Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локус-направленный мутагенез у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Локус-направленный мутагенез у Drosophila melanogaster"

академия наук рсфср институт общей генетики им. н.и.Вавилова

На правах рукописи

хатшова марина александровна

УДК 575.24:595.77Х. 4

локус-надравленный мутагенез У ВЙОЗОРНИЛ ЦЕиШОСАЗТЕК. (03.00.15 - генетика)

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва - 19э2

Работа внпмнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН -, г.Москва.

Научный руководитель : доктор биологических наук

Т.И.Герасимова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Л.И.Корочкин доктор биологических наук Н. А.Чуриков

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится "_"_ 1992г.

в_час. на заседании Специализированного совета

(Д 002.49.01) при Институте общей генетики им.Н.И.Ваваюва РАН по адресу: г.Москва,ул.Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН.

Автореферат разослан "_"_ 1992г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

вквдение

В обычных условиях транспозиции мобильных элементов в инбредных линиях происходят крайне редко, с частотой менее ,чем 10 (.Ананьев, 1982; ), поэтому исследовать их практически невозможно. Однако,в настоящее время обнаружены генетические системы, где транспозиционные события наблкднвтся значительно чаще (-Ю-2-Ю-4), что открывает зозможность их анализа. Наиболее хорошо изучены системы гибридного дисгенеза: P-u, I-R, Н-Е (Kidvrall et al.,1987; Bregliano et al.,1981; Jannopouloa et al.,1987). В этих системах перемещаются отдельиге мобильные генетические элементы (МГЭ)- транспозазо-зависимые Р или Hobo и ретротранспозоны LlNE-типа - I-элемэнт. Нестабильность й системах гибридного дисгенеза, как правило, затухает после третьего поколения. Помимо систем гибридного дисгенеза, в литературе описаны вша и другие системы генетической нестабильности. Например, в нестабильной ис-хрогасоме и ее производных перемещаются ВДГ4 и НоЪо-элзиент (Lim, Judd,1986;Lim,1988 ), • в Мутаторной иииии - ВДГ4 (Ким Беляева, 1386; Ким и др.,158Э), в система продленной нестабильности - ЬЩГ Сталкер ( Герасимова и др., 1990; Georgiev at al., 1990).

Описана нестабильность ovoD -мутаций, где авторы наблэдали

ОДНОМОМеНТННе Перемещения ВДГ4 И copia (Unvel-Ninio et

al., 1989). . Одномоментные множественные транспсэации различных семейств мобильных элементов - транспозиционные взрывы показаны В системе ctUR2 (Ceraaioova et al., 1981). Кроме ТОГО, множественные транспозиции наблвдались в инбредных линиях (Гвоздев, Кейданов,1986; Kaldanov et al.,1990; Blemont et al.,1986).

Транспозиционные события можно индуцирсвать такими воздействиями, как инъекции экзогенной ДНЕ (Гершензон, Шандала, 1935;Набирочкин и др. ,1987) .тепловой шок CJimakovic et al., 1986) или МИТОШЩИН С (Georgiev et al., 1990).

Однако, в настоящее время имеется не так много систем, где поддерживается нестабильность, и , з связи с этим( представляется актуальным создание новых систем генетической нестабильности, в которых можно было бы генетическими' и молекулярными методами изучать механизмы траншииций МГЭ и локус-направленного инсерционного мутагенеза.

Цель . и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование локус-направленного (специфичного) мутагенеза в новой системе генетической нестабильности, которая возникла при

2 а.4

скрещивании самцов линии у w с самками C(i)DX,yf, несущими сцепленные Х-хромосомы. В связи с s там, были поставлены-следу-. щие задачи: 1 .Определение частоты мутагенеза, его зависимости ■'• от направления скрещивания и использования самок других лабораторных линий; 2.Характеристика полученных мутаций - их локус-спецнфичность, новизна, генетическая нестабильность! 3.Анализ Х-хромосш полученных мутантных линий с помощью метода гибридизации in situ с различными МГЭ - выявление их транспозиций; 4.Изучение некоторых мутационных изменений с помощью блот- анализа.

Научная новизна работы■ В результате проведенных экспериментов выявлена новая система генетической нестабильности. Обнаружено , что скрещивание деух лабораторных линий y2wa4 и С( 1 )ВХ ,yf приводит к мутагенезу с частотой 0,7-1,0*Ю-3 во второй и третьем поколениях. Мутагенез наблэдается только в том случае, если в скрещивание вводят самцов линии

2 =4

у w и затухает после третьего поколения. Он носит явно выраженный локуо-специфичный характер и возникает как в соматических, так и в половых клетках. Показано, что хотя имеется сходство с системами гибридного дисгенеза, е данную нестабильность не вовлечены мобильные элементы, ответственные за гибридный дисгенез - Р, Hobo, I. Большинство мутаций были необычны И не описаны ранее(Lindsley, Grell, 1968). Наибольший интерес представляют выявленные транс-регуляторные мутации -Eni wa4) и Su( Wa4). Эти гены были локализованы генетически. Sut wa4) супрессЕрует различные инсерционные мутации локуса white .вызванные встройкой различных МГЭ в интроны локуса,что дает основание предполагать механизм действия, связанный со сплайсингом.'

В созданной системе генетической нестабильности обнаружены транспозиции МДГ4 и ЫДГ Сталкера. Это указывает на новый , явно множественный характер транспозиционных событий в данной системе.

