Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование гибридных белков, содержащих фрагменты антигенов вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование гибридных белков, содержащих фрагменты антигенов вируса гепатита В"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

МАКЕЕВА Ирина Викторовна

УДК 577.217.52

КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТЫ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1991

Работа выполнена в лаборатории химии вирусных нуклеиновых кисл I (1-е /¡ков Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Научные руководители: кандидат химических наук, руководитель лаборатории Смирнов В. Д. кандидат биологических наук Худяков 10. Е.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Зайдес В. М. кандидат биологических наук Лунин В. Г.

Ведущее учреждение: кафедра ш фусологии биологического факультета МГУ.

Защита состоится " М- 1991 г. в час

на заседании Специализированного Совета (Д 001.02.01) при Институте ви| солОгпи им Д. И. Ивановского АМН СССР по адресу: 123098, Москва, Д-! ул. Гамалеи, д. 16).

Автореферат разослан

и/СлгЗ- 1991 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусо; гни им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат медицинских наук А. М. Жуковский

" Актуальность темы. Создание методами белковой инженерии ис-

венных полипептидов с заранее заданными структурой и свойс-

. -.|.,1твгш открывает новые перспективы в моделировании вирусспецифичес-

^ тдел,

ссертЩЙЙ структур и исследовании подходов к созданию вакцинных препаратов. Решение этой задачи требует дальнейшего углубления существующих представлений о структурной организации вирусных белков и механизмах их синтеза в гетерологичных системах экспрессии генов.

В качестве объекта настоящего исследования выбран вирус гепа- . тита В человека (HBV), вызывающий распространенное тяжелое инфекционное заболевание, профилактика, диагностика и лечение которого является одной из острых проблем медицины. Внутренний антиген HBV представляет интерес с точки зрения использования его как белка-носителя для протективных детерминант из других белков HBV или других вирусов, т.к. он обладает высокой иммуногенностью , является как Т-зависимым, так и Г-независимым иммуногеном с относительно изученной структурой. Эффективная защита от HBV-инфекции может быть достигнута, как показывают последние работы С Neurath et al. , 1989; Emini et al., 1989], при вакцинации препаратами, содержащими детерминанты preS-области поверхностного антигена HBV. В нашей работе мы исследовали возможности объединения этих вирусспецифичес-ких структур в составе гибридного белка с использованием доступной и дешевой гетерологичной системы экспрессии генов в Е. coli.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка подходов к созданию методами белковой инженерии рекомбинантных белков с заранее заданными антигенными и иммуноген-ными свойствами с помощью бактериальной системы экспрессии генов,

используя в качестве модельного объекта вирус гепатита В.

Были поставлены следующие основные экспериментальные задачи:

1. Сконструировать векторы, обеспечивающие эффективную экспрессию в Е. coli гена белка нуклеокапсида вируса гепатита В.

Z. Выбрать участки полипептида внутреннего антигена HBV (HBcAg) для возможного встраивания чужеродных аминокислотных последовательностей без нарушения самосборки антигена в частицы и экспонирования этих последовательностей на поверхности белка.

3. Осуществить в Е. coli синтез гибридных белков на основе HBcAg, содержащих встроенные антигенные детерминанты preS-области поверхностного белка HBV, и исследовать их физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства.

Научная новизна работы Впервые созданы гибридные белки, в которых эпитопы, соответствующие участкам 31-36 а. к., 94-105 а. к. preSl области и 133-143 а. к. preS2 области HBV встроены в N-конец и в район 75-77 а. к. последовательности HBcAg. Создан рекомбинант-ный белок, содержащий две различные антигенные детерминанты из preS области HBV в составе одного гибридного белка на основе HBcAg. Белки эффективно экспрессируются в Е. coli, образуют частицы, что делает их высокоиммуногенными, обладают антигенностью, характерной как для нативного HBcAg, гак и для соответствующих фрагментов preS области HBV. Белки, содержащие эпитоп 31-36 а. к. preSI, взаимодействуют с моноклональными AT к preSl области HBV, что служит подтверждением проведенной ранее в нашей лаборатории локализации антигенной детерминанты в данном участке preSl области, а также свидетельствует о том ,чго детерминанта сохраняет на-тивную конформацию как при встраивании ее в N-конец, так и в район

70-05 а. к. HBcAg. При иммунизации зшвотных вырабатываются как анти -HBcAg антитела , так и антитела против встроенных детерминант. Это свидетельствует о том, что фрагменты preS области, введенные в выбранные нами участки бежа HBcAg, экспонированы на поверхности гибридных частиц.

