспечивается уникальным в каждом случае пространственно-временным паттерном экспрессии в различных нервных клетках, что может объяснять, почему действие нокдауна

UAS-GFP

i'/W-GALJ UAS-GFP

4»

appl-GAL-t UAS-GFP

tsh-a4U UAS-GFP

Рисунок 5. Флуоресценция GFP в нервной системе эмбрионов дрозофилы на последних стадиях развития 13-16. Передняя часть эмбрионов направлена влево, брюшная

часть вниз. В качестве контроля взята родительская линия с трансгеном UAS-GFP без драйвера. Структуры, демонстрирующие GFP-флуоресценцию, частично размыты сильной автофлуоресценцией кишечника. Снимки сделаны с 20-кратным увеличением.

сильно зависит от ОАЬ4-драйвера, определяющего локализацию, стадию и интенсивность подавления экспрессии гена.

Песенная активность линий с локальным нокдауном генов-кандидатов. Для 5 генов-кандидатов (CG15630, Sps2, Mefi, CG6746 и CG34460) выполнена оценка влияния нейроспецифичного нокдауна на параметры ИП самца. Нокдаун всех протестированных генов-кандидатов приводил к отклонениям значений МИИ от нормы по одному или нескольким используемым драйверам (Рисунок 6). Самые выраженные изменения наблюдались у мух с РНК-интерференцией гена CG15630, подавление экспрессии которого вызывало существенное уменьшение МИИ под контролем Зх из 4х драйверов.

По биоинформационным данным CG15630 кодирует неизученный нейроспецифичный белок, который связывает другие белки. В составе гена выявлены консервативные последовательности, соответствующие доменам иммуноглобулина и фибронектина типа III (InterPro, ebi.ac.uk/interpro, accession number Q9VR25). Данные домены обнаруживаются в различных рецепторах на поверхности клетки и молекулах клеточной адгезии. Ортологом CGI5630 у млекопитающих является ген NCAM1, который играет важную роль в клеточной адгезии, клеточной пролиферации и миграции, росте аксонов и образовании проводящих путей, синаптической пластичности и регенерации. Функциональная характеристика доменов CGI5630 позволяет предполагать, что выявленные отклонения в моторном паттерне песенной активности при нокдауне гена могут быть следствием как дефектов развития, так и нарушений на стадии имаго.

Локомоторная и песенная активность мух при индуцированном нокдауне гена CG1S630 на стадии имаго. Чтобы выяснить, вовлечен ли ген CG15630 непосредственно в функционирование моторных систем и, возможно, непосредственно в работу песенного генератора, было проведено тестирование моторной активности мух с индуцированным нокдауном гена CG15630 на стадии имаго. Стадиеспецифичная РНК-интерференция у взрослых мух достигалась путем использования драйвера GAL4.ER, активация которым

165 135 4 105 •

75 т 45 I 15 4

^лителыиосп» посылки, мс

Ме/2

Ж 1

Частота шнщнашш посылок, и за МО с

Межвяоулк в ы * 'интервал, мс

44 40 36 32

в1ау пгЛ арр! 663

в!ау пп/2 арр! 663

е!ау пгй арр1 863

хтгар

®!ау пп/2 арр! (вЬ 3389

I ~С№44№1

г\г^2 арр! мЬ 3389

«1ау пп?2 арр! («¡1 3389

х \ЛЖС

в!ау пгу2 арр! 3290

е!ау пгу2 арр) гвИ 3290

€(}!$ 030

165 135 105 75 45 15

__ 60 • —------------

Щ'Ш&й

е!ау пгл<2 арр! 3404а

I Зр*2

48 44 40 36 32

е)ау пгу2 арр! 3404а

в!ау пгу2 арр! 3290

ХУОВС

пгу2 арр! 18И 3404а X УОНС

е!ау ппй арр! 5769

е!ау пп/2 арр! 5769

Ыау пгу2 арр! 5769 ХУРНС

Рисунок 6. Параметры песенной активности линий с нейроспецифичным нокдауном генов-кандидатов. См. подпись к рисунку 3.