Обнаруженную нестабильность мокно индуцировать скрещиванием самцов y2wa4 с самками некоторых других линий: 23.5*! Df(l )Pgd-bt/FU4.

Таким образом, создана новая система генетической

нестабильности и выявлены новые особенности нестабильности генома.

Практическая ценность работы•В процессе данной работы создана большая коллекция мутантных ЛИНИЙ D.melanogaster, не известных ранее. Это является фундаментом для проводимых в настоящее время молекулярно-генетических исследований. Полученные данные открывают новые возможности для анализа механизмов транспозиций и влияния МГЭ на уникальные локусы дрозофилы. В то же время, поиск новых НГЗ, вовлеченных в описываемую систему ген е тическ о й нестабильности , будет способствовать выявлении новых удобных векторов для генноинженерных исследований.

Аппробадия работы•Результаты работы были доложены на межамериканской конференции по дрозофиле (Mid-amarica Drosophila conference, • 1990, Baltimore, USA), на 12-Й Европейской конференции по исследованию Дрозофилы (12-th EERC, Mainz, Germany, 1991), на межлабораторном научном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен им. Н.И.Вавилова (Москва, 1ЭЭ1). .

Структура и об'ем работы■ Диссертация изложена на 139 стр., включая 13 таблиц и 11 рисунков и фотографий, и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов.

Результаты.

1 .Обнаружение мутагенеза в генетических скрещиваниях.При

2 а.4

скрещивании двух стабильных лабораторных линий у w и 0(l)DX,yf была обнаружена генетическая нестабильность. В первом поколении после скрещивания мутации не появлялись (Табл. 1). Они возникали на протяжении второго к третьего поколений. Поскольку анализ велся при скрещивании с сачками, несущими сцепленные Х-хромосомы, то большинство выявленных мутаций были локализованы в Х-хромосоме. Среди них были как рецессивные, так и доминантные. На 54.193 проанализированные хромосомы в F2-F3 зарегистрировано 19 видимых сцепленных с полом мутаций. При этом, частота мутагенеза составила 0.7«10-3 (Тайл.1). На 36.400 просмотренных хромосом, в четвертом и пятом поколении не обнаружено ни одного мутационного события. Итак, было показано, что мутагенез индуцируется в результате скрещивания самцоз линии y2wa4 с самками CdiDX.yf без использования дополнительных факторов шщукции мутагенеза (Табл. 1). В связи

з

с етим,возникает вопрос о дестабилизации в реципрокном скрещивании, в котором самцов из линии С(1)ЕХ,у£ скрещивали с самками у2 иа4. Зо втором и третьем поколениях протестировали 17.998 хромосом и, при атом, не обнаружили ни одной мутации.

Таблица 1

Результаты скрещивания самцов у2иа4 с самками СП шх,у?»несупрами сцепленные Х-хромосомы-

Л Схема скрещивания Число Число мутац. Частота

аш провнал событий мутаге-

!

та особей Ода Клает Ыозаи ков. неза

I . Р ?С11 )Ъх,у{х6у2^ - - - - -

Р1 -//- 11.804 0 0 0 <0.08

Р2-РЗ -//- 18.019 8 0 5 0.7

и : Р $С11 )Бх,у£хс&2«а4 - - - - -

Р1 -//- 10.234 0 0 0 <0.09

-//- 12.012 1(31* 3 0.6

ш Р ^СПЮх^хву2,/-* _ - - - -

Р1 -//- 15.025 0 0 0 <0.07

24.162 10 1(3 )* 10 0.95

На основании выше описанных опытов можно сделать вывод, что активный мутагенез индуцируется в результате скрещивания самцов у2«а4 с сшпсами С( 1 шх,у? без использования каких-либо факторов усиления мутагенвзЕ. Поскольку спонтанная индукция мутагенеза в описанном скрещивании представляла несошенный интерес, то мы иссгедовали этот феномен более подробно.

2.Характеристика ликий^. скретагаания которых приводят к дестабилизации гтиома.Как уже отмечалось, для индукции мутагенеза в опиоааасмой аистам© аагно направлен:«о скрещивания.

Мутагенез наблццается лишь в том случав, когда в скрещивание

2 а.4

вводят самцов линии у w . Это роднит данную систему с ранее описанными Р-М и I-R системами гибридного дисгенэза (Kidwail et al; 1977; Ersgliano, 1981). Поэтому необходимо было проверить, не относится ли описанная нами система к известным системам гибридного дисгенеза. С этой целью, были определены цитотипы исходных лабораторных ЛИНИЙ y2wa4 и СС1 )DX,yf.

Для определения наличия полноценных копий Ново-элвмента в используемых линиях была поставлена гибридизация геномных ДНК различных линий, обработанных рестриктазой Xhol, с меченным фрагментом мобильного элемента Ново. Результаты блот-анапиза показали, что линии y2v?4 и CdlDX.yf не содариат полноценных копий Ново-элвмента, что исключает полностью btoî теп дисгенеза в нашей системе.

