Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование штаммов-реципиентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и анализ в их клетках митотической стабильности рекомбинантных плазмид и уровня экспрессии гетерологичных генов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструирование штаммов-реципиентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и анализ в их клетках митотической стабильности рекомбинантных плазмид и уровня экспрессии гетерологичных генов"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

На правах рукописи УДК 575.24:576.85

ВОРОПАЕВА Лилия Андреевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ-РЕЦИПИЕНТОВ ДРОЖЖЕЙ 8АССНАЯОМУСЕ5 СЕ1*ЕУ151АЕ И АНАЛИЗ В ИХ КЛЕТКАХ МИТОТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД И УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ

ГЕНОВ

(03.00.15 — генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

ВОРОПАЕВА Лилия Андреевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ-РЕЦИПИЕНТОВ ДРОЖЖЕЙ БАССНАКОМУСЕБ СЕ1?ЕУ181АЕ И АНАЛИЗ В ИХ КЛЕТКАХ МИТОТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД И УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ

ГЕНОВ

(03.00.15 — генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток г. Санкт-Петербурга

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор И. А. Захаров доктор медицинских наук, профессор О. К. Кузнецов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И. И. Толсторуков кандидат биологических наук С. П. Смирнов

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Защита диссертации состоится __1992 г.

в на заседании специализированного совета Д.098.12.01

при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов корпорации «Фарминдустрия» — Москва, 113545, ул. Дорожная, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан ,, ^ "__1992 г_

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук В. И. Щербакова

Актуальность исследований. Клетки дрожжей БассЬаготу-сев сеге^ае являются традиционными объектами различных исследований в области биотехнологии. Дрожжи—низшие эука-риоты—как продуценты имеют особое преимущество перед прокариотами, т.к. наличие в их клетках корректной системы транспорта, секреции и процессинга делает их универсальной системой накопления эукариотических и вирусных белков.

Конкретные показатели продукци гетерологических белков в любом продуценте определяются кооперативными взаимодействиями в системе «клетка-вектор». Это предполагает проведение генетикоселекционной работы в двух направлениях при осуществлении синтеза: совершенствование структуры экспрес-сирующего вектора и селекция клонов реципиентного штамма, которая необходима на всех этапах констру^ирования — от эффективной трансформации рекомбинантными молекулами ДНК до высокой стабильности сохранения в клетке целевого продукта

Хорошая генетическая изученность дрожжей, наличие разнообразных коллекций штаммов и возможность целенаправленного конструирования их генотипов во многом определило успех использования дрожжевых клеток в генно-инженерной биотехнологии. В связи с ее дальнейшим развитием сохраняет свою актуальность применение традиционных и создание новых подходов в конструировании и селекции реципиентных штаммов дрожжей с оптимальным генотипом для осуществления синтеза конкретного гетерологического белка.

В нашей работе эффективность различных приемов отбора и конструирования реципиентных штаммов для гетерологического синтеза оценивали по уровню продукции двух белков /9-лактамазы Е.соН и HBsAg вируса гепатита В. Важным параметром анализируемых штаммов служила также митотическая ста-бильность^кЪмбинантных плазмид в популяции клеток.

Создание продуцентов белка HBsAg, антитела к которому создают основу протективного иммунитета против вируса гепатита В, имеет огромное значение в связи с широким распространением вируса и тяжестью клинических форм заболевания.

Существуют различные приемы накопления НВ;^ белка, и дрожжи оказались наиболее эффективными и дешевыми его продуцентами. В настоящее время многие зарубежные фирмы наладили серийный выпуск вакцины на основе дрожжевого рекомбинантного НВ:^ (Гендон, 1988). В СССР также получены дрожжевые штаммы и векторы для синтеза HBsAg (Арман и др., Грановский и др., 1986), а также охарактеризованы основные этапы его накопления и очистки (Симоненков и др., 1985; Успенский и др., 1990). Это послужило основой дл ясоздания технологической инструкции по синтезу в дрожжах НВбА§ при крупномасштабном культивировании, на основе которой получены первые экспериментально-производственные серии дрожжевой реком-бинантной вакцины на предприятиях Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток. Актуальным является разработка приемов оптимизации производства вакцины, в том числе и за счет создания новых штаммов-реципиентов дрожжей.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в поиске и изучении генотипических детерминант дрожжей, определяющих митотическую стабилизацию гибридных плаз-мид и высокий уровень экспрессии генов уЗ-лактамазы Е.соИ и HBsAg вируса гепатита В, для чего предполагали решить следующие задачи:

1. Конструирование экспрессирующих векторов-эписом-ного и центромерного — для анализа уровня синтеза НВзА£ и )3-лактамазы в различных штаммах.

2. Отбор и генетический анализ мутантов дрожжей с повышенной экспрессией плазмидного гена-репортера 1?1а и определение в их клетках стабильности векторов и уровня экспрессии гена НВбА^

3. Изучение влияния увеличения плоидности клеток на стабильность гибридных плазмид и уровень синтеза гетерологи-ческих белков НВ:^ и /3-лактамазы в штаммах как гибридного, так и изогенного происхождения.

4. Исследование возможного влияния локуса МАТ на митотическую стабильность плазмид с различными типами репликаторов.

5. Характеристика полученных штаммов в производстве НВ5А§ при крупномасштабном культивировании.

Научная новизна.

1. Впервые выявлена большая гетерогенность по активности плазмидного гена-репортера/?-лактамазы Е.соН и митотичес-кой стабильности эписомных плазмид в популяции плазмидо-содержащих клонов после длительного неселективного культивирования трансформантов.

