Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида

Белоусова, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида"

На правах рукописи

Белоусова Наталья Викторовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ НАЦЕЛЕННЫХ АДЕНОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ПОСРЕДСТВОМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ВИРУСНОГО КАПСИДА

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2003

Работа выполнена в University of Alabama at Birmingham, USA.

Научный руководитель: Ph.D. B.H. Красных

Официальные оппоненты: д б.н., профессор В.В. Месянжинов

д.б.н., профессор С.Н. Щелкунов

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН (Москва).

Защита состоится « » бв^С* 1%^)А ^ 2003 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан » a^u^f^ 2ооз

года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э Г.

I ч

'75

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проведённые в течение более чем десятилетнего периода генно-терапевтические исследования привели к разработке ряда протоколов, направленных на лечение наследственных и приобретённых заболеваний. Наиболее эффективные из них находятся сейчас в стадии клинических испытаний. Наряду с достигнутыми впечатляющими результатами, эти исследования выявили ряд фундаментальных проблем, препятствующих полной реализации этой медико-биологической концепции. Центральной из них является проблема эффективной и селективной экспрессии терапевтического гена в пораженной болезнью ткани. Решение этой проблемы требует разработки новых систем безопасной и эффективной доставки генов, так называемых "векторов".

Хотя критический анализ существующих на сегодняшний день вирусных и невирусных векторных систем свидетельствует о том, что ни одна из них не является идеальной, общепризнано, что аденовирусы (Ад) человека являются наилучшими кандидатами в векторы для генной терапии. Ад векторы имеют следующие преимущества перед другими векторными системами. (1) они способны эффективно трансдуцировать широкий спектр разных типов клеток, как делящихся, так и покоящихся; (2) значительный объём генетического материала (до 36 т.п н.) может быть встроен в Ад вектор; (3) Ад человека не являются онкогенными; (4) Ад сохраняют высокую инфекционность т vivo; (5) современная технология позволяет получать векторные препараты в масштабах, пригодных для клинического применения - свыше 1014 вирионов с титрами до 10!3 частиц на мл

В совокупности эти преимущества привели к широкому использованию Ад векторов для доставки терапевтических генов, а также к разработке так называемых онколитических вирусов, способных разрушать злокачественные опухоли за счёт селективной репликации в раковых клетках.

Однако, несмотря на существенный прогресс, достигнутый в разработке Ад векторов для генной терапии, на сегодняшний день сохраняется необходимость преодоления двух основных недостатков этой системы генной доставки' (I) неспособность Ад векторов эффективно инфицировать определённые типы клеток-мишеней и (2) отсутствие тканевой селективности, которая приводит к

неконтролируемой трансдукции как клеток-мишеней, так и клеток здоровых тканей и значительно снижает эффективность терапии в целом.

Поскольку эти проблемы являются прямым следствием природного тропизма Ад, наша стратегия создания ткане-специфичных, или "нацеленных" Ад векторов, основана на модификации природного механизма взаимодействия вируса с клеткой, с тем, чтобы обеспечить эффективную и специфичную доставку терапевтического гена в клетки-мишени (трансдукционный таргетинг). Два подхода для лолучения нацеленных Ад, основанные на генетическом включении Э состав векторного вириона молекул лигандов, были разработаны в представленной работе.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка новых стратегий получения нацеленных Ад векторов для генной терапии В качестве методологической основы этих стратегий были использованы (а) модификация глобулярного домена (ГД) шипа Ад5 и (б) замещение шипа химерными молекулами.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: .1. Получить серию Ад векторов, содержащих в Ш-петле ГД шипа увеличивающиеся по размеру встройки фрагментов гипервариабельной петли основания пентона (ОП) Ад5.

2. Выявить зависимость продуктивности вирусной инфекции, инфекционности вирусов и их рецепторной специфичности от размера встроек в Ш-петле.

3. Создать серию шаттл-плазмид, позволяющих быстро и эффективно встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли всех полученных конструкций

4. Используя вновь сконструированные шаттл-плазмиды, получить Ад векторы, содержащие в составе удлиненной Ш-петли вазоактивный полипептид тонкого кишечника (VIP), и охарактеризовать их продуктивность, инфекционность и взаимодействие с рецепторами.

5. Сконструировать химерную молекулу-прототип шип-фибритин-лиганд, предназначенную для нацеливания Ад вектора посредством замещения шипа в капсвде Ад.

6. Продемонстрировать способность фибритина бактериофага Т4 выполнять тримеризующую и лиганд-представляющую функции в составе химерной молекулы.

7. Продемонстрировать способность химеры встраиваться в Ад вирионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором (ИР).

8. Изучить влияние делении большей части последовательности шина в составе химеры на инфекционность вирусов, несущих химерный шип.

9. Установить, сохраняет ли TNF-подобный домен CD40 лиганда (CD40L) свою функциональную структуру в отсутствие внутренней дисульфидной связи, и совместима ли его структура со структурой химеры шип-фибригин.

10 Сконструировать Ад вектор, капсид которого содержит химеру шип-фибритин-С040Ь вместо шипа дикого типа, а также мозаичную версию этого вектора, включающую помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в сайте связывания с природным Ад рецептором, называемым рецептором вируса коксаки и аденовируса (КАР).

11. Определить эффективность связывания этих вирусов с CD40 и трансдукции ими СГМО-положительных клеток

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые продемонстрирована возможность встраивания полипептидов размером до 111 а о в Ш-петлю ГД шипа. Эти данные позволили пересмотреть коренным образом сложившиеся ранее предсталения о том, что выбор лигандов для нацеливания Ад векторов ограничен короткими пептидными молекулами. На основании полученных нами результатов был сделан вывод о возможности нацеливания Ад за счёт модификации ГД шипа полипептидными лигандами, что значительно расширяет репертуар как лигандов, так и рецепторов-мишеней пригодных для таргетинга Ад.

Сконструирована серия шаттл-плазмид, позволяющая эффективно и быстро клонировать кодирующие лиганд последовательности в Ш-петли ГД шипа, удлиненные разными по величине фрагментами гибкой петли ОП, для оптимального представления нацеливающих лигандов рекомбинантным шипом.

Продемонстрировано, что VIP-содержащий вектор, полученный с использованием этих шаттл-плазмид, обладает повышенной инфекционностью на КАР-негативных клетках, что делает его потенциально полезным для доставки генов в такие клетки.

Разработана принципиально новая стратегия таргетинга, основанная на замещении шипа Ад химерной молекулой и позволяющая решить две главные

задачи, связанные с нацеливанием Ад векторов: разрешение структурной и функциональной несовместимости лиганда и шипа, и обеспечение специфичного связывания с рецептором-мишенью.

Установлено, что созданная химерная молекула эффективно тримеризуется при генетическом слиянии с нацеливающими белковыми лигандами, обладающими сложной третичной конформацией, и сохраняет способность встраиваться в Ад вирионы.

Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что встраивание в капсид Ад векторов, несущих химерный шип, дополнительного полноразмерного шипа Ад5, с мутацией в КАР-связывающем сайте, увеличивает их инфекционность, не изменяя при этом специфичность связывания с рецептором-мишенью.

Сконструированы нацеленные к CD40 Ад векторы, эффективно и специфично трансдуцирукяцие дендритные и опухолевые клетки яичников и мочевого пузыря человека. Эта векторы являются наиболее эффективными из известных в настоящее время средств доставки генов в названные типы клеток-мишеней, а потому могут служить прототипами терапевтических векторов для генетической иммунизации против рака и инфекционных агентов, Альтернативно, сконструированные на их основе условно-репликативные вирусы могут быть использованы для уничтожения метастазирующих злокачественных, CD40-экспрессирующих опухолей посредством их селективной трансдукции.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном Конгрессе "Biotechnology 2000" (Берлин, Германия, 2000), на Международном Симпозиуме "Genetic Anticancer Agents" (Валенсия, Испания,

2001), на Международном Вирусологическом Конгрессе (Париж, Франция, 2002), на Международном Конгрессе "New Trends in Cancer Therapy" (Ровиго, Италия,

2002), на Третьей, Четвертой и Пятой Ежегодной Конференции American Society of Gene Therapy (Денвер, Колорадо, 2000; Сиэттл, Вашингтон, 2001; Бостон, Массачусетс, 2002), на конференции "Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery" (Cold Spring Harbor, 2001), на Ежегодном Медицинском Форуме в University of Alabama at Birmingham, UAB (Бирмингем, Алабама, 2001 и 2002). Результаты обсуждались на семинаре в Gene Therapy Center, UAB (Бирмингем, Алабама, июль 2003).

По материалам работы опубликованы 4 статьи и тезисы 9 конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 184 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 320 ссылок и содержит 6 таблиц и 34 рисунка.

П. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Получение нацеленных аденовирусов с полипептидными лигандами, встроенными в HI-петлю глобулярного домена шипа и их характеризация.

Основываясь на пространственной модели ГД шипа Ад5, мы выдвинули предположение о том, что структура Ш-петли ГД, которая в предыдущих работах была использована только для представления коротких пептидов, может служить основой и для встраивания более протяженных, объемных молекул-лигандов

Попытка оценить потенциальную "ёмкость" Ш-петли шипа была предпринята за счет встраивания в нее увеличивающихся по величине фрагментов гипервариабельной петли ОП Ад5, размером от 13 до 83 а,о., в центре которых располагался аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (КСО)-трипептид. Вирусы, несущие модифицированные шипы с удлинёнными Ш-петлями, Ad5Luc.NNRGD (NN соответствует размеру встройки, Luc - люциферазный ген-репортёр), были спасены в результате трансфекции клеток 293 рекомбинантными Ад геномами, полученными с помощью гомологичной рекомбинации в E.coli

Правильность структуры очищенных вирусов была подтверждена анализом продуктов ПЦР с праймерами, фланкирующими Ш-петлю шипа, частичным сиквенсом и Вестерн блотингом с антителом 4D2, узнающим хвостовой домен (ХД) шипа и антителом DAV-1, узнающим RGD-содержащий эпитоп в ОП.

Сравнение продуктивности инфекции полученных вирусов на клетках 293 обнаружило, что встраивание фрагментов ОП размером 13-53 а о. не влияет на амплификацию вирусов, в то время как дальнейшее увеличение длины встройки приводит к снижению продукции вирусов в 2-3 раза по сравнению с контрольным AdSLucl (Табл. 1).

Относительная инфекционность вирусов AdSLuc.NNRGD на клетках 293 варьировала от 15% (Ad5Luc.73RGD) до 130% (Ad5Luc I3RGD) от инфекционости, определённой для немодифицированного Ад, при этом

наблюдалась обратная корреляция между размером встройки в Ш-петле и способностью вектора инфицировать клетки 293 (Табл. 1).

Таблица 1. Продуктивность инфекции и относительные инфекционности Ad5Luc.NNR.GD вирусов на клетках 293.

Вирус Выход частиц на кяетку " Относительные инфекционности 6

А<Шлю1 2,0 х 104 ± 2,4 х 103 100

Аст,ис.131УЭО 2,0 х 10" ± 3,6 х 103 130

Ас15ис 231ЮО 2,3 х 104± 1,5 х 103 94

А(1эЬис.331«;В 2,0 х 10" ± 4,9 х 102 96

Ad5Luc.43R.GD 1,8 х 104 ± 5,3 х 102 84

Ad5Luc.53K.GD 2,2 х 104± 7,3 х 102 30

Ad5Luc.63R.GD 1,2 х 104 ± 6,3 х 102 25

Ad5Luc.73RGD 6,3 х 103± 1,1 х 103 15

Ad5Luc.83RGD 1,1 х 104±9,5 х 102 23

" Представленные значения являются средними двух независимых экспериментов ± стандартные отклонения

6 Представленные значения соответствуют отношению удельной инфекционное™ векторов серии А<15Ьис.Г'П*ЖЖ к таковой Ас15[.ис1, выраженной в процентах

Полученные данные свидетельствовали о том, что удлинение Ш-петли в вирусах Ас15Ьис.ММКОО не оказывает значительного влияния ни на структуру шипа, ни на его функции. Эти данные хорошо коррелировали с тем фактом, что никаких значительных отличий в динамике развития цитопатического эффекта (ЦПЭ) среди этих вирусов замечено не было.

Способность вирусов Ad5Luc.NNR.GD связываться с КАР была тестирована в эксперименте по транедукции клеток 293 с использованием в качестве ингибитора ГД шипа Ад5. При блокировании транедукции, опосредованной Ad5Lucl или Ad5Luc.13R.GD, уровень экспрессии гена-репортера снижался на два порядка, в то время как при транедукции остальными векторами серии Ad5Luc.NNRGD экспрессия люциферазы снижалась лишь в 10 раз (Рис 1). Таким образом, несмотря на значительное увеличение размера ГД (до 46%), взаимодействие с КАР сохранялось и являлось предпочтительным механизмом, обеспечивающим заражение клеток векторами Ad5Luc.NNR.GD. Однако, при размере ИбО-содержащей встройки в Ш-петле равной или превышающей 23 а о , вклад 1ШО-опосредованного связывания с интегринами в суммарную инфекционность также становился значимым.

Способность Ad5Luc NNRGD вирусов связываться с клеточными интегринами бьша подтверждена также в эксперименте по трансдукции КАР-негативных клеток глиобластомы человека U118MG, экспрессирующих значительное количество otv интегринов (Miller et al., 1998) Присутствие RGD пептида в шипах вирусов Ad5Luc.NNRGD приводило к 2-8-кратному повышению уровня трансдукции U118MG клеток (Рис. 1). Более того, уровень экспрессии трансгена всеми векторами, кроме Ad5Luc.l3RGD, был выше, чем для контрольного вектора Ad5Luc FhiRGD, эффективно связывающегося с ау интегринами (Dmitriev et al., 1998).

10s

s &

|io7

* Л

s 10

b <

105

Рис. 1. Трансдукция клеток 293 и U118MG вирусами Ad5Luc NNRGD. Клетки инфицировали вирусами Ad5Luc.NNRGD либо с предшествующей инкубацией с 100 мкг/мл ГД шипа Ад5, либо без блокирования Колонки на рисунке соответствуют значениям активности люциферазы, измеренной в лизатах инфицированных клеток через 20 часов после инфекции. Каждое значение соответствует среднему трех измерений. Числа внизу рисунков указывают на размер встроек в шипе; дт - AdSLucl вектор с шипом дикого типа; к -положительный контроль - вектор Ad5Luc.FhiRGD, несущий шипы со встройкой пептида RGD-4C в Ш-петле

Получение шаттл-плазмид, позволяющих встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Н1-петли.

Полученные данные о продуктивности, инфекционности и связывающей способности вирусов Ad5Luc.NNRGD послужили основанием последующих попыток использования их в качестве прототипов Ад векторов, чей тропизм был модифицирован посредством полипептидного лиганда. Мы предположили, что

Клетки 293

10°

10*-

KnenuiU118MG

дг 13 23 33 43 53 63 73 83 Ш 100 мкг/мл ГД шипа Ад5

дг к 13 23 33 43 53 63 73 83 без блокирования

фрагменты петли ОП, присутствующие в модифицированных ГД, вследствие своей гибкой структуры могут функционировать как линкеры, позволяющие расположенному между ними лиганду принять его функциональную конформацию, а также минимизировать возможные структурные конфликты между лигандом и ГД шипа. Ожидалось, что подобно RGD-трипептиду, другие нацеливающие пептиды или полипептиды в контексте удлинённых Ш-петель будут сохранять свою конфигурацию и рецептор-связывающие свойства.

