Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование векторных систем для переноса и экспрессии чужеродных и модифицированных генов в высших растениях

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Конструирование векторных систем для переноса и экспрессии чужеродных и модифицированных генов в высших растениях"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

ЗАХРАБЕКОВА ШАХИРА МОВСУМ кызы

УДК 195.525.2

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

03.00.12 — Физиология растений C3.C0.03 — Молекулярная биология

На правах рукописи

А В ТО РЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Баку—-1994

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Института ботаники АН Азербайджанской Республики.

Научный руководитель:

академик Д. А- Алиев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. М. ДЕЕВ, кандидат биологических наук Д. М. ИСАЕВА.

Ведущая организация — Бакинский государственный университет. Защита диссертации состоится « » . 1994 г.

на заседании специализированного .совета Д004- 12.01 в Институте ботаники Азербайджанской Республики.

- Адрес: 370073, Баку, Патамдартское шоссе, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ботаниг кн Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан « . . . » ...... 1994 г.

, Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Р. К- ДЖАВАДОВА

Актуальность проб лещ. Характерной чертой современного этапа работ по генетической инженерии растений является' тенденция исследований,направленная на улучшение и создание новых сортов растений устойчивых к различным заболеваниям, холоду, засухе, повышенному содержанию солей в почво, действию гербицидов и пестицидов. В последнее десятилетие мы стали свидетелями больших успехов в области стабильной интеграции и экспрессии чужеродных генов в растительной клетке. Одной из важнейших проблем, связанных с трансформацией растений, .является конструирование векторов, обеспечивающих перенос и экспрессию чужеродных генов в новом хозяине-растении. Основной путь решения этого вопроса заключается в конструировании химерных генов, в которых структурная часть переносимого гена находится под контролем сигнальных последовательностей, узнаваемых РНК-полимэразой II. Экспрессия введенных генов возможна под контролем регуляторных участков генов, кодируемых Т-ДНК Т1-плазмид А.(итеГас1епз. Среда существующих в настоящее время векторов для .переноса генов в растения наиболее изучены и широко применяются вектор, полученные на ос-ново Т1-плэзмид агробактеркй, способные эффективно осуществлять перенос генов и обладающие широким спектром'хозяев.

Изучение кохшшзков, рзгултугатх экспрессию генов, даст возмогзюсть конструировать оДоктпв'.шо системы для переноса и экспрессии химерных генов, кодкруьж определенные целевые белки.

Цель работ», целью настоящей работе являлось конструирование систем на основе Т1-алаз:,яд АЛш!а1ас1епа ' для осуществления переноса и экспрессии чужеродных генов в высших растениях, получение Кт-устоЯчивых трансгашнх растений с, использованием этих векторов и методологии культуры клеток и тканей, а такне изуче-шге особ9!ШостеЯ экспрессии введенного гека в трэснформировашшх растениях по активности фермента неогящшфосфзтрансфэразы II. в клеточном экстракта.

Научная познана н пратеггоскоя данность работа. Впэрвно на основе плаз:лщ! рВЛ322 сконструированы прокэггуточнио векторы рА21п2 и рА222п2, в которых структурная часть маркерного гена неомищшфосфэтрансфоразы II поставлена под контроль регуляторных элементов транскрипции, (одного или двух тапде^но связашшх про-

моторов, соответственно, и терминатора) гена 5 Т-ДНЕ pTlActá. Изучены условия индукции морфогенеза из изолкрованах клеток и тканей табака сорта Закатала-4 в условиях In vitro,.

Вследствие неспособности общепринятого антибиотика КЬ по-.давлять рост штатов агробактерий, несущих коинтеграт сектора pCV3S50 с Ек-устойчпБаг,<.црококуточ1Шм вектором, был подобран антибиотик шпкокс (5мгЛш), подавляющий рост A.tumafaclena и нэ влиящнй на ход корфгонотичеешк процессов.

Сравнительной ана-ши уровней экспрессии химерных генов nao, находятся под контрезлзм ' одного или двух тандемннх промоторов гона 5 Т—ДгЕЕС рТШ1г5, в клетках трансформированных растешь не выявил корреляции шзду числам промоторов и уровнем экспрессии-•гена. ■

Получении векторы и данные относительно условий осуществления грасвЦормащй! могут бить использована для пероноса и экспрессия чужеродных генов в растительном генома с цедоз получения растений с нупшй! свойства;,сь

Йублакмст. По кагврзагш дасозрташш опубликована одна статья, рвву-ататы исслодавадЕЕ докладывалась на ков&зрзшвш молодых ученых 111 Азерб.СС? (Баку,1587), Республиканской конференции аспирантов Ш ДзорЗ.'ССР (Баку, 1930), II съезд© Всесоюзного обсастса физиологов растений (Шшск, IS39), I .Республиканской биоиаачвасоЕ: KOHíopcinuaí (Баку,IS3Q).материала быт продставяэ-Ш1 па «згдународвоС шфэроиции ФЕБО (Лзгбляна-Югослався,1987) ,иа конгрессе по биотехнологии (Лнсгердам-ИкдС'рханддД&З?)

(¡óusn p.'jgoii!. Диссертация изложена на 94-страницах машинописного текста и состоит из 'введения, обзора литературы, материалов к катодов, результатов и обсуждения, выводов и списка щгш-руокой литературы (135 ссылок).

СОДЕКШШЕ PA60TU.