2. Впервые для отбора клонов с повышенным уровнем экспрессии гена HBsAgcвыcoкoй эффективностью использовали предварительный скрининг клеток по уровню экспрессии другого гетерологичного плазмидного гена-репортера /3-лактамазы.

3. Впервые изучен уровень экспресии гетерологичных генов HBsAg и уЗ-лактамазы в большой коллекции пол^Поидных клеток как гибридного, так и изогенного происхождения.

4. Впервые выявлены случаи как повышени^так и снижения экспрессии генов HBsAg и/3-лактамазы и стабильности эписомных векторов при увеличении плоидности реципиентных клеток.

Практическая ценность работы. Получена коллекция реципиентных штаммов дрожжей, в клетках которых происходит оптимизация синтеза гетерологичных белков /3-лактамазы и НВ5А& Максимальная продуктивность по HBsAg белку выявлена для штамма Д4015, на основе которого получены 11 экспериментально-производственных серий дрожжевой рекомбинантной вакцины против гепатита В на предприятии Института вакцин и сывороток г. Санкт-Петербурга. Штамм Д4015 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Обнаружена гетерогенность популяции плазмидо-содер-жащих клонов дрожжевых трансформантов после длительного неселективного культивирования по признакам экспресии плазмидного гена-редортера /3-лактамазы и митотической стабильности эписомных плазмид.

2. Предварительный скрининг клеток по уровню экспрессии гетерологичного плазмидного гена-репортера Ыа служит эффективным способом селекции клонов с повышенным синтезом вирусного белка HBsAg.

3. В большинстве диплоидных и триплоидных штаммов

наблюдается увеличение синтеза гетерологичных белков /З-лак-тамазы и HBsAg, а также повышение митотической стабильности эписомных плазмид.

4. Структура локуса МАТ штамма-реципиента влияет на митотическую стабильность эписомных плазмид.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых во ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1989 г.) и Ленинградского института вакцин и сывороток (1988 г.), на Всесоюзной научной конференции во ВНИИТИАФ (1988 г.), на заседании вирусологической секции Общества микробиологов и эпидемиологов (1991 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 182 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов. Текст иллюстрирован 19 таблицами, 12 рисунками. Список литературы включает 204 названия работ отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Используемые в работе штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae по своему происхождению являются представителями XII расы Петергофских генетических линий (ПГЛ). Штамм YF-135 получен из Канадской коллекции.

В работе использовали плазмиды У Ер 13 (LEU2, AmpR,TetR), pYF91 (LEU2, AmpR), Rcp2 (LEU2, AmpR), полученные от Пешехо-нова B.C. (ЛИЯФ АН СССР), pFL38 (URA3, AmpR), предоставленную Самбук Е.В. (БиНИИ). Плазмида pNMVG-3954 (LEU2-d, Amp«) была предоставлена авторами (Грановский H.H., Институт вирусологии АМН) в НИИВС г.Санкт-Петербурга для получения HBsAg белка на опытном предприятии в связи с созданием серийного производства дрожжевой рекомбинатной вакцины против гепатита В и была использована в лаборатории экспериментальной вирусологии при выполнении научной темы «Оптимизация технологических приемов получения рекомбинатной вакцины

против гепатита В» (1989 г.), в которой принимал участие автор диссертации.

Среды для выращивания дрожжей, споруляции, микроманипулирования готовили в соответствии с руководством (Захаров и др., 1984 г.). Клетки Е.соН выращивали в среде ЬВ (Маниатис и др, 1984).

Ауксотрофные мутанты и мутанты по типу спаривания у дрожжей получали под действием УФ-света в дозе 300 Дж/м2 при анализе отдельных колоний. При создании полиплоидных штаммов гибридного и изогеннош происхождения проводили скрещивание клеток с частично комплементарными потребностями. Гете-розиготность по типу спаривания устанавливали по споруляции, гомозиготность — по частоте спонтанного появления рецессивной мутации сап на среде с 60 мкг/мл Сп504.

Отбор клонов с повышенным уровнем синтеза /8-лактама-зы проводили среди плазмидо-содержащих клеток трансформантов, предварительно облученных УФ-светом в дозе 300 Дж/м2,после культивирования в среде УЕРД в течение 115130 генераций. Культуру поддерживали в состоянии логарифмического роста, пересевая клетки через сутки в свежую среду УЕРД. На последнем этапе, когда доля плазмидо-содержащих клонов в популяции составляла 0.1-1 % для трансформантов с зписом-ными плазмидами и 75 % для клонов с центромерной плазми-дой, клетки высевали в концентрацию3-^ на селективную среду УМЗ с добавлением соответствующих аминокислот. Через 5-7 суток образовавшиеся крупные колонии откалывали на индикаторную среду (7 г сухой основы УИВ, 1 г Д-глюкозы, 2 г растворимого крахмала, 20 г агар-агара, фосфатного буфера до 1 л) для определения активности /9-лактамазы по методу Шевалье (1979). Клоны разного фенотипа по/?-лактамазе клонировали на селективной среде.

Оценку митотической стабильности плазмид проводили путем определения 1) процента клеток, сохранившихся селективный маркер плазмиды, от общего количества проанализированных клеток; 2) скорости потери плазмиды на генерацию по формуле: I = (1-(б/а) ) / X, где

i — частьклеток, которые теряют плазмиду в каждой генерации,

а — фракция плазмидо-содержащих клеток при посеве в

среду,

б — то же после X генераций.

Уровень активности HBsAg определяли в осветленных лизатах дрожжей с помощью реакции непрямой гемагглютина-ции (РНГА) с использованием стандартного эритроцитарного диагностикума (ИЭМ, г.Нижний Новгород). Клетки выращивали в среде minPi с низким содержанием фосфора (0.03 г/л) как в лабораторных условиях (100 мл), так и в производственных в реакторах емкостью 100 или 600 л в течение 18-48 часов. Осадок растворяли в фосфатном буфере (pH 7.5) с PMSF до концентрации

109 кл/мл и подвергали дезинтеграции со стеклянными бусами.