Принадлежность используемых линий к Р- шvs. М- цитотипам определяли по способности индуцировать мутационные переходы в локусе singad в линии у1 snw;bw,st, которая , как известно, содержит 2 копии дефектных Р-элементов в локусе singed (Roiha at al., 1988). Нестабильность апм-аллеля индуцируется лишь при внесения в геном полноценных копий Р-элемента, поскольку сама линия у sn* ;bw,at ИХ ES СОД8ПКИТ (Rubin, Spradling, 1982). Самок линии y1snw;bw,at ( i/ -тип) скрещивает с самцами исследуемых линий. В качестве контроля проводили скрещивания с самцами I?-линии, которая имеет сильный Р-цатотш. В результате проведенных скрещиваний было покагано, что обе исходные линии на индуцируют мутационные переходы в локусе singed, т.е. относятся к линиям М-типа.

Методом гибридизации in aitu мы выявили наличие I-элемента в геномах обеих линий и, следовательно, обе они имеют 1-цитотип. Таким образом, мы определили, что обе исходные линии y2wa4 и Ct i )DX,yf, используемые при получении описываемой сястеш генетической нестабильности, не имеют полноценных копий Ново-влемента, обладают М- и 1-цитотшами.

Общеизвестно, что для систем гибридного дисгенеза, как правило, характерна стерильность самок и самцов первого поколения, выражающаяся в атрофии гонад. Поэтому мы проанализировали стерильность самок и самцов первого поколения после скрещивания самцов y2v?4 с саыкаии C(l)DX,yf. Стерильность самок определяли оперативным путем, англизируя гснедн (исследовали 105 самок). 3 случае самцов, кх

фертильность контролировали индивидуальными скрещиваниями ( проанализировали 73 самца ). Данными методами стерильность самок и самцов нам обнаружить не удалось.

Итак, на основе получениях результатов мы приходим к заключению, что описываемую систему генетической нестабильности нельзя отнести ни к одной из трех известных систем гибридного дисгенеза.

2.Другие дестабилизирующие скрещивания-При .исследовании полученной нами системы генетической нестабильности возникал вопрос о возможности индукции мутагенеза путем скрещивания самцов с самками других лабораторных линий. Поскольку

недавно была описана индукция мутагенеза в процессе скрещиваний ОСОбеЙ ДВУХ лабораторных ЛИНИЙ (1 )Р8й-Ь:/т4 и у2 в с1 ( Георгиев и др., 1989; Герасимова и др., 1930 ), то мы попытались индуцировать мутагенез путем скрещивания самцов у2»/а4 с самками линии 1)? (1 >Р£Ч-кг/РМ4. Во втором и третьем поколениях было проанализировано 38.082 Х-хрокосом и обнаружено 6 одиночных сцепленных с полой мутаций и два мозаика ( Табл.2). Таким образом, и в этом скрещивании наблкщалась дестабилизация генома. Однако, частота мутагенеза в 3-5 раз была виде (0.2'

10~3) ,чем в исходном скрещивании' ( а"у2™а4х С(1)ВХ,уГ).

Таблица 2.

Результаты различных дестабилизирушцих скрещиваний.

№ опы та Схема скрещивания Чксло проанал особей Число мутационных событий Частота мутагенеза,, • 1СГ3

Один. Класт. Козаи-ков.

I Р рП£(1 )Рес1-Ь:/га4х >2 а4 оу и Р1 оу2*а4/РМ4ха£2*а4 Р2-РЗ ^хауы* - 14.103 за.082 0 б 0 0 0 2 <0.07 0.2

II Р о23.5*/СуХй^2ма4 о+/у V Хау V Р2-РЗ 5>Уу2иа4 12.302 40.353 0 40 0 9 0 13 <0.08 1 .5

III Р ^ОгойопЕхау'''«^ , , 2 <-2 а4 Г2-ГЗ сХоуг;га! _ 9,009 0 ° 0 0 0 <0.1 <0 .09

Кроме того, мы протестировали линию 23.5*, содержащую много копий НоЪо-элемента (Jannopoulos et.al.,1967). Схема скрещиваний указана в Табл.2. Среди 40353 особей во втором и третьем поколениях обнаружено 40 одиночных мутаций, Э кластеров и 13 мозаиков ( Табл.2). Частота мутирования в этом опыте составила 1,5 1СГ3 . Спектр полученных мутаций совпал с таковым в исходном скрещивании и будет описан далее. Учитывая спектр возникающих мутаций, их нельзя обЬяснить только hobo-дисгенезом. Следующая проанализ1фованная линия - это лабораторная линия Oregon R (Табл.2). 3 этом случае , на 16530 исследованных особей не выявлено никаких видимых изменений.

Таким образом, в результате исследования индукции мутагенеза в линии у2 wa4, мы можем сделать вывод о том, что мутагенез индуцируется при определенных генетических скрещиваниях, а именно , когда е скрещивания вводят самцов линии у w14 и самок других линий. Причем, степень мутагенеза определяется линиями, из которых используют самок.

4 .Характеристика мутация полученных в данной

системе.Иутагензз в нашей системе обладает высокой локусной

специфичностью. Наряду с мутациями в таких часто мутирующих в

других системах локусах, как yellow, white, forked, были

получены новые, ранее нв описанные мутации: Ss, Sw,

-4 i/i а.4 lil

Rum, En( w ) , Su(w ) .Фенотшшческое описание полученных в

данной системе мутаций и их локализация представлены в Табл.3.

Таблица 3.Основные мутации, возникающие в дестабилизирующих скрещиваниях.

