Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и структурный анализ гена HLA-В27, выделенного от больного анкилозирующим спондиоартритом

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и структурный анализ гена HLA-В27, выделенного от больного анкилозирующим спондиоартритом"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ МЕДИКО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 575.1:616.71/. 72

СЕГАЛ ВАДИМ ЕФИМОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА Н1А-В27, ВЫДЕЛЕННОГО ОТ БОЛЬНОГО АНКИЛОЗ ПРУЩИМ СПОВДИЛОАРТРИТОМ.

( 03.00.15 - генетика )

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЬЬсква - 1991

Работа выполнена в отделе эпидемиологии и генетики Института ревматологии АМН СССР

Научные руководители:

профессор, доктор медицинских наук Л И. Беневоленская профессор, доктор биологических наук А. И. Степанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. С. Шишкин кандидат биологических наук И. № Ундрецов

йздуиая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР им. Е А. Энгелъгардта

Защита состоится "_" _ 1991г. в _ часов

на заседании Специализированного ученого совета (Д.001.16.01) Всесошного научного медико-генетического центра АМН СССР по адресу: 110478 Москва, ул. Мэскворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВЩЯ"Ц АМН СССР Автореферат разослан "_" _1991г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук Л. Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. .

Актуальность проблемы. Учитывая большую социальную значимость ревматических болезней, поражающих более 107. населения, высокую инвалидизацию и раннюю потерю трудоспособности, одной из важнейших задач ревматологии является распознавание этих заболеваний в самом начале их возникновения. Так, .например, для анкилозирующего спондилоартрита /АС/ характерными являются трудности ранней диагностики, высокая временная нетрудоспособность, инвалидизация через 3-5 лет от начала-заболевания [Беневоленская АН, 1986).

Для решения этих проблем нужны, прежде всего, методы, позволяющие определять предрасположенность практически здорового пока человека к развитию той или иной патологии. Имеющиеся на сегодня генетические и ср^довые факторы риска при АС и других воспалительных ревматических заболеваниях, носят обобщенный характер и не могут быть применены в каждом конкретном случае.

Одним из наиболее ^ажных успехов ревматологии явилось открытие иммуногенетических маркеров для некоторых ревматических болезней. Среди всех HLA-ассоциированных заболеваний исключительное место занимает АС, т. к. S0Z больных этим заболеванием являются носителями HLA-E27 антигена /В27/ (в популяции его частота составляет 7-9Z) CBrewerton D. A. et al., 1973, Schlosstein L. et al., 19731. Столь высокая частота встречаемости этого антигена у больных, по общему мнению, свидетельствует о том, что oii 'прямо или косвенно

участьует в детерминации АС. Генетические, иммунологические и биохимические подходи, использовавшиеся для изучения этой связи, не доли пока исчерпывающего ответа С Сегал Е Е., 1987].

Таким образом, вследствие неоднозначности и малой ин-Нормативности имегдахся данных, касапщихся роли Е27 в эгио-патогонезе ЛС, возникла необходимость в исследованиях на генном уровне, целесообразность проведения которых в данном случае становилась все более очевидной по мере совершенствования технологии рекомбинантных ДНК и накопления сведений о генах ША-системн. В конечном счете такие исследования должны привести к установлении первичного генетического и соотьетствукхцего ему ключевого метаболического дефекта, с которым связано развитие болезни. В связи с этим в ходе диссертационного исследования предполагалось провести клонирование и структурный анализ гена ГС7, выделенного от больного АС.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы било выявление предполнгнеккх структурных особенностей гена Е27, выделенного от больного АС.

Для дос тик'ни я этой цели Сыпи поставлены следуадю экспериментальные задачи:

1. Создание геномной мини-библиотеки ДШ Е27-положительного больного АС в плгомидном векторе на основе дчншх предварительного Саузерн-анализа

2. Проведение скрининга полученной библиотеки с по' мощью В27-специфического олнгонуклеотидного эонда и выделе-

ние нескольких положительных клонов.

3. Идентификация клонов с помощью рестрикцнонного картирования.

4. Секвенирование полной последовательности гена ЕЙ7 в рамках клонированного Фрагмента ДНК.

5. Сравнительный компьютерный анализ секвенированной последовательности клонированного гена

Научная новизна работы заключается в том, что с помощью усовершенствованного метода клонирования специфических последовательностей ДНК был впервые клонирован и полностью секвенирован ген В27, выделенный от больного АС из семьи с повторным случаем заболевания. В 5' -фланкирующей области клонированного гена впервые выявлен ряд специфических Перестроек ДНК, которые могут Сыть связаны, с развитием АС.

Практическая значимость работы состоит в том, что на основе полученных результатов могут быть в дальнейшем разработаны новые способы диагностики-, а затем, возможно, и патогенетического лечения В27-ассоцш1роваиных заболеваний.