I. Кокотрупровакзэ векторов для попекоса генов р шсс;е рзстеихс.

С дэлыз получения векторных систем, эффективно экспресси-. руешх в растительной клетке, на 'основе плазыида рВН322 были

сконструирована два промежуточных вектора, содер^йзпх ген пвот-щтфосфотрансферазн II из Тп5, находящийся под контролен рвгуля-торных последовательностей .гена 5 J-ДШС pTlAchS.. Ген Б Т-ДНК pTlAcli5 несмотря на своза бактериальную природу, .контролируется сигнальными последо2зтвльпос?яки зукариотачаското юта.

В качестг? исходных кояструкцпЗ дм получения промеяуточ-ннх векторов был! использована плззмпда pAZ2 и pJA5, полученные в лаборатории К.Г.Скрябина (ряо'Л). плззмлдц получвнм па основе плазкпда pUC19 и . содержат регуляторше последовательности гена 5 Т-ДНК pTlAch5: фрагмент размером 300 п.н., содэрг.э:щЗ проноторную область, а тага» пзрЕнэ БО нуклэотвдов структурной области гена 5 и тврмшгаторную область размере;.! 280 п.н. 1'тая конструкцию pAZ2, содэрзсаедм две таэдошо связанные промоторныэ области гена 5 Т-ДНК pTlAchS, била поставлена задача получить конструкцию с одной прешторной область» гена 5 с цель» дальнейшего сравнения уровней экспрессии введенных чужеродных генов,

3«лН1 Лгс:>1

Рзс.1. Схема конструирования плазкады pAZI. р-промотор, t - тер-?я!натор.

находящихся под контролем вышеуказанных регуляторных областей. Для получения такого вектора (pAZI) BamHI-EcoRI фрагмент плаз-миды pAZ2 был переклонирован в плазмиду pJA5, предварительно расщепленную рестриктазами BamHI и EcoRI.

Рекомбинантные молекулы ДНК - pAZI и pAZ2 содержат регуля- . торные области гена Б Т-ДНК pTiAch5 с уникальным ВатН1-сайтом между ними,позволяющим клонировать в этот сайт различные структурные участки чужеродных генов.

Для получения Km-устойчивых промежуточных плазмид был использован ген неомщинфосфотрансферазы II из Тп5 с известной нук-леотидной последовательностью.Ген был клонирован в pBR322 (плазмида pATI) в лаборатории генетической инкенерии А.Ташпулатовым. Структурная часть гена neo (около 800п.н.) находится в BglII-Smal-фрагменте, причем BglII-сайт расположен в б-нетранслируемой области. Промотор гена neo был удален сначала вместе с участком Шайна-Дальгарно (плазмида рАТ4), а затем дополнительно с первыми пятью кодонами (плазмида рАТ2), вместо которых был присоединен BamHI-линкер. С целью уменьшения размера маркерного гена из незначащей 3-концевой области был удален фрагмент . величиной около Б50 п.н.. В полученной плазмиде pAT4d Фрагмент, содержащий ген neo, составляет 1050 п.н.. Плазмида pAT4d была использована для получения гибридных генов, в которых ген neo находится под контролем регуляторных последовательностей генаб Т-ДНК pTJAch5.

ВатН1-фрагмент плазмида pAT4d переклонировали в плазмида pAZI и pAZ2, предварительно расщепленные этой рестриктазой (рис.2).

Полученными векторными плазмидамп pAZInl и pAZ2nI трансформировали клетки E.coli (штата К802). Рекомбинантные плазмида были отобраны на среде с добавлением амшпиллина и канзмлцина, а также на основе картины рестрикциошюго анализа, полученной в результате электрофореза в агарозном геле (0,87. гель, трис-уцн татный буфер) (рис. 3).

Еще не,- до конца изучен вопрос о сигналах р'.тулншш транскрипции в клетках E.coli и A.tumeíaclenu. Результаты показали, что химерный ген neo экспресснруется ь клетках B.oolî. Причти устойчивости клеток Е.ооЦ к кэиамицину,трт*ро{«ирс>ы1тшх нло;-.-мидаки pAZInl и pAZJnl, возможно, докличется ь тсм.ч'К' промотор

Рис. 2. Схема конструирования плэзшщ pAZInî и pAZ2nI. Заштрихованный участок - структурная часть гена К>й-устей'птг,остп, р - промотор, t - терминатор.

гена 5 Т-ДНК pTiAchS работает в клетках В.coll. Альтсрпзтившл.! предположением является то, что в место лрнсоэдшюниа промотора гена 5 я гена пео возникает бактсриалккЗ про:;отор. Определена •«акешальноя концентрация кашкдашпз, па которой cnocoCrai расти •толугенпне Кга-устойчнвио щтаммн E.coli (табл.!). Подучетпго дан-:не показал;, что ота концентрация для гшгмзд pAZInî и pAZ2nI зостгголяот 500 !.<Г/Л.

ПроН'Э?'утсчш2о Кгп-устоЛташе векторы pAZInî н pAZ2nI получе-гл im основе шшзмидн pUG 19, в которой Ьот-участок,играющий ваз-î.7ïî роль в иснмгациошом переносе, зяттквпрован. Перекос отих

Рис.3 Электрофоретический анализ рестрикционных фрагментов плаз-мид pAZInl и pAZ2nI в 0,8St агарозном геле. Сверху указаны • названия рестриктаз, справа- размеры фрагментов в н.н. . (B-BamHI, H-HlndIII, E-EcoRI).