Локус Локали аация Типы алле- Фенотипическое проявление мутаций Ког HV- оди ноч 1-ВО гаиий к ласте о

yellow 1-0. 0 1М У Цвет тела и крыльев желтый, волоски и щетинки коричневые. 5 КЗ)*

white 1-1.5 1М w гм W ЗМ w Глаза белые. Глаза светло-желтого цвета. Глаза темно—сливового цвета. 8 6 1 0 1 (Б)

forked 1-56.7 fmM Фенотип соответствует стан- 2 0 j

^eM дартному описанию аллелей со средним мутантным лрояо-лением(1_1пс151еу,Сге11, 19£в) Фенотип, соответствует сильно выраженным мутантам. -> 0

d ivers 1-28.1 dvr Фенотип соответствует стандартному описанию. г 0

Small eyes 1-33.7 SeM Часть глазных Фасеток редуцирована, глаза уменьшены, голова слегка видоизменена. 4 0

Rumpling wings 1-8.6 Rum Одно или два крыла надорваны, смяты, имеют пузыри. 6 1 (3)

Srnal 1 wings 1-33. £ о M S.mw Крылья укорочены и шире, чем у дикого типа. Гомозиготные самки - летельны. 1 0

Enhancer of a4 w £-27. 8 En(w ) Усиливает проявление м аплеля: у гетерозигот глаза желтоватые, у гомозигот — белые. 0 1 (3)

Supres sor of a4 w 3-30. 0 Su(waV <\ У гомоз и гот и гете ро з и гот глаза тепно-зииневые.Супрес .а а4 bf сирует аллели и , и , и 3 1 (5) 1 <35

Hairless 3-69. 5 HM Фенотип соответстзует стандартному описанию. Гомозиготы летальны. 6 0

Glued 3-41. 4 61M Фенотип соответствует стандартному описанию . з 0

*В скобках указано число мутаций в кластере.

5.Распределение мдг 1.2,3.4.Из описанного выше следует, что в данной системе генетической нестабильности был получен целый ряд мутантных линий. Для того, чтобы проверить, связано ли появление мутаций с транспозициями мобильных элементов, были провэдены эксперименты по гибридизации in situ, с помощью этого метода определяли локализацию МДГ1, МДГ2, ЩГЗ, ШЕГ4 в X-хрокоссмах полученных мутантов, а также исходной линии у wa . Полученные результаты суммированы в Табл.4.

При исследовании Х-хромосом мутантных линий в анализ

брались 5-10 личинок из разных поколений. Возможность

классического кроссинговера Х-хромоссмы / с другими X-

хромосомами была исключена, поскольку полученных мутантных

самцов скрещивали с самками cii)DX,yf , Еесущзмз сцепленные

Х-хромосомы, ■ а при получении гомозиготных мутантных линий

использовали -'шнм» Df (1 )Pgd-kz/FU4, имеющую множественную

2 а4

инверсию в Х-хромосоме. Наличие маркеров у з « позволяло избежать возмонность засорения. Таким образом, анализ X-хромосом полученЕнх мутантов мог дать объективную картину предполагаемых транспозиционных событий.

При рассмотрения: данных, представленных в Табл.4 мы видим, что расположение МДГ1; №2, МДГЗ в Х-хромосомах всех тестируемых линий одинаково и идентично родительской Х-хромосоме y2wa4. При исследовании распределения МДГ4 были обнаружены как экащзин ,так и транспозиции МПГ4 в некоторых мутантных линиях.

6.Транспозиции МДГ4.Эксперименты по гибридизации in situ показали, что общее количество сайтов МДГ4 на геном линии y2wa4 составляет 7. Кашина распределения МДГ4 носит несколько иной

~ 1МЗ 1М1 еУЗ

характер (Табл.4), чем ВДГ1,2,З.Так б случае y1B-VBlf y2wa4f 2, y2wa4fsM4 появляется дополнительный сайт в районе локализации forked локуса - 15F. Это указывает на то, что, по-видимому, произошли транспозиции ВДГ4 в район лскуса forked, что и индуцировало все три forked мутации. Мутация inM2 была клонирована и в районе локализации классического аллеля f1 обнаружена вставка ЗДГ4 (К.Ховер, Т.Герасимова, В.Корсес, личное сообщение). Кроме того, у мутанта y2wa4Sw на Х-хромосоме появляется дополнительный сайт для МДГ4 з 16В районе. .

Выявлены также и случаи вырезаний для МДГ4 . Примером является y2wa4fnK2 мутантная линия, для которой обнаружено исчезновение родительского сайта 18F (Табл.4). А у у+-ревертантов

Локализация мобильных элементов в Х-хромосомах у2\уа4 линии и ее мутантных производных

