Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ структуры и функции 2 МКМ ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae различного происхождения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структуры и функции 2 МКМ ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae различного происхождения"

ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

На правах рукописи

МЕЛЬВИДАС ВИТАУТАС БОЛЕСЛОВАС ИОНО

УДК 676.113 УДК 681.184

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ 2 МКМ ДНК ДРОЖЖЕЙ ЗассЬаготусев сегеУ1в1ае - РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.15 - Генетика 03.00.12-Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диосертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

ВИЛЬНЮС - 1992

Работа выполнена в Лаборатории генной инженерии Инстит биотехнологии "Ферментас", г. Вильнюс и в Лаборатории генет Института ботаники

Научные руководители: , - кандидат биологических наух

Д. ЧИТАВИЧЮС

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор, член-кор. АН Литвы ,В. РАНЧЯЛИС - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А. ЯРОШЮС

Ведущая организация - ВИЛЬНЮССКИЙ уНИВЭрСИТвТ

Защита диссертации состоится"

1992 г.

11 часов на заседании специализированного совета К II.07.01 I защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте ботаники (2021, г. Вильнюс, ул. Жалюю эжеру, 47)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстит] ботаники

Автореферат разослан

М МЛ

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

М.К. НАВАЛИНСКЕ1;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Генноинженерные работы на дрожжах проводятся посредством конструирования векторных плазмид на основе дрожжевой 2 мкм ДНК плазмиды. Она служит и как модельная система для изучения таких фундаментальных биологических процессов как репликация и рекомбинация. 2мкм ДНК-подобные плазмиды были выделены не только из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, но и из осмофильных дрожжей Zygosaccharomyces, Kluyveromyces' и др. (Utatsu, Sakamato et al, 1987). Выяснилось, что различные по своей нуклеотидной последовательности плазмиды дрожжей можно изобразить в очень схожей пространственной модели с расположением гомологичных или аналогичных областей приблизительно в одних и тех же местах изучаемых плазмид (James, Murray et. a!, 1987). После того, как была определена первичная структура 2мкм ДНК (Scp1) штамма S. cerevisiae А364А (James, Hartley et al, 1980), основным методологическим приемом изучения ее стало исследование поведения и взаимоотношения различных областей и генов в составе рекомбинантных векторов. Первичные структуры установлены полностью или частично десяти плазмид типа Sep и 2 мкм ДНК-подобных плазмид разных видов дрожжей (James, Murray et al, 1987). Но, несмотря на очевидные успехи генноинженерной методологии, применительно к дрожжам (созданию спектра функционально различных векторов, разработке простых методов трансформации) ее функция в клетке остается не ясной. Парадоксально и то, что при не выясненной ее функции с применением плазмид типа 2 мкм ДНК для конструирования векторов достигнуты не малые достижения в биотехнологии. Для оптимизации применения таких плазмид в биотехнологических и теоретических работах необходимо знать их функции в клетке. Структурные различия между 2 мкм ДНК-подобными плазмидами остаются актуальными также при изучении факторов, влияющих на стабильность ■ рекомбинантных плазмид. В настоящее время выделено несколько плазмид типа Sep с частично различной первичной нуклеотидной последовательностью в некоторых ее участках (Xiao, Lawrence, 1991) что дает возможность изучить их как в функциональном, так и в эволюционном отношениях Для выявления функц^кз клетке всей плазмиды или отдельных ее частей требуются наличие более широкого спектра векторных молекул, включающих в себе различные по своей перэичной структуре плазмиды типа 2 мкм ДНК одного вида дроибкей. Изученные плазмиды типа Sep, выделение из дрожжей S.cerevisiae, различаются в основном делециями. Поэтому остается актуальным поиск новых вариантов плазмид дрожжей S.cerevisiae с разнообразной дивергенцией первичной нуклеотидной последовательности. Наиболее вероятно, что такие плазмиды могут быть найдены среди штаммов независимого происхождения.

Работа выполнена по теме Института ботаники "Создание и анализ модельных генетических систем на клеточном уровне для селективного изучения изменчивости и биологической продуктивности геиома с целью создания высокопрозодуктианых кормовых культур" (No Госрегистрации 022814) и является составной частью Всесоюзной научно-технической программы "Новейшие методы биоинженерии".

Целью работы явилось изучение .структуры и функции 2 мкм ДНК дрожжей S.cerevisiae штамма ¡5В-П4, происходящего из Петергофских генетических линий и проведение сравнительного анализа полученных данных с уже известными вариантами 2 мкм ДНК дрожжей типа Scpl.

Задачи исследования. В задачи настоящей работы входило' Клонирование 2 лкм ДНК штамма 15В-П4 (Scp4).

2. Составление рестрикциочной карты плазмиды Scp4 к сравнение с аналогичной картой плазмиды Scpl.

3. Определение типа дивергенции перэичной н\глсотиднс~! г.оследссзтельноои

плазмиды Scp4 по сравнению с плазмидой Sep!.

4. Определение функциональной значении районов дивергенции нуклеотидной последовательности плазмид Scp4 и Scpi.

5. Секвенирование фрагмента плазмиды Scp4, охватывающего районы "ОгГ и

REP3.