' • Таблица I

Устойчивость к канамицину •клеток E.coli, несущих химерные гены g5-neo

Плазмида Концентрация Кга.в мг/л Эффективность действия

pAZInl 50 100 250 500 600 Г7~Г+~

pAZ2nI 50 100 250 500 600 + + + + -•

Примечание к таблице I В таблице знаком "+" 'о.тмечен рост бактерий, знаком "-" отсутствие роста.

ш'азмвд из E.coll в A.tumefaclens можно осуществить, используя зспомогательные для конъюгации плазмиды, обеспечивающие функции .гобилизацяи (mob) и переноса (tra), действующие в транс-положе-чии. Вектор pBR322 содержит Ьот-участок и частота • переноса промежуточных векторов, полученных на основе плазмиды pBR322 почти в 50 раз выше, чем в случае с промежуточными векторами, полученными на основе плазмиды pUC19. Вследствие этого была поставлена задача получить промежуточные Km-устойчивыв векторы на основе плазмиды pBR322. Дня этого HinHil-EcoRI-фрагмент плазмид pAZInl и рА7,2пТ был перепланирован в pBR322,расщепленную вышеуказанными рестриктозами (рис.4).Полученные плазмиды pAZIn2 и pAZ2n2 содержат химерный ген устойчивости к канамицину. Эти плазмиды были трансформированы в бактериальные клетки (штамм E.coll-HBIOI). Рекомбинантные плазмиды были отобраны на среде 'с добавлв1шем ам-

Рис. 4. Схема конструирования плазмид рАИХпг рАй2п2.• Заштрихованный участок - структурная часть гена Кт-устойчивости, р - промотор, t - терминатор.

пицшшша и канами дана, а та же на основе картины рестрикционно-го анализа, полученной в результате электрофореза.

. 2. Коныогациошшй перенос рекомбинантных плазмид pAZIng и pAZ2r¡2 из E.coll в A.tumefaclens

Промежуточные Кш-устойчивыа векторы pAZIn2 и pAZ2n2, полученные на основе плазмиды pBR322, вводили в A.tumafaclens путем коньюгащм. В настоящее время разработан метод мобилизации векторов, полученных на основе плазмиды pBR322, в A.tumafaclens, используя акцепторную плазмиду pGV3850 (G.Lichtenstein et.al., 1985).Плазмидa pGV3850 является производной плазмиды pGV3839, У которой все онкогенные сайты удалены и заменены последовательностью pBR322.Любой фрагмент, клонированный в вектор типа pBR322 мокет быть легко встроен в pGV3850. Для функционирования системы конъюгации использовался штамм E.coll GJ23, содержащий две плаз-мядо-помощника, pGJ28 и pR64drcl11. Трансмиссибельная плазмида pR64dni11, действуя в транс-полокении,обеспечивает перенос плазмид семейства ColEI из E.coll в A.tumefaclens. Для обеспечения функций мобилизации слукит плазмида pGJ28. Она совместима с pBR322, содержит bom-сайт и mob-ген, продукт которого узнает специфическую последовательность bom-сайт. Конъюгацию, необходимую для переноса'промежуточных векторов из E.coll в A.tumeíacl-епз, осуществляли двумя альтернативными способами: методом трех-родительского' скрещивания и с помощью двухступенчатого переноса. Независимо от способа введения рекомОннзнтной конструкции в Л.turnefaclena, сначала происходит'конъюгационный перенос вспомогательных плазмид pR64drd11 и pGJ28 из донарного штамма E.coll GJ23 в штамм HBI0I, содержащий промежуточный вектор, а затем плазмиды-помощники обеспечивают, перенос в агробактерию всех трех плазмид .Двухступенчатый перенос осуществляли путем проведения сначала двухродительского скрещивания между штаммом Е.соН HBI0I, несущим Кга-устойчивый промежуточный вектор и штаммом E.coll GJ23, содержащим вспомогательные плазмида. Второе скрещивание проводили между первым трансконъюгантом и штаммом A.tume-faclens GV3101, содержащим акцепторный вектор pGV3850, несущий функции vlr-помощника. Метод трехродительскогс скрещивания достаточно прост и экономичен во ьрсмени: все три вышеуказанных

штамма смешивали вместе и отбирали здалаемые трансконъюганты нб селекционной среде. Этот метод возможен вследствие того, что ко-нъюгационный перенос вспомогательных плазмид из одного штата E.coll в другой происходит с высокой частотой.

Введение бинарного вектора рВ1п19 в штамм vlr-гомощник LA4404 было осуществлено двумя методами: методом трехродительс-кого скрещивания и методом трансформации. Бинарный вектор pBlnt9 способен реплицироваться как в клетках E.coll, так и в A.tumela-clens. В трехродительском скрещивании штамм E.coll HBIOI,несущий бинарный вектор рВ1п19, смешивают с штаммом HBIOI, содержащим плазмиду-помощник pRK2013 и с штаммам A.tmefaclena LA4404, несущим плазмиду pLA4404, ответственную за функции вирулентности. Альтернативно, для введения плазмиды рВ1п19 в акцепторный штамм LA4404 использовалась методика трансформации. Полученные трансформанты использовали как контрольную систему для трансформации растений.