Таблица 4

Расположение мобильных элементов

дотт мдг! | мдгз | мдгз | мдач

9А;10С;20А | 6А;20В | 6В;8Е;10А;1ЭА | 1 В;ЭВ;4Г>; 15Р; 16В; 18Р;20А

2 а4 у п

/V4

у1М2„а4

у2*а4<1УГМ1

угу/а^7Г+

уг«а48вМ1

угпа4ИШ1МЭ уг№1НЭ

у2«а43«Ы

у+2*а4;8и(*а4) уШЭ^ЧШ

у1МЗда1М1 £еМЭ

у2Иа4гшМ2

у2„а4^М4

в в я в я я а в в в к ш — — в я

Б я в о в ш И я в И в в в

а в в в а я в я а в н в — — а а

в а в в в я в я я я я в — — в в

в в в в Я в в в я в в п — — в в

в я И а я я в в в в И в — — в в

в а в в ' в я в в в в в в — — в в

в в я а а в в в в в в в — '— а в

я в в и в в с в в в в а — в в

И а ш в в в в т а в в 19 - — в в

ч

19 в в ■а п в я я в в в В в в в

*

В ¡в в в га в в т ' в — в В в ■

И в в в . И □ я в в а в а в

* ч

п я И в в в в в в в в в а в

ч п

а в 13 ш № в в в в в в в в в

ч

я в в 13 и в в в в в я а в я в

у+Аа4 и y+2wa4;Sulwa)M1 наблвдавтся эксцизии ВДГ4 из района 1В

2 +

локуса yellow. Таким образом, генетическая реверсия у — у коррелировала с вырезанием МДГ4 из района 1В локуса уэИом.Полученнные у^-ревертанты были исследованы на молекулярном уровне, что будет описано в самостдятельном разделе. При анализе остальных мутантных производных перемещений МДГ4 обнаружить не удалось. Даже в случае аллельного перехода от у2 к yl(y1M2wa4) сайт в районе 1В локуса yellow для ЫДГ4 сохранялся.

Таким образом, из выше изложенных данных следует, что в описываемой системе генетической нестабильности происходят отдельные транспозиции и эксцизии МДГ4. Однако, они не объясняют Есех случаев мутагенеза в данной системе. По-видимому, можно предположить, что в ней происходят транспозиции еще одного или нескольких мобильных элементов.

? .Транспозиции МДГ Сталкера. При помощи метода гибридизации

in situ мы обнаружили в исходной родительской линии у w вне

хромоцентра 18 сайтов мобильного элемента Сталкера, ранее

открытого в нашей лаборатории (Georgiev et al., 1990). На ■ X-

хромосоме линии у2 wa4 зарегистрированы три сайта • Сталкера -

13С,17В,20. Аналогичные сайты гибридизации Сталкера были

выявлены для проанализированных Sw, dvr, y2w3U2- мутантных'

2 ЗМ1 _

линий. Однако,для у w -мутанта обнаружено появление копии

Сталкера в районе 30 локуса white. Таким образом, мы видим, что

v3U1-мутация коррелировала с появлением Сталкера в районе ЗС,

1М2 ЗМЗ

где локализован локус white. А для у w мутанта показано вырезание Сталкера из района 17 В при сохранении двух других родительских сайтов - 13С и 20. В данном случае не наблвдается корреляции между появлением генетической мутации и эксцизией Сталкера. Следовательно, данные по гибридизации in situ позволяют заключить, что в нашей системе, наряду с транспозициями МДГ4, происходят транспозиции и другого МДГ -Сталкера.. Тем не менее,-^нк-перемещения №4, ни перемещения Сталкера не позволяют объяснить все случаи мутагенеза. По всей вероятности, можно предположить участив какого-либо нового мобильного элемента одновременно с ВДГ4 и Сталкером в индукции мутагенеза описываемой системы

8.Молекулярный анализ мутационных события в локусе yellow.Получянтшя в нашей системе у" -ревертантк и у1 -мутанты были проанализированы блот-анализом по Саузерну. При их

исследовании геномную ДНК обрабатывали рестриктазами BamHi -

SalGl и гибридизовали с ДНК рекомбинантного фага ASoi33,

содержащего весь локус yellow (Campuzana et al. , 1SÖ5 1 . В

исходной лшши присутствует полноразмерный МДГ4 в районе локуса

yellow, у у+-ревертантов наблюдается вырезание МДГ4 с

сохранением одиночного ДКП. В то же время, у ylalwa4~ к

у1Ы wlul-мутантов изменений в локусо yellow не обнаружено по

сравнению С контрольной линией Oregon R, т.е. В локусе yellow

данных мутнятных линей отсутствует МДГ4. Кроме того, была

проанализирована исходная родительская линия СП )DX,yf. Она

содержит точечную мутацию в районе локуса yellow, поэтому

наблюдаемая для нее картина распределения различных фрагментов

ДНК аналогична той, что обнаружена для контрольной линии Oregon

R.B ходе работы была исследована мутантная линия y1M2wa* .Для

нее было показано сохранение ВДГ4 в районе исходной мутации уг.

Итак, молекулярный анализ / -ревертактов показал, что появление

у+-реверсий сеяззно с гксцизияш ВДГ4 при сохранении соло-ДКП.

В то ко время, аллельный переход от у2 к у1 происходит либо с

сохранением ВД74 в районе локуса yellow, как в случав yla2wa4

мутанта, либо без видимых изменений в районе■ локуса yellow по

сравнению С контрольной лишка Oregon R, как В случае y1U1wa4-

1U3 а4 и у w -мутантов.

Обсуждение результатов.