Амплификацию и выделение плазмидной ДНК из клеток Exoli проводили по методу Birnboin (1979). Очистку водного раствора нуклеиновых кислот от примесей РНК и хромосомной ДНК осуществляли с помощью РНКазы и методом гель-фильтрации на сефарозе CL-2B. Реакции рестрикции плазмидной ДНК эндо-нуклеаазами BamHI, Sali, Pstl, Hindill, EcoRI, лигирование ДНК фрагментов с помощью Д НК л игазы фага Т4 проводили с учетом известных рекомендаций (Маниатис и др., 1984). Электрофорез плазмидной ДНК осуществляли в 0.8 % агарозном геле. Трансформацию бактериальных клеток проводили по методу Kuschner (1978), используя соли СаС1г и RbCl. Для получения компетентных дрожжевых клеток и их трансформации плазмидами применяли хлористый литий по методу Ito е.а. (1983).

Белковый электрофорез в 15 % полиакриламидном (ПААГ) геле проводили по методу Laemmli (1970) с последующей окраской AgNOj (Wrag е.а., 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование экспрессирующих векторов 2-УЕр13 и 9-pFL38, содержащих кассету 5>-PH05-HBsAg-3\

Для определения уровня экспрессии гена HBsAg вируса гепатита В в штаммах-реципиентах дрожжей разного генотипа были сконструированы два экспрессирующих вектора на основе илазмид YEpl3 с дрожжевым маркером LEU2 и репликатором

2 мкм плазмиды и pFL38, репликация которой в дрожжах происходит за счет ARS в последовательности CEN4 и гена URA3. В обеих схемах конструирования в качестве второй исходной плазмиды была использована pNMVG - 3954 (Грановский и др., 1986), содержащая две копии 1,8 кб Ваш HI-фрагмента с соединенными последовательностями гена HBsAg и дрожжевого промотора PHOS, обусловливающего регулируемую экспрессию клонированного гена в зависимости от концентрации в среде фосфатов. Сам вектор pNMVG - 3954 не может служить корректной моделью при изучении влияния генотипических факторов на уровень экспрессии гена HBsAg и митотическую стабильность плазмид, так как является многокопийным в силу особенностей своей структуры и в нашей работе был использован на конечных этапах анализа штаммов-продуцентов.

Сконструированный нами вектор 2-У Ер 13 содержит кассету 5,-PH05-HBsAg-3' в уникальном BamHI сайте гена TetR плазмиды YEpl3 в такой ориентации, что направление транскрипции генов TetR и HBsAg совпадают. В плазмиде 9-pFL38 фрагмент 5*-PH05-HBsAg-3'" клонирован нами в уникальном BamHI сайте полилинкера рИС19, присутствующего в плазмиде 9-pFL38. Клонированная кассета ориентирована своим 5' концом к первому сайту полилинкера EcoRI.

Полученные векторы 2-YEpl3 и 9-pFL38 обусловливают в дрожжах регулируемую концентрацией фосфатов экспрессию гена HBsAg, а также не отличаются от исходных плазмид по таким признакам, как уровень репликации в клетках E.coli и S.cerevisiae, эффективность экспрессии в дрожжах бактериального гена AmpR и митотической стабильности при росте трансформантов в неселективной среде.

Отбор и анализ клонов трансформантов дрожжей с повышенным уровнем экспрессии плазмидного гена ß-лактамазы.

С целью совершенствования генно-инженерных систем экспрессии широко используется анализ популяции клонов по уровню активности плазмидного гена-репортера с легко выявляемой активностью продукта: /3-лактамазы,/?-галактозидазы E.coli, кислой фосфатазы дрожжей и т.д. Данный принцип широко используется при анализе силы клонируемых промоторов, эн-хансеров (Полищук и др., 1989; Oker, Wolf, 1989) или оценке плаз-

мидной копийности (Hwang е.а., 1989). На наш взгляд, прием измерения экспрессии индикаторного гена также может быть эффективным при поиске супер-продуцентов, т.к. увеличение в дрожжах синтеза репортерного белка может быть обусловлено действием неспецифических к данному типу экспрессии факторов (мутаций) — рост копийности векторов, повышение стабильности мРНК, снижение протеазной активности и т.д., что определит в таких клетках оптимизацию экспрессии других гетероло-гичных генов.

Отбор клонов с увеличенной экспрессией гена Ыа проводили среди плазмидо-содержащих клеток трансформантов, предварительно облученных УФ-светом. После облучения культуру в одном варианте высевали сразу на селективную среду, тогда как в другом предварительно культивировали в течение многих генераций в неселективной среде УЕРД (рис.1). В качестве контролей также проводили культивирование необлученных клеток в УЕРД в течение многих генераций, а также выращивание облученных клеток в течение 12 генераций. Мы предположили, что прием длительного неселективного культивирования трансформантов должен оказаться эффективным прежде всего при отборе мутантов с измененной митотической стабильностью векторов. Действительно, длительное отсутствие селективного давления обедняет культуру трансформантов клонами, содержащими плазмиду, при условии, что последняя не содержит сильных репликаторов, активного центромера или других стабилизирующих структур. Эти же условия должны обогащать фракцию плазмидо-содержащих клеток субклонами, сохранившими плазмиду не случайно, а в результате наследственных изменений, определяющих плаз-мидную стабилизацию. В частности, повышение стабильности может быть обусловлено мутациями, увеличивающими копий-ность векторов, что, в свою очередь, приведет к увеличению продуктов экспрессии клонированных генов.