иА8-трансгена осуществляется лишь в присутствии гормона эстрогена. Было определено, что уровень экспрессии СС15630 у взрослых мух при индуцированном нокдауне данного гена достоверно снижался и составлял 0.649 (стандартная ошибка ± 0.044) относительно контроля, также содержащегося на среде с эстрогеном. Индуцированный нокдаун СО15630 у взрослых мух приводил к отклонениям как локомоторных, так и песенных параметров в виде увеличения длительности и уменьшения частоты инициаций побежки, а также снижения МИИ, но не вызывал отклонений в частоте и длительности посылок ИП

(Рисунок 7), изменения в которых при конститутивных нокдаунах (Рисунок 6), видимо, связаны с дефектами развития.

Щ у

5 * С

2.5 2 1.5 1 0.5 0

>Контроль

• нокдаун Сб 15630

§ 8

10 ж 45

д и 43

5 2

6 1 С «Г ГС а 41

4 а <у И 39

2 41 I X 37

0 _яя1 2 35

9 т

6 » 8 ; = I 7 : з: х

; ! е

5 « £ 5

§ = 4 43 !

100

ё § 80 О

х 31 60

х> х ои

| 1 40

К и

2С о

5 с 20

Рисунок 7. Моторная активность мух при индуцированном нокдауне гена С015630 на стадии имаго. Показаны средние значения и стандартные ошибки. Достоверные отличия между опытными и контрольными мухами отмечены звездочкой (двусторонний тест

рандомизации, Р<0.05).

Морфологические дефекты в ЦНС дрозофилы при нокдауне гена СС15630 под контролем драйвера пгу2-ОАЬ4. Чтобы выяснить, аномальное функционирование каких нервных структур может быть связано с уменьшением МИИ при подавлении экспрессии СО!5630, были изучены структурные особенности ЦНС мух с нокдауном этого гена под контролем драйвера пг^2-ОАЬ4. РНК-интерференция С015630 под управлением этого драйвера вызывала выраженное сокращение МИИ при сохранении в норме всех остальных локомоторных и песенных параметров (Рисунки 3, 6). Визуальный анализ паттерна флуоресценции дорсальных нервных структур в 6 образцах центральной нервной системы при нокдауне гена СС15630 не выявил грубых нарушений в мозге, однако показал наличие дефектов в торакоабдоминальном ганглии. На некоторых образцах при 5-кратном увеличении не обнаруживалось жужжальцевого нервного сплетения (хиазма), либо оно было частично фрагментировано (Рисунки 8, 9). При 20-кратном увеличении на дополнительно извлеченных 7 образцах также можно было часто видеть, что локализация клеточных тел (предположительно глиальных) теряет упорядоченность в их взаимном расположении (данные не показаны).

Жужжальцевое нервное сплетение образовано коллатералями интернейронов, передающих информацию от сенсорных органов жужжалец к прямым крыловым мышцам, и нейритными ветвлениями мотонейронов этих мышц (ТптагсЫ, 8сЬпе1с1егтап, 1994; ТптагсЫ, МигрЬеу, 1997). Кроме того в области жужжальцевого сплетения обнаруживаются разветвления интернейронов уРЯб, чья активность отрицательно коррелирует с величиной МИИ. Известно, что удаление концевых головок у жужжалец сопровождается увеличением частоты биения крыла в полете (Ваги^ек й а1., 2013).

крыловой нейропиль

торакальные нейромеры

жужжальцевыи нерв

абдоминальный жужжальцевая ганглий хиазма

Рисунок 8. Паттерн флуоресценции в ЦНС двух контрольных образцов и двух образцов при нокдауне гена СО15630 под управлением пп?2-САЬ4. Даны изображения ЦНС целиком и области жужжальцевого сплетения в цифровом увеличении (5-кратное оптическое увеличение). Справа представлена общая схема строения ЦНС дрозофилы.

Масштабная полоска = 50 мкм.

