Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные изменения иммуноглобулинов и альбумина сыворотки крови под влиянием разных агентов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конформационные изменения иммуноглобулинов и альбумина сыворотки крови под влиянием разных агентов"

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ' Я УКРАЇНИ ХАРКІВСЬКИЙ МЕДИЧНИЙ ІНСТИТУТ

На. правах рукопису

ЛЕВЕРОДСЬКИЙ Петро Еииуїлович

Конформаційні зміни іьуноглобулінів і альбумнну сироватки крсші під впливш різних агентів

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації ка здобуття наукового ступеня кандидата медичних лауи

Харків - 1993

Робота зиконана в- Кримському медичному інституті.

Науковій керівник

Сфіційнм опоненти;

'Провідна зстанова:'

Захист дисертації відбудеться ізаз р. на

засіданні, спеціздізованної- вченої ради Д 088.23.04 в'Харківсько иу медичному інституті за адресо»: 310022, Харків,22,пр. Ле-

ніна, 4.

З дисертацією можна ознайомитись У бібліотеці Харківського медичного інституту. , ■

Автореферат роз і сланий- " —1 " іддз р.

Бяекнй секретар» спеціалігсванної вченої ради

доктор біологкчяиг наук, члея-корес-пондент Ш України, заслужений діяч науки України,. професор Г.3. Троїцький.

доктор біоюгігШЕЕ наук Моісеез В.О. доктор біодогичнюс наук Кліменко А И.

Харківський державний університет

ІуСрікова 'і. О.

. - 3 ■

. Актуальні стъ проблемы. Суиацонуоти ’ з організмі людини, практично всі білки, а особливо білки сироватки крові, поруч г

■ звичайними фізіологичними вішівшш, зазнають впливи різних хі-

мічнкс агентів. Це- мажуть бути різноманітні метаболіти, лікарські препараті«., речовини, пр-з’являються в сироватці.крові в результаті різних іктоксікацій, детергенти. ■.Взаємодіючи в білками,' вони-аміншг її структуру,и властивості, роблють неможливими чи перекручують функціональні прояви. ..І якшр пост-оинтетична модифікація’ СЕровагичних ■ білків, яка проходить в физиологичних умовах, як совокупность генетично запрограмованих процессів закінченого формування функціонально повноцінного Сілка'С Моїй Р._, 1681, Троїцький Г.Е ,193Б,Спірін'А.С. ,19343

вивчена порівняно добре, то галузь модифікації білків при -вне-Фізіологічних вимовах розроблена значно гірш. Це пояснується, можливо, тим, ар стандартний підхід при дослідженні будь-якого., білка передбачав виділення- "чистого" . препарату при допомозі , методів, що.основуються на фізико-хімічних відмінностях компонентів суміші, тар розділяється. Пріл цьому молекули модифіційо-

■ вачого . яким-яебудь говнішім' впливом білка в ревулітаті його

високої гетерогенності неминуче виявляються гідеіяннши - і не підлягать дальшому дослідженні!.. , .

.3 іншої, сторони, ' постсйнгетична модифікація, білків, ' .шр проходить при нефі а і ологичних впливах, не шяе. розглядатись, як аномалія.- '3 цієї точки вору цікавим представляється вивчен- .• ня структурних особливостей шдифіційовйгних білків,’особливо . виконуючих захисні -функції, ' а також .вивчення .конформаційних особливостей ікуногдобудінів, як білків, шр з'являються і функціонують в момент дії, патологичних факторів. . . ’ ..

. ’ Все вище, сказане і побудило нас провести дослідження конформації імукоглобулійів і алі бум і на. сироватки’крові .при'впливах детергентів, сечовйнй, інших зшмично активних фактор і в ме-

• тодаш диференціальної спектроскопії, кругового.дихроїзху та -

дисперсії оптичного обертання.

Мета та завдання дослідження, Дана робота з продовженням комплексних досдіджні то вивченню конформаці і та фізико-хімічних властивостей імуногдобудінів і альбуміна сироватки кро- ' зі, а також по виясненню характеру модифікації цих білків при патології, шр проводились на кафедрі біохімії Кримського ме-д:гіеого .інституту під керізяицгзом чдена-кореспондента АН України професора Г. В. Тро їцьксгс. ■

На основі установлених раніше фактів і з рахунком методичної бази, шр є, буди визначеній слідуючи завдання та мета досліджень: . ■ -

1. Методами диференційяоі спектроскопії, кругового дихро-

їзму і дисперсії оптичного обертання, дослідити динамику'початкових етапів денатурації січозаноп підкласів імуногдобулініз в лвдини. . '

2. Визначити наявність і локалізувати викликані зв'язу-

ванням детергентів структурні зміни в молекулах . альбуміна ' та імуноглобулініз і-протеолітичних-фрагментах -останніх. Провестй пошук амфіфілінях а-спіралей в молекулі альбуміна. ■