В качестве модели «клетка-вектор» были выбраны транс-формантыТ1-УР-135/УЕр13, T2-YF-135/pYF91,Tl-3-YF-135/YEpl3 и Т4-Д4007/УЕр13.

Уровень стабильности плазмид в клетках Tl-YF-135/YEpl3 и T2-YF-135/pYF91 составляет 59-72 % после 12 генераций в УЕРД, тогда как в клетках T1-3-YF-135 и диплоида Д4007 отмечено пони-

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА ПО ОТБОРУ КЛОНОВ С ИЗМЕНЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ^-ЛАКТАМАЗЫ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО НЕСЕЛЕКТИВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТРАНСФОРМАНТОВ

Т1-1ЛМ35/ЦЕр13

итчв

ШВ

ШВ

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ р-ЛАКТАМАЗЫ

\ I

1542 642

1 I

0.06 % В1А++ 31 % В1А++ 2%В1А" 67 % ВЬА+

I

512

I

5 % В1А++ 0.5 % В1А" 94.5 % ВЬА+

\

678

I

100 % ВЬА+

Рис. 1. Схема отбора мутантов дрожжей с увеличенной экспрессией плазмидного гена ВЬА.

жение стабильности плазмиды УЕр13 до 37-43 % и 8-10 %, соответственно. Использование таких нестабильных трансформантов позволяет сократить число генераций при длительном культивировании и отбирать мутанты по эффекту «исправления» стабильности плазмид. Общее число генераций в связи с различной стабильностью было неодинаковым у разных трансформантов: 115-120 для Т1-УР-135/УЕр13, Т2-УР-135/рУР91 (0.1-1 % плазмидо-содержащих клеток на конец культивирования), 80 для Т1-3-УР-135/УЕр13 (0.3-0.8 % ЬЕи+ клеток) и 36 для Т4-Д4007/УЕр13. В опытах использовали также трансформант Т1-38Б-П2156, содержащий центромерную плазмиду рР138, который культивировали в течение 115-130 генераций (75 % 1ША+ клеток).

Результаты экспериментов представлены в табл.1. Максимальное количество клонов — не менее 24 % — с повышенной активност/3-лактамазы ( В1А++ фенотип) получено для разных трансформантов в варианте опыта, сочетающем предварительное УФ-облучение и длительное неселективное культивирование. Меньшее число ВЬА++ клеток (4-5 %) наблюдали в случае длительного выращивания необлученных культур, и всего по одному В1А++ клону отобрано у Т1-УР-135/УЕр13 и Т2-УР-135/ рУР91 среди клеток, которые были посеяны на УИВ сразу после облучения. Не былр обнаружено клонов с высокой активностью /3-лактамазы среди облученных клеток, культивируемых в течение 12 генераций (см. табл.1). По уровню активности/3-лактама-зы В1А++ клоны соответствуют фенотипу трансформантов УР-135с многокопийной плазмидой рИМУС-3954. В случае трансформанта Т4-Д4007/УЕр13 клоны во всех вариантах опыта и при клонировании на всех типах сред представлены крайними вариантами В1А- и В1А++, что делает его малопригодным при отборе мутантов с повышенной активностью/?-лактамазы. Таким образом, прием длительного культивирования в неселективных условиях трансформантов с различными типами плазмид является эффективным способом отбора клонов ВЬА+ + фенотипа, число которых возрастает в случае предварительного облучения УФ-светом.

Увеличение уровня экспрессии плазмидного гена может соответствовать росту копийности векторов, что, в свою очередь, определит их стабилизацию в митозе. Значения митотической

' Таблица 1

Количество клонов ВЬА++ фенотипа у трансформантов в разных вариантах опыта по длительному неселективному культивированию (суммарно для нескольких повторностей)

ВАРИАНТЫ ОПЫТА

Трансформант Число повторностей Высев на УМ* после облучения 12 ген. вУЕРД после облучения 115-120 ген. вУЕРД после облучения 115-120 ген. вУЕРД без облучения

всего клонов клоны В1А+ + всего клонов клоны В1А+ + всего клонов клоны В1А++ всего клонов клоны ВЬА+ +

Т1-УР-135/УЕр13 6 1542 1 (0.006%) 678 0 642 199 (31.3 %) 512 26 (5.2 %)

Т2-УБ-135/р УЮ1 4 2038 1 (0.04 %) 539 0 508 147 (29.1 %) 531 22 (4.1 %)

Т1-3-УР-135/УЕр13 3 1045 0 394 0 389 92 (24.2 %) 376 16 (4.2 %)

Т1-38Б-П2156 / рРЬ38 3 1028 0 371 0 351 108 (30.8 %) 366 14 (4.1 %)

стабильности длазмид определяли при росте клонов BLA++ в среде УЕРД в течение 12 генераций. Статистически достоверное увеличение стабильности плазмид до 85-92 % отмечено для 16 из 18BLA++клонов трансформанта Tl-YF-135/YEpl3 и 12 из 15BLA++ клеток T2-YF-135/pYF91. Коэффициент взаимной сопряженности между такими качественными признаками как высокая мито-тическая стабильность плазмид и высокая активность /3-лакта-мазы составляет, для этих трансформантов, соответственно, К=0,86 и К=0,81. В случае 14 проанализированных BLA++ клонов T1-3YF-135/YEpl3 9 клонов имели увеличение стабильности до 85-95 % и 1 клон до 64 % (К=0,63). Только для одного клона BLA++диплоида Т4-Д4007/УЕр13 из 8 проанализированных отмечено повышение стабильности до 98 %. У12 клонов BLA+ + трансформанта Т1-38Б-n2156/pFL38 сохраняется высокая стабильность центромерной плазмиды — 98-100 %. Таким образом, в большинстве проанализированных клонов BLA+ + фенотипа рост активности/3-лактама-зы коррелирует с плазмидной стабилизацией в митозе, что служит дополнительным фактом в пользу увеличения в данных клонах копийности векторов.

