Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экстрахромосомные ДНК дрожжей-сахаромицетов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аверьянов, Александр Владимирович

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. 2neecm ДНК дрожжей-сахарошцетов . II

2.1.1. Структура и физико-химические свойства дрожжевой плазмиды ••••••.II

2.1.2. Внутриклеточная локализация 2мкм ДНК

2.1.3. Репликация 2шш ДНК.

2.1.4. функциональное значение 2мкм ДНК ••••••

2.2. Экстрахромосомная рДНК (Змкм ДНК) дрожжей

2.3. Митохондриалъная ДНК дрожжей-сахаромицетов.

2.4. Генетическая трансформация дрожжей.

3. Материалы и методы исследований.

3.1. Микробиологические методы . ;.

3.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий.

3.1.2. Трансформация бактериальных клеток

3.1.3. Дрожжевые штаммы и условия культивирования дрожжей.

3.1.4. Трансформация дрожжей

3.2. Биохимические методы.

3.2.1. Выделение тотальной дрожжевой ДНК

3.2.2. Выделение суперспирализованной дрожжевой ^

3.2.3. Выделение бактериальной плазмпдной ДНК

3.2.4. Раскапывание градиентов и подготовка к определению радиоактивности исследуемого материала.

3.2.5. Фракционирование ДНК в градиентах нейтрального хлористого цезия.

3.2.6. Синтез комплементарной радиоактивной РНК

3.2.7. РНК-ДНК гибридизация

3.2.8. Рестрикция ДНК и лигирование рестрик-ционных фрагментов

3.2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.10. Определение концентрации ДНК спектро-флюорометрическим методом

3.2. II. ^акционирование РНК электрофорезом ^

3.2.12. Фотографирование флюоресцирующей ДНК в УФ.

3.2.13. Определение радиоактивности препара

4. Результаты исследований.

4.1. Выделение ковалентно-замкнутых ДНК дрожжей.

4.2. Рестрикционный анализ «№лкм ДНК.

4.3. Исследование сравнительного содержания 2мкм

4.3.1. Очистка ДНКазы от РНКазных примесей.

4.3.2. Получение и очистка транскрипта 2шш

4.3.3. Определение зависимости уровня гибридизации от количества ДНК на фильтре

4.3.4. Определение влияния избытка гетерологи-чной ДНК на уровень гибридизации 3Н-кРНК.

4.3.5. Определение содержания 2мкм ДНК в различных штаммах дрожжей.

4.4. Определение природы минорной фракции ДНК в препаратах кольцевых ковалентно-замкнутых молекул

4.4.1. Очистка и определение плавучей плотности минорной фракции кз ДНК.

4.4.2. Гиб^цизация кзДНК с Н-транскриптом мтДНК.

4,4.3. Электронная микроскопия легкой Фракции кзДНК.I

4.5. Конструирование двухрепликонной дрожжевой плазмиды.

4.5.1. Конструирование плазмиды.

4.5.2. Селекция и идентификация рекомбинантной плазмиды.

4.5.3. Проверка трансформирующей активности и генетической стабильности плазмиды в дрожжевых клетках.

5. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экстрахромосомные ДНК дрожжей-сахаромицетов"

Быстрое развитие биохимических методов исследования нуклеиновых кислот, открытие специфических эндонуклеаз и возникновение техники рекомбинантных ДНК при манипулировании с плазмидами и отдельными генами создало предпосылки для проведения экспериментов по конструированию новых комбинаций генов и переносу их в гетеро-логичные микроорганизмы. Очевидно, что эта методология в скором времени послужит базой для создания новых штаммов промышленных микроорганизмов, необходимых в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности»

Следует отметить, что традиционное использование бактериальных клеток в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид часто оказывается удачным лишь для клонирования последовательностей ДНК» Добиться экспрессии клонированного в бактериях гетерологичного генетического материала часто не удается» Предполагают, что препятствием для эксцрессии клонированных в бактериальной клетке генов являются различия в системе транскрипции и трансляции, а также посттранскрипционные модификации РНК и посттрансляционные перестройки полипептидов» В связи с этим для успешной экспрессии гете-рологичных генов требуется создание широкого спектра альтернативных систем "вектор-хозяин", в том числе и на основе эукариотиче-ских микроорганизмов» Для таких систем наиболее перспективным "хозяином" можно считать дрожжи-сахаромицеты, в которые уже сейчас удалось ввести некоторые эукариотические гены и получить полноценные биологические белки, например, интерферон человека» Для переноса генов в дрожжевые клетки создан ряд векторных молекул ДНК, реплицирующихся как автономно, так и в составе хромосомной ДНК» Наиболее подходящими векторами представляются многокопийные автономно реплицирующиеся моле^лы, так как они позволяют увеличить дозу гена, что, в свою очередь, может привести к повышению выхода целевого продукта. Несмотря на большие успехи в области создания дрожжевых векторов, существует много невыясненных до конца вопросов, связанных с особенностями внутриклеточного поведения дрожжевых плазмид, как природных, так и рекомбинантных. В частности к моменту начала нашей работы оставались неясными вопросы о фракционном составе экстрахромосомных ДНК дрожжей и механизме их репликации. Кроме того, большая часть работ по исследованию экстрахромосомных ДНК дрожжей была выполнена в зарубежных лабораториях. Поэтому» штаммы дрожжей, имеющиеся в отечественных генетических коллекциях, оставались мало изученными. Это позволило сформулировать цель работы следующим образом: изучить качественно и количественно фракционный состав экстрахромосомных ДНК дрожжейнзахаромицетов из Петергофской генетической коллекции и особенности их репликации.