Вслед за осуществлением введения промежуточного вектора на основе плазмиды pBR322 из E.coll в A.tmefaclena, был проведен анализ полученных трансконъюгантов на минимальной АВ-среде с контрселекцией на среде с добавлением канамицина и ампициллина. Трансконъюганты анализировали также методом дотчзлот гибридизации (fianlatls et al., 1982). Для этого было проведено выделение суммарной ДНК из отдельных колоний агробактерий, полученных в результате трехродительского скрещивания. Для скрининга трансконъюгантов в качестве зонда был использован фрагмент ДНК, содержащий структурную часть'гена неомищшфосфотрансферазы II из Tn5 E.coll, меченный при помощи метода ник-трансляции (Kanlatle et al., 1982). Радиоавтограмма гибридизации приведена на рис.5.

3. Выбор объекта и катода трансформации растангтй

Для работ в области генетической модификации растительной клетки и клеточкой инженерии.культура изолированной ткани табака является одной из наиболее удобных моделей. Причина этого заключается в том, что растения табака во-пергах являются одним из объектов, которые в природе трансформируются A.tmraiaclena; во-вторнх обличаются большой пластичностью в изолированной культуре*, в-третьих культура табака наиболее хорошо изучена в условиях

•к'

Рис.5. Гибридизация эксконъюгантов, • содержащих векторы pAZIn2 и pAZ2n2 с ник-транслированным фрагментом ДЦК, содержащим ген Kir,-устойчивости. К-контроль-гибридизация pGY3850 (не . содержащей ген Km-устойчивости) с ник-транслированным фрагментом ДНК,содержащим ген Km-устойчивости.

In vitro.

Предварительные эксперименты были посвящены изучению зависимости процесса каллусообразования от природа исходного эксплантата и типа индуктора, •применяемого для получения каллуса.

Предварительные эксперименты подтвердили высокую каллусооб-раз'уицую способность табака сорта Закатала-4. Нами были получены штаммы культуры клеток из сердцевинной паренхимы стебля, паренхимы листьев и черешков листовой пластинки. Второй этап исследований был посвящен отработке индукции морфогенеза и изучению рз-генерационной способности культивируемых клеток различного происхождения. Состав сред и их сравнительная эффективность оценивались при.получении растений-регенерантов табака отдельно как для каллусной■ткани длительно пассируемой, так к для ткани каллуса из Листовой пластинки. Все"среда пспытывалмсь в двух вариантах по углеводному компоненту: в первом случае в качэстьо источника 'углевода использовалась сахароза,-а во-второа - гймоза.

Замена сахароза на еквивалентноо количество глхкозы ускоряет образование расгашй-рогвлорантог во времена к увгжнЕаат m процентный выход. Крох» того, ргот^шя-рег-ж-ралти, сСрэдъаык-осй на среде с добааленаэы глзкоз&.отлнчадэсь бшеа привальной

формой и высокой жизнеспособностью.

Наилучшие результаты получены при использовании таких индукторов роста, как кинетин и НУК. При увеличении .соотношения . ци-токинина к ауксину образуются регенеранти с развитой корневой системой. В остальных случаях, когда соотношение ауксина к цито-кинину равно 2:1, образуются растения без корневой системы..

Основной задачей настоящего исследования являлась разработка каллусной модели для успешного переноса чужеродной генетической информации.

Анализ полученных моделей показал, что использование каллусной ткани, длительно пассируемой в условиях In vitro, для которой применяется двухэтапная схема получения растений-регенерантов, может быть не вполне корректной вследствие объективных причин, вытекающих из методологического подхода к проблеме анализа полученных растений-регенерантов. : .

Одним из принципиальных соображений, заставивших нас искать новый подход к проблеме переноса чужеродной'информации в растительную клетку в условиях In vitro с последующей реконструкцией, растений, является существование так называемой самоклональной изменчивости, возникающей при длительном культивировании клеток в условиях In vitro.

Уже на первых этапах культивирования геном • растительной клетки находится под постоянным давлением среда. Кроме того, освобождение клетки из под контроля организма ведет К большой генетической вариабельности в культуре In vitro, что может затруднить идентификацию генетических изменений при. генно-инженерных работах. •' ■ ■ ; :

Именно поэтому,в наших дальнейших исследованиях мы были вынуждены разработать и применить способ одноступенчатого -получения растений-регенерантов в условиях In vitro. Нами был применен способ получения каллуса с одновременной индукцией органогенеза непосредственно из листовой пластинки растет® табака.

Преимущество такого, метода получения растений-регенерантов в случае предварительной трансформации растений позволило совместить перенос чужеродной информации, регенерацию растений и эффективную селекцию трансформантов в едином процессе.

Использовать различных фитогормонов и их соотношений дало

различные эффекты в отноиении рогенерационной способности листо- . вых дисков. Во всех вариантах соотношении ИУК и кипетипа давало начало хорошей индукции каллуса на первичных эксплантатах. Наилучшие результаты получены в вариантах с использованием: I) МУК (Iмг/л), кинетива (1мг/л): 2) КУК (0,5 мг/л), кинетика (1мг/л). В этих, вариантах отмечен органогенез без нарушений ъ отличие от других полученных вариантов, и которых наблюдалось образование побегов и корней, что отрицательно влияло на процессы роста и развития растений-регонерантов.

В отношении углеводного компонента среды, глюкоза оказывала лучший эффект на выход регенератов и их жизнеспособность. Начало морфагонеза происходило в темноте, свет ь начальный период 1шгиоировал процесс морфогенеза, что видимо связано с нарушением полярного транспорта аушша и, тем самым, с изменением балансь гормональных факторов.