Практическая ценность работы Сконструированы плазмиды, обеспечивающие продукцию белков, обладающих антигенной активностью как нативного HBcAg, так и фрагментов preS-области поверхностного белка HBV. Получены гибридные частицы НВсАг, которые могут быть использованы для проведения исследований, направленных на получение новых поколений безопасных и эффективных генно-инженерных вакцин, комбинирующих иммунологические протективные свойства белков оболочки и нуклеокапсида HBV. Разработана система встраивания и экспозиции различных антигенных детерминант на поверхности частиц HBcAg с целью исследования возможностей создания поливакцин на основе внутреннего антигена HBV как белка-носителя.

Положения, выносимые на защиту.

-- Создана плазмида, обеспечивающая в Е. coli эффективный (до 5Z) уровень синтеза HBcAg, образующего 27нм частицы.

-- Созданы гибридные белки, содержащие фрагменты 31-36, 94-105 preSl и 133-143 preS2 в N-конце и в середине последовательности HBcAg, экспонированные на поверхности частиц, образуемых большинством этих белков в Е.coli.

-- Полученные белки обладают антигенной активностью, характерной как для HBcAg, так и для соответствующих фрагментов preS-области поверхностного белка HBV.

-- Сконструированы плазмиды, содержащие искусственные двух-цистронные опероноподобные структуры, оба цистрона которых функционально активны в клетках Е. col i и обеспечивают эффективную экспрессию HBcAg и В-галактозидазы.

Структура работы. Диссертация изложена на 16? стр. машинописного текста, включая 29 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, общей части с обсуждением результатов, вьводов и списка цитируемой литературы (289 источников).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых " Структура и функции биополимеров" (Львов, 1989), Всесоюзной конференции молодых ученых "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990), Конкурсах молодых ученых в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского (1987, 1989), Международной конференции "Вирусные гепатиты" (Ростов Великий. 1990), 8-ом Международном вирусологическом конгрессе (Берлин, 1990), Болгаро-советском симпозиуме по вирусным инфекциям (Варна, 1990). По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

¡.Экспрессия HBcAg в клетках Е. coli.

При конструировании плазмиды, обеспечивающей экспрессию HBcAg, мы планировали создать двухцисгронную опероноподобную систему, использование которой позволяет кодировать в одной плазмиде разные белки или гетерологичные субъединицы одного белка. Это открывает возможность воспроизведения в прокариотах целых мультипеп-тидных комплексов. В качестве продукта второго цистрона можно использовать легко тестируемый белок, например, ^-галактовидазу. В таком случае, если создана сопряженная система трансляции цистро-нов, можно опосредованно судить об эффективности трансляции первого цистрона по уровню продукции второго, если непосредственный тест затруднен нестабильностью белка или низкой чувствительностью метода.

Создание конструкции, обеспечивающей экспрессию HBcAg в Е.coli, проводили в несколько этапов (рис.1). Из плазмиды рНВ320

R ._ul

Pit I

S ».H I.

ч

. a. t. M '"jgk&tt

, Ж рШ7)Г—«

1 Eco RI КГ|м>1М) 31 ТТСВПМССС

jtfwi»»f6.A)

тстаяг$ттс

ТССТССМСТТ Ы1

ЧсоЖ

V BxnHl

KfmowlC.Ä)

Pit I

Pm

6WtI,

СГДСТССССГ

'«•HI,

Ce«R|

ir( ft 4

Pit ГЦ "ÄrsНи« Pit f

¡tí» M

s.n«i/p«er f ^«lÛSixui

Xb.I

fco ("

Ъ ¡fbèl/Pitl

ftcRl

t&MNT

I Pi,r ■l'L».,

[Ci Ri

f"Hl ЙГ««

pit i

и

'Eco W

рис. 1 Схема конструирования опероноподобных структур pRCl7. pRC17H, PCRL2411.