Актуальность выбранной темы исследований подтверждается тем, что она выполнялась в рамках комплексной проблемы 0.74.05 "Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии в народное хозяйство" в соответствии с постановлением ГК НТ СССР, Госплана СССР и АН СССР от 13.02.81 г. Я 24/25/13.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать оптимальный метод экстракции экстрахромосомных ДНК из дрожжевых клеток;

- выделить и проанализировать экстрахромосомные ДНК из выбранных дрожжевых штаммов; оценить содержание экстрахромосомных ДНК в исследуемых штаммах и попытаться обнаружить факторы, определяющие содержание плазмидной ДНК в дрожжевой клетке;

- сконструировать рекомбинантную плазмиду, способную эффективно трансформировать дрожжевые клетки и стабильно поддерживаться в популяции.

В результате проделанной работы были получены новые знания о физиологии экстрахромосомных ДНК дрожжей-сахаромицетов. Научная новизна представленных в диссертации результатов заключается в том, что впервые:

- проведен качественный и количественный анализ экстрахромосомных ДНК отечественных дрожжевых штаммов;

- показано, что наличие или отсутствие митохондриального генома не влияет на копийность дрожжевой плазмиды;

- обнаружена корреляция между плоидностью клетки и копий-ностью плазмидной ДНК дрожжей; прямыми биохимическими методами было показано существование 25 мкм ковалентно-замкнутой митохондриальной ДНК дрожжей-сахаромицетов;

- создана бифункциональная векторная плазмида нового типа, содержащая два независимых дрожжевых репликатора.

Исходя из полученных экспериментальных данных, их анализа и сравнения с имеющимися в литературе сведениями, на защиту выносятся следующие положения: в исследованных штаммах отечественного происхождения 2 мкм ДНК представлена редко встречающейся укороченной формой, аналогичной scp-з и содержится в количестве 87±2 копий на гаплоидный геном; содержание 2 мкм ДНК на гаплоидный геном остается постоянным в изогенных in и 2n » и jf штаммах, что предполагает наличие ядерного контроля копийности плазмидн; выделена экстрахромосомная ковалентно'-замкнутая ДНК контурной длиной 24,8^0,6 мкм, гомологичная по последовательности мтДНК дрожжей, соответствующая по размеру полное митохоцд-риальному геноцу, постулированному ранее на основе генетических данных; количество препаративно выделенной 25 мкгл ДНК соответствует приблизительно одной копии на клетку; сконструирована плаз-мида с двумя дрожжевыми репликаторами йлкм и экстрахромосомной рДНК , которая эффективно трансформирует различные штаммы дрожжей и стабильно поддерживается в них без изменения молекулярной структуры.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В работах по генной инженерии в качестве системы "вектор-хозяин" в настоящее время приобретают широкое признание дрожжи-сахаромицеты, Недавно получены новые данные об успешной экспрессии синтетического гена ск -интерферона человека в дрожжевой клетке /83/, причем уровень продукции активного интерферона, синтезированного в дрожжевой клетке, значительно превышал уровень его синтеза в бактериальной системе.

Дрожжи-сахаромицеты имеют ряд важных преимуществ перед другими возможными объектами в генно-инженерных экспериментах» Во-первых, это наиболее изученный в генетическом отношении объект из эукариотических микроорганизмов. Наличие многочисленных генетических маркеров облегчает как конструирование векторых ДНК, так и контроль цроведения генетической трансформации. Во-вторых, огромный опыт использования дрожжей-сахаромицетов в микробиологической практике, в том числе и в фармакологической и пищевой промышленности, показал их полную безвредность для человека и окружающей среды, что облегчает для этого объекта решение вопросов, связанных с проблемой потенциальной опасности работ с рекомбинан-тными ДНК и внедрением результатов научных разработок в практику •

Третье преимущество дрожжевой системы обнаружилось в 1977 году, когда была продемонстрирована эксцрессия клонированного дрожжевого гена his3 , кодирующего синтез имидазолглицерофосфат-дегидратазы, в е. coii /157, 158/; Позднее была получена эксцрессия еще нескольких дрожжевых генов в клетках е. coii/8, 31, 72, 78, 140, 159, 169). Это обеспечило первую необходимую основу для конструирования векторных ДНК - генетические маркеры для отбора трансформированных дрожжевых клеток.

Кроме того у дрожжей известны экстрахромосомные ДНК, которые содержат репликативные последовательности, обеспечивающие автономную репликацию плазмидных ДНК в дрожжевой клетке*

Содержание ядерной (хромосомной) ДНК в гаплоидных клетках дрожжей-сахаромицетов всего лишь в три раза выше, чем в клетке е*со11 /1033/. Вся генетическая информация дрожжевой клетки представлена семнадцатью группами сцепления, что соответствует семнадцати хромосомам, на которых к настоящему моменту картировано около 200 генов /136/.