Из двух нш'лучашз вариантов с моркодышм точением корфогв-нотических процессов бил использован ь дальиейюм иг.р»».'>нт с кон-цептрациой ИУК-1нг/л и шшоппз - 1 шул, ¡пк вариант, огт'сив-чиваюоий наибольший выход растений-рогинч-рлнтов.

4. Трансформация растигслыаг кяото& ко-кульуивзгегаС с АД'дГ|01ас1епЕ

А.июоГагЮпе способна трансформировать растоюлыь!» кл..-т-ки, сменше с порайонной тканью, которые иретерпопамч- кл>»точ1К4» д?лэгак> в ответ на порайонно. Клотки кьтактшх рас1«Ш!Л показываю* ыакешальшй отвот на внфгжшш Л. 1игг,еГас1епя в промежутке 1,Ь в 2 дня поело пораноний.У различии/. рао.тогоШ о га •„••лвь-гои':-ная {аза согласуется с началом клеточного д/уишя, г-слшь'н-гч» г ответ на поранение.

Как уже было указано ь продидуш-м рачделе, тр т.'.'фор'.!.':;!,!!:. растений таб'жа проводили китодом мотлш диск'»; >:'..

а1., 1935). Листовые диски дорезались из пэь-рхи-н- ;н >-<.,?"р:и1й:>'' ВЙШШХ ЛИСЛ'ЬеВ С КЖОЩЬЮ пробочного сверл!: ди^^'.ь-тр- !М ,"('1 !.'М. КМ-фицировагам проводилось двумя различными сти-ссл^ки.-.ч ним оп>-собом являлся путь инфицирования рчиои.: к.-ч-раноп-й дй'т--!' п;. ток погружения в кулыуру А.икпаГасН-т-. 1' качнет?-' очитних сио-

том для трансформации использованы полученные Кт-устойчивые iütoiímu A.tumafaciens, давшие положительный сигнал гибридизации с ник-транслированным Фрагментом, содержащим структурную область гони устойчивости к кзнамицину, а в качестве контрольной скст-ега использован агробактериальннй штамм, .содержащий вектор pBinI9. Возраст и титр бактериального инокулята оказывали незначительное влияние на эффективность трасформации, было важно, однако, избегать излишнего пропитывания исходных тканей листовых дисков бактериальной культурой.

Другим способом трансформации являлся способ 'нанесения штриховых ранений поверхности дисков с помощью иглы, смоченной в растворе бактериальной культуры.

Зараженные диски переносились в чайка Петри с питательной, средой, где выдергивались от 6-7 дней для адаптации и индукции морфогенеза.Как показали нош исследования.при помещении дисков, зараженных агробоктерией, на питательную среду начитается достаточно бурный рост A.tanafaciens. Нарастание массы A.tumafaciens р, случэо с стгашми векторами опережзет развитие каллусных клеток, аоразукглх^ч т'э .истовой ткани и у:-::е к концу 7 дня клетки фактор-!.':, / -.легатлтл гоголрл^и эй питательную среду а лэксш-:':* '•.::т--.;гГ1г гзгг'кругя развитие каллуса и

горлллл.' . л л ;гр:чт'.".?'/о:-. w." этого был модифицирован ллаоо трсноллллл лаллл .гсгз, что заключалось в нанесо-ла: А. л~л Г"л 1лл тс.:.-;-; ;:> т-; „-лотовых дисков. Этот

слосао лллллл с лал'м!:лГ: ;лск:н л растворе бактерий нс-ллла л глл'ллсл 'л-~л:ла ::орл'ол'л поверхности дисков с пи-татал ст у 2. Z '. аол""-- ' "лллдал.; дэкнре по временным ха-[лктср.л.тлл'л ;- ал:.лл Дллл;1 лл?П5 в трене.-очарованных. дис-

1!с:-:ол" .rr.orjK, фц.з&т."' я габяле Z, в основном был пплла-л аллл. пааорхл еллго лла-лля г-скс?. Перенос дисков л-лл. . 0 л';"' "ла-'ллга'лл "j гототхл содержался кана-

лл:л {IC J лл,-лл \ агл-л у /лгчЛлнптдлгн (500

"кг/мл.; ал:а:Слслл. гэдаг.ляллл рал: .Л лла1эа1еп:з, показал, что за ;Л'к."л-'."'ч'-"?1; лллл->; с глкюрсл сВ1я19 во всех остальных тлрлшлл ;:а"..:гда.:лт >лтлл:;:-нь>К рост A. turna fao leus, к а подавля-

Таблица 2

Влияние способа инфицирования на время начала роста бактериальной массы

Тип вектора

Способ трансформации

Время начала роста бактериальной массы (сутки)

pAZIn2:pGV3850:pGJ23

инкубация

5

поверхностное 10

заражение

инкубация ' ' 4

поверхностное 10

заражение

инкубация 6 .

поверхностное ■ 12

заражение

pAZ2n2:pGV3850:pGJ23

pBinI9 (B LA4404)

Вследствие того,,что карбенищшшн (500мкг/мл) не подавлял рост A.tumefaciens в случав с опытными штаммами агробактерий, был поставлен повторный эксперимент, в котором концентрация кар-бенициллина была увеличена до пятикратной (2500 мкг/мл). Результаты анализа показали, что и эта концентрация этого антибиотика также не приводила'к подавлению роста A.tumefaciens. Положительный результат не был получен и при увеличении концентрации кар-бенициллина до 5 мг/мл. Это обстоятельство побудило к поиску и подбору различных антибиотиков, подавляющих рост A.tumefaclene и не влияющих на ход нормального морфогенеза в условиях In vitro. Результаты этих исследований указаны в таблицах 3 и 4.

Исходя из данных, приведенных в таблице 3, выяснилось, что только два из общего количества испытанных антибиотиков обладали способностью подавлять рост A.turnafасlens, а именно ампиокс <5 мг/мл) и левомицетин (150 мкг/мл). Влияние на рост агробактерий различных антибиотиков, взятых в концентрациях,соответствующих трем последним-значениям, указанным в таблице 3, показано на рис. 6.

Данные, указанные в та<Шга* '1, скид-тодьстпу.^ <■> т-м, что левомшдоин полностью подавляет регенерчц'г'онн-.и щкмиссы.Ош-чг»-

Таблица 3

Влияние антибиотиков на рост АЛцюаГас1епз ■

Антибиотики Концентрация (мг/мл) Эффективность

подавления роста

Бензилпенциллин 0,25 0,5 0,75 1

Стрептомицин сульфат 0,25 0,5 1 5

Ампиокс 0,25 0,5 2,5 5

Полимиксин В сульфат 0,25 0,5 2,5 . 5

Карбенициллин 0,25 0,5 2.5 5

Левомицетин■ 0,05 0,1 0.15 0,2

Примечания к таблице 3 означает, что рост агробактерии не подавляется; "+и - рост агробактерии подавляется.

Таблица 4

Действие антибиотиков на листовые диски растений тьбака

Антибиотики Концентрация (мг/мл) Эффективность действия

Левомицетин 0,1 0,15 0,2 . _

Ампиокс 2 3,5 5 + + +

Карбенициллин 2 3.5 5 '+ " + ■ +

Примечания к таблице 4 означает подавление регенерационных процессов; "+" - процессы регенерации имеют место. -

лось явное нарушение процессов поглощения води и питательных веществ среди, что является первым этапом адаптивности ткановцх культур посла посадки на питательные среда. ТкЗпь в дальнейшем сморщивалась и шнсротизировалась. Хотя левсмзцзтин (150 мкг/мл) и подавляет рост бактерий,но пнгиблрувдее влияние этого антибиотика на ход морфогенотических процессов необратима и ' поэтому в дальнейшей работе он на использовался.

При добавлении в среду ампиокса и карбенпщшпша в концент-

Бонзштенциллин

- Стрептомицин сульфат

Ампиокс

Полимексин В сульфат

Карбенициллин

Левомкцетин

Рис. 6. Эффективность подавления различными антиьиотиками роста A.tumaiaclens. I, II. III указывают на 3 последние концентрации антибиотиков (см. табл.З). Справа указаны названия антибиотиков.

рацйях, указанных в таблице 4 процессы регенерации имеют место, хотя при увеличении концентрации этих антибиотиков выше 600 мкг/ 'мл процессы регенерации замедляются во времени по сравнению с контролем. Поскольку,, ампиокс в концентрации 5мг/мл заметно на влияет на ход морфогенетических процессов, а также концентрация этого антибиотика достаточна для подавления роста агробактерий, то именно ампиокс (Бмг/мл) и был использован в эксперименте по

регенерации растений, трансформированных опытными штаммами агро-бактерий. На рис. 7 и 8 показаны трансфомироваиные побеги, выращенные на среде с добавлением ампиокса (Бет/мл).

листовых дисков табака, трансформированных Кт-устойчивши

пкоконшгантами. ' '

4. Анализ экспрессии хкмзрцого'гена neo, регулируемого сигпальшэв! посладоватадыюст.тл гона 5 Т-ДНК pT!Ach5

Для анализа экспрессии химерных-генов нэокицинфосфотрансфе-разы II в клетках трансформированных растовкЗ табака было проведено радиометрическое определение активности КРТП в экстрактах растительных клеток, используя Р ATP (Reiss et all.,1984). Бактериальный Фзрмент NPTII осуществляет перенос . радиоактивного Y-фосфата АТР на канамищш, который в результате этого становятся

радиоактивным. С целью количественного определения продуктов этой реакции, фосфорилированный канамицин отделяли от высокорадиоактивного АТР с помощью специальной ионообменной бумаги (фэс-фоцеллюлозы Whatman Р81).

Рис.8. Трансгенный регенерант табака, несущий химерный ген прШ

В эукариотических клетках наблюдается высокий уровень эндогенной АТР-азной активности, конкурирующей с ферментом NPTII за меченный АТР. Для решения этой проблемы и получения достаточного для оценки количества фосфорилированного канамицина было проведено разделение активностей NPTII и АТР-азы с помощью неденату-рируящего электрофореза в полиакриламидном геле (Harnea et all., 1981). С целью уменьшения потери ферментативной активности разделяемых белков, электрофорез проводили на холоду (4°С).

Как известно из литературы, промотор ген:) г> 7-ДНК pTIAchS проявляет тканеспецифическую активность. Высокий y¡>- конь актив-

Рис. 9. Авторадиограмма 10% неденатурирующего полиакриламядного геля. Активность транслированных полилептидов Ш*ГИ из трансгенных растений табака. 1,2,3- экстракты из трансформированных растений табака (в качестве трансформирующего вектора использовали:1-рА21п2:р073850, 2-рАг2п2: рСУ3850, рВ1п19) 4-- экстракт из ^трансформированного растеши табака.