Полученные в описываемой работе данные позволяют сделать вывод, что в результата .скрещиваний двух стабильных лабораторных линий у2ыА и ctl)DX,yf, обладающих М-,1- и Е-цитотЕпами, происходит индукция мутагенеза с частотой 0,7 10"3. Описанная генетическая система характеризуется рядом особенностей, отличающих ее от систем' гибридного диагенеза и других известных систем нестабильности. Это,во-первых, отсутствие продленности: мутагенез шел только во втором и третьем поколениях. Во-вторых, зависимость от направления скрещивания: мутагенез наблщцался лишь при скрещивании самцов y2wa4 с самками ccimx.yf. Эти черты напоминают свойства систем гибридного дисгенеза (Kidwell et al.,1977j Bregliano et al. ,198t I. В то же время, следует отметить ряд особенностей, отличающих полученную систему от известных типов гибридного дисгензза, но делающих ее похожей на другие системы генетической нестабильности (Ким,Беляева,1986;Ким и др., 1989;Георгиев и др.,1§89; Герасимова и др., 1990;Lim, 1979;

Lim, Judd,19&6;Lim, 1963;Uevel-Ninio, 1969 ). ЭТО Отсутствие гонадной стерильности как у самок, так и у самцов. А также возникновение мутаций как в половых, так и в соматических клетках, причем, на ранних стадиях эмбриогенеза. Мутации,возникающие в описанных скрещиваниях, относительно стабильны - реверсии и аллельные переходы были обнаружены лишь для некоторых локусов.Мутагенез в описываемой системе обладает высокой локусной специфичностью. Мутации возникают в таких часто мутирупцих локусах, как yellow, white, forked, а также в совершенно новых,ранее не описанных генах - Se, Sw, Rum,

al U

Sut w ) И ДРУГИХ.

Однако, следует заметить, что мутагенез удалось

активировать не только в скрещивании самцов y2wa4 с самками

С( 1 шх ,yf ,но и с самками других лабораторных линий.

Причем,частота возникающих мутаций определяется линией, самки

_ ___ 2 а4 »,

которой- скрещиваются с самцами линии у w .в связи с этим,

лабораторные линии по.способности индупяравать мутагенез можно

разделить на три группы: сильные активаторы мутагенеза (

C(i)DX,yf/Y; 23.5*); слабые активаторы мутагенеза

(Df(1)Pgd-kz/FU4)s линии, не способные индуцировать мутагенез

(Oregon R).

Как уже отмечалось выше, в нашей системе мутации часто затрагивают локус forked, который является "горячей" точкой для МДГ4 (Ким,1986;Согсез,1939;Kim et al.,1969,1991 1.Одна ИЗ полученных мутаций г42 была проклоиирована и в районе локализации классического аллеля f1 обнаружена вставка МДМ (К.Ховер,Т.Герасимова,В.Корсес, личное сообщение). Это говорит о том,что данный район, по-видимому, является специфичным для ВДГ4. Подобная специфичность была ранее показана в системе

MR2

транспозиционных взрывов et для локуса out и ВДГ'4 (Герасимова и др.,1983;Мизрохи и др., 1985а; Gerasioova et al. , 1984b; il izrokhi et al.,1985; ЧурИКОВ ИДр.,1987). КрОМв ТОГО, в ходе .молекулярно-генетичеекмх исследований транспозиций Р-элемента показано, что Р-элемент предпочтительно встраивается в 8-нуклеотидную последовательность. О'Хара и Рубин выявили консенсус последовательности, фланкирующей 18 инсерций (O'Hare, Rubin, 1983). В' связи с этим, моЕно предположить наличие-подобной последовательности и для МДМ.

В обычных лабораторных линиях МДГ4 представлен несколькими копиями, локализованными в зухроматиновых районах, и около 20

копий в хромоцентре (iiyin et ai.,i99i>. Исключеше составляют несколько линий, где методом гибридизации m situ обнаруживается большое количество ( 35-40 ) копий МЯГ4 вне хромоцентра.т.е. каким-то образом происходит амплификация МДГ4. При скрещивании, таких многокопийных линий с малокопийными в отношении МДГ4 французские авторы и наблкщали мутагенез,"горячей" областью которого служил локус ovo®. в описанной ими системе генетической нестабильности происходили транспозиции ,то крайней мере, ДВУХ МДГ - МДГ4 И copia (Uevel-Ninio et al. ,1989 Г.ПоДОбНЫе скрещивания двух линий .одна из которых была взята из Uc- системы и являлась многокопийной в отношении МДГ4, а вторая в линия содержала, как и обычные лабораторные линии, Ее больше 3-х копий №4, приводило к активному мутагенезу, характеризующемуся транспозициями МДГ4 и НоЪо, в системе генетической нестабильности, созданной Д.К.ЛЙМОМ (Lim, 1979, 1981; Judd, 19Ô6; Lim, 1988 ).

Для ЩГ4 Ильиным был показан полиморфизм сайтов рестрикции различных КОПИЙ (Ilyin et al.,1991>. Было показано существование .так называемых, активных копий МДГ4, содержащих внутренний Н1пй-фрашэнт.ЛмшшфЕциру]отся и перемещаются по геному именно эти копии ВДГ4,но они, как известно,содертатся в геномах многих линий, оставаясь при этом стабильными. Таким образом,по-видимому, для транспозиций МДГ4 нужно два условия, а именно,наличие активной копии МДГ4 и существование каких-либо факторов генома. Об этом же свидетельствуют данные, полученные на мутаторной линии us (Ким, 1991).