С целью определения типа изменений, обусловливающих рост активности yS-лактамазы, была проведена ре-трансформация LEU" и URA' клеток 16 независимых BLA++ клонов 5 исходных трансформантов и для 13 доказана генотипическая природа мутаций: ретрансформанты сохраняли BLA+ + фенотип и высокий уровень'стабильности плазмид — 84-91 %. В одном клоне мутация произошла в последовательности плазмиды YEpl3, которая при ре-трансформации определяла BLA+í фенотип клеток и имела высокую стабильность.

В некоторых BLA++ клонах высокие активность/З-лактама-зы и стабильность плазмид сохранялись только при пассажах на селективной среде, тогда как хотя бы один пассаж на среде УЕРД приводил к необратимой потере BLA++ фенотипа и снижению стабильности эписомных плазмид, которые не восстанавливались при повторном культивировании в селективной среде. Возможно, в основе этого явления ллежат колебания копийности плазмид, известные для 2 мкм плазмиды и ее производных в зависимости от условий культивирования клеток (Mead е.а., 1986; Bugeja е.а., 1990).

На заключительном этапе определяли уровень экспрессии гена HBsAg в составе векторов 2-YEpl3 и 9-pFL38 в 10 клонах BLA++ фенотипа, для которых была доказана генотипическая природа мутаций. В 9 клонах отмечено повышение активности антигена по сравнению с исходными трансформантами (см. табл.2). Максимальный уровень синтеза HBsAg отмечен для мутантов 2-TI-YF-135 и 4-Т1-38П-П2156, который был в 16 раз выше, чем в исходных трансформантах — титры РНГА1/256 и 1/32, соответственно. Некоторое снижение количества вирусного белка наблюдали только в одном BLA++ клоне.

Для изучения характера наследования мутаций, определяющих повышенную экспрессию генов Ыа и HBsAg был проведен тетрадный анализ гибридов, полученных при скрещивании 2-T1-YF-135 на штамм 6Д-П3006 и 4-Т1-38Б-П2156 на 5Д-П3016. Сегреганты LEU' и URA" из двух полных тетрад гибридов были трансформированы векторами 2-YEpl3 и 9-pFL38, и в их клетках определили стабильность плазмид и активности /З-лактамазы и HBsAg. Полученные факты свидетельствуют, во-первых, о корреляции активности HBsAg, /3-лактамазы и стабильности эписом-ных векторов в сегрегантах и, во-вторых, характер расцепления по уровню экспрессии клонированных генов и стабильности плазмид соответствует 2:2, что указывает на моногенный контроль признака.

В заключении следует отметить, что анализ фракции плаз-мидосодержащих клонов после мутагенеза и длительного неселективного культивирования показал их гетерогенность по признакам экспрессии гена-репортера Ыа и стабильности плазмид. Подобная гетерогенность может служить основой направленного отбора клонов-продуцентов с улучшеными свойствами^ Так, предварительный скрининг клонов по активности -л актам азы оказался эффективным при отборе клеток с повышенной активностью HBsAg: 7 из 10 проанализированных BLA++ мутантов имели рост количества антигена в 4 раза и 2 мутанта—в 16 раз по сравнению с исходными трансформантами.

Таблица 2

Значения митотической стабильности плазмид и уровня экспрессии гена НВ5А§ в исходных трансформантах и клонах с увеличенной активностью /3-лактамазы, отобранных после длительного неселективного культивирования

Трансформант Фенотип по /3-л актам азе Митотическая стабильность плазмид, % Уровень экспрессии гена НВэАд (титры РИГА) в составе векторов

2-УЕр13 рУБ91 рРЬ38 2-УЕр13 9-рИ.38

Т1-УР-135 В1А+ 61.4 ±3.9 63.7 - 4.2 1/16

Т1-38Б-П2156 В1А± — — 98^ ¿1.2 — 1/2-1/4

Т2-УР-135 В1А++ 65.4 ¿3.5 68.7 ¿4.1 — 1/32 —

2-Т1-УР-135 В1А++ 81.7 - 2.3 87.3 А 2.3 — . 1/256 —

7-Т1-УР-135 ВЬА++ 80.5 ¿1.8 83.4 ¿2.2 — 1/64 —

11-Т1-УР-135 ВЬА++ 82.4 ¿1.7 88.4 ± 1.3 — 1/64 —

19.T1.YF-135 В1А++ 86.4 ¿1.8 843 ¿2.3 — 1/128 —

17-Т2ЛТ-135 В1А++ 91.4 ¿1.5 90.7 ¿1.9. — 1/4-1/8 —

18-Т2-УР-135 В1А++ 66.4 ¿3.1 68.8 ¿2.8 — 1/64 —

21-Т2-УР-135 В1А++ 61.5 ¿4.1 66.4 ¿3.8 — 1/128 —

4-Т1-38Б-П2156 В1А++ 99.7 ¿13 — 99.7 ¿1.3 «* 1/32

11-Т1-38Б-П2156 В1А++ — — 99.5 ¿1.2 - — 1/16

10-Т1-3-УР-135 В1А++ 81.5 ¿2.1 87.4 ¿4.1 — 1/64 —

Анализ влияния плоидности и аллелей локуса МАТ дрожжей на стабильность гибридных плазмид и уровень экспрессии гетерологичных генов fí-лактамазы E.coli и HBsAg вируса гепатита В