После того, как был описан метод генетической трансформации дрожжей /79/, начался активный поиск векторных молекул, которые могли бы обеспечить активную репликацию и экспрессию эукариоти-ческих генов. Основой для таких генетических векторов могли служить природные молекулы ДНК дрожжей, способные к автономной репликации, то есть не входящие в состав какой*члибо дрожжевой хромосомы. В настоящий момент для дрожжей-сахаромицетов известно три типа экстрахромосомных или плазмидных ДНК: митохоццриальная ДНК, автономно реплицирующийся комплекс рибосомальных генов или 3 мкм ДНК и криптическая плазмида сахаромицетов - 2 мкм ДНК, она же омикронная ДНК или scp .

2.1. 2 мкм ДНК дрожжей-сахаромицетов

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Аверьянов, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован метод выделения суперспирализованной ковалентно-замкнутой ДНК из дрожжевых клеток, что позволяет получать 2 мкм дрожжевую шгазмиду с чистотой не менее 99 %.

2. Показано, что все исследованные штаммы отечественного происхождения Петергофской коллекции дрожжей содержат укороченный вариант 2 мкм ДНК аналогичный scp з

3. Показано, что наличие или отсутствие митохондриального генома не влияет на копийность дрожжевой плазмиды.

4. Исследованные изогенные штаммы дрожжей содержали в среднем 87*2 копии 2 мкм ДНК на гаплоидный геном, В соответствии с этим в диплоидном штамме ПГ-60 число копий 2 мкм ДНК в клетке вдвое больше чем в изогенных гаплоидах. Полученные данные предполагают существование ядерного контроля над копийностью 2 мкм ДНК.

5. В препаратах кзДНК обнаружена минорная фракция ДНК с плавучей плотностью в градиентах нейтрального CsCi -1,684 г/см3, с контурной длиной 24,8*0,6 мкм, гомологичная по первичной структуре митохондриальной ДНК дрожжей. Кольцевая ми-тохондриальная ДНК, соответствующая по размеру полному дрожжевому митохондриальному генощ выделена впервые. Количество выделенной ковалентно-замкнутой мтДНК соответствует приблизительно одной копии на клетку.

6. Сконструирована бифункциональная векторная плазмида YCERp , содержащая два независимых дрожжевых репликатора:

2 мкм ДНК и экстрахромосомной рДНК дрожжей.

7. Плазмида YCERp эффективно трансформирует различные штаммы дрожжей и поддерживается в них без изменения молекулярной структуры. Стабильное наследование плазмиды YCERp наблюдается в штаммах способных поддерживать репликацию вектороЕ как на основе 2 мкм ДНК, так и экстрахромосомной рДНК.

В заключение хочу выразить глубокую благодарность И.В.До-марадскому и Ю.П.Зерову за руководство работой, В.Л.Ларионову за помощь в освоении использованных в работе методов исследования, Г.Г.Гаузе за проведение электронно-микроскопического анали

- 121 за ДНК, С»П« Григорьевой за помощь в некоторых экспериментах, а также всем сотрудникам лаборатории биохимии микроорганизмов ВШИ ОЧБ и отдела внехромосомной наследственности микроорганизмов ВНИИ синтез белок, чьи квалифицированные консультации и благожелательное отношение помогли выполнить настоящую работу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аверьянов, Александр Владимирович, Ленинград

1. Аверьянов А.В., Михайлов Г.А., Зеров Ю.П., Хованских А.Е. Биосинтез РНК и регуляция биосинтеза белков печени цыплят при экспериментальном кокцидиозе. - Мол.биол., 1978, т. 12, 646-653.

2. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепленияу Петергофских генетических линий дрожжей. Генетика, 1971; т.7, II3-I2I.

3. Ларионов В.Л., Гришин А.В. 3 мкм ДНК новая плазмида дрожжей s. cerevisiae.' В сб.: Плазмиды как векторные молекулы при передаче генетической информации. Тез.докл. 4-го совещания по программе "Плазмида". Т^рту, 1979, 94-96.

4. Ларионов В.Л., Гришин А.В. 3 мкм ДНК новый класс экстрахромосомной ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae • - Докл. АН СССР, 1980, т.250, 1473-1476.

5. Ларионов В.Л., Гришин А.В., Краев А.С., Скрябин К.Г., Баев А.А. Сравнение экстрахромосомной и хромосомной рдНК у дрожжей-сахаромицетов. Генетика, 1982, т.ХУШ, I9I-I98.

6. Ларионов В.Л., Гришин А.В., Паршкова Т.А., Трауготт М.Н. Индукция экстрахром ос омной рДНК у дрожжей-сахаромицетов. -Мол.биол., 1981, т.15, 124-131.

7. Aigle М.# Lacrout F. Genetical aspects of URE 3 a non-rni-tochondrial, cytoplasmically inheritid mutation in yeast. -Mol. Gener. Genet., 1975, v. 136, 327-334,

8. Berget S.M,, Moore C., Sharp p.A. Spliced segments at 5* terminus of adenovirus 2 lat messenger RNA, Proc. Nat, Acad. Sci.

9. USA, 1977, v.74, 3171-3175.

10. Bernard! G. Molecular genetics of yeast mitochondria. In: "Organization and expression of the Eucariotic genome. Biochemical mechanisms of differentiation in procaryotes and eucariotes". FEBS» symposium 1975, Elsevier/North-Holland, v. 38» 41-56.

11. Bernard! G. The mitochondrial genome of yeasts organization and recombination. In: "Genetics and biogenesis of chloroplasts and mitochondria", 1976,Elsevier/North-Holland,503-510.