Положения, выдвигаемые на заглту.

Г. Впервые клонирован и полностью секвенирован Еыесте с фланкирующим«' его районами ген К7 (4439 к. п.)', виде ленный от больного А'С из семьи1 с повторным случаем этого заболевания.

2. Белок-кодируют последовательность выделенного гена не отличается от таковой' у подтипа К1А-В*2702.

3. В пределах 5'-фланкирующей области клонированного гена впервые обнаружен ряд специфических перестроек ДНК, которые могут скаэиеаться на его тканеспецифической экспрессии и, в итоге, возможно, при определенных условиях приводить к развитию АС.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на научных конференциях отдела эпидемиологии и генетики ревматических заболеваний Института ревматологии АМН СССР, (1988, 1989, 1990 г.г.), конкурсе молодых ученых Института ревматологии АМН СССР (январь, 1990г.), на семинаре Лаборатории молекулярной генетики человека Института молекулярной генетики АН СССР (ноябрь, 1990г.), межлабораторной научной конференции Института ревматологии АМН СССР (февраль, 1991г.).

• Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура и об1^м работы. Диссертация состоит из введения, экспериментальной части (ьключаксий описание матери-■ алов и методов исследования), результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Диссертация изложена на 94 страницах и содержит 1 таблицу и 13 иллюстраций. Список литературы вклшчает 114 источников, из них 7 отечественных и 107 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И ИСТОДЫ

Отбор и клиническое обследование больных АС и членов

их семей осуществлялись сотрудниками отдела эпидемиологии и генетики ревматических заболеваний Института ревматологии АМН СССР. При этом использовались Ныо-йоркские критерии диагностики для АС (Gofton J.Р. , 1968). HLA-типирование пациентов и их родственников проводилось здесь'же с использованием стандартного лимфоцитотоксического теста по локусам HLA-A, -В и -С.

Большинство манипуляций с ДНК (выделение, гидролиз рестриктазами, электрофорез, клонирование и т.д.) проводилось в соответствии со стандартными методиками, изложенными в книге Маниатиса Т. и др. "Методы генетической ингенерии. Молекулярное клонирование" СМ. , "Мир", 1904), иногда с модификациями.

В качестве пробы для блот-гибридизации использовался предварительно переклонированный в фаг М13 mpl8 HLA-B-cne-цифический Фрагмент HLA-B8 гена, любезно предоставленный Н. Т. Orr из университета г. Миннеаполиса, США. Мечение пробы фосфором проводилось с использованием гибридизационного праймера, синтезированного А. В. Ажаевым. Предгибридизацию и гибридизацию фильтров с Иммобилизованной на них ДНК проводили при 43"с в 50* формамиде согласно рекомендациям фирмы. "Bio-Rad". «Хильтры отмывали один час в растворе 0, lxSSC+ 0,1% SDS при комнатной температуре, три раза по 0,5 часа в том же растворе при 68*С. После этого фильтры экспонировались 2-5 дней при -70°С с усиливающими экранами и рентгеновской пленкой.

Клонирование В27 гена осуществилось по результатам

- б -

анализа фрагментов ДНК по Саузерну с помощью усовершенствованного метода направленного клонирования специфических фрагментов ДНК, первоначально предложенного R. D. Nichols с соавт. (1985).

Для этого ДНК отобранного больного обрабатывалась сначала рестриктааами Sal I, ИtndIII. Clal, Pvul, GnaBI, которые по данным Саузерн-аналиэа не имели сайтов узнаваг • в клонируемом фрагменте ДНК (в течение трех часов с пятикратным избытком), а затем (после финальной депропинизации и переосаждения спиртом) в тех же условиях - рестриктааами EcoRI и ВллН!, по которым и проводилось клонирование. Продукты [Ч'стрикции ДНК для клонирования выделяли путем препаративного ядектрофорсла в геле легкоплавкой агарозы по стандартному методу. /лгированио проводилось по сайтам СосГ.!-Вл.-.Ч1 плазмидн pUC19 в стандартных условиях. Транс-форм-цут рекомбинантными плазмидами клеток Е. col i итамма XL blue проводили по катоду Т. Hanahan (1983) с модификация-ил. Д."л скрининга полученной мини-библиотеки использовали I27-c!K»uairaV.'CK;tñ д:.^^"йчгекныЛ олигонуклеотидный зонд, сикто^ированиый к. Е fowim Для анализа библиотеки бактериальные колонии переносили на нитроцеллшозние фильтры и подражали ночь на LB-агаре с ампициллином. Колонии на фильтрах диэпровались (10Z SD3, б млн.). затем ДНК в них С;¿-а дэнатуриропака (1.SM NnCl-Ю.БМ КаОН, 5 мин.) и нейтрализовала (1Мтрис-НС1, рН 7,С). Гибридизация с меченым по .5*-концу однгонуклеотидом проводилась при Б2°С по стандартному ыэтоду. Огшька фильтров от несвязавкейся пробы осу-

ществлялась в следующем режиме: три раза по 1Q минут при комнатной температуре в растворе 4xSSC+0,1ZSD3 и затем в течение 30 минут в том же растворе при температуре гибридизации. После этого фильтры экспонировались в течение часа

о

на -70 С с рентгеновской пленкой.