Рост числа копии плазмид в полйзюидах дрожжей приводит к их митотической стабилизации и увеличению дозы клонированных генов (Mead е.а., 1986; Spalding е.а., 1989). Исследование влияния плоидности на поведение разных типов векторов и уровень гетерологического синтеза требует создания штаммов с различным числом наборов хромосом как изогенного, так и гибридного происхождения. В зависимости от метода конструирования штаммы могут быть как гомо-, так и гетерозиготами по регулярному локусу МАТ. Выдвинуто предположение о возможном контроле регуляторным локусом МАТ митотической стабильности 2 мкм плазмиды и УЕр-векторов (Mead е.а., 1986), т.к. около REP3 участка плазмиды обнаружены консенсус-последовательности для взаимодействия с al/al продуктом, участвующим в репрессии транкрипции гаплоид-специфических генов (Hartley е.а., 1980).

Нами была получена коллекция диплоидных и триплоид-ных штаммов гомо- и гетерозигот по типу спаривания как изогенного происхождения на основе геномов YF-135, 9А-П4000 и 6А-Д4015, так и гибридов при скрещивании между штаммами YF-135, 9А-П4000,5Д-П3016,6Д-П3006.

Полученные триплоидный и 5 диплоидных гибридов, 12 изогенныхдиплоидов и 1триплоид трансформировали эписомн-ыми плазмидами УЕр13,2-У Ер 13 и pYF91 и определяли их мито-тическую стабильность и уровень экспрессии генов/?-лактамазы и HBsAg. Полученные данные свидетельствуют о значительном увеличении стабильности плазмид в триплоидных и большинстве диплоидных штаммов. Максимальный уровень стабилизации отмечен для 2п и Зп штаммов, гетерозиготных по локусу МАТ: доля LEU+ клонов после 12 генераций в среде У ЕРД составляла 96-98% (i=0.0013*0.0004) (таб. 3). Увеличение плоидности в клетках а/а также статистически достоверно уменьшало потери всех трех плазмид (i=0.011^0.001) (F>P=0.01). При том же уровне значимости величина стабильности гомозигот а/а была достоверно ниже, чем гетерозигот а /а. В триплоидном и диплоидных

Таблица 3

Значения митотической стабильности плазмид и уровня экспрессии HBsAg в исходных гаплоидах и полученных на их основе диплоидных и тригагоидных штаммах дрожжей

ШТАММ Плоид-ность Аллели локуса МАТ Митотическая стабильность плазмид, % Уровень экспрессии гена НВэ^ (титр РИГА)

УЕр13 2-УЕр13 рУИ>1 2-УЕр13 9-рИ38

1 2 3 4 5 6 7 8

1-УР-135 п МАТа 60.4 - 4.2 62.3 ^ 3.8 68.9 ¿3.9 1/16 _

8-УР-135 п МАТа 63.1 ¿ 4.1 59.7 ± 4.5 61.7 ¿3.5 1/16 —

М-УБ-Ш п МАТа 65.6^3.9 61.5 - 4.1 62.7 ¿3.5 1/16 —

В-УР-Ш п МАТа 65.5 4.0 63.2 ¿3.9 62.8 ¿23 1/16 —

15-УР-135 п МАТа 66.1 - 4.2 62.8 ¿4.2 — 1/16 —

6Д-П3006 п МАТа 753 - 3.1 80.2 ¿2.9 — 1/16 1/4-1/8

5Д-П3016 п МАТа 65.5 ¿ 4.1 60.1 ¿3.8 68.5 ¿1.8 1/32 1/8

7-9А-П4000 п _ МАТа 68.2 - 4.2 63.2 ¿4.0 66.4 ¿1^ 1/16 —

13-9А-П4000 п МАТа 64.5 - 4.1 60.1 ¿4.2 — 1/16 —

2-6А-Д4015 п МАТа 80.5 -1.6 81.5 ¿1.8 — 1/64 —

11-6А-Д4015 п МАТа 78.8 ± 13 78.5 ¿1.6 — 1/64 —

Окончание таблицы 3

1 2 3 4 5 6 7 8

Д4014( бд.пзооб ) 2п МАТа МАТа 99.1 -1.9 92.4 ± 2.3 94.3 £ 1.5 1/64 —

Д4015(9А«) 2п МАТа МАТа 98.2 ±1.3 91.3 - 2.0 — 1/512 —

Д4019(5д.пз016 ) 2п МАТа МАТа 97.9 -1.4 97.2 ¿1.9 — 1/128 —

П4037(й^5) 2п МАТа МАТа 100.0 98.2 ± 2.1 96.5 ± 2.3 1/128 1/16

Д4004(10_ур.135) 2п МАТа МАТа 98.2 -1.3 88.4 ±2.8 — 1/64 —

Д4007(™) 2п МАТа МАТа 8.3 - 2.7 8.4 ±2.6 7.8 ± 1.8 1/2-1/4 —

Д4008(£™ ) 2п МАТа МАТа 81.7 ± 2.8 78.4 ± 3.2 80.4 ± 3.1 1/64 —

Д40Ю(Ш1) 2п МАТа МАТа 83.7 ± 3.6 77.5 - 3.3 81.6 - 3.5 1/64 —

2п МАТа МАТа 87.7 - 3.2 82.4 ± 3.8 83.1 - 3.6 1/64 —

Д4005( ^¿ур-ш ) 2п МАТа МАТа 96.4 ±1.8 98.3- 1.1 98.2 ± 1.2 1/4-1/8 —

т«1Ш) Зп МАТа МАТа МАТа 98.4 ±1.4 89.4 - 3.6 99.1 ± 1.1 1/64 —

штаммах, полученных на основе YF-135, отмечен непродолжительный рост стабильности плазмиды Rcp2 с репликатором рДНК дрожжей—30-32 % LEU* клеток против 12-15 % в гаплоидах, но после 24-30 генераций плазмида полностью элиминировалась из гаплоидов и диплоидов. Плазмида pNMVG-3954 была одинаково высокостабильна в клетках разной плоидности штамма YF-135— 97-99 % LEU+ клонов (i=0,0008±0,0001).

В большинстве диплоидных и триплоидных клеток отмечено возрастание активности /?-лактамазы в качественном тесте, о чем свидетельствуетувеличениезоны просветления и сокращение времени ее появления на 4-6 часов. В большинстве полиплоидных трансформантов в случае вектора 2-УЕр13 уровень синтеза HBsAg возрастает в среднем в 4 раза (см. табл. 3). При этом не обнаружены отличия в количестве HBsAg между гомо- и гетерозиготами по локусу МАТ, что соответствует одинаковому тотальному содержанию плазмидной ДНК в популяции их клеток на конец культивирования (24 часа). Снижение активности HBsAg наблюдали в клетках диплоида Д4005 при сохранении высокой стабильности плазмиды 2-УЕр13. Максимальный уровень синтеза HBsAg отмечен для гибридного диплоида Д4015 (а/а): для вектора 2-У Ер 13 активность антигена увеличилась в 8 и 32 раза в сравнении, соответственно, сдиплоидами и гаплоидами (см. табл. 3). Суперпродукция HBsAg белка может быть обусловлена благоприятным для гетерологической экспрессии сочетанием в данном гибриде геномов родителей по типу гетерозиса, т.к. исходные штаммы 9А-П4000 и YF-135 принадлежат разным генетическим коллекциям. С целью выяснения типа и характера наследования детерминант, определяющих оптимизацию синтеза HBsAg, был проведен гибридологический анализ Д4015. Большинство сегрегантов трех полных тетрад в случае вектора 2-YEpl3 имеет типичный для гаплоидов уровень HBsAg — титры РНГА составляют 1/16. Повышение экспрессии гена HBsAg выявлено только в сегреганте 6А-Д4015 — титры РНГА выросли до 1/64, что типично для диплоидов. Также выросла стабильность плазмиды до 80-87 %. Увеличение активности HBsAg только в одном из 12 сегрегантов Д4015 может соответствовать генетическому контролю признака, включающему несколько детерминант, сегрегирующих в мейозе независимо. Возможно, что объ-

единение всех или многих из них в геноме гаплоида 6А-94015 обусловливает оптимизацию экспрессии HBsAg.

В клетках диплоидов а типа спаривания Д4007 и Д4009 отмечена резкая де-стабилизация плазмид YEpl3,2-YEpl3 и pYF91 (i=0,076^0,002), но не pNMVG3954 с тем же типом репликатора (см.табл.З). Уменьшение стабильности было статистически значимым ( F<P = 0,01) в сравнении с гаплоидными родителями ил и другими диплоидами, в том числе и с гомозиготой а ¡а Д4008. Анализ клонов этих диплоидов на активность/8-лактамазы показал расщепление на два фенотипа BLAi и BLA++. Подобные факты свидетельствуют о нарушении в клетках Д4007 и Д4009, скорее всего, в системе сегрегации эписомных плазмид, но не их репликации. Де-стабилизация вектора 2-YEpl3 в диплоидах Д4007 и Д4009 приводит к снижению продукции HBsAg в популяции их клеток после 48 часов роста (см. табл.3). Диплоиды Д4007 и Д4009 имеют одного общего родителя — 13-YF-135, геном которого, возможно содержит детерминанту, де-стабилизирующую эпи-сомные плазмиды на диплоидном уровне. Для гетерозиготы Д4004 а/а, также полученной при участии клона 13-YF-135, характерна высокая "стабильность тех же плазмид, поэтому, возможно, проявление признака де-стабилизации плазмид в диплоидах коррелирует с копуляционной активностью клеток. Для гибрида Д4004 в пределах каждой из двух полных тетрад сегреганты одного типа спаривания были скрещены друг с другом и с изогенн-ыми гаплоидами 1-YF-135 (а) и 10-YF-135 (а) для получения гомозигот по типу спаривания. Сегреганты обеих тетрад имели типичную для гаплоидов частоту потери плазмид — 60-66 % LEU+ клонов. Для одной тетрады де-стабилизацию плазмид наблюдали только у гомозигот а типа спаривания, полученных при скрещивании двух сегрегантов друг на друга и на мутант 1-YF-135. В случае второй тетрады снижение стабильности было у гомозигот а и а типа спаривания.

.....Гомозиготы от скрещивания клона 13-YF-133 на штаммы другого происхождения имели высокий уровень стабильности плазмид. В итоге можно сделать следующие выводы: во-первых, де-стабилизация плазмид на диплоидном уровне коррелирует с копуляционной активностью клеток, но не специфично к типу спаривания и зависит от дозы мутаций генома штамма

\T-135, во-вторых, наследование признака в мейозе свидетельствует о моногенном характере его контроля.

Полученные результаты подтверждают тот факт, что по-липлоидизация реципиентных клеток является эффективным способом повышения уровня экспрессии клонированных генов и стабильности векторов. Однако обнаруженные нами факты снижения на диплоидном уровне стабильности векторов и синтеза вирусного белка свидетельствуют о возможных ограничениях при создании полиплоидов на основе умножения одного типа генома в силу накопления дозы негативно-действующих мутаций. Дополнительным фактором стабилизации эписомных векторов в полиплоидах может служить гетерозиготность по локусу МАТ. О возможной роли этого гена в регуляции поведения векторов свидетельствует тот факт, что де-стабилизация плазмид в некоторых диплоидах зависит от действия гаплоид-специфического гена. В результате скрининга полиплоидов на активность HBsAg белка был отобран перспективный гибридный штамм Д4015.