12. Bernard! G,# Faures M,, Piperno G., Slonimski P.P. Mitochondrial DNAs from respiratory-sufficient and cytoplasmic respira-tory-defficient mutant yeast . J,Mol. Biol., 1970,v.48# 23-42.

13. Broach J.R., Strathern J.N., Hicks J.B. Transformation of yeast: developement of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene. Gene, 1979, v. 8, 121-133.

14. Burges R., Jendrisak J. A procedure for the rapid, large scale purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA-polymerase involving Polymin P precipitation and DNA-cellulose. Bio-Chem., 1975, v. 14, 4634-4638.

15. Cameron J.R., Philippsen P., Davis R.W. Analysis of chromosomal integration of yeast plasmids. Nuc.l. Acids Res., 1977, v. 4, 1429-1448.

16. Christiansen G., Christiansen C. Comparison of the fine structure of mitochondrial DNA from Saccharomyces cerevisiae S. carlsbergensis: electrone microscopy of partially denatu-rated molecules. Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, 465-476.

17. Christiansen G., Christiansen C., Let Bak. Heterogenity of mitochondrial DNA from Saccharomyces carlsbergensis. Denatu-ration mapping by electrone microscopy. Nucl. Acids Res., 1975, v. 2, 197-210.

18. Clarke L., Carbon J. Functional expression of cloned yeast DNA in E. coli: Specific complementation of argininosucci-nate lyase (arg H) mutation. J. Mol. Biol., 1978, v. 120, 517-532.

19. Clark-Walker G.D. Isolation of circular DNA from a mitochond- 126 rial fraction from yeast. Proc. Nat. Acaci. Sci. USA, 1972, v. 69, 388-392.

20. Clark-Walker G.D. Size distribution of circular DNA from petite-mutant yeast lacking DNA. Eur. J. Biochem., 1973, v. 32, 263-267.

21. Clark-Walker G.D,, Azad A.A. Hybridizable sequences betweencytoplasmic ribosomal RNAs and 3 micron circular DNAs of Saccharomyces cerevisiae and Toluropsis glabrata. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, 1009-1022.

22. Clark-Walker G.D., Linnane A.W. In vivo differentiation of yeast cytoplasmic and mitochondrial protein synthesis with antibiotics. Biochem. Biophys. Res* Commun., 1966, v. 25, 8-13.

23. Clark-Walker G.D., Miklos G.L.G. Localization and quantification of circular DNA in yeast. Eur. J. Biochem,, 1974, v., 41, 359-365.

24. Clark-Walker G.D., Miklos G.L.G. Complementation in cytoplasmic petite mutants of yeast to form respiratory competent cells. Proc. Nat, Acad. Sci, USA, 1975, v. 72, 372-375,

25. Clewell D.B. Nature of ColEl plasmid peplication in Escherichia coli in the presence of chloramphenicfel, J, Bacterid., 1972, v. 110, 667-676.

26. Cohen S.N., Chang A.S.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escheri- 127 chia coli by R-factor DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, 2110-2114.

27. Corneo G., Moore C., Sanady D.R., Grossmann L.I., Marmur J. Mitochondrial DNA of eyeast and some mammalian species. -Science, 1966, v. 151, 687-689.

28. Cottrell S., Rabinowitz M. Mitochondrial DNA synthesis in a temperature-sensetive mutant of DNA replication of Saccharo-myces cerevisiae. Biochem. 1973, v. 12, 4374-4378.

29. Cramer J.H., Farrelly F.W., Earnitz J.Т., Rownd R.H. Constructin and restrictin endonuclease mapping of hybrid plasmids containing Saccharomyces cerevisiae ribosomal DNA. -Mol. gen. Genet., 1977, v. 151, 229-244.

30. Cramer R.A., Philippsen P., Davis R.W. Divergent transcription in the yeast ribosomal RNA coding region as shown by hybridization to separated strands and sequence analysis of cloned DNA. J. Mol. Biol., 1978, v. 123, 405-416.

31. Cramer J.H., Rownd R„H, Denaturation mapping of the ribosomal DNA of S. cerevisiae. Mol. gen. Genet., 1980, v. 177,199 199

32. Crick F. Split genes and RNA splicing. Science, 1979, v. 204, 264-272.

33. Dobson M.J., Futcher А.В., Cox B.S. Control of recombination within and between DNA plasmids of Saccharomyces cerevisiae.-Current. Genet., 1980, v. 2, 193-200.- 128

34. Dujon В., Slonimski P.P., Weill,L. Mitochondrial genetics. IX. A model for recombination and segregation of mitochondrial genoms in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 1974, v. 78, 415-437.

35. Elleman Т.е., Hindley J. Sequence of 863 nucleotides encompassing the Pstl site of the yeast 2 m plasmid. Nucl. Acids Res., 1980/ v. 8, 4841-4850.

36. Ephrussi B. Nucleocytoplasmic relations in micro-organisms. -Clarendon Press, Oxford, 1953.53» Etcheverry Т., Colby D., Guthrie C. A precursor to a minor1. S63Tspicies of yeast tRNA contains an intervening sequence. -Cell, 1979, v. 18, 11-26.

37. Faye G., Dennebouy N., Kujawa C., Jacq C. Inserted sequence in the mitochondrial 23S ribosomal RNA gene. Mol. gen. Genet., 1979, v. 168, 101-109.

38. Foury F., Tzagoloff A. Assambly of the mitochondrial membrane system. Genetic complementation of mit~" mutations in mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 1978, v. 153, 3792-3798.

39. Fukuhara H. Relative proportions of mitochondrial and nuclear DNA in yeast under various conditions of growth. Europ. J. Biochem., 1969, v. 11# 135-139.

40. Gerbaud C., Guerineau M. 2 m plasmid copy number in different yeast strains and reparation of endogenous and 2 m chimeric plasmids in transformed strains. Curr. Genet., 1980, v. 1, 219-228.

41. Gillespie D., Spiegelman S. A quantative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J. Mol. Biol., 1965, v. 12, 829-845.

42. Grossman L.J., Goldring E.S., Marmur J. Preferential synthesis of yeast mitochondrial DNA in the absence of protein synthesis. - J. Mol. Biol., 1969, v. 46, 367-376.

43. Gubbins E.J., Newlon C.S,, Kann M.D., Donelson J.E. Sequence organization and expression of an yeast plasmid DNA, - Gene, 1977, v. 1, 185-207.

44. Guerineau M. Expressin of a yeast episome: RNA-DNA hybridization studies. FEBS Lett., 1977# v. 80, 426-428.

45. Guerineau M. Plasmid DNA in yeast. Ins "Virusis and plasmids in fungi", ed. Lemke P.A., 1979, 539-593.

46. Guerineua M., Grandchamp C., Paoletti C., Slonimski P. Characterization of a new class of circular DNA molecules in yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v, 42, 550-557.

47. Guerineau M., Grandchamp C.# Slonimski P.P. Rearrangement of mitochondrial DNA molecules during the differentiation of mitochondria in yeast. I, Electron microscopic study of sise shape. Biochim., 1975, v. 57, 917-929.

48. Guerineau M,, Grandchamp C., Slonimski P.P. Structure and genetics of the 2 m circular DNA in yeast. IN: "Genetics and biogenesis of chloroplasts and mitochondria", Elsevier/ North-Holland, 1976, 557-564.

49. Guerineau M., Grandchamp C., Slonimski P.P. Circular DNA ofa yeast episome with two inverted repeats: structure analisis by restriction enzyme and electron micriscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, 3030-3034.

50. Guerineau M., Slonimski P.P., Avner P.R. Yeast episome: oli-gomycin resistance associated with a small covalently closed non mitochondrial circular DNA. Biochim. Biophys. Acta, 1974, v. 61, 462-469.

51. Guerry-Eopecko P., VJickner R.B. Cloning of the URAI gene of S. cerevisiae. J. Bacterid., v. 3 43, 1530-1533, 198o,

52. Hartley J.L., Donelson J.E. Nucleotide sequence of the yeast plasmid. 1980, Nature, v.286,86o-364.

53. Hartwell L,H. Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Bacteri-ol. Rev., 1974, v. 38, 164-198.

54. Hendler F., Helbreich A., Jakovcic 3,, Patzer Merten S,, Rabinowitz M. Characterization and translation of yeast mitochondrial DNA. In: "Genetics and biogenesis of chloroplasts and mitochondria", Elsevier/North-Holland, 1976, 679684.

55. Heyting C., Meijlink F.C.P.W., Verbeet M.Ph., Sanders J.P.M., Bos J.L., Borst P. Fine structure of the 21S ribosomal RNA region on yeast mitochondrial DNA. Mol. gen. Genet., 1979,- 131

56. Heiting С., Sanders J.P.M. The physical mapping of some genetic markers in the 2IS ribosomal RNA regions of the mitochondrial DNA of yeast. In: "The genetic functions of mitochondrial DNA'j Elsevier/North-Holland, 1976, 274280.

57. Hicks J.В., Fink G.r. Identification of chromosomal location of yeast DNA from hybrid plasmid pYeleulO. Nature, 1977, v. 269, 265-267.

58. Hicks G.B., Hinnen A., Fink G.R. Properties of yeast transformation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1979, v. 43, 1305-1314.

59. Hindley J. DNA sequences in a cloned restriction fragments containing the inverted repeat region from yeast 2 m plasmid. FEBS Lett., 1977, v. 82, 121-124.

60. Hindley J., Phear G.A. Sequence of 1019 nucleotides encompassing one of the inverted repeats from the yeast 2 m plasmid. Nucl. Acids Res., 1979, v. 7, 361r375.

61. Hinnen A.H., Hicks J.В., Fink G.R. Transformation in yeast. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2978, v.75, 1929-1933.

62. Hitzeman R.A., Hagie F.E., Levin H.L., Goedded D.V., Ammerer G., Hall B.D. Expression of a human gene for interferon in yeast. - Nature, 1981, v. 293, 717-722.

63. Holland M.J,, Hager G.L., Rutter W.J. Transcription of yeast DNA by homologous RNA polymerases I and II: Selective transcription of ribosomal genes by RNA polymerase I. Bio-Chem. 1977, v. 16, 16-31.

64. Hollenberg C.P. Mapping of regions on cloned Saccharomyces cerevisiae 2 m DNA coding for polypeptides synthezized in E. coli minicells. Mol. gen. Genet,, v. 162, 23-34, 1978.- 132

65. Hollenberg С.P., Borst P., Van Bruggen E.F.G. Mitochondrial DNA. V. A 25- m closed circular duplex DNA molecule in wild-type yeast mitochondria. Structure and genetic complexity. Biochim. Biophys. Acta, 1970, v.209, 1-15.