Мы сконструировали серию шаттл-плазмид pHT.PBNN, в которых кодоны, соответствующие RGD-пептиду, в генах модифицированных шипов были замещены олигонуклеотидным дуплексом, содержащим сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции Bael. После гидролиза всех векторов pHl.PBNN Bael из них вырезался сайт узнавания этой рестриктазы и при этом оставались идентичные уникальные некомплементарные липкие концы. Таким образом, разработаная система позволяла быстро и эффективно клонировать кодирующие лиганд последовательности в удлинённые петли всех восьми конструкций, позволяя тем самым быстро подобрать оптимальные для представления конкретного лиганда линкеры.

Получение и характеризация вирусов со встройкой вазоактивяого полипеитида тонкого кишечника в модифицированные шипы.

Шаттл-плазмиды pHT.PBNN были использованы для получения Ад векторов, у которых в удлиненные Ш-петли был встроен вазоакгавный полипептид тонкого кишечника (VIP). VIP был выбран в качестве нацеливающего лиганда из-за его относительно небольшого размера (31 а.о.) и простой структуры, а также поскольку он связывается с рецепторами VPAC1 и VPAC2, которые экспрессируются на повышенном уровне различными опухолевыми клетками (Reubi et al., 2000).

Олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий VIP-пептид, был проклонирован в конструкции с двумя самыми короткими и двумя самыми длинными модифицированными Ш-петлями: рШ.РВЮ, рШ.РВ20 и рШ.РВ70, рШ.РВ80. Дальнейшее получение вирусных геномов, спасение и размножение вирусов Ad5Luc.NNVIP проводили по стандартной методике. Присутствие VIP-кодирующих последовательностей в геномах очищенных вирионов, было подтверждено с помощью ПЦР, а присутствие VIP в шипах вирусов было

подтверждено с помощью Вестерн блота. Инфекционность вирусов Ad5Luc NNVTP, определенная на клетках 293, была всего в 3 - 5,5 раз ниже, чем Ad5Lucl, несмотря на значительные модификации Ш-петли (к примеру, в векторе Ad5Luc.80VIP длина встройки была 111 а.о.). Так же как и в случае векторов Ad5Luc.NNRGD, инфекционность VIP-модифицированных Ад была обратно пропорциональна размеру встройки.

Встраивание VIP в капсид Ad5Luc.NNVIP привело к 10-100 кратному усилению трансдукции КАР-негативных CHO/VPAC1 и CHO/VPAC2 клеток, стабильно экспрессирующих рецепторы для VIP - VPAC1 и VPAC2, соответственно. Однако, вопреки ожиданиям, такое же усиление экспрессии трансгена наблюдалось при трансдукции этими вирусами VPAC-негативных родительских СНО клеток (Рис. 2).

| без блокирования Щ ] 00 мкг/мл ГД шипа Ад5

Рис 2. Трансдукция клеток СНО, CHO/VPAC1 и CHO/VPAC2 VIP-содержащими вирусами

Клетки инфицировали вирусами Ad5Luc.NNVIP, либо проинкубировав их предварительно с 100 мкг/мл ГД шипа Ад5, либо без блокирования. Активность люциферазы измеряли в лизатах клеток через 20 часов после трансдукции. Каждое значение активности соответствует среднему трёх измерений. Числа под i рафиками указывают на размер последовательности ОП, фланкирующей VIP, дт - контрольный вектор AdSLucl с шипом дикого типа.

Использование синтетического VIP в качестве специфичного ингибитора привело к эффективному, дозо-зависимому блокированию трансдукции всех клеток вирусом Ad5Luc.l0VIP (Рис. 3), что свидетельствовало о том, что усиление экспрессии трансгена было обусловлено именно включением VIP в капсид Ад, хотя и не было связано с присутствием рецепторов VP АС.

Концентрация VIP, мкг/мл ■ Ad5Lucl Э Ad5Luc.lOVIP

Рис. 3. Ингибирование синтетическим VIP трансдукции клеток СНО и CHO/VPAC1 вирусом Ad5Luc.lOVIP.

Клетки преинкубировали либо со средой, содержащей VTP-пептид в концентрации от 0,01 до 10 мкг/мл, либо со средой без ингибитора, после чего клетаи инфицировали Ad5Luc 10VIP. Активность люциферазы измеряли в лизатах клеток через 20 часов после трансдукции. Каждое представленное значение активности соответствует среднему трёх измерений.

Сравнение связывания меченых 3Н-тимидином вирусов Ad5Luc.l0VIP и Ad5Lucl с клетками CHO/VPAC1 выявило, что Ad5Luc.l0VIP прикрепляется к клеточной мембране в ] 0 раз более эффективно, чем Ad5Lucl (Рис. 4).

60 т-

S ^ |

- 30- ■

I 20- ■

? Ю- ■

0 Jj-■-

дт VIP

Рис 4. Связывание вирусов Ad5Lucl и Ad5Luc.l0VIP с клетками CHO/VPAC1. Меченые Н3-тимидином вирусы инкубировали с клетками CHO/VPAC1 в условиях предотвращающих интернализацию вируса. Число связавшихся с клетками Ад частиц вычисляли, исходя из определенной для них специфичной радиоактивности и общей радиоактивности образца Каждое значение на графике соответствует среднему трех измерений. VIP обозначает вектор Ad5Luc. 10VIP, дт - контрольный вектор Ad5Lucl.

Следовательно, несмотря на то что VDP в составе Ad5Luc.NNVIP не связывался с VPAC1 и VPAC2 рецепторами, он довольно эффективно взаимодействовал с другим неизвестным рецептором или рецепторами. Поскольку VTP является положительно заряженным полипептидом с изоэлектрической точкой выше 11, такое связывание могло быть обусловлено электростатическим взаимодействием между положительно-заряженным вирусом и отрицательно-заряженными молекулами на поверхности клеток. Конструирование и характеризацня химерного белка шип-фибритин-6Ш$-таг (FF/6H).

Для реализации идеи замещении Ад шипа молекулой, в которой функции тримеризации и связывания с рецептором были бы распределены между двумя структурно независимыми доменами, мы сконструировали химерную молекулу FF/6H, включающую в себя (1) ХД и два полных повтора ЦД шипа Ад5 (F), чтобы обеспечивать встраивание химерного шипа в Ад капсид, (2) фрагмент фибритина бактериофага Т4 (F), чтобы обеспечивать тримеризацию химерного шипа, и (3) öHis-таг (6Н), чтобы обеспечить связывание с искусственным рецептором (ИР), экспрессирующимся на поверхности клеток 293/6Н (Douglas et al, 1999) (Рис. 5).

N-концевой домен

а-сшгоальный домен Фолдон

Шип Ад

Фибритин бактериофага Т4

öHis-таг

FF/6H химера

Рис. 5. Схема, изображающая основные компоненты химерного шипа 1Т/6Н и их происхождение. ХД, ЦД и ГД - хвостовой, центральный и глобулярный домены шипа Ад

Фибритин был выбран в качестве тримеризующего компонента химеры, поскольку было известно, что его тримерная структура является очень стабильной (Тао е< а/., 1997; Ье1агоу е1 а1., 1999), а также, поскольку для него не было отмечено рецептор-связывающих функций.

Химерный шип РР/бН был экспрессирован в бактериальных клетках и очищен хроматографией на №-МТА-сефарозе. Электрофорез очищенного белка в ДСН-ПААГ выявил, что он, также как и шип Ад5 дикого типа, формирует стабильные тримеры, которые при кипячении распадаются на мономеры с ожидаемым молекулярным весом - 37 кДа (Рис. 6). Тот факт, что шип эффективно связывался с М-КГА-сефарозой, свидетельствовал о том, что 6Н15-таг был доступен для связывания в контексте тримерной молекулы. Таким образом, фибритин в составе ОТ/6Н шипа не только поддерживал тримерную конформацию химеры, но и выступал в качестве основы для эффективного представления лиганда, то есть удовлетворял двум основным критериям, предъявляемым к замещающей шип молекуле.

кДа

200 —

тримеры

мономеры

Рис. 6. Анализ рекомбинантного шипа FF/6H, экспрессированного в Ecoli. Химерный шип FF/6H очищали металохелатной хроматографией и анализировали в ДСН-ПААГ. В качестве контроля использовали шип Ад5 дикого типа (F5). Дорожка 1 - FF/6H, кипячёный; дорожка 2 - FF/6H, некипячёный; дорожка 3 - F5, кипячёный; дорожка 4 - F5, некипячёный.

Получение и характеризация аденовируса с химерным шипом FF/6H.

Рекомбинантный вирусный геном, содержащий ген химерного шиш FF/6H, был получен с помощью гомологичной рекомбинации в клетках Ecoli. Вирус Ad5LucFF/6H был спасён после трансфекции клеток 211В, конститутивно экспрессирующим шип дикого типа (Von Seggern et cd., 1998). Чтобы получить гомогенную популяцию Ад, несущих только химерный шип FF/6H, клетки 293 инфицировали вирусным стоком, наработанным на клетках 211В.

Рестрикционный анализ генома Ad5LucFF/6H, диагностическая ПЦР с праймерами, фланкирующими ген шипа, и частичный сиквенс ДНК, выделенной из очищенных вирионов, подтвердили, что вирусный геном был стабилен и в нем присутствовал только ген, кодирующий химерный шип Вестерн блот анализ очищенного препарата Ad5LucFF/6H с использованием антител, специфичных к каждому го трёх компонентов химеры - ХД шипа, фибритину или 6His-Tary -показал, что в вирионах Ad5LucFF/6H, наработанных на клетках 293 присутствует только химера FF/6H с молекулярным весом 37 кДа. Таким образом, ХД шипа, слитый с гетеролошчным тримеризующим белком сохранил свою способность взаимодействовать с ОП и обеспечивал встраивание химерного шипа в вирионы

Связывание Ad5LucFF/6H с ИР было установлено в эксперименте по транедукции клеток 293/6Н, экспрессирующих этот рецептор. Внеклеточный домен ИР представляет из себя одноцепочечное антитело, узнающее аминокислотную последовательность из 5-ти гистидинов (Lindner et al., 1997) Дня ингибирования Ад транедукции были использованы два белка, соответствующие укороченным с N-конца формам фибритина Один из этих белков содержал на С-конце 6His-Tar (фибритан-бН), в то время как другой (фибритин) - не имел этот таг. Как и ожидалось, только фибритин-бН дозо-зависимым образом ингибировал транедукцию клеток Ad5LucFF/6H (Рис. 7)

^ 120

Щ Фибритин Фибритн-бНц

Рис. 7. Ингибирование транедукции клеток 293/6Н рекомбинантными фибритинами.

Клетки 293/6Н перед инфекцией Ad5LucFF/6H преинкубировали либо с фибритином, содержащим на С-конце бКБ-таг, либо с таким же белком без тага Активность люциферазы, измеренная в лизатах инфицированных клеток при блокировании, представлена на рисунке как процент от активности люциферазы, измеренной в лизатах инфицированных клеток без блокирования.

Данные, подтверждающие, что А[151,исРР/6Н не связывается с КАР, были получены с использованием метода ИФА, а также в эксперименте по трансдукции этим вирусом клеток 293/6Н и 293. Ас^ЬисБР/бН не взаимодействовал с внеклеточной частью КАР (рКАР), сорбированной на пластике (Рис 8А) и трансдукция этим вирусом не блокировалась при добавлении ГД шипа Ад5 (Рис. 8Б), в то время как вирус с шипом дикого типа Ас151д1с1 эффективно, дозо-зависимым образом связывался с рКАР и его трансдукция блокировалась ГД более чем на 90%. Клетки 293, не экспрессирующие ИР, трансдуцировались Аё5ЬисРТУ6Н более чем на три порядка хуже, чем клетки 293/бН. Таким образом, замещение в капсиде Ад5 шипа дикого тапа химерой 1Т/6Н обеспечило КАР-независимое проникновение вируса в клетки за счёт прикрепления к ИР.

0,01 0,03 0,1 1,0 Вирус, мкг

■ Ас15Ьис1

0 1 10

ГД Ад5, мкг/мл

Аа51л1сП76Н

Рис. 8. Связьшание А<151л1с1 и Аё5ЬисШ6Н с КАР.

А. ИФА. Ас15Ьис1 и Ad5LucFF/6H инкубировали с сорбированым на пластике рКАР. Связавшийся вирус детектировали с помощью поликлональных антител, специфичных к капсидным белкам вириона.

Б Трансдукция клеток 293/бН. Вирусы добавляли к клеткам, преинкубированным либо со средой, либо со средой, содержащей ГД шипа Ад5. Активность люциферазы измеряли в лизатах инфицированных клеток через 20 часов. Колонки на графике соответствуют отношению люциферазной активности в клетках при блокировании ГД шипа к активности без блокирования, выраженному в процентах. Каждое значение соответствует среднему трех измерений.

Инфекционность вируса Ad5LucFF/6H, определённая на клетках 293/6Н с помощью метода спот-анализа, была в 51 раз меньше, чем инфекционность Ad5Lucl. Подобные данные были получены и в эксперименте по сравнению трансдукции этих клеток. При одинаковых дозах заражения, вирус Ad5LucИ7бH

доставлял репортёрный ген в клетки 293/6Н в 10-80 раз менее эффективно, чем Ad5Lucl. Основываясь на данных о константах диссоциации, определённых для взаимодействия между шипом Ад5 и КАР - 4x10"9 М (Davison el al., 1999), и для 5ffis-Tara и узнающего его моноклонального антитела - 4,8x10"7 М (Lindner et al., 1997), пониженную инфекционность Ad5LucFF/6H можно было объяснить, по крайней мере частично, низкой аффинностью связывания вируса с ИР

Продуктивность инфекции, определённая для Ad5LucFF/6H оказалась сравнимой с продуктивностью контрольного Ad5Lucl - 4,6 х 103 и 6,1 х 103 частиц на клетку, соответственно. Следовательно, делеция большей части шипа дикого типа в вирионах Ad5LucFF/6H не повлияла на амплификацию вируса.

Авторадиография белков вирусов Ad5LucFF/6H и Ad5Lucl, меченых радиоактивным 3!8-метионином обнаружила, что вирус с химерным шипом, также как и вирус с диким шипом, содержит в основном зрелые формы белков VI, VII и VIII. Таким образом, процессии- белков, включённых в вирионы Ad5LucFF/6H, протекал нормальным образом.

Выбор CD40L в качестве нацеливающего вирус лиганда.

Поскольку описанная выше химера FF/6H удовлетворяла требованиям замещающей шип молекулы, мы решили использовать её FF основу для нацеливания Ад на естественный клеточный рецептор CD40. CD40 был выбран в качестве мишени для терапевтического Ад вектора на основании данных о его повышенной экспрессии дендритными и опухолевыми клетками. В качестве нацеливающего лиганда мы выбрали CD40L человека, в частности его С-концевой TNF-подобный домен, являющийся природным лигандом для CD40.