Нуклеотндная последовательность клонированного гена определялась по двум цепям по методу F. Sanger (1077) с помощью 24 синтетических олигонуклеотидных праймеров и секве-назного набора, включающего Секвеназу-2. О (фирма "US Biochemical Corp.") в соответствии с методическими рекомендациями этой же фирмы.

Хранение и компьютерный анализ полученной генетической информации производились с помощью пакета программ "Microgenie" фирмы "Beckman" (Австрия) на базе банка генов "GenBank".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Клонирование гена HLA-BK7, выделенного от больного анкилоз ирующим спондилоартритом из семьи с повторным случаем этого заболевания.

Наличие данных о полной нуклеотидной последовательности вариантов В27 гена, встречающихся у кавказоидов CSeeman G. Н. et al., 1986, Weiss E.H. et al. , 1985], позволило использовать метод направленного клонирования специфических последовательностей ДНК, предложенный Nichols R. D. et al., (1985) для генов с уже известной структурой. В ходе выпол-

Кения исследования этот метод бил усовершенствован таким образом, что его можно было использовать и в тех случаях, .кнгда участки ДНК. фланкирующие секвенированные нуклеотид-ные последовательности, неизвестны, а клонировать их - необходимо.

4 * Суть предлагаемого подхода заключалась в следующем. Известная нуклеотидиая последовательность Б27 гена со всеми имеющимися вариантами подвергалась компьютерному анализу с целью поиска рестриктоз, не имеющих в ней участков распознавания. Таких рестриктаз было обнаружено 18, из которых 10 (EeoRI, EcoRV, BamHI, Clai, Pvul, Hpal, SnaBI, HmdlII, Ndel, Salí) были использованы при проведении Саузерн-анали-еа. Для этого, опираясь на уж/? известный факт, что полный Е27 ген расположен в EcoRI-фрагменте ДНК, длиной С,5 т. п. н. CCoppln Н. L., bkDavtU Н. О. , 19961, с помощью гибридизации с HLA-B-локус-специФической ДНК-пробой были подобраны рест-риктаэы, -не имеющие участков узнавания как в самом гене, так и в еще несеквенированных фланкирующих его участках в пределах фрагмента 6,5 т. п. н. С этой целью было отобрано несколько Е£7-положительных больных АС из семей с несколькими случаями этого заболевания. Такой подход позволил отобрать индивидов, у которых вклад генетической компоненты в предрасположенность к .возникновению болезни был наиболее высок. Ей» одним важным критерием отбора являлось то, что нуклеотидная шш хотя бы аминокислотная последовательность второго аллели В-локуса должна была быть уже известна. Это требоййлэеь гиса усгзгсного выбора структуры необходимого для

скрининга библиотеки В27-специфического олигонуклеотиднога

#

зонда, который не должен гибридиэоваться со вторым HLA-B-аллелем. В итоге, для блот-гибридизационного анализа и клонирования гена В27 был отобран больной (HLA-B27, -В40), сын которого (HLA-B27, -В35) также страдал тяжелой формой АС. Образцы геномной ДНК этого больного обрабатывались парами рестириктаз: EcoRI+BamHI, EcoRI+SnaBI, EcoRI+Sall, EcoRI* Clal, EcoRI t-HindllГ, EcoRI+PvuI, EcoRI+Ndel, EcoRI+EcoRV, EcoRI+Hpal (в качестве маркера использовали EcoRI-рестрикты ДНК того же больного).

В результате блот-гибридизационного анализа этих образцов с HLA-B-специфической пробой было показано, что гены В-локуса содержатся в EcoRI-Barrel-фрагментах ДНК длиной приблизительно 6,0 т. п. н., которые не имеют сайтов рестрикции для Sali, Н1 ndIII, Clal, SnaBI, Pvul (рис. 1). Дополнительную полос у гибридизации около 8 т. п. н. при обработке ДНК рестриктазой EcoRI дает перекрестная гибридизация пробы с .HLA-C-локусом.

С учетом полученных данных проводили препаративный электрофорез 300 ыкг ДНК больного, обработанной рестрикта-зами EcoRI, BamHI, Hindlll, Pvul, SnaBI, Clal и Sali. После этого продукты рестрикции ДНК длиной 6,0+0,5 т. п.н. были выделены из геля и клонированы по сайтам EcoRI и BarcHI плазмиды pUC19. Таким образом была получена мини-библиотека из 280 рекомбинантных клонов. Согласно теоретическим оценкам (см. таблицу 1) она должна была'быть репрезентативной по В27 гену- Скрининг шганотеки проводили с помощь» олиго-

8.06.5-

i г Ъ Ч 5 6 У 2 9 10

■F

------ - ••-"

■■■■''■.'«чт '■'•■i'.it

: • . . im

■ • • '-m

... - : ■ ЖЙГ <еэ & «s» о _ .