[В^сЬко V. , еЬ а1, 1935] был взят фрагмент ХЬа1-ХЬа1, кодирующей участок НВсАд (31-183а. к.), и перенесен в плазмиду рММ23 [Скрипкин Е. А. и др. , 1937] под контроль сильного термоиндуцибельного Рц- промотора б/ф Л , вслед за которым расположена природная иници-аторная зона белка его б/ф Л и последовательность, кодирующая 7 N -концевых а. к-т этого белка. Наличие эффективной природной зоны инициации трансляции детерминирует гмеокий уровень синтеза гибридных белков. В полученной на первом этапе конструкции рССШ кодируется НВсА^, усеченный с Ы-конца на 30 а. к-т, не в фазе трансляции белка его (рис.2). Зону инициации трансляции второго цистрона создавали искусственно с использованием синтетических олигонуклео-тидов (синтезированы В. Д. Смирновым), содержащих 30-последовательность и инициаторный кодон АТ& Расположение инициаторного кодона второго цистрона в непосредственной близости к терминирующему ко-дону предшествующе г аиотрона (рис.2) создавало условия для реини-циации трансляции.

Ввиду того, что в конструкции рСС121 фазы трансляции его и НВсАе не совпадют и шх\пк ■ '--на его находится терминатор-

ный кодон , первый цистрин плазмиды рРС17 кодирует лишь короткий пептид (рис.2). Трансляцию последовательности, кодирующей НВсА®, можно обеспечить двумя способами. Могкно создать единую фазу сго-НВсАд (схема конструирования рНС17Н). Полученная плазмида кодирует НВсАе, значительно усеченный с И-конца (последовательность ■ концевой области первого цистрона р!?С17Н приведена на рис.2). Для обеспечения синтеза НВсА?, более приблюкенного к нативному по первичной структуре, использовали другой способ. Фрагмент из плазмиды рСС1224 [Худяков Ю. Е. и др., 19876], кодирующий И-концевую часть НВсАг, был встроен в рИС17 (рис.1). Первый цистрон полученной плазмиды рСИЬ2411 кодирует гибридный белок сго-НВсА?, в котором последовательность НВсАд отличается от нативной отсутствием

рис.2 5'-концевая часть мРНК плазмид ( SD-поеледовательность выделена чертой сверху,

инициатооный и терминаторный кодоны заключены в рамку): а) рСС121 и pRC17 SD

PamHI Hind III Xbal

5'ATG TAC TAA GGA GGT TGT |ATG|GAA CAA CGC ATA ACC TTG GGA TCC GGC CAA GCT TGG GTC TAG ATA ACQ CCT CAG ...

cro ( l-7a. к. ) HE.-'Ag ( 31-175a. к. )

6) pRC17H

SD

_ _, BamHI Xbal

5' ATG TAC TAA GGA G6T TGT !ÄTG]GAA CAA CGC ATA ACC TTG GGA TCC GGC CAA GCT AGC TTG GGT СТА GAT AAC GCC ...

его HBcAg (31-175a. к. ) i__ i_»_

з) pCRL2411

SD

BamHI

5'ATG TAC TAA GGA GGT TGT [ATGJGAA CAA CGC ATA ACC TTG GAT CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA

cro HBcAg (4-175 a. k. )

г) Первичная структура инициаторной зоны второго цистрона мРНК гибридных оперонов.

400 нукл. I цистрон II цистрон

SD

__EcoRI BamHI

5'......AGA ТСА GGA GGT ЩЩ ATTC ЩШ AGC GGA TCC GGA...

HBcAg в-галактозидаза

» _I 12---

д) 5-концевая часть мРНК плазмид pPSGR и pPSR SD

_ ______EcoRI .__ ВамН1

5'ATG TAC TAA GGA GGT TGT |ATG|GAA CAA CGC ATA ACC TTG GGA TCA GCA GGT fTGÂI ATTC |ÂTG|GCT GCG____

его гибридный белок

только трех N-кошевых и восьми С-концевых аминокислот (рис.2).