6. Сравнение организации структур первичных нуклеотидных последовательностей районов "Ori и REP3 плазмид Scpl и Scp4.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучена новая 2 мкм ДНК (Scp4) штамма 15В-П4, происходящего из Петергофских генетических линий, отличающаяся от наиболее изученной плазмиды Scpl не только делециями, но и нуклеотидной последовательностью в районах REP3 и частично "Ori". Показано, что наиболее консервативная часть исследуемой плазмиды-малая Р петля и район инвентированных повторов. Впервые показано, что организация первичной структуры района REP3 отличается от района REP3 плазмиды Scpl. С пломощью векторных плазмид проведены функционально-сравнительные анализы плазмид в штаммах различного происхождения. Показано, что плазмида Scp4 менее универсальна по сравнению с Scpl. Из всех плазмид типа Sep плазмида Scp4 наиболее отличается по первичней структуре и по организации района REP3. Таким образом было показано, что для плазмид типа Sep наиболее изменчивым является район REP3.

Нами изученная 2 мкм ДНК-плазмидз 5ср4-используется в Лаборатории генетики Института Ботаники Литеы для конструирования новых векторных плазмид, с цепью повышения их стабильности и дальнейшего изучения ее функции в клетке. На основе данных о нуклеотидной последовательности района REP3 была сконструирована ¡¡екюрная плазмида со стабильностью 100% (Dale, Bruschi, 1990). Данные о первичной структуре участка REP3 плазмиды Scp4 повышает возможность выявления ее функции в клетке, что необходимо при конструировании новых векторов с повышенной стабильностью.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Данные рестрикциоиного картирования и гетеродуплексного анализа 2 мкм ДНК штаммов 153-П4 и А364А различного происхождения.

2. Данные первичной структуры и ксХтъютерного анализа определенных фрагментов плазмид Scpl и Scp4.

3. Данные функциональной активности плазмид в зависимости от структурных различий.

Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на. Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК", Пущино, 1982, Международной конференции The International Symposium of Yeast Genetics and Molecular Biology, Canada, 1936, на Республиканских конференциях общества генетиков и селекционеров, Вильнюс, 19S0, на семинарах Лаборатории генной инженерии НПО "Фермент", 1985,1986.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы четыре работы.

Объем к структура диссертации. Диссертация состоит из взедения, сбзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсу>^?ния, выводов и списка цитируемой литературы

Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 32 рисунка. Библиография включает 151 ссылку.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследований явилась 2 мкм ДНК-плазмида Scp4, выделенная из штамма 15В-П4 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, происходящего из Петергофских генетических линии (Инге-Вечтомов, 1963). Кроме того в работе были использованы штаммы дрожжей Scerevisiae: Петергофских генетических линий: А62 a a-BI88 Ieu2-?(cii°'i мортимеровских генетических линий AJS-l3eCade-2 !eu2 his3 (drO) p29DC5 a

Ieu2 his3(cir+); DC5 a Ieu2 his3 cant—ti£cîr+): DC5 a Ieu2 his3 canl-ll (cir*) - представлены Д. Гордениным, Санкт-Петербургскии университет. A364A a adel ade2 ural tyrl his7 Iys2 (cir+) (SigurdsoaLiwingston et al, 1981, Беркли, США). Для амплификации плазмид использованы штаммы E.coli: HBI0I leuB pro thLrrrr- enoo~recA, полученный из ВНИИ "Генетика", Москва; KI2 J623I F- trp pur С strR, полученный от В. Гершановичз, ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

ßna3MMAnyra ДНК дрожжей выделяли по методу Clark-Walker, 1972. Трансформации дрожжей проводили, используя интактные клетки (Ito et al, 1983) трансформацию E.coli - по методу, описанному Боливаром (Bolivar, 1979).

Плазмидную ДНК дрожжей из бактериальных клеток (трансформантов) выделяли по методу щелочной экстракции (Birboim, Doly, 1979). В некоторых случаях плазмидную ДНК подвергали очистке центрифугированием в градиенте цезия хлористого. Гидролиз ДНК рестриктазами проводили а условиях рекомендованных поставщиком НПО "Фермент (г. Вильнюс). Конструирование рекомбинантных плазмид осуществляли по методикам, изложенным в руководстве по генной' инженерии (Маниятис, 1984]. Электроферез проводили а агарозных и полиакриламидных гелях. Клонирование ДНК для секвенирования прозодили по методике и материалам, представленным фирмой Amerscnam, применяя фаг MI3 (Cloning and sequencing handbook, Amerscham, 1994). Нуклеотидную последовательность ДНК определяли методом Сэнджера (Sanger et al, 1977). При электронно-микгюскопическом исследовании ДНК-ДНК дуплексов использовали метод Девиса (Davis et al, 1971).

Миготическую стабильность плазмид определяли методом отпечатков (Захаров, 1984). Значение митотической стабильности плазмиды определялось как процентная доля LEU+ фенотип содержащих клеток, после культивирования отдельных трансформантоз в неселектиеных по отношению к плазмидному мзркеру условиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Предварительное изучение 2мкм ДНК дрожжей 5-cerevisiaa ш гамма 15В-П4.

Плазмиды дополнительно очищали центрифугированием в градиенте плетнеет цезия хлористого. Для сравнитепьнбго анализа использовали плазмяДу "Scpi. выделенную из гаплоидного штамма дрожжей А364А, происходящего из мортимеровских генетических линий. Установили, что плазМидз штамма 15В-П4 имеет лишь по одному сайту узнавания для рестрикгаз Ava I, EcoRI, Psti. При пиролизе смесью рестриктаз Hindllt+Pstl обнаружены различия в подвижности одного фрагмента, что, по-видимому, связано с делецией, похожей на делецки плазмид Scp2, Scp3. Полученные данные не дгюг точного ответа о природе различий s подвижности фрагментов плазмид при электрофорезе, поэтому пропали дальнейшее ее изучение.

2. Клонирование дрожжевых 2 мкм ДН!\ из штем'лов !5В-Л4 >л ADC'*,А а гглазмнду р BR322.

Плазмиду pBR322 рестриктаза Pstl расщепляет в о^днзфясте. Ее перзичная нуклеотидная последовательность известна. Поэтому для конструирования векторов мы использовали 2 мкм ДНК штаммов (5В-П4 и А364А (плазмида Scpl) и плазмиду pBR322, расщеппенкые рестриктазой Pstl. Выделение плазмиды ДНК проводили г:о стандартной методике (Liwingston, Kupper, 1973). Лигировзние проводили с помощью ДНК лигазы Т4 Этой смесью трансформировали штамм E.coli HBIOL Трансферта!¡ты отбирали по резистентности к тетрациклину. После зыращипания кпомэз трансформантоз в LB среде, плазмиды выделяли щелочным методом. Размер рекомбинантных ДНК проверяли гель-электрофорезом. Плаз?',иди, которые имел;* величину около 10 килобаз, подвергали рзсщеплению рестриктазой Pstl. Контропью служили Pstl-рестрикты плазмид' Scpl и pBR322. Отобранные рекомбимантные плазмиды дополнительно подвергали совместному гидролизу Hind Ili+Psti. Контролыо служили соответствующие фрагменты неклонироазнкой 2 мкм ДНК, Scpl и p8R322.

Величину фрагментов ДНК определяли методом относительной электрофоретической подвижности. Физическая карта плазмиды штамма 15В-П4 была составлена на основании данных о размерах фрагментов, образующихся в результате гидролиза специфическими эндонуклеазами и сведений о рестрикциокной карте ДНК плазмиды Scp1. В результате проведенных экспериментов было установлено, что рестриктаза Hind III имеет три сайта узнавания в 2 мкм ДНК штамма 15В-П4 и Scpl. По результатам электрофоретической подвижности фрагментов и их количеству можно предположить, что расщепление обеих дрожжевых плазмид происходит в тех же местах или близких к ним. С целью более точного картирования анализируемой плазмиды провели клонирование всей ее последовательности в бактериальный вектор pBR322. На выбор данной рекомбинантной ДНК E.coli повлияло тот факт, что известна ее нуклеотидная поспбдовательность. Для дальнейшей работы мы подобрали клоны с гибридными плазмидами. 2 мкм ДНК l5B-n4+pBR322,Scpl+pBR322, в которых трансформированы дрожжевые плазмиды "Б" формы и одной ориентации (рис. 1 \ ■ Ампликацию гибридных плазмид проводили выращивая их в среде LB с хлорамфениколом.

D37 ОХ А 27«О Б !V3i

Рис. 1. Рестрикционный анализ гибридных плазмид Бср1+рВВ322 и 15В-П4+рВЯ322 (2\ состоящих из "Б" формы 2 мкм ДНК штаммов А364А и 15В-П4, клонированных в плазмиду рЕШ322 через сайт рестрикции РбИ. А, Б, В, Г фрагменты (п.о.) 2мкм ДНК А364А, ДЕ-плазмиды рВЯ322, обработанные смесью рес-триктаз РбИ+НИШ.

3. Картирование 2 мкм ДНК штамма дрожжей 15В-П4.

Плазмиды 2 мкм ДНК и 15В-П4 и рВР322 рестриктаза ЕсоР1 расщепляет в одном месте. По величине фрагментов гидролиза плазмиды рВЯ322 смесью рестриктаз ЕсоР1 + РбИ установили, что рестриктазы ЕсоР! РбН плазмиду штамма 15В-П4 расщепляют на два фрагмента величиной около 4,3 тысячи по. и 2,0 т.п.о.

-s-

Расщеплен^.е только гибридной плазмиды рестриктазой EcoRI показало, что сайт расщепления для данной рестриктазы находится в районе области гена FLP. Таким же способом установили места расщепления для рестриктазы Aval. На гибридной плазмиде, по местам гидролиза плазмиды pBR322 рестриктазами BamHI, SalGI имея в виду, что рестриктаза Hpal расщепляет плазмиду Scpl только в одном месте, установили, что плазмиды штамма 15В-П4, упомянутые рестриктазы не разщеппяют. Используя мечение концов фрагментов 2 мкм ДНК 15В-П4 радиоактивным фосфором р32 установили места расщепления для рестриктаз: Hind 111-3 места. Hind 11-одно место, Bcnl и Sdul-два места. Таким образом удалось обнаружить, что 2 мш ДНК штамма 15В-П4 имеет делецию около 160т 50по. В фрагменте, ограниченном сайтами расщепления рестриктазами Hindlll Pstl и охватывающим один из инвентированных повторов районов "Ori" и REP.3, почти также как и для плазмид Scp2, Scp3. Однако при расщеплении гибридных плазмид 2 мкм ДНК 15В-П4+ pBR322 (формы "Б") рестриктазами Sau3A и Bspl было показано не только исчезновение сайтов расщепления, но и появление новых; например, для рестриктазы Sau3AI (ptlc. 2).

■ У60

tsz,

- r?c-

i€ О 7Ц

Z 3

рис 2. Разделение фрагментов в 2% атарозном геле после расщепления плазмид: 1 - 15В-П4 + рВЯ322. 2 - Бср1 + рВР322; 3-рВЯ322 рестриктазой 5аиЗА1. (-) и (+) - отсутствие или появление новых фрагментов; п о ±30.

Выявлено отсутствие фрагмента величиной 1576 по, затрагивающего район REP3, плазмиды Scpl и фрагмент 731 по. находящийся в другой петле, чем район REP3, а -акже и появление фрагментов величиной в 950 п.о. плазмиды штамма (5В-П4. Чтобы установить не только области делеции, но и возможную дивергенцию нукпеотидной последовательности мы провели более детальный анализ Hind III фрагментов: А, Б, В, Г, обеих плазмид (рис. 3).

Ml

CxoTU

H.'nd И!

Pill Ъсп I

Sep i

631Í п о

«ВТЙ

Рис. 3. Стратегия физического картирования 2 мкм ДИК штамма 15В-П4, расщепленной рсстриктазами Pstl + Hid III (А, Б. В, Г-фрагменты плазмиды) и сравнительные рестрикцчонные карты фрагментов P.stl плазмид Scpl и штамма 15В-П4 для рсариктаз EcoRI, Aval, Bcnl, Hind III, Hpal, Bspl, ИП-инвентировгнные

повторы, п о.-пары основания, "Ori" - район начала репликации,.

Расщепление фрагментов "А" плазмид Sep! и штамма 15В-П4 рестриктазами SaiKlAI, Bsp¡, Mspl не показало различий ни по подвижности фрагментов ни по ресгрикционному картированию. Установлено, что депеция величиной до 200 по. находится в фрагменте "Б" и ограничена большим фрагментом рестриктазы Mspl. В нем отсутствуют сайты расщепления для рестриктаз Нра!, Aval и появляется по одному сайту расщепления для рестриктаз SauOAl и Bspl (рис 4).

Рис. 4. Электрофорез в 1% агарозе фрагмента Ъ" плаз-миды 15В-П4 после гидролиза рсстриктазими. I—Bsp!. 2-Bsp! + Ben, 3—контроль (фрагмент "А" Scpl + Bspl). п.о + 30.

Новые сайты расщепления или исчезновения их по сравнению с плазмидой Scpl для рестриктазы Sau3A обнаружили также и на фрагменте "В", а для рестриктазы Bspl - в фрагменте "Г, хотя общая длина этих фрагментов практически нэ отличается. Таким образом была составлена физическая карта плазмиды штамма 15Е5-П4 для следующих рестриктаз' Aval, EcoRI, Hind l¡!. Hind II. Sdul, Cfrl, Mspl и частично для рэстриктаз Sau3A, Bspl. Из полученных данных следует, что, со сравнению с первичной нуклеотидной последовательностью плазмиды Scpl, в 2 мкм ДНК штамма 1БВ-П4 обнаружены, как локальные места малой и большой дивергенции нуклеотидной последовательности, так и место довольно большой делении. Особенно отличается фрагменты "Б". Различия наиболее охватывают район REP3. Так как было показано (James, Murray et al, 1987), что плазмиды Scpl, 5ср2, Scp3 различаются одна от другой только по величине и количеству делеций, для определения типа плазмиды штамма 15В-П4 мы провели гетеро- и гомодуллехсный сравнительный анализ между плазмидами Scpl и 2 мкм ДНК 15В-^.

4. Сравнительный электро-микроскопический амин« 2 'мкм ДИК штаммов A3S4A (Scpl) и 153-П4 (Scp4).

Гомодуплексный анализ плазмиды 15В-П4, расщепленной рестриктазазой Pstf показал, что исследуемая нами плазмида, как и плазмида Scpl имеет большую и малую "Р" петли, инвертированные повторы и ее можно изобразить в ггнтелесбразной форме, как и все 2 мкм ДНК-подобные плазмиды. Как показано на (рис. 5), на гетеродуплексе предварительно ренатурировзнных гомодуплексов плазмид Scpl - и штамма 15В-П4, расщепленных рестриктазой Pstl, в отличие от "петли", образуемой плазмидами Scp2, Scp3. плазмида штамма 15В-П4 образует более сложную структуру, что указывает на другой тип изменения нуклеотидной последовательности плазмиды штамма 15В-П4 по сравнению с Scpl.

Рис 5. Гетеродуплекс предварительно ренатурировзнных гомодуплекссз плазмчд А364А (Scpl) и 2 мкм 15В-П4, расщепленных рестриктазой Pstl. Угеличзниэ плафонного микроскопа ЗООООх, фотофзфии-23х. (-район "Orí". 2-зона дивергенция

п о, З-нить плазмиды А364А (Scpl) 4-нить 2 мкм ДНК 15В-П4,5-малые "Р" петли, 6-инвентируемые повторы по, 7-1етеродуплекс большого конца, 8-гетеродуапекс малого конца. А-электронно-микроскопическая фотография, Б-схематическое изображение.

Из полученных данных можно предположить, что значительная дивергенция области REP3 плазмиды штамма 15В-П4, обусловлена накоплением точковых мутаций или такого рода пе_рестроек как делеции. инсерции. Установлено, что величина негомологичного района составляет 550+50 п.о, что не противоречит данным рестрикционного картирования. Из рис. 5 видно, что наша плазмида короче плазмиды Scpl примерно на 200 п.о. Локус большой дивергенции, по-видимому, не затрагивает района "Ori'. Однако, при анализе гетеродуппексов линейных плазмид штамма 15В-П4 и Scpl, полученных нами рестриктазой Pstl, было установлено, что границы района дивергенции не ограничены жестко, так как использованный метод позволяет получить достоверные данные только тогда, когда дивергенция больше 20% по. Поэтому неи|ключено, что частичная дивергенция нуклеотидных последовательностей может затрагивать и более обширный район, до самых инвертированных повторов. Величина инвертированных последовательностей для плазмиды штамма 15В-П4 была установлена 599 730 п о, которая является практически идентичной плазмиде Scpl. На других местах большой дивергенции нуклеотидной последовательности не было установлено. Изучали 20-30 молекул гомодуплексов и гетеродуплексов. На ochobl всех вышеупомянутых данных мы можем считать плазмиду штамма 15В-П4 новой плазмидой типа 2 мкм ДНК дрожжей S.cerevisiae, мы назвали ее Scp4. 5. Изучение функциональных свойств REP3 области 2 мкм ДНК штаммов дрожжей различного происхождения.

Для конструирования рекомбинантных плазмид несущих 2 мкм ДНК чтобы исключить возможные ошибки из-за влияния структуры, происходящей из бактериального вектора, выбраны две разные векторные плазмиды. маркированные дрожжевым геном LEU2. Вектор pBR329-LEU2, состоит из бактериальной плазмиды pBR329 и дрожжевого гена LEU2, встроенного в сайт расщепления EcoRI. На его основе сконструированы pVM2-2, pVM3-l, несущие формы "Б" одной ориентации плазмид Scpl, Scp4, вставленных через сайт узнавания рестриктазой Pstl. Чтобы определить зависимость стабильности от ориентации 2 мкм ДНК в вектор рЕМВ427, состоящий из бактериальной части плазмиды pEMBLS (сконструирована в НПО "Фермент") и гена LEU2, через сайты расщепления рестриктазы Pstl вставлены формы "Б" плазмид Scnl, Scp4 всех возможных ориентации. Так сконструированы вектора pVMi-l, pVMI-l5(Scp4) и pVMI-35, pVM60 (Scpl) соответственно идентичной ориентации. Бактериальные части векторов различаются не только по длине, но и по количеству "Ori" районов (Маниятис, Фрич 1984). Контрольные плазмиды pVM2-8 и pVM3-2 имеют только идентичные фрагменты, ограниченные сайтами узнавания рестриктаз EcoRI-Pstl с районами "Orí" и REP3 плазмид Scpl, Scp4. Как показали исследования, стабильность векторов pVM2-8 и pVM3-2 соответствовала литературным данным (Hol enberg, 1982) и для своего поддержания требует присутствия эндогенной 2 мкм ДНК роципиентных штаммов. Различия в бактериальной части не влияло на резулТоты стабильности исследуемых векторов. Все типы рекомбинантных плазмид различаются только по первичной нуклеотидной последовательности плазмид Scpl и Scp4. В качестве реципиентных штаммов дрожжей использовали (cir+X имеющие эндогенную 2 мкм "ДНК, и производные их (c¡r°), мутантные по гену LEU2, происходящие из разных генетических линий. Основным критерием при сравнении функциональных свойств.плазмид Scpl, Scp4 служила стабильность рекомбинантных плазмид в дрожжах. Результаты стабильности представлены на табл. 1.

Таблица 1

Стабильность рекомПинантних платил в (cir+) и (cir°) штаммах дрожжей S.cerevisiae pa t личного происхождения

Плазмида и тип Трансформированные штампы и стабильность, (%)

2 мкм ЛИК

No DC5 (cir + ) DC5 (пг°) AG2 (cir+ А62 (cir° ) p29DC5(cir+) AJSI 3(cir°)

1 р\'М 35 Scpl 72 ± 5 81 ±3 78 ± 6 84 ±6 (-)

2 pVM ПО Scpl 74 ±4 82 ±4 79 ± 5 86 ±7 -

3 pVM Ы Scp4 74 ±3 05 ± 3 81 ± 5 80 ±5 -

4 pVM I-I5 Scpl /8 ±4 64 ± 3 75 ± 5 76 ±4 -

5 pVM 3-1 Scpl 76 ±4 82 ±5 80 ± 5 89 ±3 -

6 pVM 2-2 Scp4 80 ±4 G1 44 80 ±5 75 ±6 75 ± 6 53 ± 4

7 pVM 2-8 Scp4 80 ±7 1 72 ±7 3 -

8 pVM 3-2 Scpl 77 ±8 0,6 78 ±6 0.8 -

(-) стабильность не определялась, штаммы DC5 (cir+), DC5 (cir°), AJSI3 (cir°), p29DC5 (cir+), мортимерипской генетической линии, штаммы А62 (<"ir°), А62 (cir+) - Петергофской коллекции, плазмиды 1-1 сконструиропаш.1 на основе бактериальной ЛПК рЕМВ -127, а5-8-рВП322 Плазмиды 1,4 различаются от 2,3 только по ориентации 2 мкм ЛПК, в плазмидах 5-8-2 мкм ЛПК одипаконой ориентации,

Плазмиды pVM35, pVM60 pVM3-l (Scpl) в штаммах А62 (cir°) (Петергофские генетические линии) и DC5(c:rO) (мортимеровские генетические линии) в среднем имеют большую стабильность, по сравнению со соответствующими штаммами (cir+) что вполне соответствует данным других авторов (Jayaram, Broach, 1983). Плазмиды pVMI-l, pVMI-15 nVM2-2, (Scp4) наоборот имеют значительно меньшую стабильность в штамме DC5 (cir^), по сравнению со штаммом DC5 (cir+) и практически не показывают изменения стабильности в штамме А62 (cir^) по сравнению со штаммом А62 (cir*-) Аналогичные данные были получены при изучении стабильности плазмиды pVM2-2 в штаммах AJS13 (cirO) и p29DC5(cir+) (мортимеровские гентические линии). Ориентация вставления плазмид Scpl и Scp4 в рекомбинантные ДНК не влияет на результаты стабилоности. Из полученных данных следует, что для более стабильного поддержания плазмид типов pVM1, pVMI-15 и pVM2-2 (Scp4) в штаммах DC5 и AJ13 необходимо генетическое взаимодействие 2 мкм ДНК или ее продуктов с рекомбинантными плазмидами. Из полученных результатов можно предположить, что стабильность таких плазмид определяется не только первичной нуклеотидной последовательностью, но и геномом реципиентного штамма. Это означает, что стабильность самой 2 мкм ДНК не полностью обеспечивается той генетической информацией, которую кодирует она сама. Скрещивание трансформантов разных генетических линий подтвердило эти предположения, что указывает на доминирование признаков, определяющих стабильность плазмиды гемоном штамма AJS13 (мортимеровские генетические линии) над соответствующими признаками штамма А36, происходящего и? Петергофских генетических линий. "Негативный" характер влияния AJ13 на стабильность плазмиды pVM2-2 "снимается" присутствием 2 мкм ДНК. Суммируя полученные данные можно указать, что рекомбинантные плазмиды.

содержащие Scp1 2 мкм ДНК, более универсальны в отношении стабильног поддержания трансформированного приказа в дрожжевых штаммах разл"чног происхождения, чем содержащие плазмиду типа Scp4.

Рекомбинашные плазмиды, сконструированы используя Scp4 2 мкм ДНК штаммах, происходящих из моргимеровских генетических линий, подвержен! негативному влиянию генома, зависимому ог наличия 2 мкм ДНК в клетке. Так ка основные различия между плазмидами Scp1 и Scp4 обнаруживаются в области локус REP3, а ген D поврежден действием рестриктазы Pst1, можно предположить, чт характер отношений рекомбинантных плазмид с геномом определяется этой .область« Поэтому было целесообразно секвенировать эту часть плазмиды Scp4 и сравнит первичную структуру исследуемой 2 мкм ДНК с последовательностью плазмиды Sept

6. Определение нуклеотидной последовательности лохусов "Ori" и REP плазмиды Scp4.

Мы провели секвенсирование фрагмента плазмиды Scp4, ограниченного сайтам узнавания рестриктаз Xba1-Pst1, затрагивающие локусы "Ori" и REP3. Анапу первичной структуры проводили совместно со сотрудниками лаборатории генно иженерии НПО "Фермент". Нуклеотидную последовательность определили методо; Сэнджера. Структуру проверяли по обеим цепям ДНК. обобщая результаты не меньии трех независимых опытов. Общая длина секвенировант* фрагмента-1128 n.i Физическая карта, составлена по результатам данного анализа для исследуемог участка плазмиды, подтвердила результаты рестрикционного картирозания. Дл сравнительного анализа первичных структур участков плазмиды Scp1 и Scp4. v нуклеогидные последовательности были записаны от сайтов расщепления рестриктг Pst1 до сайта Xba1 (рис 6)