Характеристика штаммов-реципиентов в синтезе НВ$А% белка в экспериментально-производственных условиях.

В вышеописанных примерах были отобраны некоторые штаммы, в клетках которых наблюдали повышение синтеза белка при культивировании в лабораторных условиях. К их числу следует отнести 2-Т1-УР-135,4-Т1-38Б-П2156,6А-Д4015 и Д4015.

Штаммы 2-Т1-\Т-135 и Д4015, трансформированные плаз-мидой рНМУС-3954, были охарактеризованы при культивировании в производственных реакторах емкостью 100 л (13 опытов) и 630 л (2 опыта) на предприятии НИИВС г.Санкт-Петербурга. В качестве контроля служили параметры штамма ДАН2-12СГ (Ар-ман и др., 1985). Исследуемыми характеристиками штаммов были: скорость роста клеток, максимальный урожай биомассы, •. ■

динамика роста активности HBsAg и стабильность вектора рММУС-3954.,Если штамм 2-Т1-\Т-135по основным параметрам не отличался от штамма ДАН2-12а, то Д4015 имел некоторые преимущества. Так, при одинаковой посевной дозе 2-3,ДО6 кл/мл выход на стационар в культуре Д4015 происходит через 10 часов — на 6-8 часов раньше ДАН2-12а. Максимальный урожай был

примерно одинаков для обоих штаммов, соответственно, 1,6 - 2,1. 10е кл/мл и 1,8 - 2,4.10е кл/мл.

Для штамма Д4015 уже после 12 часов характерно появление высоких титров РНГА — 1/4096 и после 8-10 часов типичен второй пик активности -1/64.000 -1/128.000. У штамма ДАН2-Ш к 12 часам титр РНГА составляет в среднем 1/256, и максимальный пик активности отмечен на уровне 1/2048 -1/4096. В среднем разница в продуктивности между штаммами составляет 9 раз: среднее количество HBsAg для ДАН2-12« 15 мг на литр среды и для Д4015140 мг/л. Штаммы не отличались по уровню митоти-ческой стабильности вектора pNMVG-3954:97-99 % LEU+ клонов после 24-36 ч крупномасштабного культивирования.

Штамм Д4015 рекомендован в качестве продуцента при производственном накоплении HBsAg вируса гепатита В, и на основе его клеток получено 11 экспериментальных серий дрожжевой рекомбинантной вакцины против гепатита В.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированные векторы — эписомный 2-YEpl3 и центромерный 9-pFL38, содержащие соединенные последовательности промотора РН05 и гена HBsAg вируса гепатита В (5'-РН05-HBsAg-З'), обеспечивают в дрожжах регулируемую экспрессию гена HBsAg.

2. В результате длительного культивирования в неселективной среде облученных УФ-светом трансформантов сразличн-ыми типами плазмид получена коллекция мутантов с увеличенной экспрессией плазмидного гена-репортера Ыа.

3. В клетках 39 BLA++ клонов происходит значительное повышение митотической стабильности эписомных плазмид YEpl3,2-YEpl3 и pYF91.

4. Повышение уровня экспрессии плазмидного гена ß-пак-тамазы в 10 BLA++ мутантах коррелирует с увеличением активности белка вируса гепатита В.

5. Увеличение плоидности (2п и Зп) в 17 реципиентных штаммах приводит к повышению уровня синтеза/?-л актамазы и HBsAg и митотической стабильности гибридных плазмид.

6. В клетках, гетерозиготных по локусу МАТ, отмечено

статистически достоверное повышение митотической стабильности эписомных плазмид YEpl3,2-YEpl3 и pYF91 по сравнению с гомозиготами.

7. В изогенных диплоидах Д4005, Д4007 и Д4009, полученных на основе генома штамма YF-135, происходит, соответственно, снижение синтеза белков HBsAg и /3-лактамазы и де-стабили-зация эписомных плазмид YEpl3,2-YEpl3 и pYF91, зависящая от действия гаплоид-специфического гена.

8. Отселектированные штаммы 2-T1-YF-135 и Д4015 по признаку высокой экспрессии генов Ыа и HBsAg могут быть рекомендованы в качестве реципиентов в синтезе гетерологических белков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воропаева ЛА. К вопросу о создании экспрессирующего вектора дрожжей //Актуальные проблемы прикладной иммунологии и биотехнологии. — Ленинград. — 1986. — с.66-67.

2. Воропаева ДА., Захаров И А., Кузнецов O.K. Создание безопасного реципиентного штаммадрожжей Saccharomyces сеге-visiae для трансформации рекомбинантными молекулами Д НК / / Актуальные вопросы биотехнологии. — Москва — 1987. — с.48-49.

3. Воропаева JI А. Селекция мутантов с повышенной реп-ликативной стабильностью эписомных плазмид при длительном культивировании трансформантов дрожжей в неселективной среде // Проблемы медицинской иммунобиотехнологии. — 1990. - Ленинград. - с.24-26.

4. Воропаева Л А. Влияние плоидности и состояния локуса МАТ в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae на митотическую стабильность эписомных плазмид и уровень экспрессии гена HBsAg вируса гепатита В. — Генетика. — 1991. — Т.27. — N 7. — с.1143-1149.

5. Воропаева Л А. Мутанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae с повышенной митотической стабильностью плазмид, выделяемые при длительном культивировании трансформантов в неселективных условиях. — Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1991. — N 7. — с.8-12.