66. Hollenberg C.P., Degelmann A., Kustermann-Kuhn В., Royer H.D., Characterization of 2 m DNA of Saccharomyces cerevisiae by restriction fragments analysis and integration in Escherichia coli plaSmid. - Proc, Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v.73, 2072-2076.

67. Hollenberg C.P., Kustermann-Kuhn В., Royer H.-D. Synthesis of high molecular we±)th polypeptides in Escherichia coli minicells derected by cloned Saccharomyces cerevisiae 2 m DNA. Gene, 1976, v. 1, 33-48,

68. Holm C. Clonal lethality caused by the yeast plasmid 2 DNA. Cell, 1982, v.29, 585-594.

69. Hopper A.K., Schultz L.D., Shapiro R.A. Processing of intervening sequences: a new yeast mutant wich fails to excise intervening sequences from precursor tRNAs. Cell, 1980, v.19, 741-751.

70. Howell N„, Hall R,M., Linnane A.W., Lukins H.B. J. Bacterid., 1974, v.119, 1063-1065.

71. Hsiao C.-L., Carbon J. High-frequency transformation of yeast by plasmids containing Arg4 gene. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, v.76, 3829-3894.

72. Huang M., Biggs D.R., Clark-Walcer G.D., Linnane A.W. Chloramphenicol inhibition of the formation of particulate mitochondrial enzymes of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v.114, 434-436.

73. Hyman B.C., Cramer J.H., Rownd R.H. Properties of a Saccharomyces cerevisiae mtDNA segment conferring High-frequency- 133 yeast transformation. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1982,v.79, 1578-1582.

74. Jazwinski S.M., Edelman M. Replication in vitro of the 2 m DNA plasmid of yeast. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979, v.76, 12231227.

75. Kielland-Brandt M.C., Wilken В., Holmberg S., Petersen J.G.L., Nilsson-Tilgren T. Genetic evidence for nuclear location of 2-micron DNA in yeast.-Carlsberg. Res. Commun.,1980, v.45, 119-124.

76. Kleese R.A., Grotbeck R.C,, Snyder J.R. Recombination among three mitochondrial genes in yeast Saccharomyces cerevisiae. J.Bacterid., 1972, v.112, 1023-1025.

77. Klootwijk J., Jonge P., Planta R.J. The primary transcript of the ribosomal repeating unit in yeast. Nucl.Acids Res., 1979, v.<£, 27-34.

78. Knapp G., Ogden R.C., Peebles C.L., Abelson J. Splicing of tRNA precursors: structure of the reaction intermediates. -Cell, 1979,v.18,37-45.

79. Lamb A.I., Rojanapo W. Preferential transcription of dGsdC rich mitochondrial DNA in cytoplasmic petite mutants of Saccharomyces cerevisiae. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1973, v.55,765-772.

80. Larionov V.L., Grishin A.V., Smirnov M.N. 3 m DNA an ex-trachromosomal ribosomal DNA in the yeast Saccharomyces cerevisiae. - Gene,1980,v.12, 41-49.

81. Lauer G.D., Roberts T.M., Klotz L.C. Determination of the nuclear DNA content of Saccharomyces cerevisiae and implication for the organization of DNA in yeast chromosome. -J.Mol.Biol.,1977,v.114, 507-526.

82. Lee E.-H., Johnson B.F. Volume-related mitochondrial DNA- 134 synthesis in zygotes and vegetative cells of Saccharomyces cerevisiae. J.Bacterid.,1977,v.129,1066-1071.

83. Let Bak A., Christiansen C., Christiansen G. Circular repetitive DNA in yeast. Biochim.Biophys.Acta,1972,v.269,527-530.

84. Linnane A.W., Haslam J.M. The biogenesis of yeast mitochondria. In: "Current topics in cellular regulation", Acad. Press, N.-Y.,v.2,1970, Ю1-172.

85. Linnane A.W., Howell N., Lukins H.B. Mitochondrial genetics.- In: "The biogenesis of mitochondria: translational, transcriptional and genetic aspects",Acad.Press,N.-Y.,1974,193*213.

86. Livihgstone D.M. Inheritance of the 2 m DNA plasmid from Saccharomyces. Genetics,1977,v.86,73-84.

87. Livingstone D.M.,Klein H.L. DNA sequence organization of a yeast plasmid. J.Bacterid1977,v.129,472-481.

88. Livingstone D.M., Hahne S. Isolation of condensed intracellular form of the 2 m DNA plasmid of Saccharomyces cerevisiae.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979,v.76,3727-3731.

89. Livingstone D.M., Kupfer D.M., Control of Saccharomyces cerevisiae 2 m DNA replication by cell division cycle. Genes that control nuclear DNA replication. J.Mol. Biol., 1977, v.116, 249-260.

90. Luck D.J.L., Reich E. DNA in mitochondria of Neurospora cras-sa. Proc.Nat.Acad.SCi.USA, 1964,v.52,931-938.

91. Mahler H.R.,Bilinski Т., Miller D., Perlman P.S., Hanson D., Demko C.A. Respiration dificient mutants with intact mitochondrial genomes: casting a wider net. In: "Genetics of chloroplasts and mitochondria", Elsevier/North-Holland,1976, 857-863.