3. Здійснювати дальший розвиток. метод ів диференційної

спектрофотометрії з використанням сучасної обчислювальної техніки, підготувати математичке забеспечення для анализу ТПДС, забеспєчити мозшсзость порівняння спектргй, зареєстрованих в різних експериментальних умовах. '

. Наукова новика. . В даній роботі вперше показано, пр Підкласи мкзломних імувоглобулінів в людини характеризуються різно» . стійкістю до денатурації- січовинов низької, до З И концентрації. . При дому спектральні властивості та реакція, на добавлення січозиаи донорського імуноглобуліну Б є-відображенням' відповідних властивостей ІзЗ 1 підкласу.

• Еетанозлено, яр- .пов’язування катіоногенного детергента іилекулоо імуяоглобуліна 3 відбувається .переважно в галузі Гс

- Б -

фрагмента, фи цьому, по даним диференціала г спектрофотометрії,' круговогЬ дихроїзму та дисперсії оптичного обертання, молекула імуноглобуліна практично не загнав конформаційних змін. ВЬказано, пр при'дальшому Шдеищєнні концентрації детергента наступає стрибкоподібна необоротна денатурація. Дані, одержані при припиненні ТІЩ2, підтверджені результатами-досліджень донорського і його фрагментів при допомозі флюоресцентно:

ПОМІТКИ. "' ' - ■

Еперше показано, що г'вязування катионогенного детергенту молекулою вльбуміна супроводжується кооперативним конформацій-ним ефектом, що полегшує дальнше ав'язугання гідрофобних молекул і приводить до високої'гетерогенності комплексів альбумін - детергент. Запропонована модель третичної структури аль-бушна, заснована на взаємоді ї знайденій в його складі амфі-■фильних а-спиралей і ' пояснююча ряд унікальних властивостей альбуміна. \ \ .

Основи і положення, що виносяться на захист: . -'.

1. При дії січовини низької, до З М концентрації на мієломі імуноглобуліни Б різних підкласіз в інтервалі температур 10-40 град.- С. в їх молекулах відбуваються некооперативні кон-формаційні оборотні зміни, що виражаються в- зміні долі доступних розчиннику хромофорів., Імуноглобуліни різних підкласів демонструють різну динаміку конформаційних змін.

Н. Інкубування імуноглобуліну Б з розчином детергента ДТ2 в співвідношенні від 1:1 до 1:22 модь/молкприводить до зв'язку пропорціональних концентрацій кількостей детергента. Зв’язування останнього протекав перевалко в галузі Го фрагменту іму-ноглобуліву і обумовлено гідрофобними взаємодіями білок-детер-гент. - - ■ . . -

,3. Зв'язування детергента молекулами імуноглобуліну в -пі> данніга диференційноі спектрофотометрії не супроводжуємся істотними конформаційниыи змінами ал до досягнення денатуруючих

■ - б -концентрацій детергентів (виде 1:22 моль/моль). .

4.Зв'язування катіогенного детергента ДГ2 молекулою сиро-вагочного альбушна супроводжується кооперативними ганфорш-ційнимя переходами, щр полегшують дальніше зв'язуваная детергента. В формуванні третичної структури альбуміна важливу роль відіграють амфіфальні а-спіралі, шд приймають участь в гідрофобних . вз аемо д і ях. .

Практична цінність. Експериментальні підходи, які-примі-няеться, дозволяють проводити контроль не тільки аа кількісними параметрами, ар характеризують білки які досліджугаьс.але і якісно характеризувати останні. Одержана при цьому інформація дозволяє оцінити рівень структурних змін молекули білка.шр підлягають експериментальному впливові, а, значить, кількісно охарактеризувати інтенсивність зовнішньої дії. Враховуючи, шр оцінка рівня модифікації бідкз може служити токсикологічним тестом С Борисенко С. а, 1990], можливе упровадження експеримент тальвих підходів, які примішаються, в клінічну практику.

Здійснена дальніша розробка методу температурно-пертурбаційної / ди^реаціальної спектроскопії, розвинено підхід, ар

- дозволяє виявити та локалізувати спектральні відшни в зразках, ■ perістрація спектрів котрих проводилась в різних експериментальних умовах.’ Одеряала дальший розвиток методика,заснована на порівнянні інформаційних змін, викликаних різними фіги-ко-хінічними впливами, в білках різних тилів. Почато і продовжується формували* банку ІЦПС різних білків, зареєстрованих в стандартних умовах та при контррлаємому експериментальному . впливові. - .

Апробація роботи. Результати досліджень викладені на симпозіумі "Структура, біосинтез та функції молекулярних елемен-, тів імунної системи" (Пупіно, 1987), на V Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1987), на VI конференції по спектроскопи б.шюшкерів (Хзрькіг, 1988), засіданні Кримського біохл-

- ? -

мі чвогс товариства. -

І^блікадіїІ За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових робіт. .

Об'ем та структура дисертації. Дисертація представлена яа 185 сторінках дратованого тексту та складається в заголовку, введення, двох частин огляду літератури, опису матеріалів та методів, трьох частин викладу результатів власних досліджєь та їх облічування, висновків. Список літератури включає 269 назв. Дисертація ілюстрована 25 малшнхаш та 19 таблицями. ..

Матеріали та методи досліджень.

. Імуноглобулін G виділявся з сироватки крові здорових донорів та-хворих мієломною хворобою при допомозі іонообмінної хроматографії з дальніsod гель-фільтрацією. , Фрагментування імуноглобулшв 3 проводилось за иеюдасою, описаною [рріиель Г. , 1SB73. • \. . . 1 . " . ■

В роботі використовувався вільний від лирних кислот сиро-воточний альбумін,людини (Sigma, USA) та .ЧСА (Reanal, Угорщина). Контроль чистоти сироЕогочного адьбуміжа лпдини, ¡иуног-лобулінів та їх протеолітичних фрагментів проводився при. допомозі дьік-елзктрофореза та едектрофорева в гра, .ієнті 7-30Z по-:?ліакрилаі»ідного геля в присутності додецилсульфата натрія.

Для ідентифікації Fab и Fo фрагментів васгосовувався метод подвійної радіальної імуиодиффуаії sa Qüchiîrlony з антисиво-ротками проти Fab.Fc фрагментів імуноглобулінів а також іх легких (к и 1) та важких (ro,g,a) ланцюгів виробництва ГОШ АМН СРСР ім.Гамалія. Підкласи імуноглобулінів’6 людини визначалися' методом імуноферментного-анализу. ■ . . ■

Диференційні спектри реєструвались на спектрофотометрах Specord UV VIS и Specord М 40 (Carl Zeiss,Германия). .Температура кввети поріенянняпідтримувалась на рівні 10-12 Гр. С,

робочої кивеги - змінювалась-від 20 Гр. С до 40-45 Гр. С з кроком в 3 градуси. ' .

Для визначення кількості хромофорів в молекулах дослідницьких білки застосовувався метод Гудвіла - Мортона CGoodwin. V., Morton R. Д.,1946]. В ус іх випадках обчислювання оптичної пдовдши проводили г рахунком вкладу світлорозсіювання зразку екстраполяцією до точки виміру подвійної логарифмічної залежності вбирання зразка від довжини хвилі за способом, описаним CWinder A.F:,Gent V. L. G., 1971].

Розрахунки; ТВДС проводились а урахуванням взаємного вкладу двох основних максимумів - тироаинового та триптофанового. Взаємний вклад хромофорів розраховувався за формулами, одержаними в результаті аналізу модельных розчинів хромофорів в лабораторії Г. В. Троїцького СТэтин С. В., Атамась С.IL ,Ефетсв К.О. ,1984]. Кількість тирозиновых та триптофанових залишків визначалась за методом EBeaven G.Н. .Holiday Е.Н. ,19523.

. Дисперсія оптичного обертання (ДОВ) реєструвалась' на

ссекіроиолярю.іегрі Perkin-Elmer 241 ЬС (Швеція) при довжинах

хвиль 302 - 579 нм в кварцевій кюветі і довжиною оптичного

аляху 10 см. йонцетрація досліджуваних зразків ке перевищувала

1-2 мг/мл. Розрахунки проводились з використанням модифіційо-

ваних рівнянь Друде-та Моффіта [Троїцький Г.В. ,1965].'

■ Спектра кругового дихроїзму реєструвались на дихрографі

Mark 3(Jobin Yvon, Франция). Концентрація білка та довжина / ■ ■ оптичного шляху кварцевої кювети підбирались в кожному досліді

для досягнення оптимального співвідношення сигнал/шум. Температура вимірювалась безпссередно в кюветотримачу при допомозі цифрового термометру виробництва тої ж фірми.

/ Спектри флаоресценції реєструвались на флюориметрі "MIF-4" ("Hitachi",Японія) ери довжині хвилі збудження 365 нм. ’

Контроль за якістю зв'язанного с білком детергента здійснювався визначенням активності міченого радіоактивним тритівм

ДГ2, на Сета-рахівшкові "ïracc-r Analytic Dilta 300" (USA).

Результати та їх обговорення.

йгектсальн і дослідження конйормаді ї подкдасі-Е імуногдобу-діна G люпини. Кетадок ТЩГ досліджені - спектральні властивості! IgG гдоровкх донорів та імуногдобулінів 1,2 та 4 підкласів в ЗФР. Статистично достовірна неоднаковість в кількості пертур-бованис температурою хромофорних амінокислотних .задників не знайдено (табл. 1). что корелює з результатами досліджзнь іншій авторів (Денисюв А. 1. і . івш. , 1933, Abrancv V.M., 1983).

Разом г тим, введення в систему, . шр досліджується, січовини, як додаткового пертурбанта, демонструє різницю в спектральних проявах такого -впливу . на імуноглобуліни рівних підкласів (та5л.2-3). ' - ■■ . ' ,

При реєстрації ТЦДС в 1 Мсічовине спекгральни зміни всіх підкласів аналогічні приведеним для імуногдобудіна Є. 'Звертав на себе увагу більш вначна реакція на вплив сечовини зі сторони імуноглобулінів 2.підкласи. При порівнянні середніх величин' часток доступності тирозик.овия хромофорів ЦІ ВІДМІННОСТІ достовірні а імовіиністю біліш 99J (див.таблиці 2-3). Дадініше збільшення концентрації січовини до 2 М шдгвердаув тенденцію, яку спостерігаєш. " . ■ '

Збільшення концентрації січовини а 2 М до- .3. М супрувод-яуеться- к<= дальшим падінням доступності хромофорів,як можна було 5 чекати, а її ростом. Мієломні імуноглобуліни, шр досліджуються, проявляють, трохи мевьщу стійкість де впливу січовини, шр вв'язано, можливо, в їх мсноклональвістю. ..

Для контролю за вміками вторинної стуктури підкласів IgS шд Дією січовини використовувались методи реєстрації КД і ЛОВ. Спектри ВД в 3ŒP і 2 М січозині реєструвались для одного гравка з кожної групи. На мал. 1 показаний спектр К5 IgSl Черн

Мал. і.\ Зпектр .КД ІеЗІ Чгрн з ЗЙ? (1) та й 2 М січовині

в ЗФР (і) і в 2 И січовині (2). Практично повне співпадання кривше дозволяв зробити висновок про неучасть вторинної структури в конфірмаційних змінах, .індуційованяих січовиною вказаної концентрації, а також про відсутність денатураційних, змін. В іяка, щр досліджується. ’йеадри КД Іе02 Голд та Іг54 Бер, за-регстроваяі а З® тз 2 і! с.ічрзині, практично аналогічні приведеному на над. 1. Результати вимірів -ДЗВ також не виявили достовірних змін вторинно: структури ерааков, шд досліджуються.

Падіння доступності тирозкноад хромофорі? цри шдзиязнні конжктраціі січсніінг. на фоні 8і5?уї«в;ті амін вторинної

структури по данным КД и ЛОВ ю*є свідчити про аміни меадомєк-вих взаємовідношень е молекулах антител під впливом січовини. Великий розмах вказаннях амін а ІгБ 2 підкласу може' бути пояснений відмінностями внутришіомолекулярної динаміки цих білків.

Критерії достовірності різниці (І)

МІХ ДОСТУПНОСТЯМИ ТИрОЗИНОЕИХ хромофорів

Таблиця 1 ( В!ЕР ) .

дон 1 л ; 2 1 ' 4

ДОН — Г 1.46 ' 1.61 ! ■1.00

1 1.46 І \0.22 1 , 1.46

2 1.61 . 1 0.22 —- І а 66

- 4 , 1.00 » 1.4В . 0. № ! • —

Таблиця, 2 ( 1 Ы січовина)

ДОН. 1 1 1 2 о> . А ■ 4 \

дон 1 2.58* ! 0.03 І 0.74 '

1 2.58* І | 2.77* 1 2.02'

2 0.03 1 2.77* » , 1 : 0.52 .

. 4 0.74 2.02 1 0.52 1

^Доступність тирозиновкх залишив. розрізняються з достовірністю вивдэ 93. 5% '

' . - 12 -Таблица. 3 ( 2 М січовина)

1 ДОН 1 1 1 2 ! **

дон 1 — 1 0.92 1 4. 31* 1 2. 27

* - і 1 0.92 1 ( 3. 50* ! 3. 24*

2 1 4.31* 1 '3.50* 1 І 6. 77*

4 1 2.77 ! 3.24* ! 6.77* 1

«Доступність тирозинозих гашшкіз розрізняються з достовірні сот зяце 99.52

Структурні зміни адьбуміка та імукоглдбуліна 3 сироватки коса і . під впливом кат юиогенного детергента ДГ2. При зв' взуванні ДГ2 альбуміном виязляшься характерні зміни спектра, ¡зр виражається в зменьшенні амплітуди тирозинового максимуму та загального підйому короткохвильової області, що виникає, можливо, внаслідок- еклзду поглинання детергента Практично аналогічні приведеним спектральні прояви эв' яэуваннн детергента при іншії' молярних співвідношеннях - Від 1:1 до 1:22. При цьому відмінності саойїерегашься лише в амплітуді змін спектрів. При молярних співвідношеннях альбумін - детергент вища 1:6 починає проявлятися ефект пертурбації хромофорно і грулпи в.складі детергента, що виражається в.перекрученні та підйомі короткохвильової чйстики спектра з виникненням трьох нових максимумів з амплітудами, да збільшуються по мірі збільшення кількості детергента. •

. На мал. 2 приведена крива, шр відображає зміни доступності тироаикозюс хромофорів розчиннику під впливом ДТ2 різних концентрацій. Зміни молярного співвідношення білок - детергент з діапазоні 1:1 - 1:3 супроводжуються значним зниженням доступності білкових хромофорів. Яальніве збільшення концентрації детергента також викликав зниження доступності хромофорів, але

о

Мал.2. Доступність тирозинсвих хромофорів (0) розчиннику в' аалежпсті від концентрації ДГ2 (М. моль/моль).

• - альбумін.

* - альбумм в ї кощеною 5Н- групою

меньи виражене. Вказана тенденція зберегазться ах до молярного співвідношення 1:22 та денатурації альбумика. Починаючи а молярного співвідношення 1:Є, проявляється пертурбація :срс:.:офсра детергента.

Враховуючи, щз катіоногенний детергент ДГ2 може ззаз.мсзі."-

■ - 14 - ..

тк с альбуміном ЛЕОма способами (формування гідрофобних -зб’ез-к:- як s спец:£Лізо5ан;;і,я ділгнкаіа:, так і'е малололярюжи поверхностями моде куш та фіксація його за рахунок взаємодії за-рЯЖсНЕИХ груп), нами був проведений слідуючий експеримент: ТПДС альбуміна г детергентом в молярному співвідношенні 1:3 (вибрано співвідношення в максимальною амплитудою спектральних проявів) реєструвався по звичайній.методиці, але .інкубування 8 детергентом та подальду гельчїідьтраціЕ на Ультрагелі А.сА 202 дsr. Енведення невв'язанвих молекул.проводиш при рЕ 4.1, тобто Е галузі конформаційного переходу альбуміне з формуванням "Ezparicied"-®opыы [Foster J.r. ,19773.. Б цьому діапазоні pH кислі груп: амінокислот-гублять заряд, а вся молекула альбуміна заряджається позитивно tFoster J.F. 1977, Peters T. ,1535], що виключає можливість міжюних взаємодій з детергентом. .

ІЬрівняння тщс альбуміна г детергентом після ’ іЕкубування при pH 4.1 в аналогічним спектром, зареєстрованим в стандартних умовах, не виявила спектральних відмін, шр свідчить, очевидно, про ОДНОТИПНІСТЬ процесів,, цр.проходять при зв’язуванні детергента,. та дозволяє віддати перевагу.. моделі гйдроїоОних взаємодій. ■ ' .

Для вияснення ролі вільної SH- групи а зв'язуванні детергентів ми скористались методикою її блокування йодацетамидом •[Троїцький Г. В. ,13863. -Мгтодом ТЩС були прококтрольовани кон-формааійни зміни, по проходять при взаємоді ї обробленого описаним способом альбуміна і детергента в різник концентрація;:. Щік контролю конформаційних змін використовувались три концентрації детергента: 1:2,1:6 та 1:11 моль/моль. Доступності

тирогиновьк хромофорів, розраховані по температурно:- пертурбаційним спектрам,, приведена на мал. 2 в вигляді краток. Шп-литуда спектральних змін при зрості концентрації детергента зменькується, а також змінюється динамика кривой. Вказані відміни- кривих свідчать про зміни інформаційних ефектів, індуці-

йованшс зв’язуванням детергента, з альбуміні з захінвенсю' та зі ль нею сульфгидрильниш групами. -

Спектры імуноглобулінів, шр підлягають вішізові детергента в концентраціях 1:11; 1: 6; 1:3. меш/моль практично не відрізняються від спекгріз нативного білка. Це дозволяв припустити, щр зв'язування детергента в концентраціях до 1:22 моль/моль не приводить до суттєвих конфірмаційних перебудов молекули іму-ноглобуліну, і а гідрофобних взаємодіях практично яе приймають участі хромофорні 'амінскнсдрти. Дійсно, максимальна кількість тирозиновых залилков в молекулі імуноглобудіна G засереджено з варіабельних доменах Vh та VI-та в галузі йіждоменних контакт їв С Burton D. H., 19853, триптофанові залишки локализован і а

знутріпшіх гідрофобних галузях доменів, тоді як основна частина детергента, можливо, взаємодіє з Fc фрагментом,' відносно бідним пертурбіруємими хромофорами.

Стрібтог.одібна денатурація, шр проявляється при концентраціях детергента, яки перевищують. 1:22 моль/моль, свідчить, можливо, про відносно високу стійкість молекули' імуноглебуліну до гидрофобиях впливов. Ерахозудчи наявність з Fc фрагментах імуноглобудінів гідрофобних регіонів, по приймають участь в реалізації ефекторних функцій [Burton D.H.,' 19853, можна чекати, яр зв'язування детергенті молекулами антитіл проходить переважно в ціх галузях. _ ’

Ераховуючи, шр спектральні прояви впливу, наприклад, січовики на молекулу імуноглобуліну G відображають, головним чином, кснформаційні, аміни, шр відбудуться в їі Fab фрагментах, цікавим виявилось порівняння динаміка конформаційних змія Fab та Fc фрагментів донорського IgG під дією детергента. Спектри Fab фрагментів IgG ДОН Є, одержані папаtновим протеолізом, реєструвались н З® та після обробки детергентам в концентраціях від 1:1 до 1:11. Загальна динаміка зміни доступності хромофорів Г-аЬ-фрагментіз практично повторює приведену для цільної

молекули імуксглсйуліка. •

Зареєстровані THE Fe фрагмента е ЗФР та Fe фрагмента після обробки детергентом 1:10 продемонстрували практично погне сг. і впадання, але в ВЕ'яаку г низькою амплітудою піків (екстинкція врагку при обробці еменьпілась;до 0. 65) ■. коефіцієнт лінійно: кореляції ке перевищував-0.34. ; . ■

гевультатк доглідження дисперсії оптичного обертання ]g3 ДОН Є, його Fat' es Fe фрагмент іЕ Сег д*тергєнта та в його присутності приведені в таблиці 4. Зідсутнісп суттєвої аміни величини суш параметрів гО та в0 при вбілішеної концентрації дегергекга догваляє гробити висновок про незмінність елементів вторинної . структури імуноглобуліна та його протеолітичних фрагмектій під впливом детергекта в концентраціях, яки це ке викликали денатурації останніх. j

Таблига 4 . ■ ;

• Ре?удьтзги розрахунків дисперсії оптичного обертання ІЄЗ EOF. Е та toro-фрагментів в ЗФР і прк додачі ДГ2 Е полярному співвідношенні- 1:11 ( рЕ 7.2S ).

Зразок Poeчинник . S3 ЬЗ ЗЗЗ(нм)

ІГЗ 3®? -315.4 . 18.6 20c. C

JTT2 1:11 ' ■ -297. 4 11. & 211. E

Fab SB? ' ' -SOS. 3 8.3. . 224. Б

£Г2 1:11 ' • -21S. 2 . 4.6 215. 3

ЗФ? -243.1 -IE. 4 22Є. 7 •

Fe

і:11 ■ - - -251.6 -17.1 221. 8

Визначення кідькісті за' язанного з білком детергента за ло-помогоп радіоактивної мітки. Кількість молекул детергекта. зв’язаянкх а білком чи його фрагментами, визначалось для зль-буміна, імуноглобулінів ДОН Є, ДОН 0 та протеолітичних фрагментів IgQ ДОН Є. Результати експериментів приведені на мал 3. Криза (1) демонстрирув залежність зв’язанного з альбуміном детергента зід вихідної концентрації ДТ2. Кризи (2),(3) я (4)

.призедени для IgG, Fab и Fc фрагментів відповідно.

При аналізі кривих (1-4) зверта? на себе увагу низький рівень зв’язування детергента Fab фрагментами імунсглсбуліна G. Причиною цьому служить, можливо, екранування від розчинника гідрофобних регіонів, розташованих на Chi і СІ доменах CEurLon D.R. ,19853. Таким чином, основне навантаження при фіксації детергента несе Fo фрагмент, причому насищання його детергентом наступав вже при початковій концентрації 1:6 моль/моль і далі не збільшується. Зв'язування же цільною молекулою імуноглобу-ліну Б'детергента збільшується пропорціонально збільшенню концентрації останнього. ■

' Цікаво сспоставити динаміку зв’язування детергента обома фрагментами IgG та цільною молекулою. Можна відмітити, зо рівень зв'язування ДТ2 (фрагментами імуноглсбуліну мало зміняється при підвищенні концетраціїдетергента, тоді як цільна молекула IgG демонструє протилежну тенденцію. Врахозуючл, ер, по даним спектрофотометрії, таке зв'язування практично ке супроводжується конфірмаційними ефектами, можна зробити висновок про відмінність властивостей гидрофобнюс регіонів молекули IgG та суми її Fab і Fo фрагментів. •

Крива зв'язування, детергента молекулою альбуміна (1) демонструє кооперативний гетерогенний перехід сKrash-Hansen U. ,19811, який - проявляється в полегсенні фіксації детергекта при збільпешп концентрації останнього виде 1:11 моль/моль. Еказані конфсрмаційні зміни реєструються методом ТЦПС та суп-

---------1--------і--------1----I--1--------1-----H-i--------і------4----------і-------h-

2 6 6 10 12 34 'IG 18 20 22 24

vg- я Балежіїстї активності (імп/мг) эв’ваування альбумином (l),Ige(2), Fc фрагментом (3), Fab фрагментом (4). ДТ2' ст його концентрації (М. моль/моль).

розоджугсться зниженням доступной 1 6ІЛК.ОВИХ Хромофорів розчиннику. ■ • - . ■ _

Хзслідлекня йдюотесренції комплексів біантрида в імуног-добудіюм < G та його дротеолитичниик йтаг ментами. ■ Результати визначення кількісті зв'яганного в імуноглобулінам G детергента виявили нерівномірний розподіл останнього по молек^г-і igS -найбільша кількість вв'язувалась в Fс фрагментами .та значно менша - в Fab. •• Майже повна ’відсутність спектральних проявів гв' ягуьаЕня детергента може трактуватися як відсутність кок-

Мал.4. Спектр фшзресцзнціг'бі'анттпла з зразкамі IjG (і), його Fc. фрагмента (2), Fao фрагмента (3)

формаційних’ зрушень при. його "зв'язуванні. З інпої сторони, білшв двох третин асіх хромофорів в молекулі IgG лскалізовакс в-Fab фрагментах, тоді як основну навангаженність по зв'язуванні! неса, Fo фрагмент. Очевидно, щр. контроль конформаційних ефектів а Fc фрагменте молекули IgG методом ТЩС за зказаннов причиною Суде меньш "ТОЧНІШ. • "

Це пойудило нас застосувати, "для дослідження гідрофобная реакцій і лигандами молекули IgG та її фрагментів незалежний метод. Одержані для ВД та його Fab і гс фрагментів спектри флюоресценціі біантрила приведені на малюнка 4. Криза (і) на-

X 1А Y 1A Z 1AB

Hinge region

X 1C Y 1C Z 1C

Мал. 5. Рогтошуванна а-спиралышх ділянок першого домена альбуїшаь

© - амфіфільні а-спиралі .

^ - гідрофобні а-спиралі

лежить IgG, (2) и (3) - Fab и Fc в ідпсвидно.

Співставдення концентрацій • біантрила, розрахованої по флюоресцентному спектру, і концентрації IgG в досліді дозволяє гробити висновок про те, ■ щр молекула , IgG зв'язує кількісті. гонга, яки близьки до еквіюлярното. Низька амплітуда спектра (2) свідчить про мізерно низьке вв'язування біантрила a Fab

фрагментами IgS. При цьому Fc фрагмент (3) зв'ягув навіть

більше, кіл цільна молекула IgG, кількість зонда.

А&йійільві-сть а-опіральннх ділянок альбуміна як йактер, • S2. візначае його просторову сруктур". Нористушгсгь опублікова-

ною оцінкою ступеня гідрофобності амінокислот СЕїзепсег?

0. ,1534] і емпіричними розрахунками розташування а-спіральні::: ділянок в молекулі алгбуміна, ми співставили два потенціалі -а-твірний і гідрофобний на протезі, поліпептидкога лашлога зль-бушна. Для визначення а-твірногс потенціалу- використовувались дані, одержані для першого дсмена альбуміяа СМсЬзсМап А-И. ,Уа1кег ]. Е. 19771. '

а-Спіраль рахувалась амфіфільною, якщо гідрофобні моменти протилежних секгоріз відрізнялись знаком, тобто гідрофобні аминокислотні залишки локалізувались переважно на одній стороні спіралі, а гідрофільні - на другій. На мал. 5 приведено розташування Гідрофобних, амфіфільних і гідрофільних а-спіра-дей на протезі першого домена адьбуміяа. Як видно з малюнка, з спіралей проявляють амфіфільні властивості, одна з них гідрофобна, ? спіралей гидрофільні. ■

ВИСНОВКИ

1. Імуноглобуліньї В різних підкласів, виділені з сироватки крові хворих мієломною хворобой, характеризуються-різною стійкістю до дії січовини. В розчинах січовини низької, до 3 нолей, концентрації в температурному інтервалі' зід 12 до 40. град.С в молекулах мієломних імуноглобулініз 3 людини проходять оборотні некосперативні конформаційні зміни, більа виражені для імувоглоСулініз. 2 підкласу. Ці конформаційні зміни реєструються як зменьшеннд співвідношення амплітуд інкремент-ного. та модельного температурно - пертурбаційних спектрів а їх

основних максимумах. При цьому-по данным КД і ДОЗ ке відбу-

■ <з .

гається- залітних змін 2 вторинний структурі білків, пр досліджуються. , • .

2. Неспецифічне зв’язування катюногенного детергента ДТ2 з мзлекуаов імунсгдобудіну <3 відбувається в гідрофобних репо-

. - 22 -

нах його Fc .фрагмента і-по даним ТЦЦС- і ЛОВ не супроводжується суттєвими .канформгційними вмінащ аж. до стрибкоподібно наступаючої декгтураці ї. Fat» фрагмент імуноглобуліну а людини практично не приймає участі .в неспецифічному бе'язувакн: детергента Зв'язування детергента молекулою імуноглобуліну G відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій, ■ прк цьому зв'язані модакулц детергента недоступні■ пертурбуруючій дії температури.

В концентраціях,.!®: досліджууються, детергент.не ПІДЕІПУЄ СТІЇ-КіСТЬ імуноглобуліну. ДО ДІЇ. 2 і! сечовини. .. ■

• • £. Зв'язування гідрофобного флноресцентного мічення проті- ,

кає переважне в- Fc фрагментах імуноглобуліну В людини, • при цьому'Fab фрагмент'залишається інтактним. '.Зв'язування • гідрофобного мічення суцільною молекулою JjfG відбувається в центрах' г' характеристика»«!! мікрооточення , . шз відрізняється від таких в Fc фрагментах, -причому кіявкість гв-'язанного мічення вияв- . дається меншим. . ■ ■ ■

і. ‘Взаємодія .детергента з.молекулою сировагочного альбумина людини супроводжується кооперативными «інформаційними ефек- ' теми, ер-реєструється методом ТОТ. Зв'язування детергента с молярным співвідношенням до 1:5 відбувається в центрах молекули 8 жорстким, мікрооточенням. Амплітуда спектральних проявів зв’ яауванкя максимальна ррк концентраціях детергента..1:1-1: £ та зменшується з п ростом..: Вказані- конформаційні'ефекти мають, гетерогенний характер та полегшують дальше зв'язування детергента: ' Влокування вільної сульфгідрильної' групи альбукіна змінює як амплітуду спектральних проявів зв'язування, так і . їх фаан^сть. •. _ ' . . .... •’ ' ' '

' 5. Суттєве значення для стабілізації структури альбуміна иаеть гідрофобні - взаємодії .між .амфіфаі$ними-а-сг.іралями,щр входять до складу’його молекули і локалізований!'в, довгих пет^

Д?.Х'СУбД0М8НїВ.

- 23 -

СПИСОК РОБГТ no mi досерташ.

1. Зйракгвристгика конформации 'иммуноглобулинов в корыэ г. при димфоаролгфераЕйваых заболеваниях. / Атамась С. П. НЙз-тов. К. А. Сешнец П. ®.. Вэверодсетй ' П. Э. Троицкий Г. В. // 5 Укр. Сиохш. съезд: .Тез. докл. -Киев,-1987, час» 2

2. Конформационные переходы ‘ з иммуноглобулинах G в норм« и. при лим&пролиферативных . заболеваниях / Агашеъ 0.41 Ефе-тов. К.А. СемэкецПФ* Нэверодский Е. Э. - Косил б. Г., Троилний Г. В. // Симпозиум "Структура, биосинтез к функции молекулярных элементов ИМУННОЙ'СИСТвМЫ"; ' ТеЭ. ДОКХ. -Цучино, -19S7

3.Иммуноглобулина при знмфепролифератизккх ■ заболеваниях. /

Тэтин С. Ю. Атаыась С. IL Неверовский 113. Ефетсз К. к. Шидей В. 3. Троицкий Г. Е- // Конференция ' "Биохимия - ме джине": Тез. дока., -Ленинград, -1988 '

' 4. Конфориационкш переходы подклассов Igfi человека, по данным- дифференциальной спекяроскойии:;/ Тзтин-С. KL Н&зеродский ИЗ. Атгшасг С;Е. Семенец.П,& , Троицкий Г.В.//Нонфзрендая г.о спектроскопии биополимеров: Тез. дйкл. -Харьков, -1988.

5. The- рпяагу steps of dsnaturatson ■ and complement binding of IjG at norm and p&tj^ojogy./Tetin S. Yu. ,Efetov K.A. , Atamas. S.P. Nevefodsky P.E,, knjazeva. 0. A, .Troitsky S. 4. //loth \fork3hop and Syttpbosium "Structure,Biosynthssys, and function tbs nolecular element3 of th* ismune-'system" -1Э83, Folsnd, -p 22. . ;

8, Аьффщмостъ а-еяирадашх участков 'альбумина-' как фактор, определяснуа его пространственную ,структуру/Троицкий Г. В., Наверодсклй И 3. //ДЗкл. АН УССР. -1950. К 3, -С. 73-60 •

7. Спектральные проявления связьшания детергентов иммуноглобулинами G и. альОугшом саворотки крови /Троицкий ,-Г. 3.. Hi-зеро детей. О. а Тэтия С.й 7/Дм«. АН yCC?.vl9Sl-. N 10.-С. 157-121. ' .