юсти этого промотора обнаружен в каллусной ткани, в сегментах ¡тебля, но в то ге время в хорошо развитых листьях активность не »бнаруяаэна. Примордиальшо листья и корни показывали низкий уро-юнь активности №?ТП.

В связи с этим в качестве образцов для определения содержа-ия НРТН в клетках трансформированных растений были использова-ы экстракты из стеб,п;й трансформированных растений табака. На :олоду в присутствии смеси ингибиторов протеипаз получены безматочные экстракты из стеблей: I ^«трансформированных растений 'абака, 2)растений табака, трансформированных контрольным векто-

ром рВ1п19, в котором ген neo поставлен под контроль промотора гена нопалинсинтазы, 3)растений табака, трансформировании коин-тегратом p0V3850:pAZIn2, 4)растений табака, трансформированных коинтегратом pGV3850:pAZ2n2, в котором ген neo контролируется двумя тандемными промоторами гена б Т-ДНК pTlAch5.

Из рис. 9 видно, что экстракт из растений, трансформированных контрольным вектором pBin19, содержит более высокий уровень HPTII, чем экстракты из растений, трансформированных опытными штаммами агробактерий. В экстрактах из нетрансформированных растений табака присутствие NPTII не было обнаружено. Результаты эксперимента показали, что в клетках•трансформированных растений степени экспрессии химерного гена neo, находящегося под контролем одного или двух тандемных промоторов гена б Т-ДНК pTlAch5, на уровне электрофоретического анализа и последующего. радиометрического определения .существенно не отличаются. Это моют свидетельствовать о том, что в данных условиях увеличение числа промоторов не влияет на уровень экспрессии химерных генов. Однако, в целом, вопрос о влиянии увеличения числа промоторов на интенсивность транскрипции остается открытым и требует дальнейших исследований. Наконец,определенный интерес представляет изучение роли промоторной области гена 5 Т-ДНК pTiAchö относительно известного из литературы тканеспецпфнческого функционирования ¡скверных генов,- содержащих этот, ке промоторный район.

В11В0ДЦ

1. На основе плазмщщ рВП322 сконструированы пракаэдточныо векторы рА21п2 и рАг2п2, в которых маркоршй ген Кт-устойчивости пео_ находится под контролем регуляторшх элошглй транскршвдга (одного или двух тандемшх промоторов соотаетолиенпо, и тзриаю -тора) гена б Т-ДНК рШсЬБ, Полученный вектор обееп^шьа.п' <»£)-фоктивнуи экспрессия встроошах- чуаеродах генов под контролем соответствующих регуляторних олошитов в расгителышх клетках.

2. Из различных моделышх систем культуры клоток л тканой табака сорта Закатала-4 для трансформации выбрана система листовых дке-ков, позволяющая эффективно регенерировать растеши.

3. Осуществлена трансформация растительных клеток табака путем ко-культивации с A.tumefaclens и подобран соответствующий антибиотик ампиокс (Бмг/мл), подавляющий рост A.tumefaclens .и .не влияющий на ход морфогенетических процессов. Из листовых дисков табака получены трансгенные растения-регенеранты, несущие химерный ген, обеспечивающий Кт-устойчивость.

4. Установлено, что степень экспрессии химерного гена Кт-устой-чивости, находящегося под контролем одного или двух промоторов гена 5 Т-ДНК pTlAch5, в клетках трансформированных растений на уровне электрофоретического анализа, не отличается. Это мокет свидетельствовать, что увеличение числа промоторов не влияет на интенсивность экспрессии встроенных чужеродных генов.

Список работ,опубликованных по теме диссертации

1. Allev J.A., Muradav A.Z.'.Plriev N.T., Zakhrabecova S.M., Lobanov A.N. Transport Ol.foreign genes and proteins to the higher plants.-Abstract of 18 th FEBS Meeting, Ljubljana, 1987, p.145.

2. Allev J.A., Muradov A.Z., Plrlev N.I..Zakhrabecova S.M., Lobanov A.M. Transport, and expression of foreign genee' In the higher plants.-Abstract of congress of Biotechnology, Amsterdam, 1987, p.112.

3.Париев H.K., Захрабекоза ili.M., Лобанов A.H..Македов АЛ., Абзтлов Г.В., ГОсифов Т.П., Нурадов А.З. Конструирование систем для переноса и экспрессии чужеродных генов в выспно растения.-Труда конференции молодых ученых АН Аз.ССР., 1987, стр.1Б9.

4.3ахрабекова Ш.М., Адаалов В.А., Карагезов Т.Г. Селективный отбор кянамицин-устойчивых трзнсгениых растений табака.-I-Республиканская биохимическая конференция, 1990, стр.68.

5,Адж:мов В.А., Ззхрзбекова Ш.М., Карагезов Т.Г.,Алиев Д.А. Трансформация листопчх дисков растений табака'и экспрессия чуне-, родных гонов.-TT Съезд рсесоюзного общества физиологов растений, Минск,' TS90, стр.25.

6. Аливп Д.А..Захрабекова Ю.М.,Ад:ч-алов В.А..Карагезов Т.Г., Муртдс-р А.З. Перенос гена Km в растения табака. - Известия АН Азербайджана, 1901. II 5- 6, стр.3-10. _ /

Хулкез

Con он илдэ биз битки Ьу^раскндэ ¿ад кенлэрин стабил ил-TerpaoHjaoH вэ екпрвооиЛаон оаЪэоиндэ dojyic муваф1лпШэтлэр:ш ша!шди олыушуг.Енткилэрдэ апарылан трансформас^а илэ олагвдар ен вачиб проблгмлердэн бири Jem cahH6-6imaiJa ¿ад кенлэрин ко-чурулмэси вэ експрзсси^асыш те'мин едэн векторларнн копсгрук-оиЗалшздармдмаовднр.Бу мэсэлйнел Ъэлли, квчурулэн кэтш структур Ьпссеслнин биткидэки ШГ-голимераза II тэрэфиндэн тапылан сигнал ардачыллыгларшшн нэзароти алтшда олмагла химер кенлэрин ла ¿Й19лэшдиралмзсидир.

Бизим глин мэгсэди Ti-плазмидандоя истифадэ етааклэ A.tu-nafaoiono асасшда алн биткшюрдэ ¿ад кендермн кочурулнэси вэ eKcnpecciiJacffiEi hajaTa кечирыэк учун вектор систеылэри копст-рукмиалашдармаг.бу вэкторлардан .hy^ejpo вэ тохуы културасы методолоки^сындал истифадо едорок Кш-даващмглы трапскен бит-кил вр алмаг вэ Ьэщишш трансфорлак^а едшниа билшлэрэ дахил едалмиш кенин експресси^а хусуси^этлэршш ьуче^рэнан зулал екстрактшда несштсинфосфотрансфераза II фортантинш октивлз-¿ШГО керв g¿pOIÜ¡3K олмяздур.

Илк дефз рвп 322 плазвдди ооаоцнда аралиг вокторлар pAZfn2 ва pAZ2n2 копструк^адаздар:таадар.Бу вектордарда евоьштсей-фосфотраифораза и маркор коишпн структур !шссосн И-плазнадди-доки (pTlAoli5) Т-ДНГ-дэ ¿арлепвн Б-кокш TpaacicpsncaJacuEa Teromnajsn елемантяэрашш пгаарэтй'алтавдадар (juagar 'оиараг блр вэ Ja ики тандеы бирлегла нро^оторлар во тергапаюруя). In vitro пвраитдэ Вакатала-4 сортлу тугун те'грзд o^srx! JiytaJ-рв se тохумалараида корфавасоаш квдгазиа сэрсата

MyoJJea одвшдщр кв,.5-ы кяш С;гр по ja jes врохогору-пув нззарота алтшща олгш Ka xc:sp Boaanaa zzsa^i^m трглсОор-Maraja едагоаэ ftmaurepm JryteJpíwtcjEie» егекгрсфэрзхи; саиыз CBBsJJscnHSo ферглотнр. Бу нсо ярскгогордг.рыу oajmsm аркласа-нын даход едагаап ¿ад Jtensopsi oiccnpoccnja jsreeiiKawsiJsio тэ'-сцр о ты ода ¿пни костарэ бялзр..

Аланаш вектор лазяч osim xycyrajjsTJopo ыалзк битки влмат

учун ¿ад кенлэрны кочурул-астндо истеХ-здо ед\глэ бзлер.

\ ' 'Ц-

smmiKi

We have witnessed great success in tho fiald of otebls Integration and expression of -foreign genua in plant call during the last decade. One of the main problems, connected with treng-formation of plants is construction of vector for transfer and expression of foreign genes in new host-plant. Tha main way for this problem solution consists in construction a-f chimssric gs-nes in which ceding part of transfer gent» ia regulated by signal sequences, vihich is recognised by PT-'ft-ptjly.T.srasoI I.

The aim of the present work is to construct vector systems on the basis of Ti-plasmids of A. tur.ef aci sns used far transfer and expression of foreign gene* in higher plants, to obtain 'im-resistant trsnsgonous plants by using this vectors -and ¡»atodolo-qy of coll and tissue cultures and also to leern peculiarities of introduced gene expression in transfarmed plants on the basis of neomycin phosphotransferase activity in cell extract.

For the first tim<? on the basis of p0R322 «ere constructed intermsdic.ta vactora pAJlnS and pAZ2n2, in which coding regicn

(-¡is put under control ".wlp! ten (era or tno tandemly nr! t-r'iinatcr> Qf gtm»5 of T-DHA ei-.-fasia induction from isolated kitala-'? «"aristy ware studiod in

of nirI:ri n phncpotr of regul.itc- -»l^f-rnts of f.r-. bounded prc.Tsotcr*:, ^ceordingl v's of pTiAchS. Cnnditi/snu of rcrp tobacco cells and tissues, of vitro.

Antibiotic <*?pi 1 '«ilich -tsoaresa Ak tumaf ociens

grot'..h and don't influences (r/jrptvrjcnntic processes courss found.

It »S3 fcurtii that' dagroa of axpr,»anion of chimeric Km-ra-sistant qat12 i-hich was under control cf ena cr two pronators of gsne 5 or T-rKA of pTiAchS in trcnoftsroattco. film* talla at al-actrophorfifcic Analysis 1?vj1 did nat differ*. Thio ¡■*'s,y testify, that incrs.i3ff of pro-ioiora number daaan't '.nf luonea intensity of introduced foreign genes oppression. . '

Obtained vectors «nd data cn conditions of trm-sicrreatiei realization can be usad for i.r.-»naf ar and exprassian of foreign

r

genes in plant genons ta obtain plsmtn with required proper—' ties. '

- ii- . ■