92. McCready S.J., McLaughlin C.S. A comparison of small circular DNA molecules in psi+ and psi"" strains of Saccharomyces cerevisiae. Biochim.Biophys.Acta,1977,v.479,119-121.

93. Meyerink J.H., Klootwijk J., Planta R.J. van den Ende A. , van Bruggen E.F.J. Extrachromosomal circular ribosomal DNA in the yeast Saccharomyces carlsbergensis. Nucl.Acids Res. , 1979, v.7,69-76.

94. Molloy P.L., Linnane A.W., Lukins H.B. Biogenesis of mitochondria. 37. Analysis of mitochondrial antibiotic resistance markers in petite mutations of Saccharomyces cerevisiae. -J.Bacter. 1975, v.122, 7-18.

95. Morgan A.R., Pulleyblank D.E. Native and denaturated DNA , cross-linked and palindromic DNA and circular covalently -closed DNA analyzed by a sensetive fluorometric procedure. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1974, v.61, 346-356.

96. MorimotQ,Lewin A., Martin N., Merten S., Rabinowitz M. -Physical mapping of of genes on yeast mitochondrial DNA : localization of antibiotic resistance loci, and rRNA and tRNA genes. Mol.gen.Genet.,1978,v.163,241-256.

97. Nagley Ph., Linnane A.W. Mitochondrial DNA deficient petite mutants of yeast. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1970,v.39, 989-986.

98. Nass M.M.K., Nass S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristic. I. Fixation and electron staining reactions. -J.Cell Biol.,1963,v.19,593-611.

99. Nelson R.G., Fangman W.L. Nucleosome organization of the yeast 2 m DNA plasmid: a eukariotic minichromosome. Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1979,76,6515-6519.

100. Nikolaev n., Georgiev O.I., Venkov P.V., Hadjiolov A.A. The 37S precursor to rRNA is the primary transcript of rRNA genes in Saccharomyces cerevisiae. J.МЫ.Biol., 1979,v.127, 127-134.

101. Ogden R.C., Beckman J.S„, Abelson J., Kang H.S., S611 D. , Schmidt O. In vitro transcription and processing of a yeast tRNA gene containing an intervening sequence. Cell, 1979, v.17,399-406.

102. Parish J.H. Principles and practice of experiments with nucleic acids. London 1972,127-128.

103. Peacock A.C., Dingman C.W„ Resolution of multiple ribonucleic acids by polyacrilamid gel electrophoresis. Biochem. , 1967,v.6,1818-1827.- 137

104. Peebles C.L., Ogden R.C#/ Knapp G., Abelson J. Splicing of yeast tRNA precursurs: a two-stage reactions. Cell,1979 , v.18,27-36,

105. Petes T.D. Meiotic mapping of yeast ribosomal DNA on chromosome XII, J. Bacter., 1979,v.138,185-195.

106. Petes T.D., Hereford L.M.,Skryabin K.G. Characterizationо of two types of yeast: ribosomal DNA genes. J. bacteriol.,1978, v.134,295-305

107. Petes T.D., Smolik-Utlant S. Evidence that the ribosomal DNA genes of yeast are not on chromosome I. Mol.gen.Genet. ,1979,v.175,187—193.

108. Petes T.D., Williamson D.H. Replicating circular DNA molecules in yeast. Cell, 1975, v.4, 249-253.

109. Philippsen P., Thomas M., Kramer R.A., Davis R.W. Unique arrangement of coding sequences for 5S, 5.8S, 18S and 25S ribosomal RNA in SAccharomyces cerevisiae as determined by R-loop and hybridization analysis. J.Mol.Biol., 1978,v.123, 387-393.

110. Piperno G., Fonty G., Bernardi G„ The mitochondrial genome of wild type cells.II. Investigation of the compositional heterogeneity of mitochondrial DNA. J.Mol.Biol., 1972 , v.65,191-205.

111. Plischke M.E., von Borstel R.C.# Mortimer R.K., Cohen W.E. Genetic marcers and associated gene products in Saccharomyces cerevisiae. In: "Handbook of biochemistry and molecular biology", 3-rd ed.,Cleveland,Ohio,1976,765-832.

112. Prunell A., Bernardi G. The mitpchondrial genome of wild -type yeast-cells.IV.Genes and spacers. J.Mol.Biol., 1974, v.86,825-841.

113. Prunell A., Bernardi G. The mitochondrial genome of wild- 138 type yeast cells. VI. Genome organization. J. Mol. Biol., 1977, v.110,53-74.

114. Radloff R.,Bauer W., Vinograd I. A dye buoyant density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA. Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1967,v.57,1514-1521.

115. Ratzkin В., Carbon J. Functional expression of cloned yeast DNA in Escherichia coli. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1977,v.74, 487-491.

116. Royer H.D., Hollenberg C.P. Saccharomyces cerdvisiae 2 m DNA. An analysis of the monomer and its multimers by electron microscopy. Mol.gen.Genet., 1977,v.150, 271-284.

117. Sanders J.P.M., Borst P.,Weijers P.J. The organization of genes in yeast mitochondrial DNA. II. The physical map of EcoRI and Hindll+III fragments. Mol.gen.Genet.,1975,v.143, 53-64.

118. Sanders J.P.M., Flawell R.P., Borst P. Nature of the base sequence conserved in mitochondrial DNA of a low density petite. Biochim.Biophys.Acta,1973,v.312,441-457.