Поскольку в TNF-подобном домене CD40L присутствует дисульфидная связь (Karpusas et al., 1995), формирование которой несовместимо с путем биосинтеза Ад белков, прежде всего нужно было узнать, необходима ли эта связь для правильной упаковки и связывания CD40L с рецептором. Для ответа на этот вопрос, TNF-подобный домен CD40L (sCD40L) и две его производные -sCD40L/VA и SCD40L/AV - с мутациями цистеиновых остатков в позициях 83 и 123, формирующих дисульфидную связь, были экспрессированы в Я coli, очищены и анализированы с помощью метода проточной цитофлюориметрии Все три формы sCD40L связывались с CD40, присутствующим на поверхности клеток 293.CD40, причём интенсивность связанной с клетками флюоресценции

для всех белков была одинакова и сравнима с флюоресценцией клеток, инкубированных с моноклональными анти-С040 антителами в28.5 (Рис 9) Следовательно, ТЫР-подобный домен С040Ь был способен эффективно взаимодействовать с СП40 даже в отсутствии внутренней дисульфидной связи.

Счет

SCD40L

SCD40L/AV

sCWOIWA

Антитела G28.5

10° 101 102 1 03 1(Ло° 101 102 1 03 1<Л0° 101 102 103 1 0410° 10" 102 1 03 10" ИТС Р1ТС 1-1ТС Р1ТС

Рис. 9. Определение связывания вариантов бСВ40Ь с клетками 293-С040 методом проточной цитофлюориметрии.

Клетки 293 или 293.СВ40 инкубировали с одним из трех рекомбинантных белков, содержащих Т№-подобный домен СО40Ь человека или с антителами С28.5, узнающими С040 (белые профили). Связавшиеся с клетками белки выявляли с помощью вторичных ИТС-конъюгированных антител. Контрольные образцы инкубировали только со вторичными антителами (черные профили). Клетки сортировали на клеточном сортере РАСвсап

Чтобы определить, совместим ли TNF-подобный домен CD40L с FF химерой, мы сконструировали ген, кодирующий белок шип-фибритин-С040Ь (FF/CD40L) и продуцировали его в E.coli. Анализ электрофоретической подвижности химерного белка показал, что он, также как и шип дикого типа, формирует стабильные фимары, которые при кипячении диссоциируют на мономеры с ожидаемым молекулярным весом 54 кДа.

При анализе методом Вестерн блоттинга продуктов транзиентной экспрессии FF/CD40L в клетках млекопитающих 293/Г17, мы также обнаружили, что химерный белок не подвергается деградации и сохраняет свою тримерную конформацию Функциональный анализ транзиентно-экспрессированной химеры FF/CD40L, выполненный в формате проточной цитофлюориметрии на клетках 293.CD40, показал, что этот белок эффективно связывается с CD40. Таким

образом, данные, полученные в этой части работы, указывали на структурно-функциональную пригодность БЖ^МОЬ для нацеливания Ад вектора. Получение и характернаация аденовирусов, несущих химерный шип РР/С040и

Вирус Ас151д1сРР/СВ40Ъ был получен и размножен также как и Ас151л1сРР/6Н, описанный выше. Выход очищенного вируса А<151л1сРРЛ1Ю40Ь после амплифиции в клетках 293 был сопоставим с выходами немодифицированных Ад векторов и составлял 1,8x104 вч на клетку. Вестерн блот анализ подтвердил, что в вирионах А(15ЬисРР/С[)40Ь присутствуют только химерные шипы РР/СШОЬ и не обнаружил никаких следов деградации химеры. Одинаковые интенсивности сигналов на блоте свидетельствовали о том, что эффективность встраивания химерных шипов в вирусные частицы сопоставима с таковой шипа дикого типа

Вирус А(15.ЬисРР/С040Ь эффективно траисдуцировал только С040-позитивные клетки 293.С040. Экспрессия репортерного гена в этих клетках была на два порядка выше, чем в С040-негативных клетках 293, и, кроме того, селективно ингибировалась белком зС040Ь.

Эти данные, а также тот факт, что ГД шипа Ад5 не имел никакого ингибирующего эффекта на инфекцию А(151л1сРР/СВ401,, демонстрировали, что замена шипа дикого типа химерой ЕЕУОМОЬ в Ад5 вирионах приводит к желаемому изменению тропизма и обеспечивает проникновение вируса в клетки за счет С040-опосредованного связывания.

Однако, вирус А(151,исРЖЮ40Ь оказался в 40 раз менее эффективным при трансдукции клеток 293.С040, чем Ас151л1с1. Одним из объяснений этому могло быть то, что химерный шип П?/С040Ь не является полноценной заменой шипа дикого типа, функции которого, как предполагается, не ограничиваются только связыванием с клеткой. Основной целью экспериментов, описанных ниже, являлось решение проблемы неэффективной инфекции вектором Аё5ЬисРР/С040Ь.

Чтобы проверить выдвинутую нами гипотезу, мы сконструировали мозаичные вирионы, которые дополнительно к химерному шипу Н7С040Ь содержали полноразмерный шип Ад5 с мутацией в КАР-связывающем сайте. Мозаичный вектор А<151л1сРР/С1)40Ь.Р5Д был получен после размножения А<151л1сРР/СП40Ь на клетках 293ДТАУТ, конститутивно экспрессирующих мутантный шип Ад5, у

которого в КАР-связывающем сайте делегированы необходимые для взаимодействия с КАР аминокислоты ТАУТ (ЯоеЫпк с/ а!., 1999). Присутствие дополнительного шипа более чем на порядок увеличило уровень экспрессии трансгена в клетках 293.СШ0, трансдуцированных Аё5ЬисРР/СР>40Ь Р5А (Рис. 10А). При этом эффективность связывания мозаичного вектора с клетками-мишенями, определенная в эксперименте с использованием вирусов, меченных 3Н-тимидином, не изменилась (Рис. 10Б). Следовательно, наблюдаемое увеличение экспрессии трансгена мозаичным вектором не было обусловлено изменением эффективности его связывания с клетками и нарушением специфичности нацеливания к С[)40.

А Б

293 293.С040 293 293,СБ40

■ Ас15Ьис1 Ш Ас15ЬисРЕ/С040Ь □ Ас15ЬисРР/СШ0Ь Р5Д

Рис. 10. Сравнение эффективности связывания с клетками и трансдукции векторами Лё5ЬисРр/С040Ь и Аа5ЬисРР/СВ401,.К5А.

А. Клетки 293 и 293.СШО трансдуцировали вирусами Ас151л]сРР/С040Ь, Аё51люРР/С040Ь.Р5Д и Ad5Lucl. Активность люциферазы измеряли в лизатах инфицированных клеток через 20 часов после инфекции. Каждое из представленных значений является средним трех измерений. Б. Меченные Н3-тимидином вирусы Аё5ЬисРР/С040Ь, Аа51,исШС040Ь.Р5Д и Ad5Lucl инкубировали с клетками 293 и 293.С040 (4000 вч на клетку) в течение часа на льду. Клетки отмывали от несвязавшихся вирионов, ассоциированную с клетками радиоактивность измеряли в сцинтилляционном счётчике. Каждое значение является средним трёх измерений.

Последующее использование С040Ъ-содержащих векторов, как несущих только химерный белок Н?/СВ40Ь, так и в комбинации с мутантным шипом Ад5, показало их повышенную эффективность в трансдукции дендритных клеток, опухолевых клеток яичников ОУ-4 и БсоУЗлр! и мочевого пузыря Т24 человека

В дендритных клетках, транедуцированных СВ40-нацеленными векторами, А<55ЬисРР/СВ40Ь и А(15ЬисРТ/С040Ь Б5А, активность люциферазы была выше в 220 и 1250 раз, соответственно, чем в клетках, транедуцированных вирусом Ас15Ьис1. На клетках ОУ-4 разница в уровнях экспрессии люциферазы мозаичным и контрольным вирусом Ас15Ъис1 составляла 130 раз, на клетках Т24 и 8соУЗлр1 наблюдалось 40- и 6-кратное усиление экспрессии трансгена, соответственно (Рис. 11). Рекомбинантный бС040Ь эффективно ингибировал транедукцию как дендритных, так и опухолевых клеток, в то время как ГД шипа Ад5 не оказывал на неё никакого влияния. Эти данные еще раз подтвердили, что С0401^-модифицированные Ад используют исключительно СП40-опосредованный путь для проникновения в клетки.

12 3 12 3

Я без ингибитора Щ 100мкг/млГДАд5 □ 100 мкг/мл бС040Ь 1 - Аа5Ьис1 2 - Аа5ЬисШС040Ь 3 - А<151л1сШС040ир5Д

Рис. 11. Опосредованная вирусами Аё5ЬисРР/С1)401* и Ас151лсЕР/С1)40Ь.Р5Д транедукция клеток человека.

Дендритные клетки (А), опухолевые клетки мочевого пузыря Т24 (Б), и яичников человека ОУ-4 (В) и 8соУЗлр1 (Г) преинкубировали перед заражением Ад либо со средой ОМЕМ-Р12, либо с такой же средой, содержащей 100 мкг/мл ГД шипа Ад5 или 100 мкг/мл зС040Ь Колонки на графике соответствуют значениям активности люциферазы, измеренной в лизатах клеток через 20 часов после инфекции.

выводы

1. Получена серия Ад векторов, содержащих в Ш-петле глобулярного домена шипа встройки полипептидных последовательностей длиною от 13 до 111 а.о. Выявлено, что увеличение размера глобулярного домена не оказывает существенного влияния на продуктивность, инфекционность или связывание вируса с КАР, хотя, в целом, наблюдается обратная корреляция меящу размером встройки и этими параметрами.

2 Установлено, что RGD-трипептид в составе удлиненных Ш-петель способен эффективно взаимодействовать с интегринами и функционировать как нацеливающий вирус лиганд.

3. Выявлено, что вазоактивный полипептвд тонкого кишечника, будучи встроенным в удлиненные Ш-петли шипа Ад5, не связывается со своими природными рецепторами, но способен вступать в заряд-обусловленное взаимодействие с неидентифицированными молекулами на поверхности клеток.

4. С целью замещения шипа в Ад капсиде, сконструирована химерная молекула, состоящая из амино-концевого фрагмента шипа Ад5, фибритина бактериофага Т4 и лигавда Установлено, что фибритин способен поддерживать стабильную тримерную конформацию всего химерного белка и, что химера эффективно встраивается в Ад вирионы

5. Продемонстрировано, что химерные шипы в составе Ад обеспечивают эффективную КАР-независимую, опосредованную лигандом трансдукцию клеток.

6. Установлено, что замещение дикого шипа на химерный не влияет на продуктивность вирусной инфекции и протеодитический процессинг капсидных белков.

7. Выявлено, что инфекционность вектора, несущего химерный шип, может быть увеличена за счёт включения в его капсид дополнительного полноразмерного шипа Ад5, неспособного связываться с КАР.

8. Продемонстрировано, что вирус с химерным шипом, содержащим в качестве нацеливающего лиганда TNF-подобный домен CD40L человека, в 4-1000 раз более эффективно, чем вирус с диким шипом, трансдуцирует CD40-положительные дендритные и раковые клетки человека

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Krasnykh V., Dmitriev I, Navarro J.G., Belousova N., Kashentseva E., Xiang J., Douglas J.T., Curiel D.T. Advanced generation adenoviral vectors possess augmented gene transfer efficiency based upon coxsackie adenovirus receptor-independent cellular entry capacity.// Cancer Research. - 2000. - Vol.60. № 24. P.6784-87. i

2. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G, Curiel D.T. Genetic targeting of adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritm // Journal of Virology. - 2001. - Vol.75. №.9. P.4176-83.

3. Belousova N„ Krendelchtchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Modulation of Adenovirus Vector Tropism via Incorporation of Polypeptide Ligands into the Fiber Protein.//Journal of Virology. -2002. - Vol.76. №.17. P.8621-31.

4. Belousova N, Korokhov N, Krendelchtchikova V., Simonenko V., Mikheeva G, Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T., and Krasnykh V. Genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells.// Journal of Virology, (в печати).

5. Krasnykh V., Mikheeva G., Belousova N., Korokhov N., and Curiel D. T. Genetic replacement of the adenovirus fiber protein as a strategy to develop targeted vectors for cell-specific gene delivery.// Molecular Therapy. - 2000. - Vol.1. №.5. P. 176.

6. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., and Curiel D. T. Genetic replacement of the adenovirus fiber protein as a strategy to develop targeted vectors for cell-specific gene delivery.// The World Congress on Biotechnology. Berlin, Germany, September 3-8,2000. Abstr. Book. P.65-66.

7. Belousova N., Mikheeva G, Korokhov N., Curiel D.T., Krasnykh V. Derivation of targeted adenovirus vectors for cell-specific gene delivery via genetic replacement of the fiber protein.// Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery. Cold Spring Harbor, New York, March 15-18,2001. Abstr. Book. P.14.

8. Belousova N., Curiel D.T., Krasnykh V. Generation of recombinant adenoviral vectors containing fiber proteins with extended HI-loops.// Molecular Therapy. -2001.-Vol. 3(5), P. 168.

9 Belousova N, Krendelshchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Generation of targeting adenoviral vectors containing fibers with extended HI-loops.// 2001

Annual Research Retreat The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 22, 2001. Abstr. Book. P.77.

10. Krasnykh, V., Korokhov, N., Belousova, N., Simonenko, V., Krendelchtchikova, V, Mikheeva, G, and Curiel, DT. Derivation of truly targeted adenovirus vectors by the fiber replacement technology.// Xllth International Congress of Virology. Paris, France, July 27-August 1,2002. Abstr. Book.

11. Belousova N„ Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Curiel D.T., and Krasnykh V Novel genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells // Molecular Therapy. - 2002. - Vol. 5(5). P. 201.

12. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N.. Krendelchtchikova V., Simonenko V., Curiel D.T. Targeted Adenovirus Vectors For Gene Therapy of Cancer.// The 3rd International Cancer Congress New Trends in Cancer Therapy. Rovigo, Italy, December 5, 2002, Abstr. Book.

13 Belousova N„ Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T. and Krasnykh V. Novel Genetically Targeted Adenovirus Vector Directed to Dendritic Cells.// 2002 Annual Research Retreat The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 28,2002. Abstr. Book P.92.

Отпечатано "Документ-Сервис". Печать на ризографе, формат А5, тираж 100 шт. Адрес: 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская 4/1. тел. 396-600

2-ооЗ-Д

»54 75"

Í П и ^

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белоусова, Наталья Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика аденовирусов

1.2. Структурные белки капсида Ад

1.2.1. Гексон.

1.2.2. Основание пентона

1.2.3. Шип

1.2.4. Белок pIX

1.3. Инфекционный цикл Ад.

1.3.1. Проникновение Ад в клетки

1.3.2. Дезинтеграция вириона

1.3.3. Экспрессия генов и репликация ДНК.