Рисунок 9. Изображения области жужжальцевого сплетения в цифровом увеличении (5-кратное оптическое увеличение). Хиазма очерчена контуром овала. Стрелками указаны фрагментированные участки хиазмы. На образцах 5 и 6 дефекты не обнаруживаются.

Масштабная полоска = 50 мкм.

Соответственно, учащение импульсов в посылке ИП при нейроспецифичном нокдауне СО15630 также может определяться нарушениями в передаче сенсорной информации от жужжалец к прямым крыловым мышцам, чья активность отражается в параметрах ИП 1979). При этом сенсорные влияния могут идти напрямую на мотонейроны мышц или опосредовано через структуры песенного генератора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненная работа позволила идентифицировать у дрозофилы 22 гена-кандидата, участвующих в реализации моторных функций. При этом для 20 из них вовлеченность в моторные функции показана впервые. Для 10 генов была доказана необходимость их участия в нервных механизмах работы моторных систем. На примере гена СО 15630 показана возможность установления функциональных систем, для работы которых необходимы выявленные генетические детерминанты и нарушения в которых могут определять мутантный фенотип. Полученные результаты позволяют целенаправленно подходить к изучению функций конкретных молекулярных компонентов моторных систем. Возможности такого подхода можно увидеть на примере уже описанного в литературе гена Лг1 (РгасИст Л а1., 2010), который также выявлен в текущем скрининге и изучение которого привело к открытию ХУп^Яук-сигналинга и пониманию его роли в процессах нервной регенерации у млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Изменения параметров локомоторного поведения и звукопродукции в группе проанализированных 82-х Р-инсерционных мутантов дрозофилы происходят взаимосвязано. В длительности и частоте инициаций побежек и посылок импульсной песни ухаживания отражаются неспецифические нарушения, которые затрагивают регуляцию или базовые механизмы функционирования различных моторных систем. Скорость побежек, межимпульсный интервал и несущая частота импульса являются специфическими показателями работы соответствующих форм моторной активности.

2. Выявленные в результате скрининга 22 гена-кандидата кодируют мембранные белки, ферменты, регуляторные факторы и РНК, для 20 из которых участие в реализации ритмических движений показано впервые. Обнаружение у 14 генов-кандидатов ортологов у млекопитающих и человека предполагает возможность переноса результатов исследования молекулярных механизмов реализации моторных функций на более сложноорганизованные нервные сети.

3. Нейроспецифичный нокдаун для 10 генов-кандидатов подтвердил вовлеченность данных генетических детерминант в нервные механизмы, определяющие параметры ритмической моторной активности. Эффекты нейроспецифичного нокдауна могут повторять эффект мутации (drl), быть противоположными мутантному фенотипу (Jola), либо иметь специфический набор отклонений (Sps2).

4. Установлено, что ген CG15630 является специфической детерминантой, которая определяет надлежащее функционирование нервных сетей, формирующих моторный паттерн песенной активности самцов дрозофилы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ:

1. Панова A.A., Федотов С.А., Брагина Ю.В. Влияние социального опыта на локомоторную активность и поведение ухаживания самцов Drosophila melanogaster // Труды Томского Государственного Университета. - Серия биологическая. - 2010. - Т. 275. -С. 221-224.

2. Федотов С.А., Брагина Ю.В., Беседина Н.Г., Даниленкова Л.В., Камышева Е.А., Камышев Н.Г. Генетическое исследование моторных функций Drosophila melanogaster II Экологическая генетика. - 2012. - Т. 10. - №1. - С. 51-61.

3. Федотов С.А., Брагина Ю.В., Беседина Н.Г., Даниленкова JI.B., Камышева Е.А., Камышев Н.Г. Генетические детерминанты генерации моторного паттерна ритмических движений Drosophila melanogaster II Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова.-2013.-Т. 99.-№ 1.-С. 120-130.