2 а4

В линии у w методом гибридизации in situ с пробами, мечеными тритием, в эухроматине было обнаружено 7 копий ВДГ4,т.е. ВДГ4 не амшшфицировак. Однако, при использовании проб, меченых гексогенином, обнаруживалось большое количество сайтов гибридизации в линии y2wa (Герасимова, личное сообщение). В то же время,в другой исходной линии ~c(i!DX,yf зарегистрировано всего несколько сайтов. Эти данные резко отличаются от данных,полученных щи использовании проб,меченых тритием. Принимая во внимание то, что иммунологический метод является более чувствительным и одинаково выявляет как короткие,так и длинные последовательности, мы предполагаем,что в геЕоме ис-

2 а4

ходной линии/ w имеется большое количество неполноценных копий МДГ4, как в Uc хромосоме (Lim,1979,i9Si) или в мутаторной линии us (Кем,Беляева, 1986;Ким и др.,1989), а, возможно,и оди-

ночных ДКП. Можно предположить, что в силу этого обстоятельства и активизируется транспозиции МДГ4, происходящие в результате гомологичной рекомбинации по ДКП.Однако, нельзя исключить и другой вариант, предполагающий то, что мы захватываем лишь начальные. этапы амплификации ВДГ4. Поскольку затухание мутагенеза происходит в течение 2-3-х поколений, мы не успеваем увидеть амплификации ВДГ4.

Транспозиции 1<ЩГ4, происходящие в нашей системе, идентичны транспозициям МДГ4 в других системах и происходят на премейоти-ческих стадиях, захватывая как половые, так и соматические клетки, о чем свидетельствует появление у- и f-мозаиков (Ким,Беляева,198S;Ким И др.,1989; Lim, 1979, 1981; Mavsl-Ninio et al., 1989). Тем не менее .следует заметить, что в нашей системе генетической нестабильности, в отличие от других систем нестабильности, в которых наблвдаются перемещения МДГ4 по геному (Ким, Беляева, 198S; Ким и др., 1989; Lim, 1979, 1981 ), транспозиции ЫДГ4 происходят при отсутствии каких-либо копий Hobo-элемента в обеих родительских линиях. Однако, нельзя объяснить случаи мутагенеза в нашей системе лишь транспозициями ВДГ4.

Используя метод гибридизации in situ ,нам удалось выявить наряду с транспозициями МДГ4 транспозиции ?ДЦГ Сталкера, ранее открытого в нашей лаборатории (Георгиев и др., 1988). Сталкер индуцирует систему продленной нестабильности, которая возникла в результате скрещивания 2-х стабильных лабораторных линий y2sc1waG И FM4,у ldacadm В, СОДвржаЩКХ МНОГО (45) И МЙЛО (4) копий Сталкера, соответственно (Георгиев и др. ,1938; Герасимова и др.,1990).

Большинство лабораторных линий содеркит в. эухроматинв небольшое количзсво копий Сталкера от- 1 до- 8 (Герасимова и др. ,1990). Исключением явилась линия у2ас^аС, которая содержит необыкновенно большое количесвто копий Сталкера вне хромоцент-ра. Именно в ней происходит мутагенез при скрещивании с малоко-пийной линией FUi.

В линии у vf4 , одной из исходных линий описываемой системы генетической нестабильности, методом гибридизации in situ было обнарукено относительно большое количество копий Сталкера - 1S копий. По числу копий Сталкера эта линия значительно превосходит другие лабораторные линии, содаргащяе от 1 до 8 копий этого МЦГ, однако, уступает линия / ас1 wG ,содзрзаигэй 45

копий Сталкера. Исходя из того, что транспозиции Сталкера наблюдались при скрещивании малокопийной линии с многокопийной в системе продленной нестабильности, в нашей системе также можно было ожидать транспозиции Сталкера. И,действительно,. анализируя методом гибридизации in situ полученные в нашей системе мутантные линии , мы обнаружили транспозиции Сталкера в некоторых из них. Однако, не все случаи появления мутаций связаны с транспозициями ВДГ -Сталкера.

Таким образом, мы видим ,что ни транспозиции ВДГ4, ни транспозиции Сталкера не объясняют всех случаев мутагенеза в нашей системе. Поэтому поиск мобильных элементов, участвующих в дестабилизации генома описанных скрещиваний продолжается. Недавно в нашей лаборатории Е.Буффом был проведен анализ некоторых V-мутантов, полученных в данной системе генетической нес-

31Í1

табильности . В одном из них w была обнаружена неизвестная вставка размером 6 т.п.н. наряду с инсерцией BEL, которая была в исходной линии y2wa4 в локусе white . в настоящээ время в лаборатории ведется работа по клонированию этой вставки и выяснению еа роли в полученной системе генетической нестабильности. Сейчас уже ясно, что дестабилизация генома в нашей системе происходит по типу гибридного дисгенеза ( зависит от направлевия скрещивания; мутагенез затухает в течение второго-третьего поколения). Тем не менее, характерны транспозиции не одного мобильного элемента, как в случае гибридного дисгенеза, а , по крайней мере, трех мобильных элементов. Однако, не исключено участие и других, еще не выявленных мобильных элементов . В этом плане наблодается большая аналогия с системой гибридного дисгенеза, обнаруженной Евгеньевым для D.virilis. в этой системе, обладающей чертами типичного дисгенеза ( стерильность, зависимость от направлений скрещиваний), активизируются, по крайней мере,транспозиции двух мобильных элементов - Улиса и Пенелопы (Corees,Evgeniev,1991).Однако,и они не объясняют всех случаев мутагенеза ,наблвдаемых автором.