1.3.4. Сборка вирусных частиц и выход их из клетки

1.4. Рецепторы, используемые Ад для проникновения в клетки

1.4.1. Первичные рецепторы

1.4.2. Вторичные рецепторы

1.5. Стратегии таргетинга

1.6. Трансдукционный таргетинг

1.6.1. Нацеливание Ад с помощью комплексов "адаптер-лиганд".

1.6.2. Генетическая модификация тропизма Ад

1.6.2.1. Таргетинг Ад с помощью замещения шипов или ГД шипов.

1.6.2.2. Таргетинг Ад с помощью генетического включения лиганда в капсидные белки

1.6.2.2.1. Модификация основания пентона

1.6.2.2.2. Модификация гексона.

1.6.2.2.3. Модификация белка pIX.

1.6.2.2.4. Модификация ГД шипа

1.6.2.2.4.1. Встраивание лигандов на С-конец ГД шипа.

1.6.2.2.4.2. Встраивание лигандов в Ш-петлю шипа

1.6.2.3. Замена шипа химерным белком

1.6.3. Клеточные линии для получения нацеленных векторов

1.7. Аденовирусные векторы как терапевтические агенты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида"

Актуальность проблемы.

Генная терапия сформировалась на рубеже 1980-х и 1990-х годов как альтернативный подход к лечению наследственных и приобретённых заболеваний. Проведённые в течение более чем десятилетнего периода исследования привели к разработке ряда терапевтических протоколов, наиболее эффективные из которых находятся сейчас в стадии клинических испытаний. Заметные успехи были достигнуты при лечении кистозного фиброза, коронарной болезни сердца, а также различных типов рака (Hamid et al., 2003, Kubo et al., 2003, Lamont et al., 2000, Makower et al., 2003, Nemunaitis et al., 2001, Rosengart et al., 1999, Schuler et al., 2001). Однако, наряду с достигнутыми впечатляющими результатами, генно-терапевтические исследования выявили ряд фундаментальных проблем, препятствующих полной реализации этой медико-биологической концепции. Центральной из них является проблема эффективной и селективной экспрессии терапевтического гена в поражённой болезнью ткани. Решение этой проблемы требует разработки как новых методов, так и средств доставки генов к месту назначения безопасным и эффективным способом, предъявляя строгие критерии к системам, обеспечивающим доставку генетического материала - так называемым "векторам". Прежде всего, терапевтический вектор должен быть стабилен in vivo в течение времени, необходимого для эффективной трансдукции поражённой ткани. Во-вторых, вектор не должен быть токсичным, онкогенным и иммунногенным. В идеале, доставка гена должна быть тканеспецифичной, с тем, чтобы с одной стороны, усилить терапевтический эффект в области развития патологии, а с другой -минимизировать потенциально негативное воздействие продукта терапевтического гена на здоровые органы и ткани. Помимо вышесказанного, вследствие разнообразия способов и случаев применения генных векторов, они должны быть способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки.

Хотя критический анализ существующих на сегодняшний день вирусных и невирусных векторных систем свидетельствует о том, что ни одна из них не удовлетворяет вышеперечисленным требованиям во всей полноте, общепризнано, что аденовирусы (Ад) человека являются наилучшими кандидатами в векторы для генной терапии. Ад имеют следующие преимущества перед другими векторными системами: (1) они способны эффективно трансдуцировать широкий спектр разных типов клеток, как делящихся, так и покоящихся; (2) Ад сохраняют высокую инфекционность in vivo; (3) Ад человека не являются онкогенными; (4) разработанная методология позволяет получать репликативно дефектные производные Ад, способные размножаться только в специально сконструированных клеточных линиях, а потому безопасные при терапевтическом использовании; (5) значительный объём генетического материала (до 36 т.п.н.) может быть встроен в Ад вектор, что, при условии замещения всех генов Ад, позволяет клонировать в них полные копии генов млекопитающих; (6) современная технология производства и очистки Ад даёт возможность получения векторных препаратов, пригодных для клинического применения в масштабе свыше 1014 вирионов и с титрами до 1013 частиц на мл, таким образом снижая производственные затраты.

В совокупности эти преимущества привели к широкому использованию Ад векторов в генной терапии для доставки терапевтических и репортёрных генов, а также к разработке так называемых онколитических Ад, способных разрушать злокачественные опухоли за счёт селективной репликации в раковых клетках.

Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в разработке Ад векторов для генной терапии, на сегодняшний день сохраняется необходимость преодоления трёх основных недостатков этой системы генной доставки: (1) вызываемый векторами иммунный ответ, (2) неспособность Ад векторов эффективно инфицировать определённые типы клеток-мишеней и (3) отсутствие тканевой селективности, которая приводит к неконтролируемой трансдукции как клеток-мишеней, так и клеток здоровых тканей и значительно снижает эффективность терапии.

Первая из перечисленных проблем решается разработкой как методов непосредственного снижения иммуногенности и иммунореактивности Ад (конструирования так называемых «выпотрошенных» векторов, из геномов которых удалены все вирусные гены; химической «маскировки» вирусного капсида и т. д.) (Croyle et al., 2001, Fisher et al., 2001, Kochanek et al., 1996, O'Riordan et al., 1999, Pastore et al., 1999), так и попытками использовать временное подавление иммунной системы пациента или очистку крови пациента от анти-Ад антител как средство снижения иммунного пресса на используемый вирусный вектор (Chen et al., 2000, Fang et al., 1995, Han et al., 1997, Jooss et al., 1996, Lochmuller et al., 1996).

Главной целью данного исследования являлась разработка подходов к решению двух последних из перечисленных выше проблем, характерных для Ад векторов. Поскольку эти проблемы являются прямым следствием природного тропизма Ад, наша стратегия создания ткане-специфичных, или "нацеленных" Ад векторов, основана на модификации природного механизма взаимодействия вируса с клеткой, с тем, чтобы обеспечить эффективную и специфичную доставку терапевтического гена в клетки-мишени (трансдукционный таргетинг). Два подхода для получения нацеленных Ад, основанные на генетическом включении в состав векторного вириона молекул лигандов, были разработаны в представленной работе.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлась разработка новых стратегий получения нацеленных Ад векторов для генной терапии. В качестве методологической основы этих стратегий были использованы (а) модификация глобулярного домена (ГД) шипа Ад5 и (б) замещение шипа химерными молекулами.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить серию Ад векторов, содержащих в Ш-петле ГД шипа увеличивающиеся по размеру встройки фрагментов гипервариабельной петли основания пентона (ОП) Ад5.

2. Установить зависимость продуктивности вирусной инфекции, инфекционности вирусов и их рецепторной специфичности от размера встроек в Ш-петле.

3. Создать серию шаттл-плазмид, позволяющих быстро и эффективно встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли всех полученных конструкций.

4. Используя вновь сконструированные шатгл-плазмиды, получить Ад векторы, содержащие в составе удлинённой HI-петли вазоактивный полипептид тонкого кишечника (VIP), и охарактеризовать их продуктивность, инфекционность и взаимодействие с рецепторами.

5. Сконструировать химерную молекулу-прототип шип-фибр итин-лиганд, предназначенную для нацеливания Ад вектора посредством замещения шипа в капсиде Ад.

6. Продемонстрировать способность фибритина бактериофага Т4 выполнять тримеризуюхцую и лиганд-представляющую функции в составе химерной молекулы.

7. Продемонстрировать способность химеры встраиваться в Ад вир ионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором (ИР).

8. Изучить влияние делеции большей части последовательности шипа в составе химеры на инфекционность вирусов, несущих химерный шип.

9. Установить, сохраняет ли TNF-подобный домен CD40L свою функциональную структуру в отсутствие внутренней дисульфидной связи, и совместима ли его структура со структурой химеры шип-фибритин.

10. Сконструировать Ад вектор, капсид которого содержит химеру шип-фибритин-С040Ь вместо шипа дикого типа, а также мозаичную версию этого вектора, включающую помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в сайте связывания с природным Ад рецептором, КАР. 11. Определить эффективность связывания этих вирусов с CD40 и трансдукции ими СБ40-положительных клеток.

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые продемонстрирована возможность встраивания полипептидов размером до 111 а.о. в HI-петлю ГД шипа. Эти данные позволили коренным образом пересмотреть сложившиеся ранее представления о том, что выбор лигандов для нацеливания Ад векторов ограничен короткими пептидными молекулами. На основании полученных нами результатов был сделан вывод о возможности нацеливания Ад за счёт модификации ГД шипа полипептидными лигандами, что значительно расширяет репертуар как лигандов, так и рецепторов-мишеней пригодных для таргетинга Ад.

Сконструирована серия шаттл-плазм ид, позволяющая эффективно и быстро клонировать кодирующие лиганд последовательности в Ш-петли ГД шипа, удлинённые разными по величине фрагментами гибкой петли ОП, для оптимального представления нацеливающих лигандов рекомбинантным шипом.

Продемонстрировано, что VIP-содержащий вектор, полученный с использованием этих шаттл-плазмид, обладает повышенной инфекционностью на КАР-нсгативных клетках, что делает его потенциально полезным для доставки генов в такие клетки.

Разработана принципиально новая стратегия таргетинга, основанная на замещении шипа Ад химерной молекулой и позволяющая решить две главные задачи, связанные с нацеливанием Ад векторов: разрешение структурной и функциональной несовместимости лиганда и шипа, а также обеспечение специфичного связывания с рецептором-мишенью.

Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что встраивание в капсид Ад векторов, несущих химерный шип, дополнительного полноразмерного шипа Ад5, 8 с мутацией в КАР-связывающем сайте, увеличивает их инфекционность, не изменяя при этом специфичность связывания с рецептором-мишенью.

Сконструированы нацеленные к CD40 Ад векторы, эффективно и специфично трансдуцирующие дендритные и опухолевые клетки яичников и мочевого пузыря человека. Эти векторы являются наиболее эффективными из известных в настоящее время средств доставки генов в названные типы клеток-мишеней, а потому могут служить прототипами терапевтических векторов для генетической иммунизации против рака и инфекционных агентов. Альтернативно, сконструированные на их основе условно-репликативные вирусы могут быть использованы для уничтожения метастазирующих злокачественных, CD40-экспрессирующих опухолей посредством их селективной трансдукции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Получение серии из восьми Ад векторов, Ad5LucNNRGD, содержащих встройки размером от 13 до 83 а.о. в Ш-петле ГД шипа Ад5 и подтверждение их структуры.

2. Определение влияния размера встроек в Ш-петле на продуктивность вирусной инфекции, инфекционность вирусов и их тропизм.

3. Создание серии шаттл-плазмид pHI.PBNN, позволяющих быстро и эффективно встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли всех восьми конструкций.

4. Получение вирусов Ad5LucNNVIP, со встройкой VIP в Ш-петлях, содержащих дополнительные линкеры размером 5, 10, 35 и 40 а.о. Изучение механизмов проникновения модифицированных вирусов в клетки.

5. Создание химерной молекулы шип-фибритин-бИБ-таг (FF/6H), предназначенной для замещения шипа в капсиде Ад. Определение способности химеры тримеризоваться, встраиваться в Ад вирионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором (ИР).

6. Определение, насколько критичной для правильной упаковки и связывания с рецептором является присутствующая в CD40L дисульфидная связь.

7. Создание химерной молекулы шип-фибритин, включающей в качестве лиганда TNF-подобный домен CD40L.

8. Получение вектора, несущего химерный С040Ь-содержащий шип. Определение его инфекционное™ и специфичности взаимодействия с CD40.

9. Создание мозаичного вектора, содержащего помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в КАР связывающем сайте. Сравнение его инфекционности с инфекционностью вируса содержащего только химерный шип.

10. Сравнение эффективности транедукции дендритных и опухолевых клеток человека С040Ь-содержащими вирусами с таковой немодифицированного вируса, содержащего шип дикого типа.

Апробация и публикации.

Результаты работы были представлены на Международном Конгрессе по Биотехнологии "Biotechnology 2000" (Берлин, Германия, 2000), на Международном Симпозиуме "Genetic Anticancer Agents" (Валенсия, Испания,

2002), на Третьей, Четвёртой и Пятой Ежегодной Конференции American Society of Gene Therapy (Денвер, Колорадо, 2000; Сиэттл, Вашингтон, 2001; Бостон, Массачусетс, 2002), на конференции 'Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery" в Cold Spring Harbor (Cold Spring Harbor, 2001), на Ежегодном Медицинском Форуме в University of Alabama at Birmingham, UAB (Бирмингем, Алабама, 2001 и 2002). Результаты обсуждались на семинаре в Gene Therapy Center, UAB (Бирмингем, Алабама, июль 2003).

По материалам работы опубликованы 4 статьи и тезисы 9 конференций:

1. Krasnykh V., Dmitriev I., Navarro J.G., Belousova N., Kashentseva E., Xiang J., Douglas J.T., Curiel D.T. Advanced generation adenoviral vectors possess augmented gene transfer efficiency based upon coxsackie adenovirus receptor-independent cellular entry capacity.// Cancer Research. - 2000. - Vol.60. №.24. P.6784-87.

2. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., Curiel D.T. Genetic targeting of adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin.// Journal of Virology. - 2001. - Vol.75. №.9. P.4176-83.

3. Belousova N., Krendelchtchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Modulation of Adenovirus Vector Tropism via Incorporation of Polypeptide Ligands into the Fiber Protein.//Journal of Virology. - 2002. - Vol.76. №.17. P.8621-31.

4. Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Mikheeva G., Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T., and Krasnykh V. Genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells.// Journal of Virology, (в печати).

7. Belousova N., Mikheeva G., Korokhov N., Curiel D.T., Krasnykh V. Derivation of targeted adenovirus vectors for cell-specific gene delivery via genetic replacement of the fiber protein.// Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery. Cold Spring Harbor, New York, March 15-18, 2001. Abstr. Book. P.14.

8. Belousova N., Curiel D.T., Krasnykh V. Generation of recombinant adenoviral vectors containing fiber proteins with extended HI-loops.// Molecular Therapy. - • 2001.-Vol. 3(5), P. 168.

9. Belousova N., Krendelshchikova V., Curiel D.T. and Krasnykh V. Generation of targeting adenoviral vectors containing fibers with extended HI-loops.// 2001 Annual Research Retreat. The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 22, 2001. Abstr. Book. P.77.

10. Krasnykh, V., Korokhov, N., Belousova, N., Simonenko, V., Krendelchtchikova, V., Mikheeva, G., and Curiel, DT. Derivation of truly targeted adenovirus vectors by the fiber replacement technology.// Xllth International Congress of Virology. Paris, France, July 27-August 1, 2002. Abstr. Book.

11. Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Curiel D.T., and Krasnykh V. Novel genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells.// Molecular Therapy. - 2002. - Vol. 5(5). P. 201.

12. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Curiel D.T. Targeted Adenovirus Vectors For Gene Therapy of Cancer.// The 3rd International Cancer Congress "New Trends in Cancer Therapy". Rovigo, Italy, December 5, 2002. Abstr. Book.

13. Belousova N., Korokhov N., Krendelchtchikova V., Simonenko V., Aldrich W., Triozzi P., Curiel D.T. and Krasnykh V. Novel Genetically Targeted Adenovirus Vector Directed to Dendritic Cells.// 2002 Annual Research Retreat. The Medical Forum, Birmingham, Alabama, October 28, 2002. Abstr. Book. P.92.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность В.Н. Красных за помощь и руководство работой, Н.П. Корохову за обсуждение результатов по ходу выполнения работы, В.Г. Кренделыциковой за участие и помощь в работе, А.В. Перебоеву, В.В. Терновому и С.А Шестопал за критические замечания при прочтении рукописи.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Белоусова, Наталья Викторовна

выводы

1. Получена серия Ад векторов, содержащих в HI-петле глобулярного домена шипа встройки полипептидных последовательностей длиною от 13 до 111 а.о. Выявлено, что увеличение размера глобулярного домена не оказывает существенного влияния на продуктивность, инфекционность или связывание вируса с КАР, хотя, в целом, наблюдается обратная корреляция между размером встройки и этими параметрами.

2. Установлено, что RGD-трипептид в составе удлинённых Ш-петель способен эффективно взаимодействовать с интегринами и функционировать как нацеливающий вирус лиганд.

3. Выявлено, что вазоактивный полипептид тонкого кишечника, будучи встроенным в удлинённые HI-петли шипа Ад5, не связывается со своими природными рецепторами, но способен вступать в заряд-обусловленное взаимодействие с не идентифицированными молекулами на поверхности клеток.

4. С целью замещения шипа в Ад капсиде, сконструирована химерная молекула, состоящая из амино-концевого фрагмента шипа Ад5, фибритина бактериофага Т4 и лиганда. Установлено, что фибритин способен поддерживать стабильную тримерную конформацию всего химерного белка и, что химера эффективно встраивается в Ад вирионы.

6. Установлено, что замещение дикого шипа на химерный не влияет на продуктивность вирусной инфекции и протеолитический процессинг капсид ных белков.

Заключение

Подводя итог вышесказанному, следует сказать, что существенный прогресс в понимании механизмов, обеспечивающих Ад инфекцию, явился рациональной основой для генетической модификации тропизма Ад как стратегии получения более совершенных терапевтических векторов.

Настоящая диссертационная работа суммирует вклад, внесённый соискателем в развитие концепции нацеленных Ад векторов для генной терапии человека. Приведённые ниже исследования проводились соискателем с 1997 по 2003 год в Центре Генной Терапии Университета Алабамы в Бирмингеме (Gene Therapy Center, University of Alabama at Birmingham, USA).

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

В работе использовали следующие штаммы E.coli: XLl-Blue MRF (Stratagen, La Jolla, CA, USA), STBL2 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), BJ5183 (Quantum, Montreal, Quebec, Canada), M15[pREP4] (Qiagen, Valencia, CA, USA), BL21(DE3)pLysS (Novagen, Madison, WI, USA).

2.1.2. Эукариотические клетки.

Эмбриональные клетки почки человека 293, трансформированные ДНК Ад5 (Graham et al., 1977), их производные 293Т/17, экспрессирующие большой Т антиген обезьяньего вируса 40, глиальные клетки U118MG и клетки карциномы мочевого пузыря Т24 человека были получены из American Type Culture Collection (АТСС, Manassas, VA, USA). Клетки 211, производные клеток 293, конститутивно экспрессирующие шип Ад5, были любезно предоставлены Von Seggem (The Scrips Research Institute, La Jolla, CA, USA). Клетки карциномы яичников человека SKOV3.ipl и OV-4 были получены от Janet Price (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA) и Timothy Eberlein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MS, USA), соответственно. Клетки яичников китайского хомячка СНО, а также производные этих клеток CHO/VPAC1 и CHO/VPAC2, экспрессирующие VPAC1 и VPAC2 рецепторы, были предоставлены Marie Laburthe (Institut National de la Sante et de la Recherche M6dicale, Paris, France). Клеточные линии 293-6H, 293.CD40, 293F28 и 293ATAYT, экспрессирующие искусственный рецептор, узнающий 6His-Tar, CD40, шип Ad5 дикого типа или мутантный шип Ад5 с делецией аминокислот 489-492, соответственно, были получены после трансфекции клеток 293 плазмидами, кодирующими соответствующий белок, с последующим отбором стабильных клонов на селективной среде. Для получения перечисленных линий-продуцентов были использованы плазмидные векторы pD.H2 (Douglas et al., 1999), pcDNA.CD40, pVS2 и pVSATAYT. Отбор клонов, стабильно экспрессирующих рецептор к 6His-Tary и CD40, вели в присутствии 1 мг/мл генетицина (G418) (Mediatech, Herndon, Va, USA). Уровень экспрессии рецепторов в индивидуальных клонах определяли при помощи Вестерн блоттинга с антителами, узнающими НА-эшггоп (Roche, Indianapolis, IN, USA) или CD40 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Клоны, экспрессирующие шип дикого типа и мутантный, отбирали на среде, содержащей 600 мкг/мл зеоцина (Invitrogen), продукцию белков затем оценивали Вестерн блоттингом с использованием моноклональных антител 4D2 к шипу Ад5 (Hong and Engler, 1991), предоставленных Jeffrey Engler (University of Alabama at Birmingham, Alabama, USA).

Клетки CHO культивировались на среде Ham's-F12, их производные, экспрессирующие VPAC рецепторы, поддерживались в той же самой среде, содержащей 100 мкг/мл G418. Все остальные клеточные линии велись на среде DMEM-F12.

Для размножения всех клеток в среды добавляли эмбриональную сыворотку телёнка до 10%, глютамин до 2 мМ, пенициллин до 100 ед/мл и стрептомицин до 100 мкг/мл. Все клетки инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СОг.

Дендритные клетки человека были получены из Департамента Гематологии и Онкологии University of Alabama at Birmingham из CD 14-положительных моноцитов, изолированных из периферической крови анонимных доноров. Клетки поддерживали в культуре в течение нескольких дней на среде RPMI-1640, содержащей сыворотку, глютамин, пенициллин и стрептомицин, в концентрациях, указанных выше, а также фактор, стимулирующий рост гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), в концентрации 100 нг/мл и интерлекин 4 (IL-4), в концентрации 1000 ед/мл. 2.1.3. Антитела и белки.

Антитела, используемые в работе, приведены в Таблице 2.1.3.

Шип Ад5 (Dmitriev et al., 1998) и рКАР (Dmitriev et al., 2000) были получены в нашей лаборатории и любезно предоставлены Игорем Дмитриевым. Белок FF/6H и укороченные формы фибритина - фибритин и фибритин-бН были получены и предоставлены для данного исследования Николаем Короховым (University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama, USA). ф

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоусова, Наталья Викторовна, Birmingham

1. Albinsson В and Kidd АН (1999). Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Res. 64: 125-36.

2. Alemany R, Balague С and Curiel DT (2000). Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol. 18: 723-7.

3. Alemany R and Curiel DT (2001). CAR-binding ablation does not change biodistribution and toxicity of adenoviral vectors. Gene Ther. 8: 1347-53.

4. Anderson CW, Young ME and Flint SJ (1989). Characterization of the adenovirus 2 virion protein, mu. Virology. 172: 506-12.

5. Anderson CW (1990). The proteinase polypeptide of adenovirus serotype 2 virions. Virology. 177: 259-72.

6. Arnberg N, Mei Y and Wade 11 G (1997). Fiber genes of adenoviruses with tropism for the eye and the genital tract. Virology. 227: 239-44.

7. Arnberg N, Kidd AH, Edlund K, Olfat F and Wadell G (2000). Initial interactions of subgenus D adenoviruses with A549 cellular receptors: sialic acid versus alpha(v) integrins. J Virol. 74: 7691-3.

8. Asada-Mikami R, Heike Y, Kanai S, Azuma M, Shirakawa K, Takaue Y, Krasnykh V, Curiel DT, Terada M, Abe T and Wakasugi H (2001). Efficient gene transduction by RGD-fiber modified recombinant adenovirus into dendritic cells. Jpn J Cancer Res. 92: 321-7.

9. Babiss LE and Ginsberg HS (1984). Adenovirus type 5 early region lb gene product is required for efficient shutoff of host protein synthesis. J Virol. 50: 202-12.

10. Bai M, Harfe В and Freimuth P (1993). Mutations that alter an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence in the adenovirus type 2 penton base protein abolish its cell-rounding activity and delay virus reproduction in flat cells. J Virol. 67: 5198-205.

11. Batra RK, Olsen JC, Pickles RJ, Hoganson DK and Boucher RC (1998). Transduction of non-small cell lung cancer cells by adenoviral and retroviral vectors. Am J Respir Cell Mol Biol. 18: 402-10.

12. Beltz GA and Hint SJ (1979). Inhibition of HeLa cell protein synthesis during adenovirus infection. Restriction of cellular messenger RNA sequences to the nucleus. J Mol Biol. 131: 353-73.

13. Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, Horwitz MS, Crowell RL and Finberg RW (1997). Isolation of a common receptor for Coxsackie В viruses and adenoviruses 2 and 5. Science. 275: 1320-3.

14. Bergelson JM, Krithivas A, Celi L, Droguett G, Horwitz MS, Wickham T, Crowell RL and Finberg RW (1998). The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie В viruses and adenoviruses. J Virol. 72: 415-9.

15. Bemal RM, Sharma S, Gardner BK, Douglas JT, Bergelson JM, Dubinett SM and Batra RK (2002). Soluble coxsackievirus adenovirus receptor is a putative inhibitor of adenoviral gene transfer in the tumor milieu. Clin Cancer Res. 8: 1915-23.

16. Bewig В and Schmidt WE (2000). Accelerated titering of adenoviruses. Biotechniques. 28: 870-3.

17. Bewley MC, Springer K, Zhang YB, Freimuth P and Flanagan JM (1999). Structural analysis of the mechanism of adenovirus binding to its human cellular receptor, CAR. Science. 286: 1579-83.

18. Blackwell JL, Miller CR, Douglas JT, Li H, Reynolds PN, Carroll WR, Peters GE, Strong TV and Curiel DT (1999). Retargeting to EGFR enhances adenovirus infection efficiency of squamous cell carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck1. A Surg. 125: 856-63.

19. Blackwell JL, Li H, Gomez-Navarro J, Dmitriev I, Krasnykh V, Richter CA, Shaw DR, Alvarez RD, Curiel DT and Strong TV (2000). Using a tropism-modified adenoviral vector to circumvent inhibitory factors in ascites fluid. Hum Gene Ther. 11: 1657-69.

20. Bouri K, Feero WG, Myerburg MM, Wickham TJ, Kovesdi I, Hoffman EP and Clemens PR (1999). Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. Hum Gene Ther. 10: 1633-40.

21. Bridge E, Medghalchi S, Ubol S, Leesong M and Ketner G (1993). Adenovirus early region 4 and viral DNA synthesis. Virology. 193: 794-801.

22. Caillet-Boudin ML, Strecker G and Michalski JC (1989). O-linked GlcNAc inserotype-2 adenovirus fibre. Eur J Biochem. 184: 205-11.

23. Carson SD, Hobbs JT, Tracy SM and Chapman NM (1999). Expression of the coxsackievirus and adenovirus receptor in cultured human umbilical vein endothelial cells: regulation in response to cell density. J Virol. 73: 7077-9.

24. Серко CL and Sharp PA (1982). Assembly of adenovirus major capsid protein is mediated by anonvirion protein. Cell. 31: 407-15.

25. Challberg MD and Kelly TJ (1989). Animal virus DNA replication. Annu Rev Biochem. 58: 671-717.

26. Chardonnet Y and Dales S (1970). Early events in the interaction of adenoviruses with HeLa cells. I. Penetration of type 5 and intracellular release of the DNA genome. Virology. 40: 462-77.

27. Chartier C, Degryse E, Gantzer M, Dieterle A, Pavirani A and Mehtali M (1996). Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J Virol. 70: 4805-10.

28. Chatteijee PK, Vayda ME and Flint SJ (1986). Adenoviral protein VII packages intracellular viral DNA throughout the early phase of infection. Embo J. 5: 1633-44.

29. Chen P, Kovesdi I and Bruder JT (2000). Effective repeat administration with adenovirus vectors to the muscle. Gene Ther. 7: 587-95.

30. Chen PH, Omelles DA and Shenk T (1993). The adenovirus L3 23-kilodalton proteinase cleaves the amino-terminal head domain from cytokeratin 18 and disrupts the cytokeratin network of HeLa cells. J Virol. 67: 3507-14.

31. Chillon M, Bosch A, Zabner J, Law L, Armentano D, Welsh MJ and Davidson BL (1999). Group D adenoviruses infect primary central nervous system cells more efficiently than those from group C. J Virol. 73: 2537-40.

32. Chiu CY, Mathias P, Nemerow GR and Stewart PL (1999). Structure of adenovirus complexed with its internalization receptor, alphavbeta5 integrin. J Virol. 73: 675968.

33. Chiu CY, Wu E, Brown SL, Von Seggern DJ, Nemerow GR and Stewart PL (2001). Structural analysis of a fiber-pseudotyped adenovirus with ocular tropism suggests differential modes of cell receptor interactions. J Virol. 75: 5375-80.

34. Chroboczek J, Ruigrok RW and Cusack S (1995). Adenovirus fiber. Curr Top Microbiol Immunol. 199: 163-200.

35. Cleat PH and Hay RT (1989). Co-operative interactions between NFI and the adenovirus DNA binding protein at the adenovirus origin of replication. Embo J. 8: 1841-8.

36. Cohen CJ, Shieh JT, Pickles RJ, Okegawa T, Hsieh JT and Bergelson JM (2001). The coxsackievirus and adenovirus receptor is a transmembrane component of the tight junction. Proc Natl Acad Sci USA. 98: 15191-6.

37. Crawford-Miksza L and Schnurr DP (1996). Analysis of 15 adenovirus hexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues. J Virol. 70: 1836-44.

38. Crompton J, Toogood CI, Wallis N and Hay RT (1994). Expression of a foreign epitope on the surface of the adenovirus hexon. J Gen Virol. 75: 133-9.

39. Croyle MA, Cheng X, Sandhu A and Wilson JM (2001). Development of novel formulations that enhance adenoviral-mediated gene expression in the lung in vitro and in vivo. Mol Ther. 4: 22-8.

40. Cuesta R, Xi Q and Schneider RJ (2001). Preferential translation of adenovirus mRNAs in infected cells. Cold Spring Harb Svmp Quant Biol. 66: 259-67.

41. Cuzange A, Chroboczek J and Jacrot В (1994). The penton base of human adenovirus type 3 has the RGD motif. Gene. 146: 257-9.

42. Davison AJ, Telford EA, Watson MS, McBride К and Mautner V (1993). The DNA sequence of adenovirus type 40. J Mol Biol. 234: 1308-16.

43. Davison E, Diaz RM, Hart IR, Santis G and Marshall JF (1997). Integrin alpha5betal-mediated adenovirus infection is enhanced by the integrin-activating antibody TS2/16. J Virol. 71: 6204-7.

44. Davison E, Kirby I, Elliott T and Santis G (1999). The human HLA-A*0201 allele, expressed in hamster cells, is not a high-affinity receptor for adenovirus type 5 fiber. J Virol .73: 4513-7.

45. Davison E, Kirby I, Elliott T and Santis G (1999). The Human HLA-A*0201 Allele, Expressed in Hamster Cells, Is Not a High- Affinity Receptor for Adenovirus Type 5 Fiber. J Virol. 73: 4513-4517.

46. Dechecchi MC, Tamanini A, Bonizzato A and Cabrini G (2000). Heparan sulfate glycosaminoglycans are involved in adenovirus type 5 and 2-host cell interactions. Virology. 268: 382-90.

47. Dechecchi MC, Melotti P, Bonizzato A, Santacatterina M, Chilosi M and Cabrini G (2001). Heparan sulfate glycosaminoglycans are receptors sufficient to mediate the initial binding of adenovirus types 2 and 5. J Virol. 75: 8772-80.

48. Defer C, Belin MT, Caillet-Boudin ML and Boulanger P (1990). Human adenovirus-host cell interactions: comparative study with members of subgroups В and C. J Virol. 64:3661-73.

49. Dietz AB and Vuk-Pavlovic S (1998). High efficiency adenovirus-mediated gene transfer to human dendritic cells. Blood. 91: 392-8.

50. Dmitriev IP, Kashentseva EA and Curiel DT (2002). Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the С terminus of capsid protein IX. J Virol. 76: 6893-9.

51. Douglas JT, Rogers BE, Rosenfeld ME, Michael SI, Feng M and Curiel DT (1996). Targeted gene delivery by tropism-modified adenoviral vectors. Nat Biotechnol. 14: 1574-8.

52. Douglas JT, Miller CR, Kim M, Dmitriev I, Mikheeva G, Krasnykh V and Curiel DT (1999). A system for the propagation of adenoviral vectors with genetically modified receptor specificities. Nat Biotechnol. 17: 470-5.

53. Durmort C, Stehlin C, Schoehn G, Mitraki A, Drouet E, Cusack S and Burmeister WP (2001). Structure of the fiber head of Ad3, a non-CAR-binding serotype of adenovirus. Virology. 285: 302-12.

54. Ebbinghaus C, Al-Jaibaji A, Operschall E, Schoffel A, Peter I, Greber UF and Hemmi S (2001). Functional and selective targeting of adenovirus to high-affinity Fcgamma receptor I-positive cells by using a bispecific hybrid adapter. J Virol. 75: 480-9.

55. Efimov VP, Nepluev IV and Mesyanzhinov W (1995). Bacteriophage T4 as a surface display vector. Virus Genes. 10: 173-7.

56. Einfeld DA, Brough DE, Roelvink PW, Kovesdi I and Wickham TJ (1999). Construction of a pseudoreceptor that mediates transduction by adenoviruses expressing a ligand in fiber or penton base. J Virol. 73: 9130-6.

57. Einfeld DA, Schroeder R, Roelvink PW, Lizonova A, King CR, Kovesdi I and Wickham TJ (2001). Reducing the native tropism of adenovirus vectors requires removal of both CAR and integrin interactions. J Virol. 75: 11284-91.

58. Everitt E, Sundquist B, Pettersson U and Philipson L (1973). Structural proteins of adenoviruses. X. Isolation and topography of low molecular weight antigens from the virion of adenovirus type 2. Virology. 52: 130-47.

59. Falgout В and Ketner G (1988). Characterization of adenovirus particles made by deletion mutants lacking the fiber gene. J Virol. 62: 622-5.

60. Fender P, Ruigrok RW, Gout E, Buffet S and Chroboczek J (1997). Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat Biotechnol. 15: 52-6.

61. Field J, Gronostajski RM and Hurwitz J (1984). Properties of the adenovirus DNA polymerase. J Biol Chem. 259: 9487-95.

62. Fisher KD, Stallwood Y, Green NK, Ulbrich K, Mautner V and Seymour LW (2001). Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralising antibodies. Gene Ther. 8: 341-8.

63. Freimuth P, Springer K, Berard C, Hainfeld J, Bewley M and Flanagan J (1999). Coxsackievirus and adenovirus receptor amino-terminal immunoglobulin V-related domain binds adenovirus type 2 and fiber knob from adenovirus type 12. J Virol. 73: 1392-8.

64. Furcinitti PS, van Oostrum J and Burnett RM (1989). Adenovirus polypeptide IX revealed as capsid cement by difference images from electron microscopy and crystallography. Embo J. 8: 3563-70.

65. Gafvelin G, Andersson M, Dimaline R, Jornvall H and Mutt V (1988). Isolation and characterization of a variant form of vasoactive intestinal polypeptide. Peptides. 9: 469-74.

66. Gall J, Kass-Eisler A, Leinwand L and Falck-Pedersen E (1996). Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. J Virol. 70: 2116-23.

67. Garcia-Castro J, Segovia JC, Garcia-Sanchez F, Lillo R, Gomez-Navarro J, Curiel DT and Bueren JA (2001). Selective transduction of murine myelomonocytic leukemia cells (WEHI-3B) with regular and RGD-adenoviral vectors. Mol Ther. 3: 70-7.

68. Ghosh-Choudhuiy G, Haj-Ahmad Y and Graham FL (1987). Protein IX, a minor component of the human adenovirus capsid, is essential for the packaging of full length genomes. Embo J. 6: 1733-9.

69. Ginsberg HS, Pereira HG, Valentine RC and Wilcox WC (1966). A proposed terminology for the adenovirus antigens and virion morphological subunits. Virology. 28: 782-3.

70. Ginsberg HS, Lundholm-Beauchamp U, Horswood RL, Pernis B, Wold WS, Chanock RM and Prince GA (1989). Role of early region 3 (E3) in pathogenesis of adenovirus disease. Proc Natl Acad Sci USA. 86: 3823-7.

71. Goldman CK, Rogers BE, Douglas JT, Sosnowski BA, Ying W, Siegal GP, Baird A, Campain JA and Curiel DT (1997). Targeted gene delivery to Kaposi's sarcoma cells via the fibroblast growth factor receptor. Cancer Res. 57: 1447-51.

72. Gonzalez R, Vereecque R, Wickham TJ, Vanrumbeke M, Kovesdi I, Bauters F, Fenaux P and Quesnel В (1999). Increased gene transfer in acute myeloid leukemic cells by an adenovirus vector containing a modified fiber protein. Gene Ther. 6: 314-20.

73. Goossens PH, Havenga MJ, Pieterman E, Lemckert AA, Breedveld FC, Bout A and Huizinga TW (2001). Infection efficiency of type 5 adenoviral vectors in synovial tissue can be enhanced with a type 16 fiber. Arthritis Rheum. 44: 570-7.

74. Grable M and Hearing P (1992). cis and trans requirements for the selective packaging of adenovirus type 5 DNA. J Virol. 66: 723-31.

75. Graham FL, Smiley J, Russell WC and Nairn R (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol. 36: 5974.

76. Grand RJ (1987). The structure and functions of the adenovirus early region 1 proteins. BiochenvJ. 241: 25-38.

77. Greber UF, Willetts M, Webster P and Helenius A (1993). Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell. 75: 477-86.

78. Greber UF and Fassati A (2003). Nuclear import of viral DNA genomes. Traffic. 4: 136-43.

79. Green NM, Wrigley NG, Russell WC, Martin SR and McLachlan AD (1983). Evidence for a repeating cross-beta sheet structure in the adenovirus fibre. Embo J. 2: 1357-65.

80. Haisma HJ, Grill J, Curiel DT, Hoogeland S, van Beusechem VW, Pinedo HM and Gerritsen WR (2000). Targeting of adenoviral vectors through a bispecific single-chain antibody. Cancer Gene Ther. 7: 901-4.

81. Hakkarainen T, Hemminki A, Pereboev AV, Barker SD, Asiedu CK, Strong TV, Kanerva A, Wahlfors J and Curiel DT (2003). CD40 is expressed on ovarian cancer cells and can be utilized for targeting adenoviruses. Clin Cancer Res. 9: 619-24.

82. Halbert DN, Cutt JR and Shenk T (1985). Adenovirus early region 4 encodes functions required for efficient DNA replication, late gene expression, and host cell shutofF. J Virol. 56: 250-7.

83. Hamid O, Varterasian ML, Wadler S, Hecht JR, Benson A, 3rd, Galanis E, Uprichard M, Omer C, Bycott P, Hackman RC and Shields AF (2003). Phase II trialof intravenous CI-1042 in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol.21: 1498-504.

84. Hammarskjold ML and Winberg G (1980). Encapsidation of adenovirus 16 DNA is directed by a small DNA sequence at the left end of the genome. Cell. 20: 787-95.

85. Harari OA, Wickham TJ, Stocker CJ, Kovesdi I, Segal DM, Huehns ТУ, Sarraf С and Haskard DO (1999). Targeting an adenoviral gene vector to cytokine-activated vascular endothelium via E-selectin. Gene Ther. 6: 801-7.

86. Hasson ТВ, Soloway PD, Ornelles DA, Doerfler W and Shenk T (1989). Adenovirus LI 52- and 55-kilodalton proteins are required for assembly of virions. J4 Virol. 63: 3612-21.

87. Hasson ТВ, Ornelles DA and Shenk T (1992). Adenovirus LI 52- and 55-kilodalton proteins are present within assembling virions and colocalize with nuclear structures distinct from replication centers. J Virol. 66: 6133-42.

88. Havenga MJ, Vogels R, Bout A and Mehtali M (2002). Pseudotyping of adenoviral vectors. Vector Targeting for Therapeutic Gene Delivery. Edited by Curiel D.T. and Douglas J.T.: 89-121.

89. Hayashi K, Hayashi M, Jalkanen M, Firestone JH, Trelstad RL and Bernfield M (1987). Immunocytochemistry of cell surface heparan sulfate proteoglycan in mouse tissues. A light and electron microscopic study. J Histochem Cvtochem. 35: 107988.

90. Hayes BW, Telling GC, Myat MM, Williams JF and Flint SJ (1990). The adenovirus L4 100-kilodalton protein is necessary for efficient translation of viral late mRNA species. J Virol. 64: 2732-42.

91. Hearing P, Samulski RJ, Wishart WL and Shenk T (1987). Identification of a repeated sequence element required for efficient encapsidation of the adenovirus type 5 chromosome. J Virol. 61: 2555-8.

92. Hemminki A, Dmitriev I, Liu B, Desmond RA, Alemany R and Curiel DT (2001). Targeting oncolytic adenoviral agents to the epidermal growth factor pathway with a secretory fusion molecule. Cancer Res. 61: 6377-81.

93. Hennache В and Boulanger P (1977). Biochemical study of KB-cell receptor for adenovirus. Biochem J. 166: 237-47.

94. Henry LJ, Xia D, Wilke ME, Deisenhofer J and Gerard RD (1994). Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber protein expressed in Escherichia coli. J Virol. 68: 5239-46.

95. Herz J and Gerard RD (1993). Adenovirus-mediated transfer of low density lipoprotein receptor gene acutely accelerates cholesterol clearance in normal mice. Proc Natl Acad Sci USA. 90: 2812-6.

96. Hirano A, Longo DL, Taub DD, Ferris DK, Young LS, Eliopoulos AG, Agathanggelou A, Cullen N, Macartney J, Fanslow WC and Murphy WJ (1999). Inhibition of human breast carcinoma growth by a soluble recombinant human CD40 ligand. Blood. 93: 2999-3007.

97. Hong JS and Engler JA (1991). The amino terminus of the adenovirus fiber protein encodes the nuclear localization signal. Virology. 185: 758-67.

98. Hong JS and Engler JA (1996). Domains required for assembly of adenovirus type 2 fiber trimers. J Virol. 70: 7071-8.

99. Hong SS and Boulanger P (1995). Protein ligands of the human adenovirus type 2 outer capsid identified by biopanning of a phage-displayed peptide library on separate domains of wild-type and mutant penton capsomers. Embo J. 14: 4714-27.

100. Hong SS, Karayan L, Tournier J, Curiel DT and Boulanger PA (1997). Adenovirus type 5 fiber knob binds to MHC class I alpha2 domain at the surface of human epithelial and В lymphoblastoid cells. Embo J. 16: 2294-306.

101. Hong SS, Galaup A, Peytavi R, Chazal N and Boulanger P (1999). Enhancement of adenovirus-mediated gene delivery by use of an oligopeptide with dual binding specificity. Hum Gene Ther. 10: 2577-86.

102. Home RW (1979). The formation of virus crystalline and paracrystalline arrays for electron microscopy and image analysis. Adv Virus Res. 24: 173-221.

103. Howe JA, Mymryk JS, Egan C, Branton PE and Bayley ST (1990). Retinoblastoma growth suppressor and a 300-kDa protein appear to regulate cellular DNA synthesis. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 5883-7.

104. Huang S, Endo RI and Nemerow GR (1995). Upregulation of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 on human monocytes and T lymphocytes facilitates adenovirus-mediated gene delivery. J Virol. 69: 2257-63.

105. Huang S, Kamata T, Takada Y, Ruggeri ZM and Nemerow GR (1996). Adenovirus interaction with distinct integrins mediates separate events in cell entry and gene delivery to hematopoietic cells. J Virol. 70: 4502-8.

106. Huang S, Reddy V, Dasgupta N and Nemerow GR (1999). A single amino acid in the adenovirus type 37 fiber confers binding to human conjunctival cells. J Virol. 73: 2798-802.

107. Huard J, Lochmuller H, Acsadi G, Jani A, Massie В and Karpati G (1995). The route of administration is a major determinant of the transduction efficiency of rat tissues by adenoviral recombinants. Gene Ther. 2: 107-15.

108. Hynes RO (1992). Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. СеП. 69: 11-25.

109. Israel BF, Pickles RJ, Segal DM, Gerard RD and Kenney SC (2001). Enhancement of adenovirus vector entry into CD70-positive B-cell Lines by using a bispecific CD70-adenovirus fiber antibody. J Virol. 75: 5215-21.

110. Jakobson E, Jonsson G, Bjorck P and Paulie S (1998). Stimulation of CD40 in human bladder carcinoma cells inhibits anti-Fas/APO-1 (CD95)-induced apoptosis. Int J Cancer. 77: 849-53.

111. Jones N and Shenk T (1979). An adenovirus type 5 early gene function regulates expression of other early viral genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 76: 3665-9.

112. Jooss K, Yang Y and Wilson JM (1996). Cyclophosphamide diminishes inflammation and prolongs transgene expression following delivery of adenoviral vectors to mouse liver and lung. Hum Gene Ther. 7: 1555-66.

113. Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, Pennington SE, Shankara S, Woodworth LA and Roberts BL (1999). Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducedwith adenovirus vector-encoding endogenous tumor-associated antigens. I Immunol. 163: 699-707.

114. Karpusas M, Hsu YM, Wang JH, Thompson J, Lederman S, Chess L and Thomas D (1995). 2 A crystal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand. Structure. 3: 1426.

115. Kass-Eisler A, Falck-Pedersen E, Elfenbein DH, Alvira M, Buttrick PM and Leinwand LA (1994). The impact of developmental stage, route of administration and the immune system on adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 1: 395402.

116. Kim M, Sumerel LA, Belousova N, Lyons GR, Carey DE, Krasnykh V and Douglas JT (2003). The coxsackievirus and adenovirus receptor acts as a tumour suppressor in malignant glioma cells. Br J Cancer. 88: 1411-6.