4. Panova A.A., Bragina J.V., Danilenkova L.V., Besedina N.G., Kamysheva E.A., Fedotov S.A., Kamyshev N.G. Group rearing leads to long-term changes in locomotor activity of

Drosophila males // Open Journal of Animal Sciences. — 2013. - Vol. 3. - № 4B. - P. 31-35. -doi:10.4236/ojas.2013.34A2004.

ИЗБРАННЫЕ ТЕЗИСЫ:

1. Федотов С.А., Брагина Ю.В., Камышев Н.Г., Беседина Н.Г., Даниленкова JI.B., Камышева Е.А. Молекулярно-генетический анализ Р-инсерционных мутантов Drosophila melanogaster с нарушениями локомоторного поведения и звукопродукции // XIV школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, Москва. - 2010 г. - С. 61.

2. Федотов С.А., Брагина Ю.В. Влияние индивидуального опыта на характеристики песни ухаживания самцов Drosophila melanogaster II Конференция молодых ученых «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды", посвященная 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, СПб.-2010.-С. 114.

3. Федотов С. А., Брагина Ю. В., Беседина Н. Г., Даниленкова JI. В., Камышева Е. А., Камышев Н. Г. Генетическое исследование мутантов дрозофилы с измененными показателями моторных функций // XIV международное совещание и VII школа по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика JI. А. Орбели, СПб. - 2011. -С. 192.

4. Федотов С. А., Брагина Ю. В. Генетическое исследование моторных функций дрозофилы // Всероссийская молодежная конференция-школа «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященная 120-летию создания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины. Медицинский академический журнал, Т. 11, Спецвыпуск, СПб. - 2011. - С. 57.

5. Fedotov S.A., Bragina J.V., Besedina N.G., Danilenkova L.V., Kamysheva E.A., Kamyshev N.G. Genetic determinants of generating the motor pattern of rhythmic movements in Drosophila melanogaster II X East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems", Russia, Moscow. - 2012. - P. 15.

Подписано в печать 24.12.2013 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 658

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федотов, Сергей Александрович, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова

На правах рукописи

04201455915

Федотов Сергей Александрович

Молекулярно-генетический и физиологический анализ нарушений моторики у мутантов дрозофилы

03.03.01 - физиология 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Шуваев В.Т.

д.б.н. Камышев Н.Г.

Санкт-Петербург 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................15

1.1 Развитие представлений о ЦГМП.........................................................15

1.2 Морфо функциональная организация изученных ЦГМП............................24

1.2.1 Сердечный генератор пиявки.............................................................24

1.2.2 Пилорический генератор ракообразных...............................................26

1.2.3 Локомоторный генератор моллюска СИопе............................................28

1.2.4 Локомоторный генератор палочников..................................................29

1.3 Молекулярные механизмы функционирования и развития ЦГМП.................31

1.4 Дрозофила как модельный объект в исследованиях молекулярно-генетических механизмов моторной активности................................................42

1.5 Характеристика ритмических форм поведения дрозофилы.........................51

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................63

2.1 Тестирование моторной активности мутантных линий................................63

2.2. Определение локализации и направленности Рс1Ь-транспозона

в геноме..............................................................................................66

2.3 Система локального нокдауна генов-кандидатов......................................68

2.4 Количественная оценка уровня экспрессии генов-кандидатов.......................71

2.5 Флуоресцентная микроскопия.............................................................72

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.......................................................................74

3.1 Характеристика локомоторных отклонений у Р-инсерционных

мутантов............................................................................................74

3.2 Характеристика песенных отклонений у Р-инсерционных мутантов..............78

3.3 Идентификация мутаций в линиях с отклонениями

в моторной активности...........................................................................86

3.4 Характеристика генов-кандидатов, определяющих параметры ритмических движений.........................................................................88

3.5 Локомоторная активность линий с локальным нокдауном генов-

кандидатов........................................................................................119

3.6 Анализ работы систем GAL4/UAS, обеспечивающих

нейроспецифичный нокдаун..................................................................123

3.7 Песенная активность линий с локальным нокдауном

генов-кандидатов...............................................................................125

3.8 Локомоторная и песенная активность мух при локальном

нокдауне генов Sps2 и CGI5630 в глиальных клетках...................................127

3.9 Локомоторная и песенная активность мух при

индуцированном нокдауне гена CG15630 на стадии имаго............................129

3.10 Локомоторная активность самок дрозофилы при

нейроспецифичном нокдауне гена CGI5630................................................131

3.11 Морфологический анализ ЦНС дрозофилы при нокдауне

гена CGI5630 под контролем драйвера nrv2-GAL4......................................132

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................139

ВЫВОДЫ........................................................................................154

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................155

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

АЦП - аналого-цифровой преобразователь

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ДМСО - диметилсульфооксид

ДПИП - длительность посылки импульсной песни

ДПоб - длительность побежки

ИА - индекс активности

ИИП - индекс импульсной песни

инРНК - интерферирующая РНК

ИП - импульсная песня

МИИ - межимпульсный интервал

MIHI - мембранный потенциал покоя

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НЧИ - несущая частота импульса

п.н. - пар нуклеотидов

ПД - потенциал действия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЖГ - ротожелудочный ганглий

СП - скорость побежки

ТФ - транскрипционный фактор

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦГМП - центральный генератор моторного паттерна

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ЧИ - числовой идентификатор

ЧИ11И11 - частота инициации посылок импульсной песни

ЧП - частота побежек

AB - передний пейсмейкер (anterior burster)

АМРА- а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионовой кислоты (а-

amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) BDSC - Bloomington Drosophila Stock Center

BLAST - программа поиска нуклеотидных последовательностей в геномной базе данных Drosophila melanogaster (Basic Local Alignment Search Tool) CS - линия дикого типа Canton-S

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor)

EMS - этилметансульфонат (ethyl methanesulfonate) GAL.ER - химерный белок, полученный путем сшивания лигандсвязывающего домена эстрогенового рецептора человека и ДНК-связывающего домена GAL4.

Gi/o - G-белок, связывающий альфа2-адренорецепторы Gq - G-белок, связывающий альфа1 -адренорецепторы Gs - G-белок, связывающий бета-адренорецепторы

HCN - катионные неселективные каналы, активируемые гиперполяризацией (hyperpolarization-activated, cation nonselective) HLB - тельце гистонного локуса (histone locus body)

hnRNPs - гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins)

5-HT- серотонин (5-hydroxytryptamine)

IA- потенциал-зависимые быстрые выходящие токи

/са— кальциевые входящие токи

¡CAN- кальций-зависимый входящий ток

1са-т - подпороговые токи кальция

7h - токи, активируемые гиперполяризацией

/к-са - кальций-зависимыми токами калия

^k-leak - токи утечки калия

/kv - потенциал-зависимые токи калия

^nalcn- токи утечки натрия через NALCN-каналы

/ыаР - потенциал-зависимые устойчивые токи натрия

/NaR - возрождающиеся токи натрия

-^Nav— потенциал-зависимые быстрые токи натрия

П^-инозитолтрифосфатные рецепторы (inositol triphosphate receptors) /SK — Са2+-активируемые калиевые токи с малой проводимостью LP - латеральный пилорический нейрон (lateral pyloric) LRR - повтор богатый лейцином (leucine-rich repeat)

МАРК - митоген-активируемая киназа (Ras/mitogen-activated protein kinase) mGluR - метаботропные глутаматные рецепторы (metabotropic glutamate receptors)

NALCN - нечувствительные к тетродотоксину неселелективные катионные каналы (Na+ leak channel)

NCBI - интернет ресурс научной информации (National Center for Biotechnology Information)

NMDA - ]Ч-метил-Б-аспартат (N-methyl-D-aspartate) PD - пилорический дилататор (pyloric dilatator)

PEV - эффект положения мозаичного типа (position-effect variegation)

PY - пилорический нейрон (pyloric neuron)

RNAi - РНК-опосредованная интерференция (RNA interference)

RyR - рианодиновые рецепторы (ryanodine receptors)

sAHP - следовая гиперполяризация (slow afterhyperpolarization)

SERCA - кальциевый насос (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase)

shRNA - малые шпилечные РНК (small hairpin RNA)

SMW - вторая митотическая волна (second mitotic wave)

TKRPs - пептиды, родственные тахикинину (tachykinin-related peptides)

TTX - тетродотоксин (tetrodotoxin)

UAS - регуляторная последовательность, которая при связывании GAL4 активирует экспрессию элемента, стоящего за ней (upstream activation sequence)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования.

Исследование нервных механизмов, определяющих генерацию моторного паттерна ритмических движений, является необходимым для лечения моторных дисфункций и восстановления утерянной двигательной активности в результате повреждений нервной системы (Pearson, 2000; Marder, Bucher, 2001; Gordon, Whelan, 2006). Несмотря на определенные успехи в изучении генераторов моторного паттерна на человеке и других млекопитающих (Kiehn, Butt, 2003; Goulding, Pfaff, 2005; Andersson et al., 2012), исследования механизмов их работы на клеточном и молекулярном уровнях в составе нейронных ансамблей продвигаются крайне медленно и находятся на начальной стадии (Kiehn, 2011). В то же время для многих беспозвоночных животных дано исчерпывающее описание клеточной организации и механизмов функционирования центральных генераторов моторного паттерна (ЦГМП) различных форм ритмической деятельности (Arshavsky et al., 1998; Cymbalyuk et al, 2002; Marder, Bucher, 2007), что дает возможность проведения исследований молекулярных основ формирования и работы нервной сети генератора. Однако для модельных объектов с детально изученной морфофункциональной организацией ЦГМП, как правило, не существует готовых к использованию молекулярно-генетических методов, а также баз биоинформационных данных о генах и их продуктах. Вследствие этого сведения о молекулярных механизмах генерации моторного паттерна носят фрагментарный характер, а сама проблема остается крайне малоизученной. Однако в последние годы появились работы, в которых были описаны отдельные молекулярные факторы, необходимые для генерации моторного паттерна разных форм ритмических движений (Marder, Bucher, 2007; Ping et al., 2010; Lu, Feng, 2012). Успех этих исследований связан во многих случаях с использованием плодовых мушек Drosophila melanogaster либо непосредственно в опытах с изучением их моторной активности (Banerjee et al., 2004; Nash et al., 2002; Ping et al., 2010), либо как источник биоинформационных

данных о возможных молекулярных участниках работы и развития ЦГМП (Littleton, Ganetzky, 2000). Преимущество дрозофилы перед другими модельными объектами заключается в том, что для данного вида разработаны уникальные молекулярные и генетические методы, существенно расширяющие возможности исследования различных физиологических параметров, а также полностью секвенирован и подробнейше изучен его геном. Биоинформационный анализ позволяет оценивать функциональные свойства тех или иных структурных элементов генома и прогнозировать их роль в изучаемых процессах.

Исследование молекулярно-генетических основ генерации моторного паттерна ритмических движений у дрозофилы является актуальным и перспективным, так как между классами насекомых и млекопитающих имеется определенное сходство между функциональными характеристиками молекулярных продуктов, кодируемых генами ортологами в этих двух таксонах (Fradkin et al., 2010; Ping et al., 2010; Xiong et al., 2012). Подобное сходство не только позволяет раскрывать ранее неизвестные молекулярные детерминанты исследуемых физиологических процессов, но и обеспечивает параллельное исследование этих процессов одновременно у млекопитающих и дрозофилы (Iijima-Ando et al., 2009; Mallik, Lakhotia, 2010; Read et al., 2009). Кроме того, стратегия развития в современной фармацевтике все больше разворачивается в сторону поиска и создания агентов, специфически влияющих на конкретные молекулярные компоненты, участвующие в патологических процессах, что связано с более высокой эффективностью лекарственной терапии и меньшим количеством побочных эффектов (Zheng et al., 2006).

Во многих современных работах анализ моторных функций дрозофилы выполняется в целях выявления и изучения роли генов, участвующих в физиологических и молекулярно-клеточных процессах (Fox et al., 2006; Poeck et al., 2008). В то же время часто применяется и подход обратной генетики, когда изучение молекулярно-клеточных и физиологических механизмов моторной деятельности начинается с тестирования генетически модифицированных организмов (Moran, Kyriacou, 2009). И тот, и другой подходы были применены в

настоящей работе с целью создания отправных точек в исследовании нейрональных механизмов генерации моторного паттерна ритмических движений.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является идентификация молекулярно-генетических детерминант нервных процессов, ответственных за реализацию ритмических форм моторной активности у дрозофилы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

3. Идентифицировать затронутые мутациями гены и определить их молекулярные продукты по биоинформационным и экспериментальным данным.

Научная новизна работы.

Выявлены статистические закономерности в характере отклонений параметров локомоторной и песенной активности в группе Р-инсерционных мутантов дрозофилы. Впервые показана вовлеченность 22 генов дрозофилы в определении параметров как локомоции, так и звукопродукции, а для 10 из них подтверждено участие в нервных процессах, связанных с реализацией данных форм моторной активности. Впервые изучено влияние подавления экспрессии гена СО15630 в нейрональных и глиальных клетках на структуру моторного паттерна песни ухаживания самцов дрозофилы. Впервые выявлены структурные аномалии в центральной нервной системе (ЦНС) дрозофилы при нокдауне гена СС15630, которые могут являться причиной отклонений в моторном паттерне

песенной активности наравне с функциональными нарушениями, вызываемыми нокдауном гена на стадии имаго.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Транскрипты 5 генов-кандидатов, отобранных в результате скрининга по параметрам моторной активности, вовлечены в нервные процессы, которые в трех случаях связаны с определением структуры моторного паттерна песенной активности дрозофилы (Sps2, CGI5630, CG34460), и в двух случаях с определением параметров как локомоторных, так и песенных моторных актов животного {Meß, CG6746).

3. Экспрессия гена CGI5630 в нейронах необходима как для развития, так и для функционирования структур, предположительно опосредующих регуляторные влияния на ЦГМП песни ухаживания со стороны сенсорных органов.

Теоретическая и практическая значимость.

Проведенное генетическое исследование моторной активности у дрозофилы позволило определить ряд значимых молекулярных детерминант нейрональных механизмов генерации моторного паттерна ритмических движений, которые на фоне малочисленности сведений о молекулярных процессах, определяющих работу ЦГМП, могут быть использованы в качестве отправных точек в исследованиях в данной области. Наличие у 14 из 22 описанных в работе генов-кандидатов ортологов у млекопитающих и человека предполагает возможность переноса в дальнейшем результатов исследования молекулярных механизмов работы ЦГМП на более сложноорганизованные нервные сети, что может обеспечить разработку новых стратегий лечения моторных дисфункций на

молекулярном уровне. В частности, исследование влияния продукта гена CG15630 на нервные сети, опосредующих передачу сенсорной информации на моторные системы мухи, могут послужить отправной точкой в изучении молекулярных механизмов эффекта тренировок на скорость восстановления утраченной активности у млекопитающих.

Апробация работы.

Основные положения и результаты диссертации были представлены на 11 российских и международных конференциях: Шестом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Суцак, 2010); Первой Всероссийской молодежной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском государственной университете (Томск, 2010); XIV школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2010); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010); Конференции молодых ученых «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды", посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010); Седьмом международном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Суцак, 2011); XIV международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика JI. А. Орбели (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященной 120-летию создания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2011), X East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems" (Russia, Moscow, 2012).

Вклад автора.

Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем. Лично автором выполнена идентификация, затронутых мутациями генов, осуществлена оценка экспрессии

генов-кандидатов методом количеств

Информация о работе

Федотов, Сергей Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.03.01

Диссертация

Молекулярно-генетический и физиологический анализ нарушений моторики у мутантов дрозофилы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы