Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ЛИПИДОВ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ЛИПИДОВ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

J-¡zs&/£

Андрей Петрович БЕЛОВ

На правах рукописи

КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ЛИПИДОВ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

(Специальность 03.00.07— микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА— 1978

ОЫТЬШ

Работа выполнена в Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им, К. А. Тимирязева, на кафедре прикладной атомной физики и радиохимии.

Научный руководитель— профессор, доктор химических наук В. В. Рачимский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Безбородое А. М.; доктор биологических наук профессор Шнльникова В. К.

Ведущее предприятие — кафедра микробиологии Московского Государственного университета им. М. В, Ломоносова.

Защита состоится «^Г» . ..... 1978 г. ~

/С & * ¡¿* ау* 1ма} ММ

в «/£» час: на Заседании Спецйчргизированного товета

К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им, К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, Москва, И-550, ул, Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан «/¿?> . ^ 1978 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета доцент П В. Г. МАРЬЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диссертация посвящена изучению внутриклеточной ком п арт ме нт а л и э ации углеродных соединений дрожжевой клетки. Комиартментализация являет* ся регуляторньш механизмом, действующим на различных уровнях клеточной организации. Наиболее ярко действие этого регуляторного механизма проявляется на уровне органелл н -структур клетки. Изучение регуляторных механизмов клетки— одно из основных направлений современной биологии. Знание физиологии и биохимии микроорганизмов промышленного значения, каковыми являются дрожжи рода Candida, необходимо для эффективного практического использования их полезных свойств.

Работа выполнялась по координационному плану научно-исследовательских работ на 1976—1980 годы по проблеме № 2.23.11, отделения биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединен« АН СССР,

Цель исследований. Цель исследований состояла в изучении субклеточной компартментализации ннзкомолекулярных фондов углерода дрожжевой клетки. Изучали: 1) качественный. и количественный состав компартментов свободных аминокислот (вакуолярного, митохондриального и цитоплазма-тического); 2) состав липидов вакуолей, липидных гранул и митохондрий; 3) кинетику синтеза и обновления углерода свободных аминокислот исследуемых компартментов; 4) кинетику синтеза отдельных классов лнпндов в вакуолях, липидных гранулах и митохондриях.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение состава и динамики обмена углерода отдельных компартментов свободных аминокислот дрожжевой клетки на уровне органелл. Впервые охарактеризован состав липидных гранул и ли-пидный состав вакуолей дрожжей.

Практические значение результатов работы. Компартментализация низкомолекулярных фондов,углерода и динамика их обновления являются важными факторами, определяющими регуляцию клеточного обмена.. Полученные сведения об углеродном обмене при росте дрожжей на глюкозе и н-алканах могут быть использованы при направленном введении производственного процесса — получения белка микробиологическим путем, при составлении математических моделей этого процесса в микробиологической промышленности.

Объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, включает 29 рисунков и 49 таблиц, иллюстрирована 8 фотографиями. Список использованной литературы ключает 285 наименований, в том числе 222 иностранных.

Апробация работы: Результаты работы были доложены на 7-fi конференции молодых специалистов и ученых института «ВНИИ синтезбелок»,и опубликованы в 4-х печатных работах в журналах «Доклады АН СССР», «Микробиология» и «Известия ТСХА».

Теоретические аспекты н предпосылки работы

Современные представления о структуре организации зука-риотической; клетки подразумевают наличие компартментали-зации,' т. е. упорядоченного распределения в клетке макромолекул и пизкомолекулярных метаболитов. Тогда как распределение макромолекул изучено относительно полно, распределение низкомолекулярных компонентов только начинает подвергаться исследованию. Необходимо отметить, что, зная место локализации фермента, нельзя говорить о локализации субстрата (Davis, 1974). При регуляции обменных процессов клетки важна не общая концентрация субстрата в клетке, а эффективная концентрация в месте его метаболизма (Steb-bing, 1974). Таким образом, изучение компартментализации метаболитов представляет большой интерес для понимания процессов обмена и их регуляции в клетке. Однако получение экспериментальных доказательств компартментализации наталкивается на определенные трудности, связанные с выделением интактных структур клетки.

' Наиболее интенсивно изучается компартментализация свободных аминокислот дрожжевой клетки, что объясняется довольно большим размером пула свободных аминокислот, а также участием свободных аминокислот в-большинстве мета; болических процессов {Безбородое, 1975). Многочисленные функции свободных аминокислот предполагают наличие ряда хомпартментов этих соединений на различных уровнях клеточной организации.

Интенсивно начали проводиться также исследования компартментализации липндов клетки. Поскольку липиды, являясь основным структурным компонентом всех клеточных мембран, определяют во-многом их специфичность, они играют огромную роль в метаболизме живой клетки.

Данная работа посвящена изучению локализации ком-партмснтов аминокислот и липидов на субклеточном уровне, определению их состава исследованию их метаболической активности и взаимосвязи друг с другом.

Методы исследования. Характеристика органелл, выделенный из протопластов дрожжей Candida tropicalis

В работе использовал» дрожжи Candida tropicalis штамм ВСБ-30, полученный из коллекции института «ВНИИ синтез-белок». Дрожжи выращивали к среде следующего состава: NH4HjP04 —0,5 г/л; (NH4)2HP04 — 2,0 г/л; K2S04 — 0,2 г/л; MgS04— 0,2 г/л; биотнн —5 мкг/л; вода водопроводная; исходный pH среди составляет 5,5. В среду вносили глюкозу в концентрации 1% или н-октадскан в концентрации 0,5%.

Культуру дрожжей выращивали на скошенном минеральном агаре с добавлением алканов в течение 48 часов при 30*. Биомассу с агара переносили о колбу на 750 мл со 150 мл минеральной среды и 1% глюкозы, или 0,5% н-октадскана. Посевную культуру-выращивали в течение 12 часов при 30' и 200 об/мни в аппарате для встряхивания фирмы Нью-Вра-невик. Культивирование дрожжей проводили в таких же условиях. Время культивации — 8 часов при- выращивании на среде с глюкозой и 12 часов на среде с н-октадеканом.

Протопласты дрожжей получали, обрабатывая клетки дрожжей логическими ферментами из пищеварительного сока улитки Helix pomatia (Заикнна и др., 1970). Контроль за выходом протопластов осуществляли путем осмотического лизиса и последующего измерения экстникции лизата при 600 им (Indffe et al., 1968). Наличие остатков клеточной стенки определяли с помощью люминесцентной мик[*оскошш с приму-лином (Заикнна, 1970).

Для выделения оргаиелл протопласты разрушали в изотопических условиях с бусами Балотнпи 0=0,45 мм. Из го-могената протопластов изолировали вакуоли, митохондрии и липидные гранулы.

Вакуоли выделяли методом флотации п ступенчатом градиенте фпколла согласно разработзнной методике. Митохондрии изолировали методом дифференциального центрифугирования при 10000ХК (Акименко, 1975; Duell, 1907). Ли-пндные гранулы получали методом флоташш в ступенчатом градиенте сахарозы согласно разработанной .методики.

Для изучения морфологии препаратов органелл применяли методы электронной микроскопии, растровой электронной микроскопии, а также методы световой микроскопии.

Оценку чистоты изолированных органелл проводили с помощью метода маркерных ферментов. В гомогенате протопластов и препаратах органелл измеряли активность следующих ферментов; алкогольдегндрогепазы (Тарасова и др., 1972), магний зависимой, олнгомнцнннечувствителыюй адено-зин трлфосфатазы (Schwartz, 1962), НАДФ-Н-цктохром-с ок-сидорсдуктазы (Cartledge, 1972), «-маннозидазы (Van der

Vilden et al., 1973), сукцинатдегидрогеназы (Eies, 1959), глю-козо-6-фосфатдегндрогеназы (Boerinfier), катал азы (Luck, 1963), оксндазы Д-аминокислот, (Parish, 1975), липазы (Звягинцева, 1972), щелочной фосфатазы (Weiss, 1973), оксндазы мочевой кислоты (Muller and Möller, 1969). Фракционирование органических компонентов изучаемых структур осуществляли следующим образом: биомассу гидролнзовали в 5% ТХУ, суспензию центрифугировали. Супернатант содержал свободные аминокислоты, органические кислоты и углеводы, Из осадка экстрагировали смесью хлороформа и метанола (1:1) липиды. Аминокислоты выделяли из кислотного гидролнзата методом ионообменной хроматографии на колонках с катионином Амберлнт CG-120 в Н+ форме. Фракционирование аминокислот осуществляли методом тонкослойной ионообменной хроматографии на пластинках Фикснон 50X8 и с помощью аминокислотных анализаторов. Липиды фракционировали при помощи тонкослойной хроматографии на пластинках Siluíol.