117. Kleeff J, Fukahi K, Lopez ME, Friess H, Buchler MW, Sosnowski BA and Korc M (2002). Targeting of suicide gene delivery in pancreatic cancer cells via FGF receptors. Cancer Gene Ther. 9: 522-32.

118. Korokhov N, Mikheeva G, Krendelshchikov A, Belousova N, Simonenko V, Krendelshchikova V, Pereboev A, Kotov A, Kotova O, Triozzi PL, Aldrich WA, Curiel DT and Krasnykh V (2003). Ad vectors modified with domain С of Staphylococcus Protein A. J Virol.

119. Krasnykh V, Dmitriev I, Mikheeva G, Miller CR, Belousova N and Curiel DT1998). Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob. J Virol. 72: 1844-52.

120. Krasnykh VN, Mikheeva GV, Douglas JT and Curiel DT (1996). Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. J Virol. 70: 6839-46.

121. Kreda SM, Pickles RJ, Lazarowski ER and Boucher RC (2000). G-protein-coupled receptors as targets for gene transfer vectors using natural small-molecule ligands. Nat Biotechnol. 18: 635-40.

122. Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-5.

123. Lamont JP, Nemunaitis J, Kuhn JA, Landers SA and McCarty TM (2000). A prospective phase II trial of ONYX-O15 adenovirus and chemotherapy in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck (the Baylor experience). Ann Surg Oncol. 7: 588-92.

124. Lanuti M, Kouri CE, Force S, Chang M, Amin K, Xu K, Blair I, Kaiser L and Albelda S (1999). Use of protamine to augment adenovirus-mediated cancer gene therapy. Gene Ther. 6: 1600-10.

125. Law LK and Davidson BL (2002). Adenovirus serotype 30 fiber does not mediate transduction via the coxsackie-adenovirus receptor. J Virol. 76: 656-61.

126. Legrand V, Spehner D, Schlesinger Y, Settelen N, Pavirani A and Mehtali M1999). Fiberless recombinant adenoviruses: virus maturation and infectivity in the absence of fiber. J Virol. 73: 907-19.

127. Legrand V, Leissner P, Winter A, Mehtali M and Lusky M (2002). Transductional targeting with recombinant adenovirus vectors. Curr Gene Ther. 2: 323-39.

128. Leissner P, Legrand V, Schlesinger Y, Hadji DA, van Raaij M, Cusack S, Pavirani A and Mehtali M (2001). Influence of adenoviral fiber mutations on viral encapsidation, infectivity and in vivo tropism. Gene Ther. 8: 49-57.

129. Leon RP, Hedlund T, Meech SJ, Li S, Schaack J, Hunger SP, Duke RC and DeGregori J (1998). Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 13159-64.

130. Leopold PL, Ferris B, Grinberg I, Worgall S, Hackett NR and Crystal RG (1998). Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum Gene Ther. 9: 367-78.

131. Letarov AV, Londer YY, Boudko SP and Mesyanzhinov W (1999). The carboxy-terminal domain initiates trimerization of bacteriophage T4 fibritin. Biochemistry (Mosc). 64: 817-23.

132. Li E, Stupack D, Bokoch GM and Nemerow GR (1998). Adenovirus endocytosis requires actin cytoskeleton reorganization mediated by Rho family GTPases. J Virol. 72: 8806-12.

133. Li E, Stupack D, Klemke R, Cheresh DA and Nemerow GR (1998). Adenovirus endocytosis via alpha(v) integrins requires phosphoinositide-3-ОН kinase. J Virol. 72: 2055-61.

134. Li E, Brown SL, Von Seggern DJ, Brown GB and Nemerow GR (2000). Signaling antibodies complexed with adenovirus circumvent CAR and integrin interactions and improve gene delivery. Gene Ther. 7: 1593-9.

135. Li Y, Pong RC, Bergelson JM, Hall MC, Sagalowsky Al, Tseng CP, Wang Z and Hsieh JT (1999). Loss of adenoviral receptor expression in human bladder cancer cells: a potential impact on the efficacy of gene therapy. Cancer Res. 59: 325-30.

136. Lieber A, He CY, Meuse L, Schowalter D, Kirillova I, Winther В and Kay MA (1997). The role of Kupffer cell activation and viral gene expression in early liver toxicity after infusion of recombinant adenovirus vectors. J Virol. 71: 8798-807.

137. Louis N, Fender P, Barge A, Kitts P and Chroboczek J (1994). Cell-binding domain of adenovirus serotype 2 fiber. J Virol. 68: 4104-6.

138. Lozier JN, Metzger ME, Donahue RE and Morgan RA (1999). Adenovirus-mediated expression of human coagulation factor IX in the rhesus macaque is associated with dose-limiting toxicity. Blood. 94: 3968-75.

139. Lutz P, Rosa-Calatrava M and Kedinger С (1997). The product of the adenovirus intermediate gene IX is a transcriptional activator. J Virol. 71: 5102-9.

140. Magnusson MK, Hong SS, Boulanger P and Lindholm L (2001). Genetic retargeting of adenovirus: novel strategy employing "deknobbing" of the fiber. J Virol. 75: 7280-9.

141. Maizel JV, Jr., White DO and Scharff MD (1968). The polypeptides of adenovirus. II. Soluble proteins, cores, top components and the structure of the virion. Virology. 36: 126-36.

142. Maizel JV, Jr., White DO and Scharff MD (1968). The polypeptides of adenovirus. I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12. Virology. 36: 115-25.

143. Mangel WF, McGrath WJ, Toledo DL and Anderson CW (1993). Viral DNA and a viral peptide can act as cofactors of adenovirus virion proteinase activity. Nature. 361: 274-5.

144. Maran A and Mathews MB (1988). Characterization of the double-stranded RNA implicated in the inhibition of protein synthesis in cells infected with a mutant adenovirus defective for VA RNA. Virology. 164: 106-13.

145. Mathias P, Wickham T, Moore M and Nemerow G (1994). Multiple adenovirus serotypes use alpha v integrins for infection. J Virol. 68: 6811-4.

146. Mathias P, Galleno M and Nemerow GR (1998). Interactions of soluble recombinant integrin alphav beta5 with human adenoviruses. J Virol. 72: 8669-75.

147. McDonald D, Stockwin L, Matzow T, Blair Zajdel ME and Blair GE (1999).

148. Coxsackie and adenovirus receptor (CAR)-dependent and major histocompatibility complex (MHC) class I-independent uptake of recombinant adenoviruses into human tumour cells. Gene Ther. 6: 1512-9.

149. McDonald GA, Zhu G, Li Y, Kovesdi I, Wickham TJ and Sukhatme VP (1999). Efficient adenoviral gene transfer to kidney cortical vasculature utilizing a fiber modified vector. J Gene Med. 1: 103-10.

150. Michael SI, Hong JS, Curiel DT and Engler JA (1995). Addition of a short peptide ligand to the adenovirus fiber protein. Gene Ther. 2: 660-8.

151. Miroshnikov KA, Marusich EI, Cerritelli ME, Cheng N, Hyde CC, Steven AC and Mesyanzhinov W (1998). Engineering trimeric fibrous proteins based on bacteriophage T4 adhesins. Protein Eng. 11: 329-32.

152. Mitraki A, Barge A, Chroboczek J, Andrieu JP, Gagnon J and Ruigrok RW1999). Unfolding studies of human adenovirus type 2 fibre trimers. Evidence for a stable domain. Eur J Biochem. 264: 599-606.

153. Mittal SK, McDermott MR, Johnson DC, Prevec L and Graham FL (1993). Monitoring foreign gene expression by a human adenovirus-based vector using the firefly luciferase gene as a reporter. Virus Res. 28: 67-90.

154. Miyazawa N, Leopold PL, Hackett NR, Ferris B, Woigall S, Falck-Pedersen E and Crystal RG (1999). Fiber swap between adenovirus subgroups В and С alters intracellular trafficking of adenovirus gene transfer vectors. J Virol. 73: 6056-65.

155. Miyazawa N, Crystal RG and Leopold PL (2001). Adenovirus serotype 7 retention in a late endosomal compartment prior to cytosol escape is modulated by fiber protein. J Virol. 75: 1387-400.

156. Mizuguchi H, Koizumi N, Hosono T, Utoguchi N, Watanabe Y, Kay MA and Hayakawa T (2001). A simplified system for constructing recombinant adenoviral vectors containing heterologous peptides in the HI loop of their fiber knob. Gene Ther. 8: 730-5.

157. Morris AE, Remmele RL, Jr., Klinke R, Macduff BM, Fanslow WC and Armitage RJ (1999). Incorporation of an isoleucine zipper motif enhances the biological activity of soluble CD40L (CD154). J Biol Chem. 274: 418-23.

158. Mullis KG, Haltiwanger RS, Hart GW, Marchase RB and Engler JA (1990). Relative accessibility of N-acetylglucosamine in trimers of the adenovirus types 2 and 5 fiber proteins. J Virol. 64: 5317-23.

159. Nagata K, Guggenheimer RA and Hurwitz J (1983). Adenovirus DNA replication in vitro: synthesis of full-length DNA with purified proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 80: 4266-70.

160. Neill SD, Hemstrom C, Virtanen A and Nevins JR (1990). An adenovirus E4 gene product trans-activates E2 transcription and stimulates stable E2F binding through a direct association with E2F. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2008-12.

161. Nemerow GR and Stewart PL (1999). Role of alpha(v) integrins in adenovirus cell entry and gene delivery. Microbiol Mol Biol Rev. 63: 725-34.

162. Nemerow GR (2000). Cell receptors involved in adenovirus entry. Virology. 274: 1-4.

163. Neumann R, Chroboczek J and Jacrot В (1988). Determination of the nucleotide sequence for the penton-base gene of human adenovirus type 5. Gene. 69: 153-7.

164. Nicklin SA, White SJ, Watkins SJ, Hawkins RE and Baker AH (2000). Selectivetargeting of gene transfer to vascular endothelial cells by use of peptides isolated by phage display. Circulation. 102: 231-7.

165. Norrby E, Bartha A, Boulanger P, Dreizin RS, Ginsberg HS, Kalter SS, Kawamura H, Rowe WP, Russell WC, Schlesinger W and Wigand R (1976). Adenoviridae. Intervirology. 7: 117-25.

166. Novelli A and Boulanger PA (1991). Deletion analysis of functional domains in baculovirus-expressed adenovirus type 2 fiber. Virology. 185: 365-76.

167. Novelli A and Boulanger PA (1991). Assembly of adenovirus type 2 fibersynthesized in cell-free translation system. J Biol Chem. 266: 9299-303.

168. O'Riordan CR, Lachapelle A, Delgado C, Parkes V, Wadsworth SC, Smith AE and Francis GE (1999). PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Hum Gene Ther. 10: 1349-58.

169. Pasqualini R, Koivunen E and Ruoslahti E (1995). A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins. J Cell Biol. 130: 1189-96.

170. Pasqualini R, Koivunen E, Kain R, Lahdenranta J, Sakamoto M, Stryhn A, Ashmun RA, Shapiro LH, Arap W and Ruoslahti E (2000). Aminopeptidase N is areceptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 60: 722-7.

171. Pastore L, Morral N, Zhou H, Garcia R, Parks RJ, Kochanek S, Graham FL, Lee В and Beaudet AL (1999). Use of a liver-specific promoter reduces immune response to the transgene in adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10: 1773-81.

172. Philipson L, Lonberg-Holm К and Pettersson U (1968). Virus-receptor interaction in an adenovirus system. J Virol. 2: 1064-75.A

173. Philipson L (1984). Structure and assembly of adenoviruses. Curr Top Microbiol Immunol. 109: 1-52.

174. Rea D, Schagen FH, Hoeben RC, Mehtali M, Havenga MJ, Toes RE, Melief CJ and Offringa R (1999). Adenoviruses activate human dendritic cells without polarization toward aT-helpertype 1-inducing subset. J Virol. 73: 10245-53.

175. Rea D, Havenga MJ, van Den Assem M, Sutmuller RP, Lemckert A, Hoeben RC,

176. Rekosh DM, Russell WC, Bellet AJ and Robinson AJ (1977). Identification of a protein linked to the ends of adenovirus DNA. Cell. 11: 283-95.

177. Reubi JC, Laderach U, Waser B, Gebbers JO, Robberecht P and Laissue JA (2000). Vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor subtypes in human tumors and their tissues of origin. Cancer Res. 60: 3105-12.

178. Reynolds PN and Curiel DT (1998). Viral vectors show promise in Colorado. Nat Biotechnol. 16: 422-3.

179. Richards JL, Abend JR, Miller ML, Chakraborty-Sett S, Dewhurst S and Whetter LE (2003). A peptide containing a novel FPGN CD40-binding sequence enhances adenoviral infection of murine and human dendritic cells. Eur J Biochem. 270: 2287-94.

180. Rodriguez-Viciana P, Warne PH, Khwaja A, Marte BM, Pappin D, Das P, Waterfield MD, Ridley A and Downward J (1997). Role of phosphoinositide 3-OH kinase in cell transformation and control of the actin cytoskeleton by Ras. Cell. 89: 457-67.

181. Roelvink PW, Kovesdi I and Wickham TJ (1996). Comparative analysis of adenovirus fiber-cell interaction: adenovirus type 2 (Ad2) and Ad9 utilize the same cellular fiber receptor but use different binding strategies for attachment. J Virol. 70:7614-21.

182. Roelvink PW, Mi Lee G, Einfeld DA, Kovesdi I and Wickham TJ (1999). Identification of a conserved receptor-binding site on the fiber proteins of CAR-recognizing adenoviridae. Science. 286: 1568-71.

183. Rogers BE, Douglas JT, Ahlem C, Buchsbaum DJ, Frincke J and Curiel DT (1997). Use of a novel cross-linking method to modify adenovirus tropism. Gene Ther. 4: 1387-92.

184. Romanczuk H, Galer CE, Zabner J, Barsomian G, Wadsworth SC and O'Riordan CR (1999). Modification of an adenoviral vector with biologically selected peptides: a novel strategy for gene delivery to cells of choice. Hum Gene Ther. 10: 2615-26.

185. Rosa-Calatrava M, Grave L, Puvion-Dutilleul F, Chatton В and Kedinger С (2001). Functional analysis of adenovirus protein IX identifies domains involved in capsid stability, transcriptional activity, and nuclear reorganization. J Virol. 75: 7131-41.

186. Ruigrok RW, Barge A, Albiges-Rizo С and Dayan S (1990). Structure of adenovirus fibre. II. Morphology of single fibres. J Mol Biol. 215: 589-96.

187. Ruoslahti E and Pierschbacher MD (1987). New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238: 491-7.

188. Rux JJ and Burnett RM (2000). Type-specific epitope locations revealed by X-ray crystallographic study of adenovirus type 5 hexon. Mol Ther. 1: 18-30.

189. Santis G, Legrand V, Hong SS, Davison E, Kirby I, Imler JL, Finberg RW, Bergelson JM, Mehtali M and Boulanger P (1999). Molecular determinants of adenovirus serotype 5 fibre binding to its cellular receptor CAR. J Gen Virol. 80: 1519-27.