По характеру множественных транспозиций наша система напоминает систему транспозиционных взрывов ctMR2 (Герасимова и др., 13846).Тем не менее, основной принцип, характерный для системы транспозиционных взрывов,- "Есе или ничего" мы не наблюдаем.

Каждая система нестабильности характеризуется определенным спектром мутаций. В нашей системе были получены наряду с хорошо

известными у, w, f, dvr, Gl, H - мутациями, совершенно новые,

,4 1|

ранее не описанные шэде мутации - Se, Su, Run, Su(w ) .

Особый интерес представляет трансрегуляторная мутация

Su(wa4)M1, обнаруженная при скрещивании самцов y2wa4 с самками

со сцепленными х-хромосомами ciliDX.yf. Полученный нами „ , а4 ,М1 а4 a bf ' aG

Suíw ) супрессируэт w ,w ,w и w аллели, содержащие различные транспозоны в интронах white-локуса. При 8TOM,Sutwa4 )M1 оказывает влияние на фенотипическое проявление этих аллелей, имещих не значите льнув пишентацию глаз. Кроме того, наши исследования показали, что Su(wa4)M1 не супрессирует другие проанализированные аллели локуса whits, приводящие к более темной окраске глаз - wbl, we, wbwx, w1, w2u. Эти аллели обусловлены внедрением различных мобильных элементов в различные участки локуса «hita. т.о. мы видим, что описываемый регуляторный ген Su(^4 ) супрессирует только те аллели, у которых обнаружены различные вставки в интроны. Тем не менее,не все вставки в интроны супрессируются анализируемым супрессором. Например, аллель wbl, имеющий встаЕку мобильного элемента blood во II интроне, не супрессируется. Можно предположить, что Su(wa4) регулирует экспрессию локуса white на уровне сплайсинга. Возможно, он усиливает образование нормальных транскриптов в случае частичной супрессии w"4, wa, vf, лчаЬ-аллелей либо за счет увеличения эффективности точного сплайсинга редких, неусеченных транскриптов, либо,препятствуя терминации его транскрипции на интегрированных в различные интроны транспозонах. Т.е. мы предполагаем, что взаимодействие продукта локуса Su(wa4) с локусом white, вероятно, осуществляется на уровне регуляции транскрипции. Однако, для точного определения взаимодействия Su(wa4> и локуса white нужны дальнейшие молекулярные исследования.

Таким образом, в результате описанной работы создана система "дестабилизирующих скрещиваний.- Преимущество ее состоит в том, что сна обладает воспроизводимостью. Основной особенностью этой системы являются множественные транспозиции,по крайней мере,трех мобильных элементов. Результаты данной работы создали генетическую базу для дальнейших молекулярных исследований, которые проводятся в настоящее время. Кроме того выявлен рад интересных транс-регуляторных геноЕ, что открывает возможности для их изучения.

Выводы-

1.B результате скрещивания двух стабильных лабораторных линий у2ыа и cniDX.yf создана новая система генетической

о

нестабильности. Мутагенез с частотой 0.7-1.0*1СГ наблвдапся во втором и третьем поколениях. Мутагенез происходит только в том случае, если в скрещивание вводят самцов линии y2wa4. Он затухает уже после третьего поколения. Мутагенез носит характер высокой локусной специфичности-, и идет как в половых, так и в соматических клетках самцов. Некоторые из полученных мутаций нестабильны. Они ревертировали к дикому типу или другим мутантным производным.

2.В созданной системе генетической нестабильности методом гибридизации in situ обнаружены ексцизии и транспозиции МДГ4. Установлено, что специфичный мутагенез в локусе forked индуцирован транспозициями ЫДГ4.

3.Методом гибрэдизации in situ было показана, что в одной из

2 а.4

родительских линий-у w обнаружено 18 копий МДГ Сталкер в эухроматиновых районах, в то время, как вторая родительская линия содерЕИТ всего 3 копии Сталкера, как и другие лабораторные линии. Были также выявлены транспозиции Сталкера на Х-храмосомах полученных мутантных линий. ..

4.С помощью блот-анализа выявлена гомологичная рекомбинация по ДКП МДГ4 с сохранением одиночного ДКП в локусе yellow.

5.В созданной системе генетической нестабильности получен целый ряд новых мутаций. Наибольший интерес представляет транс-регуляторные мутации En(wa4) и Su(wa4l, последний, по-видимому вовлечен б регуляцию локуса white на уровне сплайсинга.

Список работ,опубликованных по 'теме диссертации.

1.Хатыпова М.А., Буфф Е.М., Могила В.А., Набирочкин С.Д., Герасимова Т.И. Индукция мутагенеза в результате генетических скрещиваний // Генетика. 1992. Т.З. C.57-S7.

2. Хатыпова М.А., Герасимова Т.И. Супрессорная мутация , ЕЗаИМОДеЙСТВуПЦаЯ С аЛЛеЛЯМИ ЛОКуса white Drosophlla malanogaster // Генетика. 1992. Т.5. С.00-00.

3. Garasimova T.I., Mogila V.A., Khateepova U.A., Buff Е.Ц. Different systems of genetic instability in Drosophlla roelanogaster //. The Abstract Boole 12th European Drosophlla Research conferen3e. Mains. Germany. 1991. P.6.