В работе широко использовали метод изотопных индикаторов, который применяли как при изучении состава выделенных органелл, так и при исследовании кинетики синтеза н обновления изучаемых ком партиен тов. Для определения активности НС в биологических образцах использовали жидкостную сцинтилляционную радиометрию. Активность 14С определяли на радиометре-спектрометре Марк П.

.Выделенные препараты вакуолей и митохондрий обладали удовлетворительной степенью чистоты (табл. 1). С помощью

'Таблица!

Активность ферментов в препаратах вакуолей и митохондрий (% от их о кт и зное ти в протопластах)

Фермент Вакуоли Митохондрии

Алкогольдегидрогеназа .... 1.88 Не определяли

Глюко-$-фосфэтдегидрогеназа . . 3.33 4.1

Mg*1—зависимая АТФ-аза , , . 0 Не определяли

Окскдаза мочевой кислоты . .. . 0 0

О кс и да за Д-аминокислот . . . 0 0

Суки к на г дегидрогеназа .... 0 140

НАДФ-Н-штмрос С-оксидорсдук- 10.9 Не определяли

а-маннозидаза . . ..... 803 1,7

G4G Не определяли

метода изотопных индикаторов определен компонентный состав протопластов и изучаемых органелл (табл. 2). Как следует из табл. 2, вакуоли отличаются наиболее высоким отно-

Таблица 2

Компокенткыб состав протопластов и субклеточных фракций дрожжей, вырашейных на меченом источнике углерода

Фракции Источник углерода в пи татсльноб среде Углерод белка, % Углерод лнлядов, ■% Углерод кислотного гидролизата % Углерод свободных аминокислот % Углерод органиче- . ских кислот+уг- ЛСВОДОВ

Протопласты I—6—"С-глюкоза . , . 50.0 ±0,8 18,0 ±0,7 20±1 И,5 ±0,5 8,4 ±0,4

1—"С-октадекэн . . 54,0 ±3,8 30,5 ±0.9 6.5 ±0.5 3,8 ±0,6 2,6 ±0,1

Вакуоли 1—&—1 «С-глюкоза , , . 43±2 32,5±1,5 28,5±1,7 ,25±0,3 2,5 ±0,4

Митохондрии 1—6—"С-глюкоза . . . 48,8±0Л 45,7±1,2 5,5 ±0,4 3,7 ±0,7 ] ,8 ±0.2

1—"С-октадекаи . . . 4 8,5 ±3,2 49,6 ±2.6 1Д±0,9 — —

Липидные гранулы..... 1—б—14С-глюкоза . . . 0,5+2,0 Ш±\2 18,8±0,8 — —

1—|4С-октадекзк . , . ]2,5±3,2 87,4 ±3,1 •

сительным содержанием углерода свободных аминокислот,.а липидные гранулы наиболее большим относительным содержанием углерода лииидов.

Проведенное комплексное морфологобиохимическое исследование препаратов выделенных органелл позволило не только охарактризовать чистоту и состав изучаемых структур, но и показать иптактность органелл. Выделенные вакуоли аккумулировали из среды краситель нейтральный красный, что может служить определенной характеристикой интактности (Indge, 1968). Дыхательный контроль по Чаису для изолированных митохондрий составлял 1,8—2,0 (субстрат а-кето-глутарат), что является показателем физиологической сохранности данных структуру (Тюрин, 1975). Морфологический анализ липидных гранул с помощью растровой электронной микроскопии показал, что размеры и форма липидных гранул сопоставимы с аналогичными структурами, обнаруженными у других видов дрожжей {Clausen et ah, 1974).

Таким образом, выделенные нами препараты органелл были пригодны для изучения компартментализации низкомолекулярных фондов углерода.

Исследование комиартментов свободных аминокислот

дрожжей

Был определен состав свободных аминокислот протопластов, вакуолей и митохондрий дрожжей, выращенных на 1-6-14С-глюкозс.' Результаты определения содержания индивидуальных аминокислот представлены п табл. 3. Как следует из приведенных данных, существенных различий в качественном составе свободных аминокислот не обнаружено, однако, относительное содержание углерода аминокислот в изучаемых пулах различно. Так, содержание углерода глготэминовой кислоты, аланина, лейцина и аспарагнновой кислоты в вакуолях меньшее, чем в протопластах, а углерода аргинина, гнети-дина, феиилаланнна, тирозина и лизина — большее. Относительное содержание углерода феинлаланина, лейцин а, метио-чина, валика, аспарагнновой кислоты в митохондриях выше, чем в протопластах и вакуолях. Математическая обработка показала достаточно высокую степень различий.

Используя данные по относительному содержанию свободных аминокислот в протопластах, вакуолях и митохондриях дрожжей (табл. 3) и величины относительного содержания фракций углерода .исследуемых органелл (табл. 2), была рассчитана доля углерода каждой аминокислоты, локализованной в вакуолях, митохондриях и цитоплазме. Характеристика распределения свободных аминокислот по компарт-ментам клетки-представлена в;табл. 4, откуда следует, что е

игС*1М

Рио.1. Кинетические кривые включения углерода-14 во фракцию свобшних аминокислот вакуолей (I), протопластов (2), митохондрий (3) и

цитоплаэмы(4).

кг с ««

Рис.2, Кинетика включения меченого углероде в аргинин (а) и глутамшонуо кислоту (й) N

протопластов С1), паку ол ей (2) и «итохондрип (3).

аргинин, гистидии, лизин и валнн почти исключительно локализованы в пакуолях! В то же время'в вакуолях локализуется только-32 и 34% углерода глютаминовой и аспарагиновой кислот соответственно. Лейцин-г изо лейцин и метионин распределены между цитоплазмой (41%) и вакуолями (44ч--46%) равномерно. В митохондриях содержится до 25% угле. рода валина и 26% углерода аспарагиновой кислоты от общего.содержания углерода этих аминокислот в пуле клетки.

Таблица 3

Относительное содержание углерода индивидуальных ^аминокислот в % от общего углерода пула свободных аминокислот протопластов, вакуолей и митохондрий

\ Аминокислоты Протопласты Вакуоли Мнто-хондрни

Аргинин.......... 13,8*1,6 24 £±2.8 18.0±0.2

Гистидии , ....... 5,4 ± 1,4 8.5 ±0,6 5.8 ±0,1

Лизин........... 7,2±2,1 11.1 ±2,4 9,7 ±0,1

Фемнлллании ........ 0,53 ±0,09 2.8*1,1 3.6 ±0,2

Тнроиин.......... 1.06 ±0,22 3.1 ±1,2 2,45±0.05

Лейиии+ и1олеДцнн...... ЗЛ7±0,С0 . 2,6±0,G 5,06 ±0.09

Метионин......... 1.71 ±0,48 ' 1.28±0.58 2.8 ±0.3

Взлин ........... 1,81 ±0.38 2,72:1,0 4,7 ±0.3

Алании .......... 11.9±1,0 S,15±0,43

Глншш.......... 2,18 ±0,64 4,1 ± 1,7 10,5 ±0.2

Глутачиновая кислота+треонин+ 41.3±2,6

+серии . . ,...... 22 4 ± 2 5

Аспэрагнновзя кислота..... G£7±0,82 3,9+0,6 18.9±0,7

Х-фракция......... 7,3 ±0,1 9,0±0.9 3,7 ±0,4

Таким образом, нами установлен состав компартментов свободных аминокислот, локализованных в вакуолях, митохондриях и цитоплазме дрожжей С. tropicalis. Показано, что имеются существенные различия в относительном распределении отдельных аминокислот среди изученных компартментов клетки. •■ ■

Было проведено исследование кинетики синтеза свободных аминокислот изучаемых компартментов. Определяли включение углерода-14 из ЬС-НС-глюкозы в свободные аминокислоты протопластов, вакуолей и митохондрий дрожжей. Кинетические кривые включения углсрода-14 во фракцию свободных аминокислот компартментов приведены на * рис. 1. Как видно из рис. I, удельное накопление "С-аминокнслот в митохондриях намного больше, чем в протопластах н вакуолях. Кинетическое равновесие во включении НС в аминокислоты -протопластов и цитоплазмы наступает к J5 минуте инкубации,

Таблица 4

Распределение свобдных аминокислот клетки

Аминокислот Протопласты Вакуоли Митохондрии Цитоплазма1

мгС'ХЮО % мгС'ХЮО % мгС*Х 100 л мС*Х100

мг Сц* мг Сил мг См иг См

Аргинин........... 1,11 ±0,13 100 1,18±0,13 106 0,138 ±0,001 12

0,4» ¿0,11 100 0.40 ±0,03 93 0,013 ±0,001 10 — _

0^8^0.17 100 0,53 ¿0,11 91 0,072± 0,001 12 — —

Фенилаланна* ....... 0,433:0.007 100 0,13 ±0,05 >100 0,026±0,002 — — —

100 0,16 ±0,00 <100 0.018+0,001 — — —

Лейцин+изолейцнн...... 0.27^0,05 100 0,12—0,03 40 0,037± 0,002 14 о.ш 41

Мегиопич ......... 0,14 ±0,04 100 0,0б±0.03 44 0.021 ±0.001 15 0,057 41

Валин , ......... 0,15 ±0,03 100 0,13± 0,05 88 0,034 ±0,002 23 _ —

0^7^0.07 то 0,4 4 ±0,05 77 0,077± 0,001 14 0,051 9

Глутакииокач кислота + трео- 3,33 ±0,21

ния+ссрии....... . 100 1,06 ±0.12 32 0,157± 0.005 5 2,104 03

Лспзрагнновая кислота ( . . . . 0,54 ±0.07 100 0,18±0.03 34 0.139 ±0,005 26 0513 40

0,588 ±0,003 100 0,43 ±0,0 { 73 0,027 ±0,003 5 0,134 23

«Штошшчатнчсский пул определен по разности между содержанием и протопластах, вакуолях и митохондрия*, а Погрешность опенки удельного содержания этих аминокислот очень велика, что не позволяет рассчитать и« удель-дельной доли в отдельных ком парт ментах.

Рис.З.'Кинетические кривые скоростей обновления углерода - свободных,аминокислот протопластов (I), вакуилва(2),1ШТ0*0НдриЙ (3) и цитоплазмы (4),

50 Я «г С мг, ■ 1

41 Л «

м 1 V* и

« . —-^— 1 м

(0 РЛ

: М

Рис.4. Кинатшш обмена меченого углерода аргинина (а) и ■ глутаминовой кислоты (б) протопластов (I), 'вакуолей (2) и ыитохоидрш! (3).

^о.б. Кинвтшвские кривыв вллтоиия угл^рода-И в лнтщи

протопластов И на .в лкпшшюс гранул (4

^уолвп

Г«)""митохондрш1 (3)

в вакуолях к 30 минуте. В митохондриях равновесие не было досигнуто и после часа инкубации..

Изучали динамику включения углерода-14-в индивидуальные аминокислоты компартментов. Получены данные о различной интенсивности включения "С в отдельные аминокислоты. Показано, что во всех исследуемых пулах кислые и нейтральные аминокислоты характеризуются более высокой интенсивностью накопления углсрода-14, по сравнению с основными аминокислотами. К моменту наступления кинетического равновесия (15 мин) доля углерода вновь синтезированных аминокислот составляет для аланина и глицина 40% от количества углерода этой аминокислоты в протопластах, глутаминовой кислоты— 12%, зспарапшовой кислоты— 10% и только 0,8% для аргинина, 1,2% для гистидина и лизина. Относительное количество тнрознна, лейцина и метионина, меченных |4С, в пуле протопластов ниже, чем содержание этих "¿-аминокислот в митохондриальном пуле, но выше, чем в ва-куолярном пуле. Содержание |4С-валина в пулах этой аминокислоты в протопластах и митохондриях близко и выше,-чем относительное содержание "С-валииа в вакуолярном ком-партмеите.

На рис. 2 представлены кинетические кривые относительного накопления С* п аргинине и гл>таминовой кислоте. Как видно из рис. 2, наиболее интенсивно происходит накопление 1'С-аминокислот в пуле митохондрий. В вакуолярном ком* партменте мС-аминокислоты накапливаются с меньшей интенсивностью, чем в протопластах. Определение скорости обновления углерода изучаемых компартментов свободных аминокислот проводили с помощью метода «меченой волны». В качестве соединения с меченым углеродом была использована 1-6-иС-глюкоза, На основании полученных данных построены кинетические кривые скоростей обновления углерода свободных аминокислот протопластов, вакуолей, митохондрий н цитоплазмы (рис. 3). Следует отметить, что представленные на рис. 3 кривые характеризуют скорости обновления углерода бистрообмснижающихся фоидов.амииокислот. Как следует иэ полученных кривых, наибольшей скоростью обновления углерода обладает пул свободных аминокислот цитоплазмы. Скорость обновления углерода свободных аминокислот протопластов примерно в три раза ниже, чем митохондрнального ком-партмента. Удельная активность углерода свободных амино» кислот вакуолярного компартмента возрастает в первые 15 мин. инкубации (рис. 3). Этот факт свидетельствует в пользу предположения о существовании транспорта свободных аминокислот из цитоплазмы в вакуоли. Последующее уменьшение удельной.активности углерода аминокислот вакуолярного компартмента может объясняться налнчием'обратного

потока свободных аминокислот— в цитоплазму. Таким образом. возможно существование транспортной системы свободных аминокислот между вакуолями и цитоплазмой. Обсуждаются вероятные функции этой системы.

Рассчитаны также величины обменных - фондов углерода аминокислот исследуемых компартментов. Обменный фонд вакуолей составляет 2% от углерода всех аминокислот данного компартмента. "Величина обменного фонда митохондрий равняется 20%, а протопластов — 9,5%.

Была исследована и кинетика обновления углерода индивидуальных аминокислот. На рис. 4 в качестве примера представлены кинетические кривые скоростей обновления углерода аргинина и глутаминовой кислоты изучаемых компартментов. Необходимо отметить, что увеличение удельной активности (ИС) аминокислот вакуолей указывает на поступление С*-аминокислот ^ из цитоплазмы. Величина относительного увеличения удельной активности может быть связана с величиной обменного фонда аминокислот в цитоплазм этическом компартменте. Величины обменных фондов аминокислот приведены в табл. 5. Отрицательная величина обменного фонда означает, что в процессе инкубации увеличивается удельная активность углерода данной аминокислоты, что указывает на наличие пула метаболического предшественника. Наибольшие величины обменных фондов основных аминокислот характерны для протопластов. Пул протопластов состоит из нескольких компартментов и поскольку вакуолярный ком парт* мент обладает низкими .значениями обменных фондов, очевидно, что высокие значения обменных фондов протопластов отражают процессы, протекающие в других ком парт ментах, в основном в цитоплазме.

Обменный фонд углерода таких аминокислот, как лейцин, валин, аланнн + глинин, глутамнновая кислота и аспарагино-вая кислота наиболее значителен в мнтохондриальном компартменте (табл. 5). Обменные фонды углерода фенилалани-на и X-фракции в вакуолях н протопластах очень близки.

На основании полученных данных можно предполагать, что как цитоплазма, так н вакуоли представляют собой гетерогенные компартмены свободных аминокислот. Результаты изучения кинетики обновления углерода аминокислот вакуо-лярного компартмента, кроме того, свидетельствуют в пользу предположения об отсутствии изотопного метаболического обмена между обменным и необменным фондами этого ком-компартмента.

Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что вакуолярный компартмект может выполнять функции ре-гуляторного механизма в метаболизме свободных :аминокис-лот;дрожжевой клетки. *: . ■ ■ ■ •

Таблица S

'Величины обменных фондов углерода свободны* аминокислот 1 - протопластов, вакуолей к митохондрий (в % от углерода обмен «ого пула данной аминокислоты)

Аминокислоты Протопласты Вакуоли -Ми то- 1 хоидрин

Аргинин......... . 38 —14.9 . . 17,8

Гистндип , ....... 54 0.87 28.7

—103 , —180 .—45

54 53.4 • 18 -

Тирозин .......... 70 55,9 43

Лейиин+изолеГщин..... 35 12 . 63

Мети он ин......... 72 46 58

В алии.......... . 69 47 76

Алания+глицин ....... 79 45 -90

Глутамнновая кислота + трео- —06 74

нин+сернн........ 50

Аспарагиновая кислота .... 20 —11 66

Х-фракиия ......... 16 18,6 —40

Исследование компартментализации липидов дрожжей

Функциональные и морфологические различия изучаемых клеточных структур дают основания предполагать, что орга-неллы обладают определенным компонентным составом липидов.

Фракционный состав липидов изучаемых структур клетки определяли у дрожжей, выращенных как на 1-6-иС-глкжозе, так и на 1-1(С-октадекане. Полученные данные представлены в табл. 6.

Показано, что липиды вакуолей представлены в основном фосфолипидами и жирными кислотами — соответственно 59 и 26% от общего содержания углерода липидов. Относительное содержание углерода жирных кислот в вакуолях в два раза выше, чем в протопластах. Математическая обработка показала, что достоверных различий между содержанием углерода диглниеридов и эфиров стсринов в вакуоляхи протопластах не обнаружено. Липиды митохондрий характеризуются высоким содержанием фосфолнпидов и жирных кислот, ■ ■

Определение: компонентного состава липидов: жироэых включений (липидных гранул) дрожжей Candida-показало, что углерод триглиперидов составляет 03% от углерода липид* ной фракции этих структур. Таким образом, лшшдлые'гранулы являются основным компартмситом триглццеридов в дрож*" жевой клетке. Относительно низкое содержание углерода^фос-.-

п

Таблица 6

Относительное содержание углерода отдельных классов липидов

(% от общего углерода липнднон фракции)

"Фракции Прото-. пласты Вакуоли Митохондрии Липидные гранулы

Фосфолнпнды + моно- .53,4 ±2.0

58,9 ±3,6 11.1 ±3,5

Диглниериды..... 5.7±2,2 4,3*1,5 4,8 ±1,8 5.9 ±0,2

Стерины . . ...... 1,4 ±0,6 — — —

Жирные кислоты . . . 12,9л 1,7 26.3±1,7 -24,5± 1,4 8,3± 1,4

Хрфракция ..... 0,90±0.38 — 1,4 ±0,4 _

Трнглицериды .... 3.8л 0.7 0,46 ±0,11 11,2±1,7 68,6 ±3,6

Ха-фракиия..... 1,0 ±0,5 — — —

Воска....... 3.7±1,6 5,7±1.9 3,63 ±0,52 3,5 ±2,2

Эфиры стеринов, + угле-

водороды ..... 0,65*0,35 2,0± ] ,0 1,0±0.3 2,39 ±0.2 8

фолипидов (П%) и жирных кислот (8,3%) по сравнению с другими исследуемыми структурами может указывать на участие этих соединений в построении мембраны липидных гранул.

Кинетику синтеза липидов изучаемых структур исследовали с помощью меченого предшественника—1-6нС-глюкозы. Кинетические кривые включения меченого углерода в липиды протопластов, вакуолей, митохондрий и липидных гранул дрожжей приведены на рис. 5. Показано, что наиболее интенсивно накопление нС-липидов осуществляется в,вакуолях. С наименьшей скоростью происходит накопление нС-липидов в жировых включениях. Накопление меченого углеродав ли-пидах митохондрий характеризуется постоянной скоростью, за счет чего к 60 мин. инкубации величина относительного содержания нС-липидов в митохондриях выше, чем в протопластах.

Изучено также включение углерода-14 в отдельные классы липидов исследуемых структур.

Для протопластов наиболее высокий уровень включения МС в липиды показан во фракции жирных кислот и эфиров стеринов. В вакуолях наибольшее относительное включение углерода-14 наблюдается во фракции триглицеридов. В митохондриях наиболее высокий уровень включения обнаружен в эфнрах стеринов. Показан очень низкий уровень включения углерода-14 в лиг.идные фракции липидных гранул. Это позволяет-предполагать, что липидные гранулы выполняют в клетках дрожжей функции запасного компартмента тригли-церйдов.

Выводы

1. Разработана методика выделения вакуолей из протопластов дрожжей Candida tropicalis, выращенных на полной питательной среде с глюкозой в качестве источника углерода. Методика позволяет получать препараты вакуолей достаточной степени чистоты.

2. Разработана методика выделения липндных гранул (жировых вакуолей) из протопластов дрожжей Candida tropicalis, выращенных на полной питательной среде с глюкозой или н-октадеканом в качестве источников углерода.

3. Дана морфологическая и биохимическая характеристики выделенных из протопластов дрожжей препаратов вакуолей, митохондрий и липндных гранул.

4. Произведено сравнительное определение свободных аминокислот в протопластах, вакуолях и митохондриях дрожжевых клеток. Установлено, что удельное содержание свободных аминокислот в вакуолях наивысшее и составляет 25%, в протопластах— 11%, а в митохондриях — 3,7% от углерода органеллы.

5. Определен компонентный состав различных компарт-ментов свободных аминокислот дрожжевой клетки (вакуо-лярный, митохондрнальный и цитоплазматический). Установлены достоверные различия в относительном содержании углерода различных аминокислот в указанных компартментах в условиях квазистационарного равновесия углеродного обмена дрожжевой клетки,

6. Произведена оценка доли индивидуальных аминокислот, локализованных в различных органеллах. Показано, что такие аминокислоты, как аргинин, гистидин, лизин, фенил ала* иин и тирозин локализованы исключительно в вакуолях (содержится около 100% от их суммарного углерода в клетке), а доля массы углерода остальных аминокислот колеблется в пределах 32—88%, Значительные количества глутаминовой кислоты (63% по углероду), аспарагиновой кислоты, метио-нина и лейцина (40% по углероду) локализованы в цитоплаз-матическом компартменте. Митохондрнальный компартменг содержит весь набор аминокислот, определяемый в пуле свободных аминокислот дрожжевой клетки, однако, их доля невелика, обнаружены лишь значительные количества аспарагиновой кислоты (20% по углероду) и валина (24 % по углероду).

7. Проведено сравнительное исследование кинетики синтеза аминокислот исследуемых компартментов. Показано, что имеются существенные различия как в интенсивности и уровнях первичного накопления индивидуальных аминокислот в

Ч »3 .

различных компартмеитах, так.и в интенсивности их обнов-лсиия.

8. Исследование кинетики обмена углерода аминокислот позволило установить, что как вакуолярный, так и митохонд-риальныйкомпартменты обладают быстрообновляемыми и относительно стабильными фондами, однако, доля этих фондов в исследуемых компартментах различна. Обменный фонд углерода вакуодярного компзртмена составляет 2% от общего фонда углерода аминокислот этой органеллы, у митохонд-риального компартмекта эта величина составляет 20%, а у цитоплазм этического 20%, в то время как обменный фонд углерода свободных аминокислот протопластов составляет 9% от суммарного пула.

9. Установлена возможность обмена индивидуальных аминокислот между цнтоплазматичсским и вакуолярным пулами. Такому обмену подвергается не более 2% углерода аминокислот вакуолярного компартмента. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения об отсутствии перемешивания между обменным и необменным фондами свободных аминокислот в вакуолях.

10. Произведено сравнительное определение доли углерода липидов в протопластах, вакуолях, митохондриях и липидиых гранулах дрожжевых клеток. Установлено, что удельное содержание липидоз в лнпидных гранулах составляет 75%, в митохондриях —46%, в вакуолях — 31% и в протопластах— 18% от углерода органеллы.

1. Определен компонентный состав различных компарт-ментов липидов дрожжевой клетки (вакуолярного, мнтохонд-рнального л лннидных гранул). Установлено, что основным классом липидов вакуолей и митохондрий являются фосфоли-пиды. Показано, что *липидные гранулы являются основным компартментом трнглицеридов дрожжевой клетки.

.12. Проведено сравнительное исследование кинетики сип-теза липидов исследуемых компартиентов. Показано, что имеются существенные различия в скоростях синтеза отдельных классов липидов в различных компартментах. Наибольшая скорость синтеза липидов обнаружена в вакуолях и митохондриях. Показана метаболическая инертность липидов лнпидных гранул.

По материалам диссертации опубликованы следующие

работы

1. Выделение вакуолей из дрожжей Candida tropicalis. Микробиология, 1976, т. 45, вып. 5, с, 852—858; в соавторстве.

2* Изучение фондов аминокислот и липидов в вакуолях Candida tropicalis. Известия ТСХА, 1976, вып. 5, с. 21—29; в соавторстве.

3. Исследование роли липпдных гранул дрожжевой клетки в ассимиляции н-алканов. Доклады АН СССР, 1977, т..235, №5, с. 1189—1192; в соавторстве.

4. Выделение и характеристика липидных гранул дрожжей Candida tropicalis. Микробиология, 1977, т. 46, вып. 6, с 1044— 1049;в соавторстве.

Л 107331 17/Ш—78 г. Объем 1 п. л. Заказ 407. ; Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44 .