190. Saphire AC, Guan T, Schirmer EC, Nemerow GR and Gerace L (2000). Nuclear import of adenovirus DNA in vitro involves the nuclear protein import pathway and hsc70. J Biol Chem. 275: 4298-304.

191. Sarnow P, Ho YS, Williams J and Levine AJ (1982). Adenovirus Elb-58kd tumor antigen and SV40 large tumor antigen are physically associated with the same 54 kd cellular protein in transformed cells. Cell. 28: 387-94.

192. Savill J, Dransfield I, Hogg N and Haslett С (1990). Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343: 170-3.

193. Scaria A, Tollefson AE, Saha SK and Wold WS (1992). The ЕЗ-11.6K protein of adenovirus is an Asn-glycosylated integral membrane protein that localizes to the nuclear membrane. Virology. 191: 743-53.

194. Schmidt MR, Piekos B, Cabatingan MS and Woodland RT (2000). Expression of a human coxsackie/adenovirus receptor transgene permits adenovirus infection of primary lymphocytes. J Immunol. 165: 4112-9.

195. Schoehn G, Fender P, Chroboczek J and Hewat EA (1996). Adenovirus 3 penton dodecahedron exhibits structural changes of the base on fibre binding. Embo J. 15: 6841-6.

196. Segerman A, Mei YF and Wadell G (2000). Adenovirus types 1 lp and 35p show high binding efficiencies for committed hematopoietic cell lines and are infective to these cell lines. J Virol. 74: 1457-67.

197. Shayakhmetov DM and Lieber A (2000). Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain. J Virol. 74: 10274-86.

198. Shayakhmetov DM, Papayannopoulou T, Stamatoyannopoulos G and Lieber A (2000). Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. J Virol. 74: 2567-83.

199. Shayakhmetov DM, Carlson CA, Stecher H, Li Q, Stamatoyannopoulos G and Lieber A (2002). A high-capacity, capsid-modified hybrid adenovirus/adeno-associated virus vector for stable transduction of human hematopoietic cells. J Virol. 76:1135-43.

200. Shayakhmetov DM, Ni S, Gaggar A, Belousova N, Krasnykh V, Lieber A (2003). Binding of adenovirus fiber knob to blood coagulation factors mediates CAR-independent liver tropism. Nat Biotechnol.

201. Shenk T and Flint J (1991). Transcriptional and transforming activities of the adenovirus E1A proteins. Adv Cancer Res. 57: 47-85.

202. Shimizu H, Mitomo K, Watanabe T, Okamoto S and Yamamoto К (1990). Involvement of a NF-kappa B-like transcription factor in the activation of the interleukin-6 gene by inflammatory lymphokines. Mol Cell Biol. 10: 561-8.

203. Shinoura N, Yoshida Y, Tsunoda R, Ohashi M, Zhang W, Asai A, Kirino T and Hamada H (1999). Highly augmented cytopathic effect of a fiber-mutant EIB-defective adenovirus for gene therapy of gliomas. Cancer Res. 59: 3411-6.

204. Shinoura N, Sakurai S, Asai A, Kirino T and Hamada H (2000). Transduction of a fiber-mutant adenovirus for the HSVtk gene highly augments the cytopathic effect towards gliomas. Jpn J Cancer Res. 91: 1028-34.

205. Signas C, Akusjarvi G and Pettersson U (1985). Adenovirus 3 fiber polypeptide gene: implications for the structure of the fiber protein. J Virol. 53: 672-8.

206. Skog J, Mei YF and Wadell G (2002). Human adenovirus serotypes 4p and 1 lp are efficiently expressed in cell lines of neural tumour origin. J Gen Virol. 83: 1299309.

207. Smith JS, Keller JR, Lohrey NC, McCauslin CS, Ortiz M, Cowan К and Spence SE (1999). Redirected infection of directly biotinylated recombinant adenovirus vectors through cell surface receptors and antigens. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 8855-60.

208. Smith ТА, Idamakanti N, Rollence ML, Marshall-Neff J, Kim J, Mulgrew K, Nemerow GR, Kaleko M and Stevenson SC (2003). Adenovirus serotype 5 fiber shaft influences in vivo gene transfer in mice. Hum Gene Ther. 14: 777-87.

209. Stephenson J (2001). Studies illuminate cause of fatal reaction in gene-therapy trial. Jama. 285: 2570.

210. Stevenson SC, Rollence M, White B, Weaver L and McClelland A (1995). Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to two different cellular receptors via the fiber head domain. J Virol. 69: 2850-7.

211. Stevenson SC, Rollence M, Marshall-Neff J and McClelland A (1997). Selective targeting of human cells by a chimeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. J Virol. 71: 4782-90.

212. Stewart PL, Burnett RM, Cyrklaff M and Fuller SD (1991). Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67: 145-54.

213. Stewart PL and Burnett RM (1995). Adenovirus structure by X-ray crystallography and electron microscopy. CurrTop Microbiol Immunol. 199: 25-38.

214. Stewart PL, Chiu CY, Huang S, Muir T, Zhao Y, Chait B, Mathias P and Nemerow GR (1997). Cryo-EM visualization of an exposed RGD epitope on adenovirus that escapes antibody neutralization. Embo J. 16: 1189-98.

215. Stillman BW, Lewis JB, Chow LT, Mathews MB and Smart JE (1981). Identification of the gene and mRNA for the adenovirus terminal protein precursor. Cell. 23: 497-508.

216. Su L, Garber EA and Hsu YM (2001). CD 154 variant lacking tumor necrosis factor homologous domain inhibits cell surface expression of wild-type protein. J Biol Chem. 276: 1673-6.

217. Svensson U, Persson R and Everitt E (1981). Virus-receptor interaction in the adenovirus system I. Identification of virion attachment proteins of the HeLa cell plasma membrane. J Virol. 38: 70-81.

218. Tao N, Gao GP, Parr M, Johnston J, Baradet T, Wilson JM, Barsoum J and Fawell SE (2001). Sequestration of adenoviral vector by Kupffer cells leads to a nonlinear dose response of transduction in liver. Mol Ther. 3: 28-35.

219. Tao Y, Strelkov SV, Mesyanzhinov W and Rossmann MG (1997). Structure of bacteriophage T4 fibritin: a segmented coiled coil and the role of the C-terminal domain. Structure. 5: 789-98.

220. Thoelen I, Keyaerts E, Lindberg M and Van Ranst M (2001). Characterization of a cDNA encoding the bovine coxsackie and adenovirus receptor. Biochem Biophvs Res Commun. 288: 805-8.

221. Tibbetts С (1977). Viral DNA sequences from incomplete particles of human adenovirus type 7. Cell. 12: 243-9.

222. Tillman BW, de Gruijl TD, Luykx-de Bakker SA, Scheper RJ, Pinedo HM, Curiel TJ, Gerritsen WR and Curiel DT (1999). Maturation of dendritic cells accompanieshigh-efficiency gene transfer by a CD40-targeted adenoviral vector. J Immunol. 162: 6378-83.

223. Tollefson AE, Hermiston TW, Lichtenstein DL, Colle CF, Tripp RA, Dimitrov T, Toth K, Wells CE, Doherty PC and Wold WS (1998). Forced degradation of Fas inhibits apoptosis in adenovirus-infected cells. Nature. 392: 726-30.

224. Tomko RP, Xu R and Philipson L (1997). HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup С adenoviruses and group В coxsackieviruses. Proc Natl Acad Sci USA. 94: 3352-6.

225. Trepel M, Grifman M, Weitzman MD and Pasqualini R (2000). Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery. Hum Gene Ther. 11: 197181.

226. Vigne E, Mahfouz I, Dedieu JF, Brie A, Perricaudet M and Yeh P (1999). RGD inclusion in the hexon monomer provides adenovirus type 5-based vectors with a fiber knob-independent pathway for infection. J Virol. 73: 5156-61.

227. Von Seggern DJ, Kehler J, Endo RI and Nemerow GR (1998). Complementation of a fibre mutant adenovirus by packaging cell lines stably expressing the adenovirus type 5 fibre protein. J Gen Virol. 79: 1461-8.

228. Von Seggern DJ, Chiu CY, Fleck SK, Stewart PL and Nemerow GR (1999). A helper-independent adenovirus vector with El, E3, and fiber deleted: structure and infectivity of fiberless particles. J Virol. 73: 1601-8.

229. Von Seggern DJ, Huang S, Fleck SK, Stevenson SC and Nemerow GR (2000). Adenovirus vector pseudotyping in fiber-expressing cell lines: improved transduction of Epstein-Barr virus-transformed В cells. J Virol. 74: 354-62.

230. Walters RW, Grunst T, Bergelson JM, Finberg RW, Welsh MJ and Zabner J (1999). Basolateral localization of fiber receptors limits adenovirus infection from the apical surface of airway epithelia. J Biol Chem. 274: 10219-26.

231. Walters RW, Freimuth P, Moninger TO, Ganske I, Zabner J and Welsh MJ (2002). Adenovirus fiber disrupts CAR-mediated intercellular adhesion allowing virus escape. СеЦ. 110: 789-99.

232. Wang К, Guan T, Cheresh DA and Nemerow GR (2000). Regulation of adenovirus membrane penetration by the cytoplasmic tail of integrin beta5. J Virol. 74: 2731-9.

233. Wang X and Bergelson JM (1999). Coxsackievirus and adenovirus receptor cytoplasmic and transmembrane domains are not essential for coxsackievirus and adenovirus infection. JVirol. 73: 2559-62.

234. Watkins SJ, Mesyanzhinov W, Kurochkina LP and Hawkins RE (1997). The 'adenobody' approach to viral targeting: specific and enhanced adenoviral gene delivery. Gene Ther. 4: 1004-12.

235. Weber JM, Dery CV, Mirza MA and Horvath J (1985). Adenovirus DNA synthesis is coupled to virus assembly. Virology. 140: 351-9.

236. Weber JM, Talbot BG and Delorme L (1989). The orientation of the adenovirus fiber and its anchor domain identified through molecular mimicry. Viroloev. 168: 180-2.

237. Webster A, Hay RT and Kemp G (1993). The adenovirus protease is activated by a virus-coded disulphide-linked peptide. Cell. 72: 97-104.

238. White E and Cipriani R (1989). Specific disruption of intermediate filaments and the nuclear lamina by the 19-kDa product of the adenovirus E1B oncogene. Proc Natl Acad Sci USA. 86: 9886-90.

239. Whyte P, Williamson NM and Harlow E (1989). Cellular targets for transformation by the adenovirus El A proteins. Cell. 56: 67-75.

240. Wickham TJ, Mathias P, Cheresh DA and Nemerow GR (1993). Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell. 73: 309-19.

241. Wickham TJ, Filardo EJ, Cheresh DA and Nemerow GR (1994). Integrin alpha v beta 5 selectively promotes adenovirus mediated cell membrane permeabilization. J Cell Biol. 127: 257-64.

242. Wickham TJ, Carrion ME and Kovesdi I (1995). Targeting of adenovirus penton base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. Gene Ther. 2: 750-6.

243. Wickham TJ, Roelvink PW, Brough DE and Kovesdi I (1996). Adenovirus targeted to heparan-containing receptors increases its gene delivery efficiency to multiple cell types. Nat Biotechnol. 14: 1570-3.

244. Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM and Kovesdi I (1996). Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. J Virol. 70: 6831-8.

245. Wickham TJ, Haskard D, Segal D and Kovesdi I (1997). Targeting endothelium for gene therapy via receptors up-regulated during angiogenesis and inflammation. Cancer Immunol Immunother. 45: 149-51.

246. Wickham TJ, Lee GM, Titus JA, Sconocchia G, Bakacs T, Kovesdi I and Segal DM (1997). Targeted adenovirus-mediated gene delivery to T cells via CD3. J Virol. 71: 7663-9.

247. Wickham TJ, Tzeng E, Shears LL, 2nd, Roelvink PW, Li Y, Lee GM, Brough DE, Lizonova A and Kovesdi I (1997). Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. J Virol. 71: 8221-9.

248. Wingett DG, Vestal RE, Forcier K, Hadjokas N and Nielson CP (1998). CD40 is functionally expressed on human breast carcinomas: variable inducibility by cytokines and enhancement of Fas-mediated apoptosis. Breast Cancer Res Treat. 50: 27-36.

249. Worgall S, Leopold PL, Wolff G, Ferris B, Van Roijen N and Crystal RG (1997). Role of alveolar macrophages in rapid elimination of adenovirus vectors administered to the epithelial surface of the respiratory tract. Hum Gene Ther. 8: 1675-84.

250. Worn A and Pluckthun A (1998). An intrinsically stable antibody scFv fragment can tolerate the loss of both disulfide bonds and fold correctly. FEBS Lett. 427: 357-61.

251. Wu E, Fernandez J, Fleck SK, Von Seggern DJ, Huang S and Nemerow GR (2001). A 50-kDa membrane protein mediates sialic acid-independent binding and infection of conjunctival cells by adenovirus type 37. Virology. 279: 78-89.

252. Xia D, Henry LJ, Gerard RD and Deisenhofer J (1994). Crystal structure of the receptor-binding domain of adenovirus type 5 fiber protein at 1.7 A resolution. Structure. 2: 1259-70.

253. Xia H, Anderson В, Mao Q and Davidson BL (2000). Recombinant human adenovirus: targeting to the human transferrin receptor improves gene transfer to brain microcapillary endothelium. J Virol. 74: 11359-66.

254. Yeh HY, Pieniazek N, Pieniazek D, Gelderblom H and Lufiig RB T1994). Human adenovirus type 41 contains two fibers. Virus Res. 33: 179-98.

255. Yoon SK, Mohr L, O'Riordan CR, Lachapelle A, Armentano D and Wands JR (2000). Targeting a recombinant adenovirus vector to HCC cells using a bifunctional Fab-antibody conjugate. Biochem Biophvs Res Commun. 272: 497504.

256. Yoshida Y, Sadata A, Zhang W, Saito K, Shinoura N and Hamada H (1998). Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma. Hum Gene Ther. 9: 2503-15.

257. Zabner J, Chillon M, Grunst T, Moninger TO, Davidson BL, Gregory R and Armentano D (1999). A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. J Virol. 73: 8689-95.

258. Zeng G (1998). Sticky-end PCR: new method for subcloning. Biotechniques. 25: 206-8.

259. Zhang LQ, Mei YF and Wadell G (2003). Human adenovirus serotypes 4 and 11 show higher binding affinity and infectivity for endothelial and carcinoma cell lines than serotype 5. J Gen Virol. 84: 687-95.

260. Zhang Y and Schneider RJ (1994). Adenovirus inhibition of cell translation facilitates release of virus particles and enhances degradation of the cytokeratin network. J Virol. 68: 2544-55.

261. Zinn KR, Douglas JT, Smyth CA, Liu HG, Wu Q, Krasnykh VN, Mountz JD, Curiel DT and Mountz JM (1998). Imaging and tissue biodistribution of 99mTc-labeled adenovirus knob (serotype 5). Gene Ther. 5: 798-808.

Информация о работе

Белоусова, Наталья Викторовна
кандидата биологических наук
Birmingham, 2003
ВАК 03.00.06

Диссертация

Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы