Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Общая кобальт-связывающая способность сыворотки крови: оптимизация протокола и оценка применимости в диагностике острой миокардиальной ишемии

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Общая кобальт-связывающая способность сыворотки крови: оптимизация протокола и оценка применимости в диагностике острой миокардиальной ишемии"

На правах рукописи

ЛИТУС Екатерина Андреевна

ОБЩАЯ КОБАЛЬТ-СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ: ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОТОКОЛА И ОЦЕНКА ПРИМЕНИМОСТИ В ДИАГНОСТИКЕ ОСТРОЙ МИОКАРДИАЛЫЮЙ ИШЕМИИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 ОКТ 2014

Краснодар - 2014

005553798

005553798

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России).

Официальные оппоненты:

Бородулин Владимир Борисович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России) кафедра биохимии, заведующий кафедрой.

Боцдарь Татьяна Петровна, доктор медицинских наук, профессор, федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет» (ФГАОУ ВПО СКФУ), институт живых систем, кафедра медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, заведующий кафедрой.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России).

Защита состоится «12» ноября 2014 года в 10,00 час. на заседании диссертационного совета Д208.038.02 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России) (350063, Краснодар, ул. Седина, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России и в сети «Интернет» на официальном сайте университета http://www.ksma.ru.

Автореферат разослан «10» октября 2014 г. Учёный секретарь

диссертационного совета Д208.038.02 доктор медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Островский Олег Владимирович

доцент

Общая характеристика диссертации

Актуальность темы исследования

Поиск новых биомаркеров и разработка методов их определения является активно развивающимся направлением современной медицины. Постоянно появляются десятки предложений новых лабораторных тестов, однако клиническое признание получают единицы. Особое внимание исследователи уделяют разработке методов диагностики рака (Jantus-Lewintre Е et al., 2012), сердечно-сосудистых заболеваний (Vasàn R.S., 2006), болезни Альцгеймера (Milward Е.А. et al., 2013). Поиск биомаркеров нацелен на ранние, обратимые стадии заболевания, в частности много работ посвящено выявлению ишемии миокарда, начальной стадии развития шпемической болезни сердца (Bar-Or et al., 1999, Sinha MK et al, 2003; Peacoc F. et al., 2006; Keating L., 2006). В настоящий момент нет общепринятого лабораторного метода, позволяющего быстро и объективно диагностировать обратимые изменения кардиомиоцитов (Рябыкина Г.В., 2002; Островский О.В., 2009). Это осложняет раннюю диагностику таких форм шпемической болезни сердца, как бессимптомная ишемия миокарда (Sharma R,, 2007), нестабильная стенокардия и острый инфаркт миокарда (Бокарев И.Н., 2009).

В качестве раннего маркера ишемии миокарда в 1999 г. было предложено анализировать снижение способности сывороточного альбумина связывать Со2+ (Bar-Or D et al, 1999). Считается, что белок подвергается модификации в очаге ишемии (Wu А., 2002) и, в результате, не может образовывать комплекс с некоторыми ионами двухвалентных металлов (Sbaroimi, 2006, da Silva SH, 2010), что позволило ряду исследователей (Sinha MK et al., 2003; Wu А., 2002) назвать данный тест тестом определения уровня ишемически-модифицированного альбумина. В США Albumin cobalt binding test (АСВ-тест) был рекомендован Food and Drug Administration (FDA) к использованию в лабораторной практике для детектирования ишемии миокарда у пациентов с подозрением на острый коронарный синдром. Однако, данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что изменения кобальт-связывающей способности сыворотки крови связано не только с патологией миокарда (Hacker M. et al, 2007; Senes M et al. 2007; Turedi S. et al, 2007; Gunduz A et al., 2009) и тканевой ишемией (Bar-Or D et al-, 2008; Gaze DC et al., 2006; Zapico-Muniz E. et al., 2004; Sbarouni E., 2011). И хотя АСВ-тест все еще считается перспективным диагностическим инструментом (Gaze DC, 2009; Van Belle E. et al., 2010; Dong S-Y. et al., 2012), вопрос о границах его применимости остается открытым.

Степень разработанности проблемы

Ишемически-модифицированный альбумин на сегодняшний день остается единственным маркером ишемии миокарда, который был разрешен к использованию в клинической лабораторной практике (Gaze DC, 2009). Но до сих пор нет единой точки зрения на диагностические возможности данного теста. Некоторые исследователи считают его незаменимым для диагностики

острого коронарного синдрома (Sinsha МК et al., 2004) и мониторинга состояния пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование (Dong S-Y. et al., 2012), a также важным показателем для долгосрочного прогноза у больных после острого инфаркта миокарда (Van Beile Е. et al., 2010). Другие полагают, что низкая специфичность маркера не позволяет использовать его для выявления острой ишемии миокарда (Keating L., et al., 2006). Одной из причин этих противоречий является отсутствие целостного представления о природе кобальт-связывающей способности сыворотки крови и о факторах, которые могут на нее повлиять. Очевидно, что изменение способности альбумина взаимодействовать с ионами двухвалентных металлов может быть вызвано не только его ишемической модификацией (Sbarouni Е., 2011; Lu J. et al., 2012). Более того альбумин является не единственным сывороточным белком способным связывать ионы двухвалентных металлов (Al-Mashikhi S.A. et al., 1988; Stoiber H. et al., 1995). При этом вклад других белков сыворотки в ее общую кобальт-связывающую способность до сих пор малоизучен.

Не маловажной проблемой является тот факт, что исследователи используют разные протоколы для определения ишемически-модифицированного альбумина (Christenson R.H., 2001; Bhagavan N.V., 2003; Bar-Or D. et al., 2000; Abadie J.M. et al., 2005; Anwaruddin S. et al., 2005). Это затрудняет сравнение данных и вносит путаницу в их интерпретацию.

Диссертация подготовлена и выполнена по плану НИР ВолгГМУ на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии. Научное сотрудничество осуществлялось с ГБУЗ "Волгоградский областной клинический кардиологический центр", МУЗ «Городская клиническая больница № 25» и ФГУЗ "Волгоградский медицинский центр федерального медико-биологического агентства России". Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета ВолгГМУ. Работа выполнялась в рамках общего направления работы кафедры биохимии.

Цель исследования: оптимизация процедуры и оценка клинической информативности метода определения общей кобальт-связывающей способности белков сыворотки крови в лабораторной практике.

Задачи исследования

1. Разработать унифицированный протокол фотометрического определения кобальт-связывающей способности растворов модельных белков и образцов сыворотки крови.

2. Исследовать возможные свободно-радикальные механизмы, лежащие в основе снижения кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина.

3. Установить региональные референтные границы уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

4. Оценить показатели биологической вариабельности уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови и коэффициент критической разницы показателя.

5. Апробировать полученный протокол определения кобальт-

связывающей способности на группе пациентов с миокардиаяьной ишемией.

6. Исследовать уровень кобальт-связывающей способности у пациентов с заболеваниями, не сопровождающимися острой ишемией миокарда.

Научная новизна

Впервые были получены данные о внутри- и межиндивидуальной биологической вариабельности общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови для группы условно здоровых добровольцев.

Впервые рассчитаны индекс индивидуальности и коэффициент критической разницы показателя (ЫСУ) общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови. Впервые показана необходимость привлечения ЯСУ при интерпретации результатов анализа кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов с острой ишемией миокарда.

Впервые были получены данные о связи между изменением белкового спектра сыворотки крови и уровнем ее кобальт-связывающей способности у пациентов с аутоиммунной патологией и сахарным диабетом 2 типа.

Теоретическая значимость

Данные, полученные в экспериментах с модельными системами, свидетельствуют, что свободные радикалы вызывают сайт-специфическую модификацию сывороточного альбумина. Это приводит к снижению его кобальт-связывающей способности. Описанный патогенетический механизм может иметь место в очаге ишемии миокарда, где увеличивается концентрация свободных радикалов, что объясняет снижение уровня общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

Нами было показано, что соотношение белковых фракций сыворотки крови влияет на уровень ее кобальт-связывающей способности. Изменение соотношения концентраций у-глобулинов и альбумина в сыворотке крови является неспецифическим механизмом снижения ее общей кобальт-связывающей способности, несвязанным с острой ишемией миокарда и свободно-радикальными процессами.

Практическая значимость

1. Разработан оптимизированный протокол определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

2. Определены региональные референтные границы и ЯСУ для кобальт-связывающей способности сыворотки крови: 95%-е доверительные границы составляют 0,462 - 0,744 ммоль Со2+/л сыворотки, односторонний ¿СУ - 0,097 ммоль Со2+/л сыворотки, двухсторонний - 0,115 ммоль Со2+/л сыворотки.

3. Установлено, что патологические изменения белкового спектра сыворотки крови необходимо учитывать при интерпретации результатов анализа ее кобальт-связывающей способности.

4. На основании предложенного протокола могут быть созданы коммерчески доступные наборы для определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Способность сывороточного альбумина взаимодействовать с Со24" может меняться в зависимости от конформационных изменений его молекулы. Сайт-специфическое окисление молекулы альбумина вызывает снижение его кобальт-связывшощей способности.

2. Биологическая вариабельность вносит существенный вклад в значение общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови, что необходимо учитывать при интерпретации результатов анализа данного показателя.

3. Изменение соотношения концентраций у-глобулинов и альбумина в сыворотке крови влечет за собой изменение ее общей кобальт-связывающей способности. Данный механизм не связан с ишемией миокарда и свободно-радикальным окислением.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 4 - в издании, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 4th EucheMs chemistry congress (Prague, Czech republic, 2012); 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Berlin, Germany, 2011); Восьмой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск, 2014; Первой всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012 г); 65-й, 67-й и 68-й научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград 2007,2009, 2010 гг.); Научно-практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (Москва, 2008 г.); IV Съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики России. Научно-практическая конференция «Лабораторная наука - практике: первое десятилетие XXI века» (Москва, 2010 г.); Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 г.); 3-ем научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2010 г.); Пятой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007); XTV Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2009). Результаты диссертационной работы легли в основу инновационного проекта «Новый метод диагностики ишемии миокарда», который стал победителем программы «У.М.Н.И.К.» в апреле 2011г., занял первое место в «Ежегодном областном конкурсе инновационных проектов Волгоградской области» (2011 г.), а также стал победителем Регионального

молодежного инновационного конвента в марте 2012 г. (г. Волгоград). В июле 2012 г. проект стал призером конкурса КУМИР.

Внедрение в практику

Предложенный диагностический тест для определения общей кобальт-связываюгцей сыворотки крови внедрен в практику на базе ГБУЗ "Волгоградский областной клинический кардиологический центр" как дополнительный метод исследования для скрининга и мониторинга острой ишемии миокарда. Отдельные положения и выводы нашли применение в учебном процессе на кафедре внутренних болезней педиатрического и стоматологического факультетов и кафедре кардиологии с функциональной и лабораторной диагностикой ФУВ ГБОУ ВПО «ВолГМУ Минздрав РФ». Предложенный нами тест также используется для работы НИИ фармакологии ВолгГМУ и ФГБУ научно-исследовательского института клинической и экспериментальной ревматологии РАМН.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 121 страниц. Список литературы содержит 141 наименование.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования

В работе были использованы следующие реактивы: дитиотрейтол (Диаэм, США), №2-гидроксиэтилгтиперазин-ЬР-этансульфоновая кислота (HEPES), морфолинопропансульфониевая кислота (MOPS) (Fluka, Швецария), трис-(оксиметил)-аминометан (НПО «Биохимреакгив», Олайский завод хим.реактивов, Россия), кобальта сульфат, ч.д.а. (Реахим, Россия), трицин (Sigma, США), хлорид натрия, ч.д.а. (Реахим, Россия), бычий сывороточный альбумин (Диа-М, Россия), калия фосфорнокислый двузамещенный трехводный, ч.д.а. (Реахимсервис, Россия), натрия фосфорнокислый однозамещенный, х.ч. (Реахимсервис, Россия), аммония-железа(П) сульфат (соль Мора) (Реахимсервис, Россия), меди сульфат пятиводный (Реахимсервис, Россия), натрия азид (Merck, Германия), спирт этиловый 96 % (Реахим, Россия), сефадекс G25 Coarse (Amersham Pharmacia, США), 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS или АБТС), метгемоглобин из эритроцитов крупного рогатого скота, калия гидроксид х.ч. (Реахим, Россия), водорода пероксид хл. (Реахим, Россия), хлорид железа (Ш), калия гидрофосфат х.ч. (Реахим Россия), натрий фосфорнокислы 2-х замещений 12-ти водный ч.д.а. (Реахим, Россия), иммуноглобулин человеческий нормальный фирмы (Биомед, Россия), w-диметиламинобензальдегид (ПДАБА) (Реахим, Россия), соляная кислота (Реахим, Россия), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота), 98% (Sigma, США).

В основу методики определения кобальт-связывающей способности растворов чистых белков и биологических образцов лег метод, предложенный Бар-Ором с соавт. (Bar-Or et al, 1999). Концентрацию глобулярных белков в растворах определяли фотохимическим методом с п-диметиламинобензальдегидом (Y. Susuki, 2000). Концентрацию сывороточного альбумина и общего белка в сыворотки крови определяли с помощью наборов реактивов для определения концентрации общего белка (Диакон-ДиаСис, Россия) и сывороточного альбумина (Диакон-ДиаСис, Россия). Окислительную модификацию альбумина проводили системой Фентона на основе солей меди и железа (Си2+ (200 мкМ)+Н202 (30 мкМ) и Fe2+ (200 мкМ)+Н202 (30 мкМ)); при помощи модели сайт-специфического окисления (Wu А., 2002): белок преинкубировали с Си2+ (200 мкМ), а затем для инициации окисления сывороточного альбумина вносили Н202 (ЗОмкМ); а также комбинацией воздействия ионов меди и системы Фентона на основе соли железа (последовательность проведения аналогична сайт-спецефической модификации). В качестве контролей использовали образцы сывороточного альбумина без обработки, а также после инкубации с Си2+ или моноокисления перекисью водорода. Определение содержания хлораминовых групп проводили методом с 5-тио-2-нитробензойной кислотой (Hawkins C.L., Davies M.J., 1998).

Для получения кинетических и спектральных данных использовалась программа Biochem-2. Для хранения и обработки экспериментальных данных были использованы Excel 2007 из пакета Office ХР ("Microsoft", США) и Statistica 6.0 ("StatSoft, Inc.", США). Диапазон линейности метода определения Со2+, сходимость, воспроизводимость, предел обнаружения и предел надежного количественного определения Со2+ в растворе были рассчитаны согласно ICH Q2 Guidelines. Расчет RCV проводили по Харрису (Harris Е.К., Yasaka T., 1983), а также по Фрейзеру (Fraser C.G., 2001).

Клиническая характеристика групп пациентов и здоровых добровольцев

Контрольную группу составили 194 условно здоровых добровольца (94 мужчины и 100 женщин в возрасте от 18 до 72 лет). Состояние их здоровья оценивалось по результатам анкетирования, критериями исключения были: острые и хронические заболевания в стадии обострения, беременность, ожирение 2-3 степени, инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения и клиническая смерть в анамнезе, нахождение на амбулаторном или стационарном лечении, назначенном врачом. В образцах сыворотки определялись уровень кобальт-связывающей способности, общий белок, сывороточный альбумин, общий иммуноглобулин. Группу условно здоровых добровольцев для исследования показателей биологической вариабельности уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови составили 15 человек, из них 6 - мужчин и 9 - женщин, в возрасте от 19 до 28 лет. Забор крови проводился 1 раз в неделю на протяжении 4-х недель. Критерии исключения аналогичны. При последующем анализе полученных данных и детализации анамнеза 2 человека были исключены из исследования.

Пациенты, перенесшие плановое аортокоронарное шунтирование (9 мужчин в возрасте от 41 до 70), имели стеноз хотя бы одной коронарной артерии 50% и более. Критерием исключения было несогласие пациента. В данной группе проводили анализ общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови и уровня сывороточного альбумина за 1-3 дня до операции, на 3 день после операции и перед выпиской (в среднем на 15 - 16 день после операции).

Пациенты с аутоиммунной патологией (44 человека, из них 6 мужчин, от 16 до 78), находились на стационарном лечении и имели установленный диагноз ревматоидный артрит - 35, системная красная волчанка - 2, системная и очаговая склеродермия - 7. Критериями исключения было развитие острого инфаркта миокарда, несогласие пациента. Пациенты с диагнозом сахарный диабет 2 типа (50 человек, из них 15 мужчин, от 45 до 85), были госпитализированы в связи с декомпенсацией заболевания. Критериями исключения были острый инфаркт миокарда, вирусные гепатиты, ВИЧ, хроническая сердечная недостаточность 4 класс, алкогольный гепатоз, тиреотоксикоз и любые заболевания щитовидной железы, сопровождающиеся изменением гормонального статуса, несогласие пациента. Для данных групп пациентов проводили анализ общей кобальт-связывающей способности, уровня сывороточного альбумина, общего белка и глобулинов в сыворотке крови.

Результаты исследования и их обсуждение Оптимизация протокола определения уровня кобальт-связывающей способности растворов белков и биологических образцов

Для оптимизации метода определения Со2+ в растворе мы исследовали стабильность нескольких вариантов реактива на основе дитиотрейтола (табл. 1): 25 мМ МОРБ с рН 7,4; 25 мМ НЕРЕЭ с рН 7,4; 50 мМ ТРИС с рН 7,4; 12,5 мМ трицин с рН 7,4. Все варианты реактива содержали хлорид натрия в изотонической концентрации. Для реактива на основе НЕРЕБ-буфера коэффициенты вариации (как между измерениями, так и между приготовлениями) оказались в пределах 10%. Хранение реактива данного состава в течение суток не приводило к достоверному снижению окраски реакционной смеси, в отличие от реактивов на основе других буферных систем.

Для реактива на основе НЕРЕ8-буфера были рассчитаны аналитические характеристики с привлечением данных приведенных на рис. 1. Коэффициент вариации в диапазоне конечных концентраций Со2+ 13,5-135,14 мкМ не превышал 2 - 4 %, что делает этот диапазон оптимальным для проведения анализа. Величина смещения достоверно не отличалась от 0, что указывает на возможность применения одноточечной калибровки.

Предел обнаружения и предел количественного определения, рассчитанные в соответствии с ЮН, составили 5,69.10"4 ммоль Со +/л и 0,001724 ммоль Со2+/л, соответственно.

Исследование стабильности результатов, полученных с помощью _ реактивов на основе MOPS, ТРИС, HEPES_

Концентрация кобальта, мкМ Оптическая плотность комплекса

Среднее значение Коэффициент вариации, %

Общий В течение ДНЯ* Между днями**

MOPS

22,7 0,196 8,8 8,73 13,55

45,5 0,440 4,1 5,44 5,25

90,9 0,926 8,2 6,32 12,17

Трис-аминометан

22,7 0,146 14,6 5,17 19,28

45,5 0,404 8,7 9,27 12,09

90,9 0,880 4,9 7,51 3,80

HEPES

22,7 0,192 7,4 7,95 6,25

45,5 0,443 5,3 8,79 3,13

90,9 0,917 5,5 4,53 8,34

*- работа с одним реактивом в течение дня;

** - сравнение данных полученных для нескольких приготовлений реактива в разные дни.

U -1-.-1-1-1-.-1-.-1---1—■—|—//I''.....

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,20 0,25

Конечная концентрация Сог+, иМ

Рисунок 1. Диаграмма рассеяния и регрессионная прямая для зависимости оптической плотности реакционной смеси от концентрации Со2+ (25мМ НЕРЕБ рН7,4).

Результаты анализа внутри- и межсерийной аналитической вариабельности приведены в табл. 2.

Оценка аналитической сходимости и воспроизводимости метода определения Со2+ в растворе 25 мМ НЕРЕБ с рН 7,4, с 0,9% ИаС1

Концентрация кобальта, мМ Оптическая плотность комплекса, о.е.

Среднее значение Сигма

сходимость Воспроизводимость

0,068 0,768 0,025 0,034

0,09 0,983 0,033 0,052

0,135 1,455 0,032 0,059

Наиболее стабильным оказался реактив, приготовленный на основе 25 мМ НЕРЕБ-буфера. Его аналитические характеристики, соответствуют общим требованиям для фотометрических методов анализа, что позволяет использовать данный вариант реактива для определения содержания свободных Со2+ в растворе.

Для оптимизации протокола проведения анализа кобальт-связывающей способности чистых растворов белков и образцов сыворотки крови были исследованы спектральные и кинетические характеристики реакции образования комплекса Со2+ с дитиотрейтолом в присутствии бычьего сывороточного альбумина, определение оптимального времени инкубации и исследование стабильности образцов сыворотки при различных условиях хранения.

Согласно полученным данным рабочий диапазон сывороточного альбумина соответствует 6 - 10 г/л (СУ < 10 %). Минимальное время преинкубации Со2+ с белком составляет 15 мин. После внесения реактива измерение следует проводить строго спустя 2 мин на длине волны 495 нм (490 - 500 нм). Перед началом работы с реактивом необходимо провести калибровку растворами Со2+ (0,027-0,135 мМ). Образцы сыворотки должны анализироваться в течение 4 ч. с момента ее получения. Допускается замораживание при -18 °С и хранение образцов не более 21 дня. СУ для образцов сыворотки в условиях сходимости составляет 2,6 % для двухточечного определения, и 3,3 % для одноточечного. Разработанный протокол проведения анализа кобальт-связывающей способности сыворотки крови представлен в табл. 3.

Порядок проведения анализа кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

Компоненты контроль опыт холостая проба

Ф/р 60 мкл - -

2,5 мМ C0SO4 - 60 мкл 60 мкл

Сыворотка - 200 мкл -

Ф/р 800 мкл 600 мкл 800 мкл

Инкубация в течение 15 мин.

Реактив 250 мкл | 250 мкл 250 мкл

Инкубация 2 мин. Измерение при А,=495 нм.

Изменение кобальт-связываюшей способности сывороточного альбумина под

действием окислителей in vitro Согласно теории сайт-специфической модификации, в условиях ишемии миокарда воздействие окислителей на сывороточный альбумин является ключевым фактором в снижении его кобальт-связывающей способности (Wu А., 2002). В контексте данной гипотезы, in vitro было исследовано влияние на кобальт-связывающую способность сывороточного альбумина нескольких систем окисления, моделирующих возможное сочетание факторов повреждения ш vivo: система Фентона на основе Си2+; система Фентона на основе Fe2+; комбинация воздействия Си2+ и системы Фентона на основе Fe2+, модель сайт-специфической модификации.

Сайт-специфическая модификация вызывала достоверное снижение (~ 34 %) кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина (согласно тесту Даннета, р=0,026), в то время как показатели кобальт-связывающей способности после обработки системой Фентона с Си2+ обнаруживают лишь тенденцию к снижению (р=0,055). Снижение показателя после инкубации белка с Си2+ также не было достоверным. В случае других окислителей тенденции к снижению кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина выявлено не было.

Таким образом сайт-специфическая модификация сывороточного альбумина снижает его способность формировать комплекс с Со2+ и может лежать в основе механизма изменения общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови при миокардиальной ишемии.

Определение референтных пределов кобальт-связывающей способности

сыворотки крови здоровых добровольцев Были проанализированы образцы сыворотки здоровых добровольцев, проживающих на территории Волгоградской области. Согласно критериям Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка и Лиллиефорса, распределение показателя близко к нормальному (р>0,05 для всех трех критериев). Уменьшение флуктуаций CV с ростом выборки и стремление его значения к асимптоте, соответствующей 12 %, указывает на достаточный объем выборки.

95 % доверительные границы кобальт-связывающей способности сыворотки крови здоровых добровольцев составили 0,445-0,738 ммоль Со2+/л сыворотки. Зависимости анализируемого признака от пола и возраста выявлено не было. Кроме того, анализ зависимости кобальт-связывающей способности от содержания сывороточных белков не выявил значимых корреляций с концентрациями альбумина и у-глобулинов сыворотки крови.

Исследование показателей биологической вариабельности уровня кобальт

связывающей способности сыворотки крови Показатели биологической вариабельности кобальт-связывающей способности сыворотки крови для группы из 13 здоровых добровольцев приведены в табл. 4. Индекс индивидуальности, рассчитанный на основе полученных данных о вариабельности показателя, оказался равным 0,69, что соответствует промежуточному положению между 0,6 (высокий вклад индивидуальности) и 1,4 (низкий вклад индивидуальности) (Fraser C.G., 2001). Однако ввиду того, что полученное значение индекса оказалось близко к нижней границе приведенного интервала при интерпретации результатов анализа кобальт-связывающей способности сыворотки крови необходимо учитывать RCV.

Таблица 4.

Показатели биологической вариабельности кобальт-связывающей способности сыворотки крови.

Тип показателя Стандартное отклонение Коэффициент вариации, %

внутрииндивидуальный 0,08 14,09

аналитический 0,01 1,33

межиндивидуальный 0,11 20,51

Для расчета RCV мы использовали показатели общей аналитической вариабельности, рассчитанные из приведенных ранее нами данных для аналитической сходимости и воспроизводимости (<rtoui ^,=0,036, CVtotal ^,=5,04%). Нами были рассчитаны односторонние и двухсторонние варианты коэффициента. Значение одностороннего RCV позволит судить о смещении показателя при мониторинге патологии, когда его уровень заведомо снижен. Значение двухстороннего RCV предпочтительнее использовать при обследовании пациентов с неустановленным диагнозом, когда мы не можем спрогнозировать направление сдвига. Согласно Харрису (Harris Е.К., Yasaka Т., 1983) с учетом корреляции между двумя независимыми измерениями значимым сдвигом уровня кобальт-связывающей способности можно считать: в случае одностороннего RCV - 0,097 ммоль Со2+/л сыворотки, для двухстороннего -0,115 ммоль Со2+/л сыворотки. Учет коэффициента корреляции необходим при небольших интервалах между измерениями (при мониторинге состояния пациента). В случае обследования здоровых или реконвалесцирующих лиц коэффициент корреляции стремиться к 0, в этом случае значимым сдвигом можно считать величину 0,1 ммоль Со2+/л сыворотки (односторонний RCV) или

0,119 мм оль Со21 /л сыворотки (двухсторонний Г<СУ). Значение КСУ, рассчитанное с привлечением аналитической вариабельности (по Фрейзеру), оказалось равным 24,7% для одностороннего варианта критерия и 29,3% - для двухстороннего КСУ.

Полученные значения критерия должны учитываться при интерпретации результатов анализа кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов, что позволит упростить процедуру постановки диагноза острых форм ишемичсской болезни сердца.

Исследование динамики показателя у пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование Мы исследовали уровень кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов после проведения аортокоронарного шунтирования. Результаты анализа образцов сыворотки крови пациентов на разных этапах госпитализации в связи с аортокоронарным шунтированием приведены на рис. 2.

- референтный интервал больной N

0,30

До операции После оперании При выписке

Рисунок 2. Динамика кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование.

*- р<0,05 по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони для 1 и 2 групп.

# - р<0,05 по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони для 2 и 3 групп.

До операции значения кобальт-связывающей способности сыворотки крови всех пациентов, за исключением пациента Ы, были близки среднему значению показателя для референтной группы (0,57 ммоль Со2+/л). У пациента N. у которого была диагностирована безболевая ишемия, величина кобальт-связывающей способности была понижена до 0,394 ммоль Со2+/л.

После проведения аортокоронарного шунтирования уровень кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов значимо снижался, причем у 43 % обследованных пациентов уровень показателя был ниже референтных пределов. Согласно рассчитанному RCV значимый сдвиг кобальт-связывающей способности сыворотки крови наблюдался также у 43 % пациентов. Полученные результаты соответствуют данными литературы (Smith R.C. et al, 1991, Berry P.D. et al, 1998), согласно которым после проведения аортокоронарного шунтирования ишемия миокарда развивается от 26 до 48 % случаев.

На момент выписки уровень кобальт-связывающей способности возвращался к базовому значению. Для пациента с диагнозом безболевой ишемии уровень кобальт-связывающей способности к моменту выписки приблизилось к фаницам референтного интервала и составило 0,445 ммоль Со2+/л сыворотки.

В послеоперационном периоде согласно данным обследования у пациентов наблюдались лабораторные признаки анемии и воспаления, что, вероятно, вызывало гипоксию ассоциированную с ишемией, особенно выраженную в области проведения хирургического вмешательства. Приведенные данные согласуются с наличием характерных для миокардиальной ишемии изменений на ЭКГ, которые часто удается зафиксировать у пациентов после проведения аортокоронарного шунтирования (Berry P.D. et al, 1998).

Таким образом, снижение уровня общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови пациентов после проведения аортокоронарного шунтирования указывает на развитие послеоперационной ишемии миокарда.

Исследование образцов сыворотки крови пациентов с некардиологическими патологиями

Возможный альтернативный механизм изменений кобальт-связывающей способности сыворотки крови может быть предложен, исходя из результатов, полученных при обследовании пациентов с заболеваниями, патогенез которых напрямую не связан с ишемией: сахарным диабетом 2-го типа и аутоиммунными заболеваниями.

Больные с указанными патологиями имели пониженный уровень кобальт-связывающая способность сыворотки крови. Более того, если в группе больных диабетом доля пациентов с уровнем показателя ниже референтного предела составляла всего -8% , то в группе пациентов с аутоиммунными заболеваниями -32%. Таким образом, понижение кобальт-связывающей способности невозможно однозначно связать именно с ишемией миокарда.

Анализ взаимозависимости показателей пациентов с аутоиммунными заболеваниями продемонстрировал, что для данной группы пациентов характерно появление значимой (р<0,05) корреляции между кобальт-связывающей способностью и уровнем альбумина (R2=0,14), сопоставимой с величинами обнаруженными в других исследованиях. Однако, того же порядка (R2=0,15) оказалась и степень связи с уровнем глобулинов.

Дискриминантный анализ трех исследованных групп (включая группу здоровых добравольцев) в системе показателей «кобальт-связывающая способность-альбумин-глобулины» (рис. 3) подтвердил, что на самом деле ведущий фактор в различиях этих групп - это соотношение уровней альбумина и «глобулинов» (функция 1, рис.3).

Референтная группа

-2 -1 0 1 1 3 4 5 6 Значения дискрймннантнон функции 1

Глобулины Альбумин

ксс

УУ///^///////////////Л

ШШ/.

ш

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Стандартизованные коэффициенты функции 1 Рисунок 3. Результаты дискриминантного анализа показателей референтной группы и пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями и диабетом. КСС-кобальт-связывающая способность.

Полученный результат можно истолковать как то, что исследованные группы различаются не собственно кобальт-евязывающей способностью, а особенностями белкового спектра. И, соответственно, учитывая различную способность сывороточных белков к связыванию Со2+, регистрируемые смещения показателя могут быть отражением именно этих особенностей, а не изменением свойств только альбумина, как это предполагается Бар-Ором.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что общая кобальт-связывающая способность сыворотки крови является чувствительным лабораторным показателем. Причиной ее снижения может стать окислительная модификация сывороточного альбумина в очаге ишемии миокарда, и в этом случае уровень кобальт-евязывающей способности будет являться важным ранним диагностическим критерием для выявления острых форм ишемической болезни сердца. Однако данный маркер обладает не высокой специфичностью и может изменяться при других патологиях, для которых свойственны качественные изменения белкового спектра сыворотки крови, что необходимо учитывать при интерпретации результатов анализа общей кобальт-евязывающей способности сыворотки крови.

16

Выводы

1. Наряду с маркерами некроза кардиомиоцитов, современная медицина нуждается в диагностических маркерах ишемии миокарда, основой для разработки которых может стать общая кобальт-связывакяцая способность сыворотки крови.

2. В экспериментах in vitro установлено, что сайт-специфическая модификация сывороточного альбумина снижает его способность связывать Со2+, что подтверждает теорию о данном типе окислительной модификации альбумина как возможной причине снижения общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови во время миокардиальной ишемии.

3. Региональные референтные пределы кобальт-связывающей способности сыворотки крови составляют 0,445 - 0,738 ммоль Со /л сыворотки не зависимо от пола и возраста.

4. При определении кобальт-связывающей способности сыворотки крови в целях мониторинга интерпретация результатов должна проводиться с учетом биологической вариабельности показателя: односторонний RCV составляет 0,097 ммоль Со2+/л сыворотки, двухсторонний - 0,115 ммоль Со2+/л сыворотки.

5. Уровень общей кобальт-связывающей способности сыворотки крови снижается у пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование, в связи с развитием послеоперационной ишемии.

6. Установлено влияние белкового состава сыворотки крови на уровень ее общей кобальт-связывающей способности при сахарном диабете и аутоиммунной патологии.

Основные положения диссертации представлены в следующих публикациях автора:

Статьи в рецензируемых научных изданиях, включенных в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата ааук.

1. Is cobalt_binding capacity of serum a new perspective diagnostic marker?/ E.A. Litus, V.G. Zaitsev, V.E. Verovskij [et al.]// Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. - 2013. - № 37. - P. 224-227.

2. Динамика кобальтсвязывающей активности сыворотки крови пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование/ Е.А. Литус, Н.С. Костерина, В.Г. Зайцев [и др.]// Клиническая лабораторная диагностика. -2011.-№9.-С. 13.

3. Кобальт-связывающая способность сыворотки крови как маркер ишемии миокарда у пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование/ Ю.М. Лопатин, Е.А. Литус, В.Г. Зайцев [и др.]// Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 6. Режим доступа URL: www.science-education.ru/100-5114 (дата обращения 30.07.2014).

4. Литус, Е.А. Разработка протокола определения кобальтсвязывающей способности сыворотки у пациентов с возможной ишемией миокарда/ Е.А. Литус, В.Г.Зайцев, СХВ.Островский// Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 9. - С. 51.

Статьи в журналах, не включенных в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук,, доклады и тезисы в трудах научных конференций

5. Cobalt-binding capacity of the bovine serum albumin treated in vitro by various oxidizing agents/ V. Zaitsev, E. Litus, A. Zhdanova [et al.]// Chem. Listy. -2012. - № s4. - P. s902.

6. Contribution of globulins to human blood plasma/serum cobalt binding capacity used as basis of the ischemia-modified albumin test/ O.V. Ostrovskij, V.G. Zaitsev, E.A. Litus [et al.]// Clin. Chem. Lab. Med. - 2011. - № si. - P. S323.

7. Влияние инициаторов окислительного повреждения на кобальт-связывающую активность сывороточного альбумина/ Е.А. Литус,

A.B. Шишкина, Е.А. Никитенко [и др.]// Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксид анты и здоровье человека: Мат. 5-ой национальной научно-практической конф. с междунар. участием. Смоленск: ФГУ «Смоленский ЦНТИ». - 2007. - С. 95.

8. Зайцев, В.Г. Разнонаправленное изменение кобальтсвязывающей способности сывороточного альбумина под действием различных окислителей/

B.Г. Зайцев, Е.А. Литус, A.B. Жданова// Вестник Волгоградского государственного университета. Cep.ll. Биология и биотехнология. — 2011. -№ 2. - С. 22-25.

9. Литус, Е. А. Влияние белковых компонентов плазмы и сыворотки крови человека на определение ишемически-модифицированного альбумина/ Е. А. Литус, В. Г. Зайцев, О. В. Островский// Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 9. - С. 55.

10. Литус, Е.А. Апробация методики определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови человека для выявления ишемически-модифицированного альбумина/ Е.А. Литус// Мат. 67-й открытой научно-практической конф. молодых ученых и студентов с междунар. участием. Волгоград. - 2009. - С. 36-37.

11. Литус, Е.А. Ишемически-модифицированный альбумин, кобальт-связывающая активность и основные белковые фракции сыворотки крови человека/ Е.А. Литус, В.Г. Зайцев, О.В. Островский// Кислород и антаоксиданты. - 2010. - № 2. - С. 107-108.

12. Литус, Е.А. Ишемически-модифицированный альбумин: маркер или предиктор окислительного стресса?/ Е.А. Литус, В.Г. Зайцев, О.В. Островский// Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека:

Мат. 8-мой национальной научно-практической конф. с междунар. участием. Смоленск: ООО «ТМ Диджитал». - 2014. - С. 117.

13. Литус, Е.А. Кобальт-связывающая способность нативнош и обработанного гирохлорит-анионом сывороточного альбумина/ Е.А. Литус, О.Д. Гаврилина// Вестник РГМУ. - 2007. - № 2(55). - С. 287.

14. Литус, Е.А. Определение ишемически-модифицированного альбумина: клиническая апробация и моделирование ишемического повреждения in vitro/ Е.А. Литус // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Мат. 68-й открытой научно-практической конф. молодых ученых и студентов с междунар. участием, посвященной 75-летию ВолГМУ. Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - 2010. - С. 30 - 31.

15. Литус, Е.А. Определение кобальт-связывающей способности альбумина в сыворотке крови человека/ Е.А. Литус, О.Д. Гаврилина, Е.А. Зайцева// Молодые ученые в медицине: Сборник работ XII Всеросс. научно-практической конф. с международ, участием, посвященной 150-летию со дня рождения В.М.Бехтерева. Казань. - 2007. - С. 218.

16. Литус, Е.А. Определение кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина (методологические аспекты)// Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Сборник работ XIX Зимней молодежной научной школы. Москва. - 2007. - С. 26.

17. Литус, Е.А. Оценка межвидовой вариабельности кобальт-связывающей способности образцов сыворотки/ Е.А. Литус, Н.С. Костерина// Медицинский академический журнал. - 2010. - № 5. - С.101-102.

18. Перспективы анализа кобальт-связывающей способности основных белковых фракций сыворотки крови для лабораторной диагностики. Е.А. Литус, Н.С. Костерина, В.Г. Зайцев [и др.]// Инновационные технологии в медицине XXI века: 1-ая всеросс. конф. молодых ученых-медиков. Мат. конф. Москва. Издательство РООИ «Здоровье человека». - 2012. - С. 298-299.

19. Шишкина, A.B. Влияние окислительной модификации гипохлоритом на химические свойства и лиганд-связывающую способность сывороточного альбумина./ A.B. Шишкина, Е.А. Литус, И.А. Нохашкиева// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Мат. 65-й юбилейной научной конф. студентов и молодых ученых ВолГМУ. Волгоград. - 2007. -С. 29-28.

20. Является ли ишемически модифицированный альбумин продуктом окислительной модификации/ A.B. Рякшина, Е.А. Литус, Н.С. Костерина [и др.]// Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: 8-я Междунар. Крымская конф. Крым. - 2012. - С. 63.

Литус Екатерина Авдреевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 0509 2014 г. ФорматбО х 841/, Бумагаофсетаая. ГаршпураТппез. Учизд.л. 1,0.ТиражЮОэкз.Заказ223/9 .

Отпечатано с готового оригинал- макета в типографии издательства «Перемена» 400066, г. Волгоград, пр. В.И.Ленина, 27.