° ез^'Л

О о О© '«ST

Я» ^

'/•'"иг,.'... • í

tmni Г.

• г. *>

.. .i. * ■ ■ - " ' '] 'j

V ' Ï iifiirrfwAt^f Ulf

Рис. I. ADTopajworpai.wa йлот-гнбрйдизации рестриктов тотальной геномной ДНК больного анкилозкрушЕм спондкло-артритом с Н1А-1>-спещ:}кческоа пробой. 1 - Eco SI| 2 - loo DI + Вша Hit 3 - Eco HI + Ena BIj 4 - Eco RI + Sal I| 5 - Eco RI + Cía I» 6 - Eco RI ♦ Hlai III» 7 - Eco fil ♦ Pvu I; В - Eco RI 4 Ilde Ij 9 - Eco RI + Eco RVj 10 - Eco El ♦ Нра I. Цвфрама слева указаны размеры фрагментов ДИК в т.п.н.

Таблица I. Теоретические оценки репрезентативности плазмидной клонотеки для уникального Фрагмента ДК длиной 6 т.п.н. на диплошишй геном /6х109 п.н./

Количество ферментов 0 I 2 3 4 5 6 7

Количество •

клонов, необ-

ходимых для Ю6 2х105 4хЮ4' 6хЮ3 1600 320 64 13

получения реп-

резентативной *

клонотеки

нуклеотидного зонда 5' -CAGATCTGCAAGGCCAAGGC-3', комплементарного В27-специфическому участку второго экзона искомого •Гена. Было выделено шесть положительных клонов В27-1, В27-2, В27-3, Е27-4, В27-5, Е27-6 . Один из них, В27-2, был взят эа основу для дальнейших исследований.

Таким образом, техника направленного клонирования специфических последовательностей ДНК вместе с использовавнием В27-специфического одигонуклеотидного зонда позволила нам уменьшить в тысячи раз количество рекомбинантных клонов, KOTopt*? требовалось скринировать, чтобы выделить искомый ген и, кроме того, обойтись без тран:фекции клонированных генов в мышиные L-клетки для подтверждения их серологической характеристики.

Цукл^отидная последовательность клона РВ27-2.

JV<m удобства дальнейших исследований рестрикционный фрагмент EcoRI-Pst I (4,4 т. п. н.), полученный в условиях частичного растепления рестриктазой Pstl вставки клона В27-2, был реклонировам в плаз ми ду pGEM-3Zf(+). Рестрикци-онное картирование полученного клона РВ27-2 с использованием рестриктал Sacl, PvuII, Pstl, Smal, Bfflll, Kpnl, ХЬа! подтвердило наличие в нем полного гена В27 (рис. 2).

При секвенировании клона РН27-2 по Сэнгеру использовался набор из 24-х 18-членных праймеров, синтезированных на основе у» известных последовательностей HLA-B*2702 и -В*270б tSeeman ÜH.A. et al., 1986: Weiss Е. К. et el., 19851. Расположение праймеров, их нумерация и направление секвенироваяия указаны на рис. 26.

В итоге была секвенирована последовательность ДНК дли-,

icoPJ

PstI

Se $m X SmPsBSatKSvPrK Ps Pf Sc

3ScXPt>

I I 1 IMI M К I

LLLL

12 3 t ■ S

s 7 е/з-н.р.

SCOHM.

а/ Л

П га • ЕЯ

Рис. 2. Схема организации рестрикционная карта ДНК клона РБ27-2, содержащего ген Н1А-Б27 в составе Eco EI -Pot I-фрагмента ДНК длиной 4,3 т.п.н. Прямоугольниками обозначена ДНК вектора. Se - Sac I, Sm - Sma I, X — Xba I,

Pe - Pet I, В - Bsl' II, К - Kpn I, Pv - Pvu. II.

а/. Схема экзон-интронной структуры гена HIA-B27 [ni], ориентированная в состаЕе клона РВ27; заштрихованными прямоугольника)® (1-8) обозначены экзоны, З'-н.р, - 3»-нетранслируемый район. . .

> б/. Схема секвеннрования вставки клона РВ27-2 о помощью синтетических праймеров.

ной 4439 п.н., которая по данным компьютерного анализа содержала полный BS7 ген и протяженные фланкируквде его области. Кахдая обнаруженная перестройка ДНК проверялась на двух других независимых клонах, также содержащих ген Е27 (В27-1, -4).

Сравнительный .структурный анализ клонированного подтипа HLA-P27 гена.

Сравнительный структурный анализ нуклеотидной последовательности (члонироьанного гена показал, что он представляет собой новый серологически не выявляемый подтип гена К7, ^ сформированный4в результате реципрокной межаллельной реком-' бинации и точечных мутаций. Представленное на рис. 3 сравнение нуклеотидной пос'леД'ой'а'^^ьности' второго экзона и прилегающих К' н'бйУ y*i&e¥Köö' ЙЖ äioio iend с' ранее опубликованными1 соответствующими' последовательностям двух подтипов HLA-B*"2705 [Seemann G. Н. А. et al. , 1986, Weiss E. H: et al. , 19853 йодного HLA- B*2702 [Seeirar.n G. H. A. et <Й.-, 1986] с очевидностью, на наш взгляд, свидетельствует о том1,- что вы-делёнйый' Нами ген и ген HLA-B*2705 [Seemann G. Н. Ä. et älv ,• 19863 я:6л#кй?6я!,- в1 ос/товйоМ, peäfi&Häioü ре^Ойбй'йацйОн'ноГо события' МежДУ й^бдйШ форШ.М HLÄ-B*2702 CSeenmnn' Gl-H.A. et al. , 19Ш vi HLAB*2705 [Weiss E. H. et al. , 1985]. Этот вывод основан на Töiii1,- что клоМровайЙЕй? refi ißfeef во втором экзоне (дом'ен^'1) эггй'топ (йа 3 вьщеДей райКоЙ), характерный для1 подтипа НЫ-Ё'^ёУОё С Seemann . G. Н. А. et al., 1986], ä весь остальной fett,- з& йс'ключеййей 5"'-фланкирующей области, практически не отличается от йоследовательности

ЙЗНЗМКУРНТ

1 кООАЗ'САЗ'^иоЛ С0А >>?3' СЛ Л84С ^ --------------------------------- -----------.------------------

3 -------------С-----------------Д-----------------------------

4 -------------с------------ ------д-----------------------------

1 ЭКЯ0Н2 10

1 <гдг:зба:стсАСххг:птсга 900

2 ------------------------------------------------------------

3 ------С----7----------- ------------------------------------

•1 .....-С----Т.............

и

г*

г» ...........

4-с - - -........

1 ССи767ССПС07С'С&70С(*7030'~ АоС0ССи077С А~С АССОТбСо"! АСиГСю АС5АС А 96С

0 ____ _____________________________________________________

3 ---------------------------------------- ---------------

/ ___________________________________________„________ .._______

иЗУЗйР(ЗКСЕРКК1 Т V в У V э о

2а --------------------

ие......--------------

------------------- .

1 ССШи770С73А0377С6А0А0СиЛССГ'СС>^~А07П^ 1020

3 ........------------------------------------------------------

4 -----------------------------------------------------------------

иТЬРУКРОЗОААЗРЙЕЕРКЛР

¡а --------------------

.......

4* --------- -.....

г,О 70

1 С0}Л7Л0А!У7.53АОТ"Л7Ск~ЛиТА773Т1нС^^^ 1 ООО

и V I Е о Е- в Р Е У V 0 К Е Т <г I СКЛК

4Я

■ла

С ДСЛ'З А СТ ПА ССЗЛП АС ........- г--•-и « -о ДА0С7 СУХО А1 С«*У\ „„ „ „ .ТСГоТГАСТАСААСОАОАиССАив^СЗ

Л <} Т 0 К Е Н Ь К I А й - - Т Ь О - - т ь ЬКУУНОЗЕА

1 С7иЛГ7ГСАОСОгаЗОССОЗЗ Са7А0аТСАС0ЛСТССССЛ7СССССАС6ТАСи(5ССС6СиТ 1200

2 ~....................-.....—........----------------------

3 .................---в---------------------------------------

4 ..............-.....С---------------------------------------- .

Рис. 3. Структура ал-кль-спецпГичеекого участка (выделен рамкой) и прилегагщх. к нему районов клонированного гена Н1,А-Р*27025 (нуклео-тидиая последовательность обозначена цифрой 1, аминокислотная - 1^0, и генов Н1.А-Е*2705 (2 и 2*), -В*2702 (3 и И -В*27052 (4 и 4#).

- 16 -

ДНК подтипа HLA-B*2705 [Weiss E.H. et al. , 1985].

Таким образом, выделенный ген, фенотипически являющийся подтипом HLA-B*2702, оказался последним недостающим звеном в тетраде антигенов гистосовместимости, включающей в себя, как исходные, так и рекомбинантные молекулы, что является доказательством факта реципрокной межаллельной рекомбинации участков HLA-генов. Такая рекомбинация может быть обусловлена, по общему мнению, необычно высоким накоплением G- и С-нуклеотидов в интронах, фланкирующих полиморфные вторые и третьи экзоны, что позволяет, по-видимому, формировать при "перетасовке" экзонов стабильные дуплексы.^

В свете ёышеизложенного представляется целесообразным во избежание путаницы в названиях между клонированным нами подтипом HLA-B*2702 и HLA-B*2702 [Seemann G. Н. А. et al. . 1986], а также между HLA-В*2705 [Seemann G. Н. А. et al., 1986] и HLA-B*2705 [Weiss E.H. et al. , 1985], обозначить "рекомбинантные" молекулы соответственно HLA-B*27025 и HLA-В*27052, а названия исходных форм оставить без изменения.

- Еще одним важным результатом сравнительного структурного анализа клонированного гена HLA-B*27025 оказалось" то, что кроме нескольких, по-видимому, малозначимых нуклеотид-ных замен в интронах и 3'-нетранслируемой области, он имеет ряд специфических особенностей в 5*-промоторной области. Так, в пределах участка ДНК, локализованного между -229 и -186 нуклеотидами перед точкой инициации транскрипции (на рис. 4 выделен рамкой), и соответствующего консервативной цис-действующей регуляторной последовательности генов ГКГС I класса (CRE), обнаружены три точечные замены, одна из ко-

1 - 17 -

1 АТСнТТСЛСхмАТТАССААТАТТаТССТАССТАСТАТАТТАДТ^ЛАСАААДДбЗДААСТЭ СО

1 0ТСТСТАТ6АСЛАТСТСТ6ТСТ5оТС5СТТСДеЛСААААСТТСЗССА66ТТТА6АЗАЗАА 120

1 ААССССТБТС7СТАСАССТССАТТСССАССГ>ССЛГ»!Т7СЛСТСТСТС^САТСАА'ЗТТСТСС 180

2 . ----------------------------

1 6ТЗАТСЛаТТТСССТЛСЛСААаАТССАА5А6САЗА5(5ТДАЗЗА5ТаД5Д"Л0АезЗЛ6ТС 240

2 -----------------------------------------------------------

1 САЗТТСДОЗОД^ОЗОАТТ'-^ДЗЗДОЗЛЗЛЛЗ^ "рЗЗТО^С^О^ДСДТДГЗ 300

2 --------------------------------------------1------------ГЛ --

1 соззтстстсо

о ___________

''ЗСТТТССАСАВЛСЛиДТССТТа Г^ССКАСГГСЛОЗСАПАСАиГСзГиАС 300

1 АААЗАОиСТОЗТЗТАСДАЗААЗЛснЗЗАТСА аА^'аААС:^СОАнЭЭ?-СС^ЭЗиС(жС-СТСТ -520

--(Ж-

1 САОиСТСТСАЗОСТССЗ; .~Л0ССТ76 ГГТа^АТТСС/^дгесСОЛГ^АТТГхТхЗАТТССС 400 ............................-------------

1 СтрТСССДСбАОТТТСАСГГТСТТСТСССААССТАТЗТС^ССТТСТТССАОЙАТАСТС 540

1 СТСЛСССоГССССАТТТСССАОТСССЛТТЗГгЗТПТСйЗаТбТСТ АЗДЗААЗдГААТСАЗТ ООО

2 .............-.......................................ггг^....

3 ----------

4 ----------

1 6ТС'ХС533СГГСССАЗТТСТЛЛЛЗТССС0АС53АССЗДС'СЗЗЗДСТСАСЛАТСТСС7СДЗ С.оО

3 ---------------;>-.............................................

4 —----------------------------------------------------------

ЭК30Н1 -20 -10

1 ЛСОССОЛПЛТСССГДТСАСетзХСССОЛАСС 720

2 ------гг----------------------------------------------------

3 ----------------------------------------------------------

4 ..........—------------------------------------------------7-

МЯУТАРГ?Т1.1-Ь1,ЬУ6АУ

3а

4.я .......

Рис. 4. Строение Б'-франкирующей области гена К'ьА-В*27025 (нук-леотидная последовательность обозначена цифрой 1, аминокислотная - 1/) в сравнении с соответствующими последовательностями генов НЬА-В*2705 (2 и 2К), -В*2702 (3 н а?) и -В*27052 ( 4 и 4*). Области СРЕ и СЯЕ' выделены рамкой.

- 18 -

торых (в позиции -200) является, по-видимому, уникальной.

Как было показано ранее [Burke et al. , 1989), в пределах мышиной CRE-области существует три независимых участка ДНК (на рис. 5 они обозначены I, II и ill), с которыми связываются некоторые ядерные регуляторные факторы (KBF1, H-2TF1, NFkB, АР-1), обеспечивающие как тканеспецифическую экспрессию антигенов гистосовместимости 1 класса, так и регуляцию их экспрессии на различных стадиях онтогенеза: И, хотя относительный вклад этих субрайонов в энхансероподоб-ную активность CRE-оОласти у человека не известен, не исключено, что мутации, обнаруженные в пределах субрайона Ity

I »

могут влиять4 на тканеспецифическую экспрессию гена HLA-В*27025 или работу его в специфических физиологических условиях.

Кроме того, при поиске каких-либо необычных повторов в пределах клонированной последовательности ДНК, было обнаружено, что участок ДНК, находящийся в позиции От -385 по -357 по отношению к точке инициации транскрипции (на рис. 4 также выделен рамкой), имеет высокую гомологию с субрайонами I и III CRE-области. Практически идентичный участок", как показано на рис. 5, обнаружен также в уже опубликованных последовательностях генов h'LA-Ol и -Cw2 [Gussow D. et al. , 1987], но ' не в KLA-A2 [Koller В. H., Orr H.T. 1985] и '-A25 [Zinszner H. et al., 1990]. Особенности гомологии этого участка с соответствующими последовательностями ДНК генов HLA-B*2705, -Cwl и -Cw2, свидетельствуют, по-видимому, о следующем; в предковом гене HLA-C локуса произошла дуплика- ; ция фрагмента ДНК, включающего субрайоны I и III СНЕ-облас-

—-CRE-

-"СО -210 -200 -190 XIX

HLA-B*27025 GAG?CTTG7CTCCATTGO"GAGCC5CAS'^VrTuOGGATTCCCCA

- И --- X -

HLA~B*2705 ---------------------------CAG--------------

HLA-B7 -G---GG-------A-------------G..............

HLA- BwC>4 -G----С......................G--------------

HLA-B33 -G----С-----T--..........G—3..............

HLA-B39 -C----С------T-...........G---G--------------

HLA-A3 AG-- Tu—AA-G---------7-C-'—C-- ------------

HLA-A24 --G-GG—A--G---------Т-Г----,>- -----------

HLA- АГ, - - G- GG- - - A- - G---------T- С----С--------------

H'l.A- A2G AGG- GG- A- A—G-........T- С----С..............

HLA- Cwl - G- - - G--------С.....-.....С- - G- - - A------7- - -

HLA-CV2 -G---G--------С...........С- - G— A------7---

-200 -190 -1 SO -170 -ICO

H-2Kb ' C--TGAG— A-GGG------A--0---GX---------------

H- 2Ld C—TGAG- - - A- GGG------A- -С- - - CGO.............

- CRE'-

-P80 -370 -oCO

HI.A-B*27C25 С—7G---------C-G----7C--T--C

HLA-P*27Crj C---7G-----С A C-G----7C--7--C

HLA- Cw 1 C- - C7G--------C-G----7C- - T - - С

HLA-Cw2 C--CT--------C-G----TC-T-C

HLA-A2 С----COOATGC^G- G3-TTTC- С- -T7G

HLA- A20 .С----CCCATGX- AGCG777C7-C--TT

Рис. 5. Сравнительный структурный ашииз нуклеотидной последовательности энхам'^рнсЛ С£с-области (субрайоны 1, И, 111) и СКЕ-подобного участка (CRE") гена !¡LA-B*27025 и некоторых других HLA- и И-2 генов I класса. Цифрами показано расстояние до точки инициации транскрипции.

ти в участке с -3S5 по -357; затем произошел межлокуеный ' обмен дуплицированного участка с предковым В27 геном. Результатом всего этого явилось то, что перед Е27 геном, как и перед h'LA-C генами оказался второй CRE-подобный участок, названный нами CRE', который в каких-то случаях, по-видимому, может служить "ловушкой" для белковых регуляторных факторов, взаимодействующих с субрайонами I и II! CRE-области. И не исключено, что именно наличие дополнительной CRE'-об-ласти приводит как к пониженной экспрессии, которая отмечена у генов С-локуса [Sodoyer R. et al., 1934], так и специфически изменяет экспрессию В27 гена. ^

Таким образом, кйк нам представляется, существует t

большая ъерошюсур f or®, .<да вследствие либо мутаций в CRE -области, .либо доноднда.едьшго CRE'-участка, нару-

ваетоа тканеспецифическая экспрессия В27 гена или работа его э .специфических ^из^одог^ческ^х условиях.

:Этн предположения, э дроде .очередь, хорош согласуются й ,гдоот.еаой '-'артритогедного пептид^'', «едавно предложенной R. ¡Benjamin и P. Pafham (1990), по мнению которых АС является .следствием ^утореактивного Т-,клеточного ответа на'пептиду, рстречающиеся только р суставных тканях и специфичес-)си. .связывающиеся ,с молекулой В27. В обычных условиях, по мнедвд авторов гипотезы, этот пептид в тех количествах; в (лоторух он синтезируемся, не может обеспечить соответствующую ^оцщрру® селекдаю или инициировать иммунный ответ. Олццка, .бактерии, некоторые белки которых, по-видимому, даекр с щц структурную гомологию, могут сенсибилизировать f-fiWfiqf, в результате чего повысится порог их чувствитедь-

ности и они начнут взаимодействовать с интзктными артрито-генными пептидами. Предложенная гипотеза является ?-клеточ-ным вариантом гипотезы молекулярной мимикрии rEbringer А. , 1983]. Однако, не исключено, ' что причина отсутствия нелокальной иммунной селекции артритогенньгх пептидов состоит -не в недостаточном для индукции толерантности их количестве, как считают авторы гипотезн, а, именно, в нарушенной так, или иначе, тканеспецифической экспрессии В27 гена, в результате чего тот не может ка должном уровне презентировать артритогенные пептиды зФ^кторным лимфоцитам и, как следствие, обеспечить их полноценную клональную селекцию.

Дальнейшее изучение различных аспектов экспрессии Б27 гена у больных АС и здоровых индивидов, a ?a.w особенностей Функционирования промоторной области сотого гена in vivo и in vitro может, по нажму мнению, оказаться- перспективным при исследованиях возможных механизмов возникновения АС.

Кроме того, 1 Тестирование с помощью PCR-техиологии обнаруженных в 5'-фланкирующей области клонированного гена • перестроек ДНК, • проведенное у Сольных АС и здоровых индивидов, позволит, rio нашему мнению, выявить Формальную роль 1527 гена ь детерминации AC. R случае подтверждения предполагаемой ассоциации обнаруженных нами первичных генетических перестроек с АС, можно будет разработать эффективную прогностическую ДНК-пробу на эту 6о.гезиъ. В дальнейшем на модели АС могут быть разработаны подходи к изучению молекулярных механизмов предрасположенности к болезням, находя-вдмся в неравновесном сцеплении с HLA-антигенами, выяснен механизм их патогенеза

выводы.

1. С помощью усовершенствованного метода направленного клонирования специфических последовательностей ДНК был клонирован и впервые полностью секвенирован ген Н1.А-В27 (4439 н. г..), выделенный от больного анкилозируюаим спон-дилоартритом иг.- семьи с повторным случаем этого заболевания.

2. Компьютерный анализ структуры клонированного гена показал, ЧТО:

- его Селок-кодирующая последовательность не отлича-'»

» . ■ ' етсн от таковой у подтипа Н1А-В*2702;

- он представляет собой новый серологически не выявляемый подтип - НЬА-В*2702Г, образовавшийся в результате реципрокной металлельной рекомбинации и точечных мутаций; .

- в пределах консервативной энхаисерной регуляторной последовательности НЬА-генов. I класса СКЕ выявлены три точкзвые мутации, одна из которых (в позиции -2С0) является, по-видимому, уникальной;

' - перед СКЕ-областью (участок с -385 по -357) обнаружен ее дуплицированнкй дериват.

3. Выявленные особенности строения регуляторных энхансерных элементов клонированного К!_А-В27 гена могут по некоторым имеющимся экспериментальным данным дестабилизировать, тканеспецифическую экспрессию этого гена или функционирование его в условиях воспаления, иммунного ответа и

других клеточных реакций. Последующее тестирование обнаруженных перестроек ДНК У больных и здоровых индивидов, а также изучение особенностей функционирования г.ромотор-ной области клонированного гена in vivo и in vitro, позволит, по-видимому, выявить формальную роль HLA-B27 гена в детерминации анки/.озирувдзго спондилоартрита.

СПИСОК РАБОТ, ОЗ'ЕЛККОВАШгЖ ПО ТЕМЕ ™/.ССЕРТАЖ.

1. Сегал В. S. HI.A-антигены I класса: от мол-'кулчрно-генетического анализа к роли в этиопатог<,и*Ре некоторых ревматических заболеваний. // Молекулярная генетика, ¡микробиология и вирусология. - 1587. - N10. - С. 3-1-1.

2. Сегал В. ?.. Молекулярное клонирование гена Н1.А-В27, выделенного от Сольного анкилозирухиим снондилоартритом с помощью модифицированного метода направленного клонирования последовательностей"ДНК. // Тезисы докладоь на II Веесоюз-ном съезде медицинских генетиков. - Алма-Ата. - IPSO. - С. 389-390.

3. Сегал В. F.. , Венеьоленокня Л.!'.., Степансн А. И. Направленное клонирование гена HLA-P27, гыде.'епного от больного анкилозирухдим спондп/.оартригом (болезнью Бехтерева). // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1990. - N8. - С. 8-11.

4. Сегал В. Е. НовыЛ серологически не i ¡¿являемый подтип гена HLA-R27 - результат рецнлрокной мехаллельной рекомбинации и точечных мутаций: данные сравнительного структурного анализа. // Доклады АН СССР. - 1931. - Т.' 316. - NG. -С. 1482-1485.