119. Saunders G.W.,Rank G.H.,Kustermann-Kuhn В., Hollenberg C.P., Inheritance of multiple drug resistance in S. cerevisiae . Linkage to leul and analysis of 2 m DNA in partial rever -tants. Mol.gen.Genet.,1979,y.175,44-52.

120. Schatz G.,Haslbrunner E., Tuppy H. Deoxyribonucleic acid as- 139 sociated with yeast mitochondria. Biochem.Biophys. Res., 1964/v.15/127-132.

121. Seligy V.L.,Thomas D.J., Miki B.L.A. S. cerevisiae plasmid, Scp or 2 m: intracellular distribution, stability and nuc-leosomal-like packaging. Nucl,Acids Res.,1980,v.8,3371-3391.

122. Sharp P.A., Sugden В., Sambrook J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophillus parainfluenzae using analitical agarose-ethidium bromide electrophoresis. -Biochem.,1973,v.12, 3055-3063.

123. Sherman F.,Ephrussi B. The relationship between respiratory deficiency and supressivity in yeast as determined with se-gregational mutants. Genetics, 1962,v.47, 695-700.

124. Schweizer E., Mac Kachne C., Halvorson H.O. The redundancy of ribosomal and transfer RNA genes in Saccharomyces cerevisiae. J.Mol.Biol., 1969,v.40,261-277.

125. Sinclair J.H., Stevens B.J., Sanghavi P., Rabinowitz M. Mitochondrial satellite and circular DNA filaments in yeast. Science,1967,v,156,1234-1237.

126. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mpl.Biol., 1975,v.98,503-5o7.

127. Southern E. Gel electrophoresis of restriction fragments, -Ins "Methods in enzymology", Acad.Press, N.-.Y., 1979,v.68, Recombinant DNA,152-176,

128. Sriprakash K.S.,Molloy P.L., Nagley Ph,, Lukins А.В., Linnane A.W. Biogenesis of mitochondrias XLI. Physical mapping of mitochondrial genetic markers in yeast. - J,Mol. Biol.,1976,v.104,485-503.

129. Stinchcomb D.T., Struhl K., Davis R.W. Isolation and characterization of a yeast chromosomal replicator, Nature,1979,

130. Stinchcomb D.T., Struhl К., Davis R.W. Isolation and characterisation of a yeast chromosomal replicator. Nature , 1979,v.282,39-43.

131. Storm R.K., McNeil J.В., Khandekar P.S., Parker G.An.J, , Friesen J.D„ Chimeric plasmids for cloning of DNA sequences in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol.,1979,v.140, 7382.

132. Struhl K., Cameron J.R., Davis R.W. Functional genetic expression of eukariotic DNA in Escherichia coli. Proc, Nat. Acad.Sci.USA,1976, v.73, 1471-1475T

133. Struhl K., Davis R.W. A physical, genetic and transcriptinal map of the cloned his3 gene region of Saccharomyces cerevisiae. J.Mol.Biol.1980,v.136,309-322.

134. Struhl K., Stinchcomb D.T.,Scherrer S., Davis R.W, High-frequency transformation of yeast: autonoumos replication of hybrid DNA molecules. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979, v.76,1035-1039.

135. Szostak J.W., Wu R. Insertion of a genetic marker into ribo-somal DNA of yeast. Plasmid,1979,v.2, 536-541„

136. Tabak H.F. Absence of 2 m DNA sequences in S. cerevisiae . -FEBS Letters, 1977,v84,67-70.

137. Taketi M., Jazwinski S.M. Edelman G.M. Association of the2 m DNA plasmid with yeast folded chromosomes. Proc. Nat. Acad.Sci.USA, 1980,v.77,3144-3148.

138. Tay B.K., Chan C.S.M. Chromosomal replication origins in yeast. In: "Molecular biology of yeast. Abstracts of Cold Spring Harbor Conference, 14-19/VIII, 1979, 224,

139. Tzagoloff A., Foury F., Akai A. Genetic determination of mitochondrial cytochrome b. Ins "Genetics and biogenesis of chloroplasts and mitochondria", Elsevier/North-Holland,1976, 419-426.

140. Walz A., Ratzkin В., Carbon J. Control of a cloned yeast (Saccharomyces cerevisiae) gene (trp5) by a bacterial insertion element(IS2). Proc.Nat.Acad.Sci., 1978,v.75,6172-6174.

141. Wesolowski M., Fukuhara H. The genetic map of transfer RNAgenes of yeast mitochondria: correction and extention. Mol. gen.Genet.,1979,261-269,

142. Wilkie D., Saunders G.W., Linnane A.W. Inhibition of respiratory enzyme synthesis in yeast by chloramphenicol. Relationship between chloramphenicol tolerance and resistance to other antibacterial antibiotics. Genet.Res.,1967,v.10, 199-203.

143. Zakian V.A., Brewer B.J., Fangman W.L. Replication of each copy of the yeast 2micron DNA plasmid occurs during the S phase. Cell,1979,v.17,923-934.

144. Zeman L., Lusena C.V. Closed circular DNA associated with yeast mitochondria. FEBS Letters, 1974,v.38,171-174.

145. Zimmerman S.B.,Sandeen G. The ribonuclease activity of cri-stallized pancreatic deoxyribonuclease. Analyt.Biochem., 1966,v.14,269-277.