Методом э/ф белков в ПААГ и иммуноблоттингом (исследования

проводили совместно с Т.И.Калининой) показано, что плазмида

PÜRL2411 обеспечивает высокий уровень продукции в Е. coli HBc-airr*

гена с ожидаемой мол. массой 22 кД. В ИФА лизаты клеток проявляют

L г

специфическую антигенную активность при разведении в 5x10 -10 раз. Методом электронной микроскопии в ультратонких срезах клеток, содержащих эту плазмиду, (все электронно-микроскопические исследования проведены Ю. П. Кадошниковым) обнаружены структуры, схожие с 27 нм частицами, образуемыми нмивнда HBcAg в гепатоцитах человека. Частицы были очищены методом седиментации в градиенте концентрации сахарозы (рис. 3). С помощью иммуноэлектронной микроскопии показано, что они взаимодействуют .-с кроличьими и человеческими антителами против HBcAg. Ранее в нашей лаборатории была создана плазмида рСС1224, детерминирующая синтез гибридного белка cro-HBcAg, последовательность а. к-т в С-конце которого соответствует таковой для нативного соге-антигена. По первичной структуре HBcAg, кодируемый плазмидой pCRL2411, отличается только отсутствием восьми С-конце-вых а. к. Количество HBcAg в клетках, содержащих pCRL2411, составляло 5Z от суммарного клеточного белка, тогда как для белка , кодируемого плазмидой рСС1224 — примерно 1Z. По-видимому, удаление 3 а. к. с С-конца HBcAg способствует повышению его стабильности в клетках Е.coli. Что касается pRC17, то инициагорная зона ее второго цистрона отделена от терминирующего кодона первого протяженным нетранслируемым участком мРНК. Поэтому обнаружение в лизатах клеток, трансформированных этой плазмидой, белка с мол. массой 117 кД и регистрация ферментативной активности, достигающей 1000 ед. /мг белка (в лизатах клеток, не содержащих плазмиды, р-галактозидазная активность не выявлена) позволяет заключить, что в pRC17 создана зона свободной инициации трансляции второго цистрона.

рис. 3 Анализ фракций сахарозного градиента лизатов клеток, содержащих плазмиду рСЙ12411. а) Э/ф в ПААГ. Гель окрашен Кумаси синим; в) Результаты ИФА.

II. Гибридные белки, содержащие последовательности НВсАг и ргеБ-области вируса гепатита В. II. I. Гибридные белки, содержащие фрагменты ргеБ в М-конце последовательности НВсА?. 1) Конструирование и экспрессия.

В качестве антигенных детерминант для встраивания в НВсАг были выбраны участки, соответствующие 31-36 а. к. и 94-105 а. к. из рге31-области и 133-143 а. к. из ргеБ2-области этого вируса. Участки 94-105 а. к. и 133-143 а. к. были выбраны на основании ли-

тературных данных [Milieh D. R., et al, 1986b,с]. Расположение одной из антигенных детерминант preSl на участке 31-36 а. к. было установлено в нашей лаборатории [Евстигнеева Р. П. и др. ,1990]. Олигонуклеотиды, кодирующие эти эпитопы (синтезированы Ефимовой Е. А. и Самошиным В.В.), били введены в 5'-концевую часть последовательности, кодирующей HBcAg (рис.4 и 6). Для увеличения дозы введенной детерминанты в составе гибридного белка проводили полимеризацию олигонуклеотида, кодирующего участок 94-105 а. к. из preSl. В результате был получен белок, кодируемый плазмидой pPSlP-ЗО, содержащий тример этой детерминанты (рис.4 и 6).

Белки, кодируемые плазмидами pPSl-5, pPSlP-30, pPS31-42, PPS2-17, эффективно экспрессируютея и обладают ожидаемой мол. массой (анализ физико-химических и антигенных свойств гибридных белков проводили совместно с Т. И. Калининой). Лизаты клеток, содержащих эти плазмиды, при разведении в 1000-10000 раз взаимодействуют в ИФА с человеческими анти-HBcAg. Это свидетельствует о том , что полученные гибридные белки образуют частицы, в которых присутствует нативная детерминанта HBcAg. Для белка, содержащего тример детерминанты из preSl-области, НВс-антигенная активность, выявляемая в ИФА, была более низкой, что, очевидно, объясняется тем, что введение дополнительных 33а. к. в N-конец HBcAg затрудняет формирование правильной пространственной структуры, необходимой для проявления НВс-антигенной активности этого бежа Методом иммуноблот-тинга показано, что белок, кодируемый плазмидой pPS31-42, реагирует с AT к синтетическому пептиду, соответствующему 24-41 а. к. из preSl и с моноклональными антителами к preSl области, а белок, кодируемый плазмидой pPS2-17, реагирует с AT к синтетическому пепти-

ВняШ/ХЫ •олмгоиумеатиЭ

ВашН1 ХЪо1

5 сстбссттгазтсзс олсоаллеаслсвАйс 5

рРЗЗ!-42

РРЭ1-5

ВатШ ХЬо1

5 ССТССТТС'ГАСТААССОТСЛбТСТСбТСЗТСАеСС

6ЛСаАЛ6ЛТ0АТТВССЛаТСАСЛССЛСЗСА6ТС66А6С 5

рР31-101

ВшпН1 ХЬэ1

5 сстесттст АСТЛАСССТСАОТСТбОТСбТСАбСС

бАСаАЛВАТбЛТТбССАЗТСЛбЛССАБСАОТСЙбАбС 5

рРБ2-17

ВатШ ХИо1

5 ССТС6Т6ТТСПТВ6ТСТаТАСТТСССТ6С

в!\вСЛСГ\№САССШАС№ ОАЛебОАСОАБС 5

кодирует 31-36 а. к. из рге51

кодирует 94-105а. к. из ргеБ!

кодирует тример Фрагмента 94-105а. к. из ргеБ1

кодирует 133-143а. к. из ргеБ2

рис.4 Схема конструирования плазмид рР31-5, рР51Р-30, рР331-42, рР32-17. В таблице приведена структура олигонуклеотидов, отмеченных значком *.

рис. 5 Анализ антигенных свойств белка, кодируемого плазмидой рРБ2-17. Контроль — белок, кодируемый плазмидой рС1?Ь2411. а) Э/ф в ПААГ очищенных препаратов белков, кодируемых плаз-мидами: 1, 2, 6, 7-рРБ2-17; 3, 4, 8, 9-р(ЖЬ2411. Гель окрашен Кумаси синим, в) Иммуноблоттинг этих препаратов с ан-ти-НВсАд сыворотками (кроличьими) и сыворотками против пептида 133-143 из рге52, коньюгированого с БСА.

cro-preS2-core-cro-core-

) г j * 5 е 7 » »

МОЛ. Д1ЛССЛ лмркерных 5елко6(кД):

-Н -67

-30

-20 -«л

/жти-НВсЛд-АГ лнти-рге52-ДТ

cropreS2-core— cro-core—

S i I ! (

6 Г 8 9

ду 133-143 а. к. из ргеБ2 области НВУ (рис.5). С помощью ИФА показано, что частицы, образуемые гибридными белками, кодируемыми плазмидами рР32-17 и рР331-42, могут взаимодействовать антителами к соответствующему пептиду из ргеБ-области или с моноклональными антителами. Эти данные свидетельствуют о том, что в частицах, образуемых гибридными белками, которые кодируеются плазмидами рР52-17 и рР331 -42, детерминанты из ргеЗ области локализованы на

preS-детерминанты

1)

4)

ATG

ого ш ß-gal у сто ш ß-gal

1У

Bam HI Xho I ) Vgl II Xba I

Ш

Bam m Xho I 5) ATG Bgl II Xba I

Ват HI Xho I Bgl II Bgl II »Iba I

Bam. MI

Ш

Xho I Bgl II

г г

oro pi О О г е

6)

ATQ Bgl II Xba I

preSg - "

7)

Bam HI Xlio 3

Bgl II Xba I

Ж

Bern HI Xho I

8)

ATG

Bam Hi XHo I

preS2

Bgl II Xba. I

'pre SI

Bam HI Xho I

Bam HI

Xho I

Рис.6. Гибридные белки.

Плазмида, содержащие • preS-дегерминанты:

№ preS1(31-36) preS1(94-105) preS1(94-105)3 PreS2 (133-143)

1 ) pPSG31-40 pPSG1-49 pPSGIP-252 pPSG2-195

2) pPS31-42 pPS1-5 pPS1P-30 pPS2-17

3) — — — pPS2-35

4) pPSGR31-15 pPSGRI-251 pPSGRIP-182 pPSGR2-214

5) pPSR31-29 pPSR1 -1 pPSRIP-101 pPSR2-85

6) — — — pPS2-20

7) pMCS31-7 pMCSI-1 pMCS1P-69 pMCS2-2

8) pPS2M31-5 (содержит детерминанты preS2(133-143) и preS1(31-36))

поверхности. Взаимодействие частиц, образуемых белком, кодируемым плазмидой рР33142, с моноклональными АТ, позволяет утверждать, что конформация фрагмента 31-36 а. к. ргеБ1 области в составе гибридной частицы аналогична конформации этого участка в нативном нукле-окапсиде НВУ. Эти выводы подтверждаются также результатами электронной и иммуноэлектронной микроскопии очищенных препаратов гибридных белков с анти-НВс и с антителами к соответствующим фрагментам ргеБ-области.

2) Белки, синтезирующиеся с "собственного" АТб-кодона и белки с укороченной С-концевой частью НВсА5.

Для создания конструкций, обеспечивающих синтез гибридных белков с "собственного" иницициаторного кодона за счет реинициации трансляции, был использован олигонуклеотид (синтезирован М.Г. Иса-гулянц), содержащий АТБ-кодон и 2 триплета, кодирующие аланин. По нашему предположению, основанному на анализе результатов, приведенных в статье СВасЬта1г еЬ а1. , 1986], такая структура М-конце-вой части гибридных белков должна была обеспечить повышение продукции. Олигонуклеотид встраивали в векторную плазмиду рУР41 [Скрипкин Е. А. и др., 1987], которая, как показано ранее, обеспечивает синтез белков по механизму реинициации трансляции (рис. 6 и 7). Однако, как показал иммуно-ферментный анализ, лизаты клеток, содержащих плазмиды рР5И-1 и рР31?31-29, обладали очень слабой НВс -антигенной активностью, а в лизатах клеток, содержащих плазмиды рРБИР-Ш и рРЗР?2-85, этим методом обнаружить НВс-антигенную активность не удалось. С помощью иммуноблоттинга было выявленно слабое взаимодействие белка , кодируемого плазмидой рРЗИ31-29, с анти -НВс.

cXLol

¿hol

Ке«поы(5ДТ.С) Pst I

BomHI

Ketnou(C.A,T,C) Pstl

рис.7 Схема конструирования плазмид pPSRl-1, pPSRlP-101, pPSR31-29, pPSR2-85.

В разделе I. было отмечено, что плазмида pCRL2411, кодирующая HBcAg, усеченный с С-конца на 7 а. к-т, обеспечивает значительно более высокий уровень продукции этого белка (до 5% от суммарного клеточного белка) по сравнению с плазмидой рСС1224, кодирующей HBcAg с немодифицированным С-концом (до 1Z от суммарного клеточного белка). Чтобы проверить, приведет ли подобное "укорочение" к повышению уровня продукции гибридных белков (как содержащих фрагмент белка его на N-конце, так и синтезирующихся с "собственного" АТб-кодона), были созданы плазмиды pPSR2-35 и pPSR2-20 (рис.6). Методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттингом показано, что эффективность синтеза белков, кодируемых плазмидами pPSR2-35 и PPSR2-20 выше чем белков, кодируемых плазмидами pPS2-17 и PPSR2-85, соответственно. В отличие от белка pPSR2-85, который практически не обнаруживается по взаимодействию с человеческими анти-НВс в ИФА даже в неразведенном лизате клеток, содержащих эту плазмиду, и не виден в иммуноблоттинге, белок pPS2-20 регистрируется в ИФА при разведении лизата соответствующих клеток в 100 раз, и методом иммуноблоттинга показана его НВс-антигенная активность. Эти данные были использованы нами при конструировании плазмид, кодирующих гибридные белки, в которых детерминанты из preS области HBV встроены в середину HBcAg.

II. II. Гибридные белки, содержащие детерминанту, встроенную в середину последовательности HBcAg.

На основании расчета вторичной структуры белков по методу Чоу и Фасмана [Chou Р. У. and Fasman G. D., 1974a,Ы было предположено,

что последовательность НВсАд в районе 70-85 а к. образует петлю, локализованную на поверхности образуемых им частиц. В связи с этим нами были созданы конструкции, детерминирующие синтез гибридных белков, в которых антигенные детерминанты из ргеБ1 и ргеБ2 областей ИВУ встроены в этот участок НВсА^. Для этого в последовательность гена НВсАг по схеме, представленной на рис.8, был введен сайт для рестриктазы ВашНГ, и получены конструкции серии рШБ С рис. 6), обеспечивающие синтез гибридных белков с собственного АТБ -кодона за счет реинициации трансляции (все аминокислоты на Ы-конце соответствуют природной последовательности НВсАд).

Белки, кодируемые плазмидами рМС531-7, рМС51-52, рМ5С1Р-69, рКС52-2, исследовали полностью аналогично описанному в разделе II. I. Результаты э/ф в ПААГ и иммуноблотгинга показали, что белки обладают ожидаемой мол. массой, взаимодействуют с анти-НВс, а для белков, кодируемых плазмидами рМСБ31-7 и рМС52-2, -- что они взаимодействуют с антителами к соответствующему участку ргеБ-области. Было обнаружено, однако, что белки, кодируемые плазмидами рМС32-2 и рМС31Р-69, агрегируют с мембранной фракцией клеток, поэтому в этих случаях для проведения э/ф использовали не лизаты, а клетки, разрушенные ультразвуком непосредственно перед нанесением на гель.

Методами ИФА с анти-НВс и электронной микроскопии было показано, что белки, кодируемые плазмидами рМ2331-7, рКСБ1-52, образуют частицы, проявляющие НВс-антигеную активность. Для плаз-миды рМС331-7 также было показано, что очищенный препарат кодируемого ею белка взаимодействует в ИФА с антителами к пептиду 24-41 ргеБ1 и с моноклональными антителами к ргеБ1. Полученные данные свидетельствуют о том, что в частицах, образуемых этим белком,

<' 1 I /й.иЛ*

ВагаЩ ЕсоШ

ДЬа I ЕсоШ

з*

ЫгЛ

Магаш>тм& гидчжц

ЗаиЗЯ

<?СО Л 1

1зИ ^-ЛГ

рис.24 Схема конструирования плазмид р(*С531-7, рМС31-52, рМС31Р-69, рМС52-2 и рТС22.

введенный участок из preS-области поверхностного антигена HBV локализован на поверхности частиц, причем его конформация аналогична нативной. Эти выводы подтверждаются также результатами иммуноэ-лектронной микроскопии с анти-НВс и с антителами к соответствующему фрагменту preS.

II. III. Гибридные белки на основе HBcAg, содержащие две детерминанты из preSl и preS2 областей HBV.

Для повьшения плотности детерминант, вводимых в последовательность HBcAg, создана конструкция, кодирующая гибридный белок, несущий две различные детерминанты из preSl и preS2 областей HBV (рис.6). Плазмида pPS2M3i-5 кодирует гибридный белок, в котором детерминанта, соответствующая 133-143 а. к. pre-S2 области, расположена на N-конце HBcAg, а детерминанта, соответствующая 31-36 а. к. preSl области, встроена в район его 70-85 а. к-т. Белок синтезируется в гибриде с N-концевой частью белка его б/ф Л , и усечен с С-конца HBcAg на 8 а. к. Методом иммуноблоттинга показано, что белок, обладающий ожидаемой мол. массой, взаимодействует как с анти-НВс AT, так и с анти-preSE ангипептидными АГ, полученными при иммунизации кроликов синтетическими пептидами 133-143 а. к. и с мо-ноклональными антителами к preSl области HBV (рис.9). Т.о. , гибридный белок, содержаний две различные антигенные детерминанты из preS-области поверхностного белка HBV в составе HBcAg, является стабильным в Е.coli и обладает антигенными свойствами как HBcAg, так и участков preS HBV. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что можно изменять антигенные свойства гибридных белков конструируемых на основе HBcAg путем повышения плотности и разнообразия встраиваемых детерминант.

онг и- виг«- опта-

рге5< ЛТ ИВсЛ3 АТ рг«3г ДТ

3 12X2412

рис. 9 Иммуноблогтинг лизата клеток, содержащих плазмиду рР32М31-5 с кроличьими сыворотками против НВсАе и пептидов 24-41 из ргеБ1 и 133-143 из рге32, коньюгированными с БСА..

II. IV. Иммуногенные свойства гибридных белков.

Образование гибридными белками высокомолекулярных агрегатов позволяло проводить их очистку методом седиментации в градиенте концентрации сахарозы. Очищенными препаратами белков (степень очистки 60-80%), кодируемых плазмидами рР2К2-35, рР31-5, рРБ2-17, рТС22, рМС31-52, проводили иммунизацию мышей и кроликов (работа проведена совместно с с. н. с. лаборатории иммунологии Павлюченковой

P. IL). Полученные сыворотки кроликов имели AT на HBcAg и соответствующие области preS, хотя уровень последних был значительно ниже: на HBcAg титры были от 100 до 500 тыс. в реакции ИФА, а на preS область — от 500 до 1000. По-нашему мнению, этот результат может быть объяснен маскировкой иммунного ответа на preS, происходящей вследствие того, что тестирование сывороток проводили не на натив-ный антиген, а на пептид, лишь в некоторой степени воспроизводящий нативную структуру участка preS.

Выводы:

1. Созданы конструкции, обеспечивающие эффективную экспрессию HBcAg в Е. coli с f^-промотора б/ф Л. Трансляция обеспечивается либо природной инициаторной зоной белка его б/ф Л, либо за счет реинициации. Уровень синтеза гибридных белков достигал 5%. Показано, что HBcAg, синтезирующийся как с собственного инициаторного кодона, так и в гибриде с небольшим участком белка его, сохраняет способность к образованию агрегатов, аналогичных 27нм частицам природного HBcAg и реагирующих с анти-НВс.

2. Сконструированы плазмиды, обеспечивающие эффективный синтез в клетках Е.coli гибридных белков на основе HBcAg, содержащих антигенные детерминанты 31-3ба. к. и 94-105а. к. из preSl- и 133-143 а. к. из ргеБ2-областей поверхностного белка HBV. Показано, что встраивание в N-конец HBcAg дополнительных фрагментов размером до 40а. к. не препятствует сборке core-подобных агрегатов.

3. Получены гибридные белки, с эпитопами preS-области, введенными в участок 70-85а. к. HBcAg, предположительно образующий петлю , экспонированную на поверхности частиц. Установлено, что такие

гибридные белки, содержащие вставку до 30а. к., стабильны в клетках Е.coli и, как правило, сохраняют способность к формированию частиц. Способность этих белков к образованию частиц, однако, более чувствительна к аминокислотному составу вставки, чем в случае белков, содержащих дополнительный фрагмент в N-конце HBcAg.

4. Короткие пептиды, содержащие всего 6-12 минокислотных остатков preS, после встраивания в состав HBcAg сохраняют свои антигенные свойства. Участки preS располагаются на поверхности частиц, формируемых гибридными белками в конформации, доступной для взаимодействия с соответствующими антителами. Иммунизация животных полученными белками вызывает продукцию как анти-НВс, так и антител к детерминантам preS.

5. Сконструированы плазмиды, содержащие двухцистронные оперо-ноподобные структуры, оба цистрона которых функционально активны в клетках Е.coli и обеспечивают эффективную экспрессию HBcAg и ^-га-лактозидазы. Зона инициации трансляции второго цистрона, созданная искусственно, по-видимому, обеспечивает синтез его продукта за счет как свободной инициации трансляции, так и за счет реинициации.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Макеева И. В. , Калинина Т. И., Неплюева В. С. , Худяков Ю. Е. , Кадошников Ю. FL , Смирнов В. Д. Конструирование и свойства гибридного оперона, кодирующего HBcAg вируса гепатита В и гапактозидазу Е.coli.//Молекулярная биология, 1990, N5, т.24, с. 1339 1350.

2. Макеева И. В. , Самошин В. В. Химико-ферментативный синтез прямых повторяющихся последовательностей ДНК и их клонирование в составе гибридных плазмид. //Тезисы докладов Всесоюзной конферен-

ции молодых ученых "Молекулярная биология и медицина". Ленинград, 12-18 мая 1990г. Москва, с. 24.

3. Макеева ÜB. Конструирование опероноподобных структур для обеспечения экспрессии генов в Е. col i. //Тезисы докладов Всесоюзной конференции молодых ученых "Структура и функции биополимеров". Львов, февраль 1989 г. Киев. с. 38.

4. Исагулянц М. Г. , Самошин В. В., Макеева И. В. , Смирнов В. Д. Эффективный синтез олиго(поли)дезоксирибонукпеотидов Н-фосфанатным методом в пластиковой микроколонке.//Биоорганическая химия, 1990, Т. 16, N 7, с. 933-939.

5. Калинина Т. И. , Худяков Ю. Е., Макеева И. В., Кадошников Ю. П. , Смирнов В. Д. Конструирование и свойства рекомбинантных частиц на основе HBcAg и участков белка оболочки вируса гепатита В. // Тезисы докладов международной конференции "Вирусные гепатиты", г. Ростов, 3-8 сентября 1990г. Москва

6. Y. Е. Khudyakov, Т. I. Kai inina, I. V. Makeeva, V. V. Samoshin, Y. A. Semiletov, Y. P. Kadoshnikov. Hybrid particles of HBcAg antigen: new approach for the development of an efficient recombinant HBV vaccine.// VHIth International congress of virology Berlin, August 26-31, 1990. p. 349.

7. Калинина Т. И. , Худяков Ю. Е. , Макеева И. В., Кадошников Ю. П. , Смирнов В. Д. Конструирование и свойства рекомбинантных частиц вируса гепатита В, несушда иммунодоминантные эпитопы preS-области этого вируса. //Тезисы докладов болгаро-советсткого симпозиума по вирусным инфекциям. г.Варна, 8-10 октября 1990г., стр. 86-87.