Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-генетическое изучение Р-инсерционных мутантов с дефектами обучения и памяти у дрозофилы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-генетическое изучение Р-инсерционных мутантов с дефектами обучения и памяти у дрозофилы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА

ФИЗИОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ Р-ИНСЕРЦИОННЫХ МУТАНТОВ С ДЕФЕКТАМИ ОБУЧЕНИЯ И ПАМЯТИ У ДРОЗОФИЛЫ

03.00.13 - "Физиология человека и животных" 03.00.15 - "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

БРАГИНА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

РГБ ОД

1 3 ннз ш

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики поведения Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Н.Г. Камышев

доктор биологических наук К.Н. Дудкин

кандидат биологических наук Е.М. Лучникова

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится 2000 г. в час.

мин. на заседании Диссертационного Совета lib защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук (К 002.36.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук О.Г. Чивилева

5 6 W. о

Актуальность темы. Изучением механизмов обучения и памяти занимаются многие науки, генетика поведения вносит свой вклад, выявляя отдельные гены и соответствующие им макромолекулы, играющие существенную роль в механизмах обучения и памяти. Исследования на .молельном объекте - дрозофиле (ИговорИИа melanogaster) - имеют здесь первостепенное значение, т.к. подготавливают базу для молекулярно-генетических исследований на млекопитающих и человеке (ВапЯ й а1., 1996). В настоящее время у дрозофилы уже выделено и в той или иной мере охарактеризовано 24 гена, нарушение функции которых вызывает дефекты памяти, однако поиск ранее неизвестных генов остается актуальной задачей генетики поведения (БиЬпаи, Ти11у, 1998).

Одно из наиболее перспективных направлений в изучении механизмов обучения н памяти состоит в использовании естественных, встречающихся в природе, форм обучения. Такой формой обучения у дрозофилы является условнорефлекторное подавление ухаживания, которое в последнее время широко применяется для исследования механизмов обучения и памяти (Капе а а1, 1997; Баул^сеуа е1 а1„ 1999; Мт, Вегкег, 1997).

В лаборатории сравнительной генетики Института физиологии им.И.ППавлова РАН были выделены 4 мутантных линии, проявляющих дефекты памяти при выработке условнорефлекторного подавления ухаживания (Илиада, 1996; Камышев и др., 1999). Локализация мутаций не совпадает с локализацией уже известных генов, контролирующих процессы обучения. Это предполагает, что были обнаружены новые гены с ранее неизвестной функцией. Дальнейшее изучение этих мутантов позволит выявить новые молекулярные компоненты механизмов обучения и памяти.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась фнзиолого-генетическая характеристика четырех Р-инсерционных мутантов с дефектами памяти при выработке условнорефлекторного подавления ухаживания, выделенных в лаборатории сравнительной генетики поведения Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Используя два функционально различных теста, определяющих сохранение в памяти разных условных связей, формирующихся при выработке условнорефлекторного подавления ухаживания, изучить динамику проявления условного рефлекса у Р-инсерционных мутантов и сопоставить полученные данные с соответствующими показателями контрольной линии дикого типа СаШоп-Б и уже известных мутантов с дефектами памяти;

2. Определить характер наследования поведенческого дефекта у разных Р-инсерционных линий;

3. Провести функциональный тест на аллелизм между имеющими близкую цитологическую локализацию Р-инсерционными мутациями во вто-

рой хромосоме и мутацией ШИео для выявления возможной принадлежности к одному гену;

4. Провести функциональный тест на аллелизм между всеми четырьмя Р-инсерционными линиями для выявления возможной обусловленности поведенческого фенотипа общей для всех Р-инсерционных линий мутацией, предсуществовавшей в одной из родительских линий, используемых при Р-инсерционном мутагенезе;

5. Для получения доказательств, что наблюдаемый поведенческий дефект обусловлен именно действием Р-инсерционной мутации, а не связан с другими генотипическими особенностями линий: а) проанализировать поведение гибридов Р-инсерционных мутантов с делециями, перекрывающими место цитологической локализации инсерции Р-элемента; б) провести замену генотипического фона у мутантов и изучить динамику сохранения условного рефлекса у конгенных мутантных и контрольных Р-инсерционных линий;

6. В случае, если делеционный анализ не даст однозначных доказательств того, что поведенческий дефект обусловлен именно Р-инсерционной мутацией, получить коллекцию линий с индуцированными эксцизиями Р-элемента и провести поиск линий, у которых после вырезания Р-элемента произошло восстановление нормальной динамики проявления условного рефлекса. Обнаружение таких линий будет доказательством того, что дефект памяти обусловлен именно инсерцией Р-элемента.

Основные результаты исследования и их новизна. Получено экспериментальное подтверждение рабочей модели выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания по механизму контробусловливания. Впервые выделены мутации, нарушающие оба типа условных связей, предсказанных в рамках модели - связи между условным стимулом (УС) и безусловным стимулом (БС) и связи межцу УС и аверсивной моти-вационной системой. Впервые выделены мутанты, у которых предполагается нарушение аверсивной мотивационной системы. Впервые показано, что при нарушении функционирования аверсивной системы (что делает невозможным обучение по типу контробусловливания) происходит выработка обычного классического условного рефлекса.

Определен характер наследования поведенческого дефекта у новых Р-инсерционных мутантов. Показано, что у двух линий (Р124 и Р171) наследование происходит по рецессивному типу, у линий Р153 и Р95 поведенческий дефект наследуется по типу матроклинии.

Для всех четырех изучаемых линий получено подтверждение, а для мутанта Р153 и однозначное доказательство обусловленности дефекта памяти действием именно Р-инсерционной мутации.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы определяется тем, что она создает предпосылки для выяснения роли новых макромолекул в механизмах обучения и памяти и для дальнейшего генетического расчленения различных форм и фаз памяти. Характеристика новых Р-инсерционных мутантов, проявляющих дефекты памяти после выработки условнорефлекторного подавления ухаживания: а) явилась необходимым этапом для их дальнейшего молекулярно-генетического изучения (клонирования); б) позволила углубить понимание процессов, вовлеченных в механизмы условнорефлекторного подавления ухаживания.

Изучение молекулярных основ обучения и памяти представляет несомненное практическое значение для медицины. Апробированные в работе поведенческие тесты могут применяться как для фундаментальных исследований в области генетики поведения, так и для практических целей - экспресс-оценки вредоносности различных факторов окружающей среды на жизнедеятельность организма.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на 1(Х1) Международном Совещании по эволюционной физиологии (С.Петербург, 1996), на сателлитном симпозиуме XXXIII Международного Конгресса по физиологическим наукам "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (Колтуши, 1997), на XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на 16-й Европейской Конференции по исследованиям на дрозофиле (Цюрих, Швейцария, 1999), на Международном Симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И.П.Павлова "Механизмы адаптивного поведения" (С.-Петербург, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на_страницах

машинописного текста, состоит из введения, 4 глав и выводов, содержит 7 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 124 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Все эксперименты проводили на линиях Drosophila melanogaster. Линии содержали на изюмно-дрожжевой среде при 12-часовом режиме освещения и температуре 25±1°С. Использовали следующие линии: 1. Аутбредная линия дикого типа Canton-S (CS); 2. Мутанты с нарушениями памяти: amnesiac (ainn), dunce1 (dnc), rutabaga1 (rut) и latheo (lat). Линии были любезно предоставлены профессором Уильямом Квинном (W. Quinn, США) и профессором Тома Преа (Т. Preat, Франция); 3. Р-инсерционные мутанты с дефектами обучения и памяти - Р95 (цитологическая локализация инсерции Р-элемента - 77C-D), Р124 (67В-68А), Р153 (49В-С), Р171 (48А-В). Линии выделены в лаборатории сравнительной генетики поведения института физиологии им. И.П.Павлова РАН; 4. Линия white (w) - аллель \v'\ 5. Линии,

несущие делеции по районам локализации инсерции Р-элемента у мутантов Р95, Р124, P153j Р171. Линии получены из Bloomington Stock Center (США) и Umea Stock Center (Швеция); 6. Линия Cy/Sp\ TM-6/SbA2-3\ 7. Линия w; Cy/Sp: D/Sb.

Подготовка и проведение экспериментов по регистрации поведения ухаживания и выработка условнореФлекторного подавления ухаживаиия. Для поведенческих опытов использовали пятидневных самцов, которых собирали без наркоза и содержали индивидуально. Во всех экспериментах использовали самок линии CS - пягисуточных девственных и оплодотворенных. Опыты проводили в период с 10.00 до 18.00. Для обучения и тестирования использовали камеры из плексигласа (диаметр -15 мм, высота - 5 мм).

Процедура обучения. Для обучения (тренировки) в камеру помещали наивного (не имеющего опыта общения с другими мухами) самца тестируемой линии и оплодотворенную самку на 30 мин. Тестирование памяти. Обученного самца изолировали на необходимое время и затем помещали в другую камеру с самкой (с обездвиженной эфирным наркозом девственной или с подвижной оплодотворенной) для тестирования памяти. Память тестировали через разные интервалы времени после обучения: 0, 0.5, 1, 3, 6 и 8 часов. В качестве контроля использовали наивных самцов. Запись и анализ этограммы полового поведения. Эгограмму поведения самца регистрировали в течение 300 с, фиксируя время начала отдельных элементов ухаживания, а также время вне ухаживания. Регистрацию начинали через 45 с после помещения мухи в камеру. Последовательность времен начала всех перечисленных элементов поведения (этограмма) для каждой экспериментальной особи записывали в отдельный файл. Для расшифровки и анализа этограммы использовали специально написанные программы (автор всех используемых программ Н.Г. Камышев).

Статистическая обработка данных. Для каждого экспериментального самца вычисляли индекс ухаживания (ИУ), т.е. время, проводимое самцом в ухаживании за самкой, выраженное в процентах от общего времени наблюдения. Для оценки ИУ у наивных и тренированных самцов использовали независимые выборки особей. Тестирование опытных и контрольных особей проводили в случайном порядке. Для количественной оценки результатов обучения вычисляли индекс обучения (ИО). Формула для расчета ИО (Gailey etal.,1982,1984):

ИУ - ИУ ( ИУ ^

ИО = —i^.100% = 1 - .100% ,

ИУ" ^ ИУ«J Где ИУН и ИУТ - средние индексы

ухаживания для независимых выборок наивных и прошедших тренировку самцов.

Обработку данных проводили с использованием подхода, основанного на прямом вычислении вероятности отвергания нулевой гипотезы (рандомн-

зационный анализ). Причины выбора именно этого статистического подхода подробно обсуждаются в работе Камышева с соавт. (Kamyshev et al., 1999). Односторонние тесты против нулевой гипотезы использовали в следующих случаях: (1) для сравнения ИУ у наивных и тренированных самцов и для тестирования нулевой гипотезы Но: И0=0, т.е. для оценки сохранения условнорефлекторного подавления ухаживания, которое обнаруживается при ИУН>ИУТ, тогда как обратная ситуация (ИУН<ИУТ) не имеет отношения к обучению; (2) для сравнения ИО, измеренных в разное время после тренировки, с исходным ИО (ИОо), измеренным сразу после завершения тренировки, т.е. для определения начала провала или утраты памяти, что обнаруживалось по ИСКИОо; (3) для сравнения ИО данной линии с ИО линии CS против альтернативы ИО<ИОа (тест на снижение индекса обучения относительно уровня дикого типа). В остальных случаях использовали двусторонние тесты. Все статистические решения принимали при уровне значимости а=0,05.

Процедура замены генотнпической среды у Р-инсерционных мутантов. Для выравнивания генотипического фона у изучаемых Р-инсерционных линий проводили процедуру конгенизации, которая представляет собой серию повторных скрещиваний нескольких линий с какой-то одной линией (обычно используется линия дикого типа, которая затем служит контролем) с целью приведения всех этих линий к единому геноти-пическому фону. В данном случае было проведено 10 повторных скрещива-ний самцов линии ve с самками w\"P[lacW\ каждой из Р-инсерционных ли-ний. Для оценки влияния новой генотнпической среды на проявление условнорефлекторного подавления ухаживания одновременно с конгени-зацией изучаемых Р-инсерционных линий по той же схеме провели конге-низацию Р-инсерционных линий, которые не проявляли дефекта памяти при скрининге коллекции, из которой были выделены изучаемые линии (Илиада, 1996). Таких линий было три - Pli, Р21 и Р71.

Получение коллекции индуцированных эксцизий РГнЧ-1- вектора для линии P1S3. Гомозиготных по P[5i\lacW+] инсерции девственных самок скрещивали с самцами, несущими источник транспозазы - Р-элеменг &2-3. В Fi отбирали самцов, несущих в геноме оба Р-элемента и индивидуально скрещивали их с самками vt'Av; Cy!Sp\ D/Sb. В потомстве (F2) от таких скрещиваний отбирали самцов, у которых произошло удаление Р-элемента из генома, о чем судили по фенотипическому маркеру - окраске глаз. Впоследствии каждый такой самец становится родоначальником эксцизионной линии. Далее хромосому с эксцизией Р-элемента выводили в гомозиготу.

аттрактивный БС (афродизиак)

аверсивный БС (антиафродизиак)

аппетитивные консумматор- < ные реакции

1 [аверсив}

аверсивные консумматор-ные реакции

J г к \ ч \ \ \ к Г

аппетитивная система —i аверсивная система

J

аппетитивные препараторные реакции

аверсивные препараторные реакции

его

Рис. 1. Контробусловливание афродизиака при сочетании антиафродизиаком (адаптировано из Dickinson, Dearing, 1979). Обозначения: —врожденные (безусловные) возбудительные связи;

......• врожденные (безусловные) тормозные связи; ► ассоциативные

(условные) возбудительные связи, образующиеся в результате выработки условного рефлекса; кружки - внутренние представления стимула, вызывавемые либо безусловными (сплошные кружки), либо условными связями (пунктирные кружки).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Условнорефлекторное подавление ухаживания. Прежде чем перейти к описанию полученных результатов и их обсуждению, необходимо кратко рассмотреть механизм выработки условнорефлекторного подавления ухаживания. Условнорефлекторное подавление ухаживания является естественной формой обучения у дрозофилы - после ухаживания за нерецептивной оплодотворенной самкой (тренировки) у самца снижается интенсивность ухаживания за всеми последующими самками -как за оплодотворенными, так и за девственными. Уже на ранних этапах изучения этого феномена была высказана гипотеза об ассоциативной природе данной модификации поведения (Siegel, Hall, 1979). Для описания процессов, происходящих при выработке данной модификации поведения, нами была адаптирована (Kamyshev et al., 1999) модель контробусловливания (рис.1), разработанная Дикинсом и Дирингом (Dickinson, Dearing, 1979) на основе более общих вдей Конорского об

участии мотивационных систем в процессах обучения и памяти (Konorski, 1967). .. ' '

При ухаживании за оплодотворенной самкой самцу предъявляются аттрактивный (афродизиак) и аверсивный (антиафродизиак) ольфакторные БС. При их сочетании аттрактивный БС начинает выполнять функцию аверсивного УС - сигнала предъявления аверсивного БС. В результате происходит изменение аффективных свойств (контробусловливание) аттрактивного БС - он становится менее привлекательным для самцов. При этом происходит образование по крайней мере двух условных связей - между внутренним представлением УС и аверсивной мотивационной системой и между внутренними представлениями УС и БС. Внутреннее представление БС имеет врожденный возбудительный вход на аверсивную систему. Стимуляция аверсивной системы двумя возбудительными связями приводит к торможению аппетитивной мотивационной системы, которое проявляется как подавление безусловнорефлекторной реакции на афродизиак.

После завершения тренировки предъявление только УС (тест с девственной самкой - тест на сохранение памяти) вызывает из памяти внутреннее представление аверсивного БС. Последнее в отсутствие его предъявления может со временем изменяться, в результате его связь с аверсивной системой ослабляется, и связь УС-БС становится неэффективной. В тесте с оплодотворенной самкой присутствуют и УС и аверсивный БС, т.е. это тест повторного обучения. Следовательно, здесь активация аверсивной системы через связь УС - БС не зависит от правильности сохранения внутреннего представления аверсивного БС, и этот тест показывает истинное время сохранения связи УС-БС. Кроме того, здесь также работает связь УС -азеренвная система.

У линии дикого типа Canton-S (CS) длительность сохранения ассоциации УС-БС составляет не менее 8 часов (рис.2, тест с оплодотворенной самкой). Время сохранения в памяти связи УС-аверсивная система и правильного внутреннего представления аверсивного БС может быть оценено по результатам теста с девственной самкой. Оно не превышает трех часов.

Сравнение динамики условнорефлекторного подавления ухаживания в тестах с девственной и оплодотворенной самкой у уже известных мутан- : тов по обучению и изучаемых Р-инсерционных мутантов. Все известные мутанты по обучению оказались способны к выработке условнорефлекторного подавления ухаживания - при тестировании сразу после тренировки у всех линий получены значимые ИО (рис.2). Однако длительность сохранения памяти у них значительно ниже, чем у линии дикого типа. У мутантов dnc, rut и lat условнорефлекторное подавление ухаживания в тесте на сохранение памяти проявляется до 0,5 часа после обучения, в тесте с оплодотворенной самкой длительность сохранения памяти не превышает 0,5-1 часа. У мутанта

100 80. О 60 = 40 20 0

Саггёоп-Б

1

£® ГЪхй......Ж

0 0,5 1 3 6

Вреня после обучения (часы)

□ Тест с девственными самками —(тест-на сохранение-памяти)—

И Тест с оплодотворенными самками (тест повторного обучения)

100 80 60 40 20 О -20 -40

1<*

* #

П1

#

о

0,5

Время после обучения (часы)

100 80 60 40 20 О

гсЛ

Луш

о

0,5

$

Время после обучения (часы)

с!пс

100 80 60 40 20 О -20

1

1 г!

О 0,5 1

Время после обучения (часы)

100 п 80 60 40 20 О

* *

атп

1

О 0,5 1 3 Время после обучения (часы)

Рис. 2. Динамика проявления условнорефлекторного подавления ухаживания в тестах с девственной и оплодотворенной самками у линии дикого типа СБ и известных мутантов с дефектами памяти. Обозначения: * ИО достоверно превышает нулевое значение (Р<0.05, односторонний тест рандомизации); # значимо снижение ИО по сравнению с ИО в данном тесте, достигнутым сразу после тренировки (Р<0.05, односторонний тест рандомизации); $ значимо снижение ИО по сравнению с ИО линии СБ в том же тесте и в той же временной точке (Р<0.05, односторонний тест рандомизации).

атп память сохраняется дольше - 1 час в тесте с девственными и 3 часа в тесте с оплодотворенными самками. У всех мутантов проявление условно-рефлекторного подавления ухаживания в обоих тестах в общем оказалось сходным, что и следовало ожидать в случае избирательного нарушения у них условной связи УС-БС при сохранении интакгной условной связи УС-аверсивная система. Необходимо отметить, что временной порядок проявлена дефектов памяти совпадает для условнорефлекторного подавления ухаживания и для классического условного рефлекса на запаховые раздрашгтели (Tully et al., 1998).

На рис. 3 представлена динамика проявления условного рефлекса в обоих тестах у Р-инсерционных мутантов Р171, Р153, Р124 и Р95 после замены у них генотипической среды. Все они проявляют дефекты памяти после замены генотипической среды, что позволяет с большей уверенностью говорить о том, что эти дефекты вызваны именно Р-инсерционной мутацией, хотя это и не может служить окончательным доказательством.

В качестве контроля влияния замены генотипического фона на поведенческий фенотип параллельно с изучаемыми мутантами процедура конгенизации была проведена для трех Р-инсерционных линий (Pli, Р21 и Р71), которые ранее не проявляли дефектов памяти в тесте с оплодотворенными самками (Илиада, 1996). Изучение динамики проявления условнорефлекторного подавления ухаживания у этих линий показало (рис.3), что замена генотипической среды не привела к существенному отличию этих линий от дикого типа в тесте повторного обучения. В тесте на сохранение памяти у всех линий наблюдается значимый ИО сразу после завершения тренировки, далее у линии Р11 память сохраняется дольше, а у линий Р21 и Р71 - меньше, чем у линии CS. Учитывая полученное разнообразие динамики проявления подавления ухаживания у этих линий в данном тесте, можно сделать вывод, что свидетельством нормального проявления условной связи УС - аверс ив ная система является наличие достоверного ИО в обоих тестах сразу после тренировки.

Анализ динамики проявления условнорефлекторного подавления ухаживания у мутанта Р153 (рис.3) позволяет предположить, что у него, так ;ке как и у уже известных мутантов по обучению, специфически нарушена условная связь УС-БС при сохранении интакгной связи УС-аверсивная система (нормальное проявление памяти в двух тестах сразу после обучения).

У мутанта Р171 в тесте повторного обучения память сохраняется по крайней мере до 3 часов после тренировки, тогда как в тесте на сохранение памяти ИО не отличается от нуля уже сразу после тренировки (рис.3). Мы предположили, что: а) у мутанта Р171 длительность сохранения правильного внутреннего представления аверсивного БС настолько мала, что акти-

80 60 -40 20 0 -20

Р153

#

1-4Я.

т

гГ

О 0,5 1 3

Время после обучения (часы)

80 60 ~40~ 20 О

Р124

$

О 0,5 1

Время после обучения (часы)

80 60 40 20 О -20 -40 --60

Р171

$* ♦

Г-Ж . Г-ЙЯ

О 0,5 1 3 Время после обучения (часы)

80 60 40 § 20 О -20 -40 -

Р95

$

И

О 0,5 1 3

Время после обучения (часы)

80 60 40 20 О -20

Р71

шА

О 0,5 1 Время после обучения (часы)

80

60

* л. # $ О 40 * 20 0

3 1и 1 6 -20

*#

Р21

0,5

1

Время после обучения (часы)

80 60 40 20 О

Р11

АШЪи

О 0,5 1 3 6 Время после обучения (часы)

Рис. 3. Динамика проявления условнорефлекторного подавления ухаживания в тестах с девственной и оплодотворенной самкой у конгенных выделенных и контрольных Р - инсерционных линий. Обозначения те же. что и на рис.2.

активации аверсивиой системы через связь УС-БС не происходит даже в немедленном тесте на сохранение памяти; б) у этой линии избирательно нарушена условная связь УС-аверсивная система.

У линий Р95 и Р124, напротив, наблюдается лучшее воспроизведение условнорефлекторного подавления ухаживания в тесте на сохранение памяти (рис.3). В тесте повторного обучения проявление условно-рефлекторного подавления ухаживания значимо снижено по сравнению с линией дикого типа. Мы предположили, что у этих мутантов нарушено функционирование аверсивной мотивационной системы, которая является центральным звеном в обучении по типу контробусловливания, т.е. изменения аффективных свойств стимула (афродизиака). Таким образом, у этих линий блокирован механизм контробусловливания. Однако, по-видимому, у этих линий происходит обучение по механизму выработки обычного классического условного рефлекса с переносом сенсорных свойств УС на БС (УС приобретает способность вызывать консумматорные реакции, характерные для БС). Такой условный рефлекс должен проявляться только в тесте с девственной самкой, тогда как в тесте повторного обучения его проявление маскируется непосредственным предъявлением самцу БС (антиафродизиака).

Показано, что у самцов линии СБ в основном происходит подавление наиболее ранних элементов в ритуале ухаживания, что отражает изменение аффективных свойств УС. У линий Р95 и Р124, напротив, основную роль в подавлении ухаживания играют завершающие стадии ухаживания (попытки копуляции), а блокировка попыток копуляции как раз и является консумматорной реакцией на предъявление БС. В пользу того, что у этих линии Р-инсерционная мутация не затрагивает компоненты механизма выработки классического условного рефлекса говорит тот факт, что для них показана нормальная способность к выработке классического условного рефлекса на ольфакторные раздражители с подкреплением электрошоком (Камышев, 1999).

Анализ характера наследования нарушения воспроизведения условнорефлекторного подавления ухаживания дал следующие результаты (рис. 4). Показан материнский эффект (преимущественное проявление особенностей материнской линии) при наследовании данного признака у линий Р95 и Р153. У линий Р171 и Р124 поведенческий дефект наследуется по рецессивному типу.

Необходимым условием при изучении Р-инсерционных линий было получение доказательств того, что во всех этих линиях не содержится какая-то одна и та же мутация, которая могла предсуществовать в одной из родительских линий, использованных при получении этих мутантов, и приводить к наблюдаемым поведенческим дефектам. Для получениятаких

Р95

о 40 * 20 0 -20

$0 60 § 40 20 0

80

60

П.п

СЭхР95 Р95хСБ Р95

Р153

*

Л......о

СБХР153 Р153хСЭ Р153

§ 40 20 0

ВО 60 40 20 О

*

Р171

$

□

Св СБХР171 Р171ХС5 Р171

Р124

*

$ '

СЭ СБхР124 Р 124хСБ Р124

□

Рис. 4. Анализ характера наследования поведенческого дефекта у Р-инсер-ционных линий (тест с оплодотворенными самками через 3 часа после тренировки для линий Р171, Р95, Р124 и тест через 8 часов после тренировки для линии Р153). Обозначения те же, что и на рис.2.

*

доказательств необходимо проведение функционального теста на аллелизм - в случае существования общей для всех линий мутации потомство от скрещивания разных линий должно иметь мутантный поведенческий фенотип. Результаты скрещиваний между четырьмя изучаемыми Р-инсер-ционными линиями в целом позволяют отвергнуть это предположение. Таким образом, дефекты памяти, наблюдаемые у изучаемых линий, вызваны мутациями в разных генах.

Представлялось интересным также провести функциональный тест на аллелизм для линий Р153иР171с известной мутацией по обучению Ш, так как инсерции Р-элемента в этих линиях на цитологической карте находятся близко от места локализации гена Ш. Полученные результаты показали отсутствие аллельности всех трех мутаций.

Получение доказательств обусловленности дефекта памяти Р-инсерционной мутацией. С целью получения однозначных доказательств в пользу того, что дефект памяти у изучаемых линий обусловлен именно Р-инсерционной мутацией, был проведен функциональный тест на аллелизм изучаемых мутаций с делениями, перекрывающими район локализации инсерции Р-элемента, который, однако, не дал однозначно интерпретируемых результатов.

Другой способ получения этих доказательств состоит в получении линий с эксцизиями Р-элемента. Метод, использованный при получении изучаемых мутантов - Р-инсерцион-ный мутагенез - предоставляет велико-

CMCOC5U?(NQO)<p ТГ<ЭЮ'"Г<оор)О

~ М- т- О т- ч—

г- Q. о О «)

а

Рис. 5. Анализ воспроизведения условнорефлекторного подавления ухаживания в тесте с оплодотворенными самками через 3 часа после обучения у линий с эксцизией Р-злеменга, полученных на основе линий Р153. Обозначения: штрихованные столбики - ИО достоверно превышает нулевое значение (Р<0.05, односторонний тест рандомизации); $ - значимо отличие от ИО линии CS (Р<0.05, односторонний тест рандомизации); @ - значимо отличие от ИО линии Р153 (Р<0.05, односторонний тест рандомизации).

лепну ю возможность для получения коллекции таких линий. Р-инсер-ционная мутация представляет собой нарушение структуры (после-довательности) гена в результате внедрения в него Р-элемента, который может бьггь вырезан и перемещен из места своего внедрения в какой-то другой участок генома, либо вырезан и удален из генома (Engels, 1996).

Если в полученной коллекции эксцизий Р-элеменга часть линий будет проявлять реверсию (восстановление) к поведенческому дикому типу (результат точного вырезания Р-злемента), это будет служить однозначным доказательством того, что именно инсерция Р-элемента ответственна За поведенческий дефект. В противном случае не должно появиться ни одного ревертанта.

Нами была получена коллекция линий с индуцированными эксцизиями для линии PI53. Все линии четко делятся на две группы (рис.5). Примерно у половины линий произошло восстановление поведенческого фенотипа. Это служит однозначным доказательством того, что поведенческий дефект у линии PI53 вызван именно Р-инсерционной мутацией. У второй половины линий обнаружены более выраженные дефекты памяти, чем у исходной линии - Р153. Дальнейшее подробное поведенческое и генетическое изучение этих линий позволит точнее охарактеризовать функцию данного гена, его роль в регуляции физиологических процессов, позволит ответить на вопрос о генетической природе образовавшихся мутаций (предположительно микроделеций в результате неточной вырезки Р-элеменга), а также насытить генетическую карту гена.

Таким образом, учитывая тот факт, что у Р-инсерционного мутанта Р153 нарушено нормальное проявление условного рефлекса по крайней мере в трех различных формах обучения (Камышев, 1999), а также то, что локализация Р-инсерции не совпадаех_с_докализацией_ранее-известных-мутаций по обучению, можно предполагать, что либо была получена мутация в совершенно новом гене, либо была получена аллель гена, влияние которого на память было ранее не известно. В настоящее время ген, в который произошла инсерция Р-элемента у линии Р153, получил название по extended memory (пету) и начато его клонирование.

Для остальных трех изучаемых мутантов (Р95, Р171 и Р124) еще предстоит получить окончательные доказательства того, что поведенческий дефект обусловлен именно Р-инсерционной мутацией.

ВЫВОДЫ

1. Подтвержден мутантный поведенческий фенотип Р-инсерционных линий Р95, Р124, Р153 и Р171, проявляемый ими как дефект памяти после выработки у самцов условнорефлекторного подавления ухаживания.

2. Установлены места действия мутационных блоков, вызывающих дефекты памяти в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания. У мутанта Р153 и у мутантов ¡at, rut, dnc и атп нарушается формирование или сохранение в памяти условной связи УС-БС, у мутанта Р171 - условной связи УС-аверсивная мотивационная система, у мутантов Р124 и Р95 - нарушено функционирование самой аверсивной системы.

3. У мутантов Р124 и Р95 с нарушением аверсивной мотивационной системы условнорефлекторное подавление ухаживания вырабатывается не на основе конгробусловливания, как у мух дикого типа и других изученных мутантов, а на основе переноса сенсорных свойств БС на УС, т.е. на основе выработки обычного классического условного рефлекса.

4. Установлено, что мутации, вызывающие поведенческий дефект у линий Р153 и Р171, и известная мутация lat, нарушают функции разных генов. Показано отсутствие общей для всех изучаемых Р-инсерционных линий мутации, которая могла бы предсуществовать в одной из родительских линий, использованных при Р-инсерционном мутагенезе, и вызывать сходный поведенческий фенотип.

5. Определен характер наследования поведенческого дефекта у Р-инсерционных линий. У линий Р124 и Р171 поведенческий дефект наследуется по рецессивному типу, у линий Р95 и Р153 наследование происходит по типу матроклинии.

6. Сохранение мутангного фенотипа после замены генетического фона у этих линий подтверждает, что он обусловлен действием именно Р-инсерционных мутаций, а не связан с другими генотипическими особенностями линий.

7. Путем получения индуцированных эксцизий Р-элемента, у которых произошла реверсия мутантного поведенческого фенотипа к нормальному (6 ревертантов из 14 полученных линий с эксцизиями) представлено окончательное доказательство того, что дефект памяти у линии Р153 обусловлен именно мутацией в результате инсерции Р-элемента. Тем самым созданы необходимые предпосылки для клонирования этого гена.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Илиади КГ., Брагина Ю.В., Переслени А.И., Савватеева Е.В., Камышев Н.Г. Выделение и изучение Р-инсерционных мутантов дрозофилы, дефектных по ассоциативному обучению и памяти. Тез. докл. 1(Х1) Междун. Совещ. по эволюц. физиологии. С.-Петербург. С. 85-86. 1996.

2. Камышев Н.Г., Илиади К.Г., Брагина Ю.В. Простой и надежный тест на ассоциативную память у дрозофилы на основе парадигмы условнорефлекторного подавления ухаживания самца за оплодотворенной самкой. Тез докл. 1(Х1) Междун. Совещ. по эволюционной физиологии. С.Петербург. С. 91-92. 1996.

3. Bragina J.V., Kamyshev N.G. New P-insertional learning and memory mutants in Drosophila-. Behavior in the conditioned courtship suppression paradigm. Abstr. Satell. Symp. XXXIII Int. Congr. Physiol. Sci. "Molecular and Genetic Bases of Adaptive Behavior", July 6-8, Koltushi (Russia). P. 6. 1997.

4. Kamyshev N., Iliadi K., Bragina J., Sawateeva E., Tokma-tcheva E., Wustmann G., Preat Th. New P-insertional autosomal Drosophila mutants deficient in learning and memory. Abstr. Satell. Symp. XXXIII Int. Congr. Physiol. Sci. "Molecular and Genetic Bases of Adaptive Behavior", July 6-8, Koltushi (Russia). P. 53. 1997.

5. Sawateeva E., Kamyshev N., Iliadi K., Bragina J., Riederer P., Kornhuber J. Behavioral and neural plasticity during ageing in Drosophila. Abstr. Satell. Symp. XXXIII Int. Congr. Physiol.Sci. "Molecular and Genetic Bases of Adaptive Behavior". Koltushi (Russia). P. 53. 1997.

6. Kamyshev N. G., Iliadi K. G., Bragina J. V. Drosophila conditioned courtship: Two ways of testing memory. Learn. & Mem. 6 (1). P. 1-20. 1999.

7. Камышев Н.Г., Илиади К.Г., Брагина Ю.В., Савватеева-Попова Е.В., Токмачева Е.В., Преа Т. Выявление мутантов дрозофилы, проявляющих дефекты памяти после выработки условнорефлекторного подавления ухаживания. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 85 (1). С. 84-92. 1999.

8. Bragina J., Iliadi К. and Kamyshev N. Mutations affect distinct associative connections in the conditioned courtship suppression paradigm. Abstr. 16th Drosophila Research Conference (EDRC99). Zurich, Switzerland P. 104. 1999.

9. Bragina J.V., Iliadi K.G., Kamyshev N.G. Drosophila mutations reveal dustinct associative connections formed to produce courtsliip inhibition. Abstr. Intern. Symp. dedicated to Academician I.P. Pavlov's 150-anniversary "Mechanisms of Adaptive Behavior", St.-Petersburg. Russia P. 27. 1999----

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брагина, Юлия Валерьевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Генетика поведения.

Методы генетики поведения.

Объекты генетики поведения.

Генетическое изучение механизмов обучения и памяти у дрозофилы.

Парадигмы обучения у дрозофилы.

Классический условный рефлекс.

Инструментальный условный рефлекс.

Условнорефлекторное подавление ухаживания.

Гены, контролирующие процессы обучения и памяти у дрозофилы.

Молекулярно-генетические компоненты классического ольфакторного обучения у дрозофилы.

Глава 2. Материал и методы.

Линии и мутанты дрозофилы, использованные в работе.

Подготовка и проведение экспериментов по регистрации поведения ухаживания и выработка условнорефлекторного подавления ухаживания. Статистическая обработка данных.

Особенности проведения некоторых генетических процедур.

Процедура конгенизации (замены генотипического фона).

Получение коллекции индуцированных эксцизий Р[н,+]- вектора для линии

Р153.

Глава 3. Результаты.

Сравнение динамики памяти у изучаемых мутантов в тестах с девственной и оплодотворенной самкой.

Сравнение поведения известных мутантов с дефектами памяти в тесте с девственной и оплодотворенной самкой.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-генетическое изучение Р-инсерционных мутантов с дефектами обучения и памяти у дрозофилы"

Актуальность темы

Механизмы обучения и памяти все еще остаются одной из наиболее интригующих проблем конца 20 века. В настоящее время уже можно с уверенностью говорить об участии в этих процессах тех или иных структур мозга, отдельных нейронов и молекулярных систем, однако до построения полной принципиальной схемы процесса обучения и последовательных стадий формирования памяти еще очень далеко. Также в настоящее можно считать доказанным, что у животных разных филогенетических уровней (от простейших до млекопитающих) в основе механизмов обучения и памяти лежат одни и те же молеку-лярно-клеточные процессы (Пономаренко, Камышев, 1995; Silva et al., 1998; Alberini, 1999).

Изучением механизмов обучения и памяти занимаются многие науки, генетика поведения вносит свой вклад, выявляя отдельные гены и соответствующие им макромолекулы, играющие существенную роль в механизмах обучения и памяти. Исследования на модельном объекте - дрозофиле {Drosophila melanogaster) - имеют здесь первостепенное значение, т.к. подготавливают базу для молекулярно-генетических исследований на млекопитающих и человеке (Banfi et al., 1996).

В настоящее время у дрозофилы уже выделено и в той или иной мере охарактеризовано 24 гена, нарушение функции которых вызывает дефекты памяти, однако поиск ранее неизвестных генов остается актуальной задачей генетики поведения (Dubnau, Tully, 1998). Необходимо отметить, что по крайней мере у части из выделенных мутантов обнаружены дефекты сенсомоторных реакций, необходимых для успешного обучения в использованной парадигме - классическом ольфакторном обучении с подкреплением электрошоком (Preat, 1998). Таким образом, для устранения подобного неспецифического (по отношению к процессам обучения и памяти) влияния изучаемых мутаций, необходимо использовать формы обучения, в которых используются естественные для дрозофилы стимулы (и, по-видимому, это касается не толькл дрозофилы, но любого модельного объекта). Одной из естественных форм обучения у дрозофилы является парадигма условнорефлекторного подавления ухаживания, которая в последнее время стала широко применяться для исследования механизмов обучения и памяти (Капе et al., 1997; Sawateeva et al., 1999; Luo et al., 1992; Min, Benzer, 1997). 6

В лаборатории сравнительной генетики Института физиологии им.И.П.Павлова ранее были выделены 4 мутанта с дефектами памяти (Илиади, 1996; Камышев и др., 1999). Локализация мутаций не совпадает с локализацией уже известных генов, контролирующих процессы обучения, что свидетельствует о том, что были обнаружены новые гены с ранее неизвестной функцией. Подробная физиолого-генетическая характеристика этих генов позволит выявить новые молекулярно-клеточные компоненты механизмов обучения и памяти.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась физиолого-генетическая характеристика четырех Р-инсерционных мутантов, выделенных в лаборатории сравнительной генетики поведения Института физиологии им. И.П. Павлова по признаку проявления дефектов памяти после выработки у самцов условнорефлекторного подавления ухаживания с тем, чтобы конкретизировать представление о вызываемом этими мутациями поведенческом фенотипе и, доказав его обусловленность именно Р-инсерциями, создать необходимые предпосылки для последующего клонирования изучаемых генов. Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Используя два функционально различных теста, определяющих сохранение в памяти разных условных связей, формирующихся при выработке условнорефлекторного подавления ухаживания, изучить динамику проявления условного рефлекса у Р-инсерционных мутантов и сопоставить полученные данные с соответствующими показателями контрольной линии дикого типа СаМоп-5 и известных мутантов по обучению;

2. Определить характер наследования поведенческого дефекта у разных Р-инсерционных линий;

3. Провести функциональный тест на аллелизм между имеющими близкую цитологическую локализацию Р-инсерционными мутациями во второй хромосоме и мутацией 1шкео для выявления возможной принадлежности к одному гену;

4. Провести функциональный тест на аллелизм между всеми четырьмя Р-инсерционными линиями для выявления возможной обусловленности поведенческого фенотипа общей для всех Р-инсерционных линий мутацией, предсуществовавшей в одной из родительских линий, используемых при Р-инсерционном мутагенезе; 7

5. Для получения доказательств того, что наблюдаемый поведенческий дефект обусловлен именно действием Р-инсерционной мутации, а не связан с другими генотипиче-скими особенностями линий: а) проанализировать поведение гибридов Р-инсерционных мутантов с делециями, перекрывающими место цитологической локализации инсерции Р-элемента; б) провести замену генотипического фона у мутантов и изучить динамику сохранения условного рефлекса у конгенных мутантных и контрольных Р-инсерционных линий;

6. В случае если делеционный анализ не даст однозначных доказательств того, что поведенческий дефект обусловлен именно Р-инсерционной мутацией, получить коллекцию линий с индуцированными эксцизиями Р-элемента и провести поиск линий, у которых после вырезания Р-элемента произошло восстановление нормальной динамики проявления условного рефлекса. Обнаружение таких линий будет доказательством того, что дефект памяти обусловлен именно инсерцией Р-элемента.

Основные результаты исследования и их новизна

Получено экспериментальное подтверждение рабочей модели обучения по типу контробусловливания в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания. Показана возможность обнаружения с помощью этой парадигмы обучения мутаций, нарушающих как образование/воспроизведение условных связей, так и функционирование мотива-ционных систем. Впервые выделены мутанты, у которых предполагается нарушение авер-сивной мотивационной системы и нарушение формирования условной связи между УС и аверсивной системой.

Изучение динамики памяти у выделенных (Р95, Р124, Р153 и Р171) и уже известных мутантов с дефектами памяти dnc, rut, атп и lat подтвердило правильность предложенной модели обучения по типу контробусловливания в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания (Kamyshev et al., 1999) и позволило установить места действия мутационных блоков. У изученных мутантов происходит нарушение по крайней мере трех компонентов системы, в рамках которой происходит формирование и сохранение условнорефлекторного подавления ухаживания. Это ассоциация между условным (УС) и безусловным (БС) стимулами, ассоциация между УС и аверсивной мотивационной системой и сама аверсивная мотивационная система, которая играет ключевую роль в механизме контробусловливания. Впервые показано, что при нарушении функционирования аверсивной 8 системы (что делает невозможным обучение по типу контробусловливания) происходит выработка обычного классического условного рефлекса.

Проведено определение характера наследования поведенческого дефекта у новых Р-инсерционных мутантов с дефектами памяти. Показано, что у линий Р124иР171 наследование поведенческого дефекта происходит по рецессивному типу, у линий Р95 и PI53 поведенческий дефект наследуется по типу матроклинии.

Для всех четырех изучаемых линий получено подтверждение, а для мутанта PI53 и однозначное доказательство обусловленности дефекта памяти действием именно Р-инсерционной мутации.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы определяется тем, что она создает предпосылки для выяснения роли новых макромолекул в механизмах обучения и памяти, и для дальнейшего генетического расчленения различных форм и фаз памяти.

Характеристика новых Р-инсерционных мутантов, проявляющих дефекты памяти в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания, и их характеристика а) создали предпосылки для их дальнейшего молекулярно-генетического изучения, направленного на выявление новых молекулярных компонентов, участвующих в механизмах обучения и памяти. Выявление молекулярных основ обучения и памяти представляет несомненное практическое значение для физиологии и медицины; б) позволили углубить понимание процессов, вовлеченных в формирование условнорефлекторного подавления ухаживания. Этот тест может применяться как для фундаментальных исследований в области генетики поведения, так и для практических целей -экспресс-оценки вредоносности различных факторов окружающей среды на жизнедеятельность организма.

Апробация работы

Материалы исследований были представлены на 1(Х1) Международном Совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996), на сателлитном симпозиуме XXXIII Международного Конгресса по физиологическим наукам "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (Колтуши, 1997), на ХУЛ Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на 16-й Европейской Конференции по исследованиям на дрозофиле (Цюрих, Швейцария, 1999), на Международном Симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И П.Павлова "Механизмы адаптивного поведения" (С.-Петербург, 1999). 9

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 86 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, содержит 7 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 124 источника.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Брагина, Юлия Валерьевна

Выводы

1. Подтвержден мутантный поведенческий фенотип Р-инсерционных линий Р95, PI24, PI53 и Р171, проявляемый ими как дефект памяти после выработки у самцов условнорефлеюгорного подавления ухаживания.

2. Установлены места действия мутационных блоков, вызывающих дефекты памяти в парадигме условнорефлекторного подавления ухаживания. У мутанта PI53 и у мутантов lat, rut, dnc и атп нарушается формирование или сохранение в памяти условной связи УС-БС, у мутанта PI71 - условной связи УС-аверсивная мотивационная система, у мутантов PI24 и Р95 - нарушено функционирование самой аверсивной системы.

3. У мутантов PI24 и Р95 с нарушением аверсивной мотивационной системы условнорефлекторное подавление ухаживания вырабатывается не на основе контробусловливания, как у мух дикого типа и других изученных мутантов, а на основе переноса сенсорных свойств БС на УС, т.е. на основе выработки обычного классического условного рефлекса.

4. Установлено, что мутации, вызывающие поведенческий дефект в линиях PI53 и Р171, и известная мутация latheo нарушают функции разных генов. Показано отсутствие общей для всех изучаемых Р-инсерционных линий мутации, которая могла бы предсуществовать в одной из родительских линий, использованных при Р-инсерционном мутагенезе, и вызывать сходный поведенческий фенотип.

5. Определен характер наследования поведенческого дефекта у Р-инсерционных линий. У линий Р124иР171 поведенческий дефект наследуется по рецессивному типу, у линий Р95 и PI53 наследование происходит по типу матроклинии.

6. Сохранение мутантного фенотипа после замены генетического фона у этих линий подтверждает, что он обусловлен действием именно Р-инсерционных мутаций, а не связан с другими генотипическими особенностями линий.

7. Путем получения индуцированных эксцизий Р-элемента, у которых произошла реверсия мутантного поведенческого фенотипа к нормальному (6 ревертантов из 14 полученных линий с эксцизиями) представлено окончательное доказательство того, что дефект памяти у линии PI53 обусловлен именно мутацией в результате инсерции Р-элемента. Тем самым созданы необходимые предпосылки для клонирования этого гена.

77

Благодарности

Автор считает своим приятным долгом выразить признательность научному руководителю Николаю Григорьевичу Камышеву за предоставление неограниченных возможностей для выполнения диссертационной работы и создание великолепных условий для обработки экспериментальных данных.

Автор выражает признательность заведующему лабораторией д.б.н. Валентину Васильевну Пономаренко за заботу и внимание ко всем проблемам автора.

Я благодарна всем сотрудникам лаборатории сравнительной генетики поведения и лаборатории нейрогенетики за плодотворные дискуссии и техническое обеспечение работы. В особенности хочется сказать большое спасибо всему коллективу лаборантов этих лабораторий.

Приношу глубокую признательность рецензентам, взявшим на себя труд первыми оценить эту работу при ее апробации - проф. Н. Г. Лопатиной и д.б.н. В. Т. Шуваеву, а также заведующему отделом физиологии и патологии высшей нервной деятельности д.м.н. М. О. Самойлову и всем сотрудникам отдела, присутствовавшим на апробации.

Я признательна также администрации Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, в трудное время оказывающей моральную и материальную поддержку молодым исследователям и сохраняющей возможность для сотрудников Института заниматься основной их деятельностью - наукой, без чего эта работа не могла бы быть завершена.

78

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брагина, Юлия Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Беляев Д.К. Биологические аспекты доместикации животных. В кн.: Генетика и селекция новых пород сельскохозяйственных животных. Алма-Ата. С. 30-44. 1970.

2. Бензер С. От гена к поведению. В кн.: Актуальные проблемы генетики поведения. Ред. В.В. Пономаренко. Л. Наука. С. 5-21. 1975.

3. Илиада К.Г. Изучение способности к формированию ассоциативной памяти у му-тантных линий дрозофилы, полученных методом Р-инсерционного мутагенеза. Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб. 1996.

4. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М. Высшая школа. 1989.

5. Кайданов Л.З., Лучникова Е.М. Принципы генетического анализа поведения. В кн.: Физиологическая генетика и генетика поведения. В серии: Руководство по физиологии. Ред. Л. В. Крушинский. Л. Наука. С. 21-77. 1981.

6. Кайданов Л.З., Мыльников C.B., Галкин А.П., Иовлева О.В., Кузнецова О.В., Зимина Н. Генетические эффекты дестабилизирующего отбора при селекции по адаптивно важным признакам в линиях Drosophila melanogaster. Генетика. 33(8): 1102-1109. 1997.

7. Камышев Н.Г. Физиолого-генетический анализ поведения и естественных форм обучения у дрозофилы. Дис. доктора биол. наук. СПб. 1999.

8. Камышев Н.Г., Камышева Е.А., Смирнова Г.П., Парафенюк И.В. Взаимообучение особей дрозофилы в групповой ситуации методом проб и ошибок. Журн. общ. биологии. 55(6): 737-748. 1994.

9. Крушинский Л.В., Зорина З.А., Полетаева И.И., Романова Л.Г. Введение в этологию и генетику поведения. Изд-во МГУ. 1983.

10. Маркова Е.В., Маслак А.А. Рандомизация и статистический вывод. М. Финансы и статистика. 1986.

11. Пономаренко В.В., Камышев Н.Г. Генетические аспекты механизмов обучения. Физиол. журн. им.И.М.Сеченова. 81 (8): 57-62. 1995.

12. Шарагина Л.М., Савватеева Е.В., Атаманенко А.А. Изучение активности фосфодиэ-стеразы циклических нуклеотидов у мутантных линий Drosophila melanogaster. Генетика. 33(6): 784-787.1997.

13. Aceves-Pina E.O., Quinn W.G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206: 93-96.1979.

14. Aekerman S.L., Siegel R.W. Chemically reinforced conditioned courtship in Drosophila: responses of wild type and the dunce, amnesiac and don giovanni mutants. J. Neurogenet. 3: 111123. 1986.

15. Alberini C.M. Genes to remember. J. Exp. Biol. 202: 2887-2891. 1999. Antony C., Jallon J.M. The chemical basis for sex recognition in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 28(10): 873-880. 1982.

16. Armstrong R.C., Montminy M.R. Transsynaptic control of gene expression. Annu. Rev. Neurosci. 16: 17-29.1993.

17. Bastock M., Manning A. The courtship of Drosophila melanogaster. Behavior. 8: 85-111.1955.

18. Bellen H.J., Kiger J.A. Maternal effects of general and regional specificity on embryos of Drosophila melanogaster caused by dunce and rutabaga mutant combinations. Roux. Arch. dev. Biol. 197 (5): 258-268.1988.

19. Belvin M.P., Yin J.C.P. Drosophila learning and memory: recent progress and new approaches. BioEssays. 19 (12): 1083-1089.1997.

20. Booker R., Quinn W.G. Conditioning of leg position in normal and mutant Drosophila. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 78: 3940-3944. 1981.

21. Broadie K. Forward and reverse genetic approaches to synaptogenesis. Curr. Opin. Neuro-biol. 8:128-138. 1998.

22. Broadie K., Rushton E., Skoulakis E.M.C., Davis R.L. Leonardo, a Drosophila 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19: 391-402. 1997.

23. Chen C.N., Denome S., Davis R.L. Molecular analysis of cDNA clones and the corresponding genomic coding region of the Drosophila dunce' locus, the structure gene for cAMP phosphodiesterase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 3599-3603. 1986.

24. Choi K.-W., Smith R.F., Buratowski R.M., Quinn W.C. Deficient protein kinade C activity in turnip, a Drosophila learning mutant. J. Biol. Chem. 266: 1599-1606. 1991.

25. Corfas G., Dudai Y. Adaptation and fatigue of mechanosensory neuron in wild type Drosophila and in memory mutants. J. Neurosci. 16: 5593. 1990.

26. Cowan T.M., Siegel R.W. Mutational and pharmacological alterations of neuronal membrane function disrupt conditioning in Drosophila. J. Neurogenet. 1: 333-334. 1984.

27. Cowan T.M., Siegel R.W. Drosophila mutations that alter ionic conduction disrupt acquisition and retention of a conditioned odor avoidance response. J. Neurogenet. 3: 187-201. 1986.

28. Dauwalder B., Davis R.L. Conditional rescue of the dunce learning/memory and female fertility defects with Drosophila or rat transgenes. J. Neurosci. 15 (5 Pt 1): 3490-3499. 1995.

29. Davis G.W., Schuster C.M., Goodman C.S. Genetic analysis of the mechanisms controlling target selection: target-derived Fasciclin II regulates the pattern of synapse formation. Neuron. 19(3): 561-573. 1997.

30. Davis R.L. Physiology and biochemistry of Drosophila learning mutants. Physiol. Rev. 76: 299-317. 1996.

31. DeZazzo J., Tully T. Dissection of memory formation: from behavioral pharmacology to molecular genetics. Trends Neurosci. 18: 212- 218. 1995.81

32. Diamond M.S., Springer T.A. The dynamic regulation of integrin adhesiveness. Curr. Biol. 4:517. 1994.

33. DiAntonio A. Learning something ORIGINal at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 23: 1-2. 1999.

34. Dickinson A., Dearing M.F. Appetitive-aversive interactions and inhibitory processes. In: Mechanisms of learning and motivation. A memorial volume to Jerzy Konorski. Ed. A. Dickinson, R. A. Boakes. N. Y. Erlbaum, Hillsdale. P. 203-231. 1979.

35. Drain P., Folkers E., Quinn W.G. CAMP-dependent protein kinase and the disruption of learning in transgenic flies. Neuron. 6: 71-82. 1991.

36. Dreesen T.D., Johnson D.H., Henikoff S. The brown protein of Drosophila melanogaster is similar to the white protein and to components of active transport complexes. Molec. Cell. Biol. 8: 5206-5215. 1988.

37. Dubnau J., Tully T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21: 407-444. 1998.

38. Dudai Y. Mutations affect storage and use of memory differentially in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80(17): 5445-5448. 1983.

39. Dudai Y., Zvi S., Segel S. A defective conditioned behavior and a defective adenylate cyclase in the Drosophila mutant rutabaga. J. comp. Physiol. 155: 569-576. 1984.

40. Duerr J.S., Quinn W.G. Three Drosophila mutations that block associative learning also affect habituation and sensitization. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 79: 3646-3650. 1982.

41. Engels W.R. P Elements in Drosophila In: Transposable elements. Ed. H. Saedler, A. Gierl. Berlin. Springer-Verlag. P. 103-123.1996.

42. Feany M.B., Quinn W.G. A neuropeptide gene defined by the Drosophila memory mutant amnesiac. Science. 268: 869-873.1995.

43. Fisher R.A. The Design of experiments. 8th edition. Edinburgh. Oliver and Boyd. 1966.

44. Folkers E. Visual learning and memory of Drosophila melanogaster wild type C-S and the mutants dunce, amnesiac, turnip and rutabaga. J. Insect Physiol. 28: 535-539. 1982.

45. Gailey D.A., Jackson F.R., Siegel R.W. Male courtship in Drosophila: The conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102: 771-782. 1982.

46. Gailey D.A., Jackson F.R., Siegel R.W. Conditioning mutations in Drosophila melanogaster affect an experience-dependent behavioral modification in courting males. Genetics. 106: 613-623. 1984.

47. Gailey D.A., Siegel R.W. A mutant strain in Drosophila melanogaster that is defective in courtship behavioural cues. Anim. Behav. 38: 163-169. 1989.82

48. Goodwin, S.F., DelVecchio, M., Tully, T., Kaiser, K. Behavior of Drosophila mutant for a regulatory sub-unit of cAMP-dependent protein kinase. J. Neurogenet. 8: 232. 1993.

49. Gotz K.G., Biesinger R. Centrophobism in Drosophila melanogaster. Behavioral modification induced by ether. J. Comp. Physiol. A. 156(3): 319-327. 1985.

50. Gotz K.G., Biesinger R. Centrophobism in Drosophila melanogaster.il. Physiological approach to search and search control. J. Comp. Physiol. A. 156(3): 329-337. 1985.

51. Greenspan R.J., Kane N., Ferveur J.-F. Genetic control of programmed and modifiable courtship behavior in Drosophila. Behav. Genet. 25(3): 268. 1995.

52. Griffith L.C., Wang J., Zhong Y., Wu C.-F., Greenspan RJ. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II and potassium channel subunit Eag similarly affect plasticity in Drosophila. Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 91: 10044-10048. 1994.

53. Grotewiel M.S., Beck C.D., Wu K.H., Zhu X.R., Davis R.L.Integrin-mediated short-term memory in Drosophila.Nature. 391(6): 455-460. 1998.

54. Hall J.C. Complex brain and behavioral functions disrupted by mutations in Drosophila. Dev. Genet. 4: 355-378. 1984.

55. Han P.-L., Levin L.R., Reed R.R., Davis R.L. Preferential expression of the Drosophila rutabaga gene in mushroom bodies, neural centers for learning in insects. Neuron. 9: 619-627. 1992.

56. Heisenberg M., Borst A., Wagner S., Byers D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory memory. J. Neurogenet. 2: 1-30. 1985.

57. Henkel-Tiggs J., Davis R. Rat homologs of the Drosophila dunce gene code for cyclic AMP phosphodiesterases sensitive to rolipram and RO-20-1724. Mol. Pharmacol. 37: 7-10. 1989.

58. Jackson F.R., Gailey D.A., Siegel R.W. Biological rhythm mutations affect an experience-dependent modification of male courtship behaviour in Drosophila melanogaster. J. comp. Physiol. 151(4): 545-552. 1983.

59. Jallon J.M. A few chemical words exchanged by Drosophila during courtship and mating. Behav. Genet. 14(5): 441-478. 1984.

60. Joiner M.A., Griffith L.C. CaM kinase II and visual input modulate memory formation in the neuronal circuit controlling courtship conditioning. J Neurosci. 17(23): 9384-9391. 1997.

61. Joiner M.A., Griffith L.C. Mapping of the anatomical circuit of CaM kinase-dependent courtship conditioning in Drosophila. Learn. & Mem. 6: 177-192. 1999.

62. Kalderon D., Rubin G.M. Isolation and characterization of Drosophila cAMP-dependent protein kinase genes. Genes Dev. 2(12A): 1539-1556. 1988.83

63. Kamyshev N.G., Iliadi K.G., Bragina J.V. Drosophila conditioned courtship: Two ways of testing memory. Learn. & Mem. 6(1): 1-20. 1999.

64. Kane N.S., Robichon A., Dickinson J.A., Greenspan R.J. Learning without performance in PKC-deficient Drosophila. Neuron. 18:307-314. 1997.

65. Mane S.D., Tompkins L., Richmond R.C. Male Esterase 6 catalyzes the synthesis of a sex pheromone in Drosophila melanogaster females. Science. 222(4622): 419-421. 1983.

66. Mariath H.A. Operant conditioning in Drosophila melanogaster wild-type and learning mutants with defects in the cyclic AMP metabolism. J. Insect Physiol. 31: 779-787. 1985.

67. Mihalek R.M , Jones C.J., Tully T. The Drosophila mutation turnip has pleiotropic behavioral effects and does not specifically affect learning. Learn. & Mem. 3(5): 425-444. 1997.

68. Min K.T., Benzer S. Spongecake and eggroll: two hereditary diseases in Drosophila resemble patterns of human brain degeneration. Curr. Biol. 7(11): 885-888. 1997.

69. Pechine J.M., Antony C., Jallon J.M. Precise characterization of cuticular hydrocarbons in young Drosophila by mass spectrometry. J. chem. Ecol. 14(4): 1071-1085. 1988.

70. Postman L. Transfer, interference and forgetting. In: Woodworth and Schlosberg's experimental psychology. 3rd edition. Eds. J.W. Kling, L.A. Riggs. New York. Holt, Rinehart and Winston. P. 1019-1132. 1971.84

71. Preat Т. Decreased odor avoidance after electric shock in Drosophila mutants biases learning and memory tests. J. Neurosci. 18(20): 8534-8538. 1998.

72. Qui Y., Chen C.-N., Malone Т., Richter L., Beckendorf S.K., Davis R.L. Characterization of the memory gene dunce of Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 222: 553-565. 1991.

73. Qui Y., Davis R.L. Genetic dissection of the learning/memory gene dunce of Drosophila melanogaster. Genes Dev. 7(7B): 1447-1458. 1993.

74. Quinn W.G., Harris W.A., Benzer S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 71: 708-712. 1974.

75. Quinn W.G., Sziber P.P., Booker R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277: 212-214. 1979.

76. Richmond, R.C., Senior, A. Esterase 6 of Drosophila melanogaster: kinetics of transfer to females, decay in females and male recovery. J. Insect Physiol. 27(12): 849-853. 1981.

77. Robertson H.M., Preston C.R., Phillis R.W., Johnson-Schlitz D., Benz W.K., Engels W.R. A stable genomic source of P-element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118: 461-470. 1988.

78. Rohrbough J., Pinto S., Mihalek R.M., Tully Т., Broadie K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23(1): 55-70. 1999.

79. Sawateeva E.V., Peresleny I.V., Peresleny A. Temperature-sensitive mutations affecting cAMP metabolism in study of learning in Drosophila. J. Neurogenet. 6: 145. 1991.

80. Sawateeva E., Peresleny I.V., Peresleny A., Tokmacheva E., Medvedeva A., Sharagina L. Behavioral and biochemical effects of the agnostic gene mutations. J. Neurogenet. 8: 247-248. 1993.

81. Schaeffer E., Smith D., Mardon G., Quinn W., Zuker C. Isolation and characteriszation of two new Drosophila protein kinase С genes, including one specifically expressed in photoreceptor cells. Cell. 57: 403-412. 1989.

82. Schuster C.M., Lin D.M., Goodman C.S. Genetic dissection of structural changes at the Drosophila neuromuscular junction: a role for Fasciclin П. J. Neurogenet. 10(1): 49-50. 1995.

83. Schuster C.M., Davis G.W., Fetter R.D., Goodman C.S. Genetic dissection of structural and functional components of synaptic plasticity. Neuron. 17(4): 641-654. 1996.85

84. Schwarz T.L., Tempel B.L., Papazian D.M., Jan Y.N., Jan L.Y. Multiple potassium-channel components are produced by alternative splicing at the Shaker locus in Drosophila. Nature. 332(6166): 740. 1988.

85. Scott D. Inhibition of female Drosophila melanogaster remating by a seminal fluid protein (Esterase 6). Evolution. 40(5): 1084-1091. 1986.

86. Scott D., Richmond R.C., Carlson D.A. Pheromones exchanged during mating: a mechanism for mate assessment in Drosophila. Anim. Behav. 36(4): 1164-1173. 1988.

87. Siegel R.W., Hall J.C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 76: 3430-3434. 1979.

88. Silva A.J., Kogan J.H., Frankland P.W., Kida S. CREB and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21:127-148.1998.

89. Skoulakis E.M., Kalderon D., Davis R.L. Preferential expression in mushroom bodies of the catalytic subunit of protein kinase A and its role in learning and memory. Neuron. 11(2): 197208. 1993.

90. Skoulakis E.M.C., Davis R.L. Olfactory learning deficits in mutamts for leonardo, a Drosophila gene encoding a 14-3-3 protein. Neuron. 17: 931-944. 1996.

91. Sokal R.R., Rohlf F.J. Biometry. 3rd ed. New York. W.H. Freeman & Co. 1995.

92. Strauss R., Hanesch U., Kinkelin M., Wolf M., Heisenberg M. no-bridge of Drosophila melanogaster: portrait of a structural brain mutant of the central complex. J. Neurogenet. 8: 125155. 1992.

93. Tearle R.G., Belote J.M., McKeown M., Baker B.S., Howells AJ. Cloning and characterization of the scarlet gene of Drosophila melanogaster. Genetics. 122: 595-606. 1989.

94. Tempel B.L., Bonini N., Dawson D.R., Quinn W.G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 80: 1482-1486. 1983.

95. Tempel B.L., Livingstone M.S., Quinn W.G. Mutations in the dopa decarboxylase gene affect learning in Drosophila. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 81: 3577-3581. 1984.

96. Tompkins L., Hall J.C. The different effects on courtship of volatile compounds from mated and virgin Drosophila females. J. Insect Physiol. 27(1): 17-21. 1981.

97. Tompkins L., Siegel R.W., Gailey D.A., Hall J.C. Conditioned courtship in Drosophila and its mediation by association of chemical cues. Behav. Genet. 13: 565-578. 1983.

98. Tully T., Boynton S., Brandes C., Dura J.-M., Mihalek R., Preat T., Villella A. Genetic dissection of memory formation in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55:203-211.1990.86

99. Tully T., Preat T., Boynton S.C., Del Vecchio M. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79: 35-47. 1994.

100. Tully T., Quinn W.G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 157: 263-277. 1985.

101. Wang J., Renger J.J., Griffith L.C., Greenspan R.J., Wu C.F. Concomitant alterations of physiological and developmental plasticity in Drosophila CaM kinase II-inhibited synapses. Neuron. 13(6): 1373-1384. 1994.

102. Wustmann G., Heisenberg M. Behavioral manipulation of retrieval in a spatial memory task for Drosophila melanogaster. Learn. & Mem. 4: 328-336. 1997.

103. Wustmann G., Rein K., Wolf R., Heisenberg M. A new paradigm for operant conditioning of Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 179: 429-436. 1996.

104. Yin J.C.P., Del Vecchio M.D., Zhou H., Tully T. CREB as a memory modulator: induced expression of a dCREB2 isoform enhances long-term memory in Drosophila. Cell. 81: 107-115. 1995a.

105. Yin J.C.P., Wallach J.S., Wilder E.L., Klingensmith J., Dang D. et al. Drosophila CREB/CREM homolog encodes multiple isoforms including a PKA-responsive transcriptional activator and antagonist. Mol. Cell. Biol. 15: 5123-5130. 1995b.

106. Yin J.C.P., Wallach J.S., DelVecchio M., Wilder E.L., Zhou H., Quinn W.G., Tully T. Induction of a dominant negative CREB transgene specifically blocks long-term memory in Drosophila. Cell. 79(1): 49-58.1994.

107. Zawistowski S. A replication demonstrating reduced courtship of Drosophila melanogaster by associative learning. J. Comp. Psychol. 102: 174-176.1988.