Нуклеотидная последовательность плазмиды Scp1 записана по данным Jame Hartley, et.al, 1980. Участки плазмиды Scp4 от 1 до 70 по. и от 941 до кони полностью гомологичны с аналогичными участками плазмиды Scp1. От 312 до 455 п плазмиды Scp4 и от 310 до 630 по. плазмиды Scp1 гомологичности нь обнаружено, h считая коротких участков длиной 4-7 п.о. В других местах гомологичность переменна выше 69%. Различие по величине сравниваемых фрагментов зависит от делеции плазмиде Scp4, составляющей 201 по. Места большой дивергенции куклеотидне последовательности захватывают не меньше 500 по, что хорошо коррелирует результатами гетеродуплексного анализа На обеих плазмидах в одном и том же мест находится участок, кодирующий ген 0. В других участках больших открытых рамс считывая не было обнаружено. 5.5 тандемных повторов, длиной 6.2-6.3 по. гомологией от 78 до 90%. описанных на плазмиде Scp1 (James. Hartley et al. 1880), г плазмиде Scp4 не обнаружено. Каноническая нуклеотидная плоследозатёльность аг консенсум ТАААСАТАА практически в том же месте и на плазмиде Scp4. Локусы "Oí плазмид Scp1, Scp4 гомологичные в районе инвентирозанных повторов и на 88' гомологичные вне инвентированных повторах. 100%-ая гемолегичноегь так* обнаружена и за пределами локуса "Ori", внутри инзентированных повторов. На осное этих данных можно предположить, что районы инвентированных повторов обек плазмид очень консервативные. Известно (Xiao, Lawrence et al, 1990), что наиболыш дивергенция (до 30%) для плазмид Sep охватывает 125 п.о. в районе REP ограниченном сайтами расщепления рестриктаз Hpa1-Ava1, которые на плазмид; Scp£ Scp3, Scp4 отсутствуют. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательное плазмиды Scp4 не показал никакой достоверной гомологичности с нуклеотидне последовательностью плазмиды Scp4 этого района или районоз, прилегающих к new Таким образом было установлено, что гпазмида Scp4 по первичней нуклеотиднг последовательности наиболее отличается от всех известных плазмид типа Sc Полученные различия дают основание предположить, что в эволбционном отношем плазмиде Scp4 свойственен другой тип развития.

Графическое изображение прямых повторов длиной 10 п.о с гомологией 80 показало, что плазмиды Scp1 район сосредоточения их более организован

scp4 scp1

i ctgcagcttctcaatgatattcgaatacgctttgaggagatacagcctaatatccgacaa

1 ctgcagcttctcaatgatrtn^

61 actgttttacagatttacrtartcgtactggttacccatcattga tttcaacatccaaa

61 actgttttácágátítacuá í'cgtácítgttácccátcá^

119 tttgttccgttt тлсс-'aaacctgatattatatttgaatctgtat аатаа cata tagtct

120 cct¿ ggagttttccctüÁÁacagatÁgtÁtÁtttgaÁcctgtÁtaÁt^

179 AAGCACTTTACGC/iAAAC.->7,ATCCATATGTCGAGTGTCC gaagaagctattccatctaa 179 agcgctttacggaacac aatgiÁtgtatttcggttcctggÁgÁÁactÁÍtgcÁtctÁt

238 ggtgtagc1atgctttagacgtctcatcccggïaagagtaatcgcacttcgatcttacac

237 1gcatággtáat>' itrjcacgtogcatccccggttcattttcrrgcgtctccatcctgcac

298 atcaatagcgtcïc gtg caaaaagaca

2s6 ttcaatagcatatctttg'n%4acgaagcatctgtgcttcattttgtagmcaaa

325 тс tgc..ctcaccttt tg cg ctg cacaaat

• 53 acgcgagagcgctaattfrtcaaacaaagaatctgagctgcattrttacagmca

154 acaaagc алсс cc gctgca tttgt aaaa

не ' ücaÁcgcgaÁÁgcgctattttaccaacgaagaatctgtgcttcÁtttttgtaa^

182 aagca tctgc acc ctgcgc тттттсс ca

76 ata¿aacgcaagagcgctaatfrftcaáacaaagaatctgagcrrgcat^n,acagaacá

10 taaatatagtgtgagag agca cttttt

за gaaatgcaacgcgagagcgctattttaccaacaXagaatgtatacttcttttttgttcta 37 tgca gaaagcacta gaaga cttag tcactttttat

se CAAAAATGcÁTCCCGAGÁcCGCTÁTTTTrCTÁÁcÁAAGCATCT^

ï2 ctttatggcgtctacaaatgca ti'tttgagtccaggaaagtaccata gtccgtttat

5f cctttgtccgctcta tkatgckgtctc^gatmctttttgckctgtkgqtccg^aag

2s gttgg gaa g с aïtttaatgtctattttacctttttaaaaaaaggccaga t cgct

15 gttagaagáaggctacnttggtgtctáítttctcítccatáá.^^agcct

!3 tctcgtgttt gigatcacaagcgaagctaccgaatgcattctctcaaggtaaacgcatc

's tcccgcgtttactgati'actagcgaagct gcíggtgcattttttcaágatáaágccátc

642 CTGGATT TAGCTTAAGTCGATGCAGATTGTGCGTACTTTATAAACAGAAAGTGGAAGCA

в34 CCCGATTATATTCTATACCGATGTGOATTGCGCATACT^

701 TTGCAAAATCTTGATTAGTCGGATTACTATGA TOATTCTTCTATTTATTC ATATATG

894 TTGATQATTOTCATTGcicAGAAAATTATGAACGGmOTCTATm

758 TGATATAT GGTAATGTTTACATTTTCTGTATTGTnTGGATATATAGTCTCAATAATXC

954 CTACGTATATCAAATGTTTACATTTTC СТАГГОтТСОАГГСАСТСТАТС^ТАСГГС

817 TCATT ATTTTTTT TATAAAGTAGACTTTTGGAGATAAACAT AAAATGTAGAAGT

1013 TTACTACAAirTmTGXCTAAAaAaTAATACTAGAGATAAA

871 CGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTCAATGAGTAGGTTATATAGG3ATATAG

107.3 CGAGfH'ACATCCAAGrrCAAO^ACCGAAAGGTGG

931 AAGATATAGAATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCA

11ЭЭ ■ CACAGAGA TATATAGCÄAÄGÄGATACTTTTGAGCAATG^

991 ATATTTTAGTAGCTCüTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAA .TGCGTCTTCAG

1192 ATArHTAGTAGCTCGTTACAGTCC^

1051 AGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTT

1252 AGCGOTTCGGTmCAA^

111J CGQAATAGGAACTTCAAA

Рис. 6. Нуклеотидная последовательность секвенированного участка плазмиды Scp4 по сравнению с участком плазмиды Sep! ограниченного сайтами расщепления рестриктаз Pstl-ХЬа1.

г If. -

охватывает гораздо более длинный участок нуклеотидной последовательности, чем плазмиды Scp4. Упомянутые участки входят в районы REP3 обеих плазмид. Для района REP3 плазмиды Scpl обнаружено четыре инвентированные повторы длиной 19-20 ,п.о. с гомологией 95-100%. На аналогичном участке плазмиды Scp4 установлено 8 инвентированных повторов длиной не меньше 10 п о. 100% гомологии. Графическое изображение при .помощи компьютера также дает основание предположить, что район REP3 плазмиды оср4 имеет другую организацию. Это может определить различную функциональную активность данного района обеих,плазмид а также различную специфичность его в штаммах дрожжей независимого происхождения. Обнаруженные нами различия в структуре плазмид Scpl, Scp4 (районы REP3), могуг быть связаны с ранее нами показанной большой универсальностью плазмиды Sep! по сравнению с плазмидой Scp4, при использовании ее для повышения стабильности трансформированного признака в штаммах дрожжей S.cerevisiae различного происхождения.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ, проведенный методом рестрикиионного картирования клонированной полной 2 мкм дрожжей штаммов 15В-П4 (Scp4) и A364Ä (Scpl) различного происхождения выявил, как появления, так и исчезновения сайтов узназания для определенных рестриктаз.

2. В результате гетеродуплексного анализа показано, что участки REP3 плазмид штаммов 15В-П4 (Scp4) и А364А (Scpl) различаются не только по длине, но и по структуре первичнои нуклеотидной последовательности.

3. Секвенирование '/частка величиной в 1128 п.о. плазмиды Scp4, ¡ахватывающего районы "Ori", REP3 и частично D, выявило, что наибольшая дивергенция первичной структуры, по сравнению с плазмидой Sep! обнаружена в эайоне REP3, а частичная- вне инвентированных повторах района "Ori" и в тоследовательности гена D. Обнаруженные изменения плазмиды Scp4 не затрагивают точки иницизции репликации. Анализируемый участок плазмиды Scp4 различается от тлазмиды Scpl делецией, состоящей из 201 п.о."

4. Наиболее консервативные нуклеотидные последовательности изучаемых тлазмид затрагивают инвестированные повторы и малую "Р" петлю.

5. Установленные различия в стабильности рекомбинантных плазмид :одержащих полноразмерные 2 мкм ДНК, в зависимости от структурных особенностей 1 мкм ДНК и происхождения реципиентных штаммов.и сравнительно-компьютерный шализ плазмиды Scp4 с плазмидой Scpl дают основание предположить, что пруктурные различия.связаны с функциональной активностью плазмид. В штаммах шличного происхождения большей универсальностью в функциональном отношении ¡ыделяется плазмида Scpl по сравнению с Scp4. При конструировании векторов (елесообразно использозать 2 мкм ДНК того же происхождения, как и реципиентные итаммы.

6. Полученные данные позволяют считать, что исследованная нами плазмида, ¡роисходящая из Петергофских генетических линий, является новой плазмидой типа ¡ср, Scp4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

!МельвидасВ, НактинисВ, Маркявичюс А, ЯнулайтисА. Рестрикционный нализ 2 мкм ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Тезисы докладов онференции "Генетика и селекция народному хозяйству Литовской ССР", Вильнюс, 981.C.12.

2. Мельвидас В, Маркявичюс А, Читавичюс Д, Нактинис В, Янулайтис А. равнитальный рестрикционный и электронно-микроскопический анализ 2 мкм ДНК

дрожжей Saccharomyces cerevisiae.. - Тезиш докладов конференции Рекомбинантные ДНК", Гуижно, 1982, с.57. х

3. VJ. Melvydas, Ai Markeviâ'us, APJanuSka, КБ. Sasnauskas. D.B. Citavitius, AA. Januiaitis. Study of REP3 region of .new 2 DNA variant from Saccaharomyces cerevisiae. - Yeast V. 2 (special issue) Canada 1986, p245.

4. V. Melvydas, A. JanuSka. The comparative analysis on the primary structures of the yeast piasmids Saccharomyces cerevisiae SepI and Scp4. - Experimental biology, No1 Vilnius "Academia", 1991, p.72-73.