Анализ аллельных вариантов генов иммуноглобулин-подобных рецепторов у пациентов со спондилоартропатиями

Звягин, Иван Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ аллельных вариантов генов иммуноглобулин-подобных рецепторов у пациентов со спондилоартропатиями
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ аллельных вариантов генов иммуноглобулин-подобных рецепторов у пациентов со спондилоартропатиями"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Г

ЗВЯГИН ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ

АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИН-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ У ПАЦИЕНТОВ СО СПОНДИЛОАРТРОПАТИЯМИ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

¡1 5

СЕН 201?

Москва - 2011

4852873

Работа выполнена в лаборатории сравнительной и функциональной геномики Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

д. б. н. Юрий Борисович Лебедев

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, д. х. н., профессор Александр Габибович Габибов

д. б. н. Игорь Викторович Коробко

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН

Зашита состоится «30» сентября 2011 г. в 10:00 часов на заседани: диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РоссийскоГ академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждени Российской академии наук Института биоорганической химии та академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «26» августа 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейникс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные патологии занимают второе место по распространенности среди заболеваний человека. Общим принципом всех аутоиммунных состояний является нарушение толерантности иммунной системы к клеткам собственного организма. Молекулярные и клеточные механизмы нарушения толерантности в большинстве случаев в настоящее время остаются невыясненными, что связано с недостатком детальных фундаментальных знаний о многих процессах иммунного ответа, а также о процессах инициации и развития аутоиммунной реакции.

Многие аутоиммунные заболевания имеют генетически обусловленную природу, связанную с присутствием в генотипе определенных аллельных вариантов генов, продукты которых прямо или опосредованно участвуют в регуляции иммунного ответа. Вклад отдельных локусов в риск развития заболевания, как правило, модулируется влиянием всего генетического окружения, а также воздействием различных факторов окружающей среды.

Одним из таких заболеваний, характеризующихся многофакторной генетической составляющей, является анкилозирующий спондилит (АС). Для АС показана связь присутствия в генотипе ряда аллельных вариантов генов, продукты которых участвуют в процессах презентации и распознавания пептидов организма и антигенов клетками иммунной системы (МНС-I, МНС - II, ERAP1, KIR3D), а также ряда аллелей генов цитокинов и рецепторов к ним (TNFa, IL23R, IL1R), с повышенным риском развития заболевания. Данная работа посвящена изучению вклада аллельных вариантов и их сочетаний гена иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров (KIR3D), аминопептидазы ERAP1, участвующей в процессе подготовки презентируемого в комплексе с МНС пептида, и МНС-подобного мембранного белка MICA в риск развития АС.

Детальное изучение генетических особенностей, связанных с риском развития аутоиммунных заболеваний, в частности на примере АС, позволяет исследовать клеточные и молекулярные механизмы, приводящие к инициации заболевания и, в дальнейшем, разрабатывать средства диагностики предрасположенности, а также подходы к терапии и профилактике подобных состояний.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение факторов генетической предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний человека на примере анкилозирующего спондилита.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

]) Создание коллекции образцов гДНК и РНК больных анкилозирующим спондилитом с классической формой заболевания и соответствующей контрольной группы здоровых доноров.

2) Разработка систем для генотипирования и проведение анализа представленности аллельных вариантов гена иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D.

3) Разработка систем для генотипирования и анализ представленности аллельных вариантов генов аминопептидазы ERAP1 и МНС-подобного мембранного белка MICA.

4) Многолокусньш анализ и выявление сочетаний аллелей по трем локусам: KIR3D, erapl и micA, вносящих вклад в генетический риск развития анкилозирующего спонднлита.

Научная новизна и практическая значимость работы

Показана связь группы аллелей KIR3DSJ, кодирующих активирующий вариант иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D с повышенным риском развития анкилозирующего спондилита у пациентов российской популяции. Впервые установлено, что носительство ряда аллелей, кодирующих функциональные ингибиторные варианты рецептора KIR3D, оказывает протективный эффект.

Показана ассоциация нескольких несинонимичных нукяеотидных замен гена аминопептидазы ERAPlc риском развития АС в российской популяции. Впервые выявлены, на основе теоретического расчета и экспериментального подтверждения, рисковый и протективный гаплотипы гена аминопептидазы.

С использованием полученных данных по локусам KIR3D, erapl и micA впервые проведен анализ ассоциаций генетических паттернов с риском развития АС на выборке больных российской популяции. Выявлены несколько сочетаний аллелей исследуемых генов, статистически достоверно преобладающих в геномах выборки больных АС российской популяции.

Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов развития аутоиммунных состояний и функционирования иммунной системы. Результаты могут быть использованы при исследовании молекулярных и клеточных механизмов возникновения анкилозирующего спондилита, а также для разработки средств диагностики предрасположенности и средств профилактики развития данного заболевания. Кроме того, полученные в работе результаты представляют несомненный интерес при разработке средств терапии анкилозирующего спондилота.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва,

-4-

2009), 15lh International Summer School on Immunology "IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION" (Hvar, Croatia, 2009), школе-конференции «Фундаментальная паука для биотехнологии и медицины 2010» (Москва, 2010), 4th ESF Conference on functional genomics and desease, Dresden, Germany, 2010), 14th International congress on immunology (Kobe, Japan, 2010), Human genome meeting 2011 (Dubai, UAE, 2011), European Human Genetics Conference 2011 (Amsterdam, The Nederlands, 2011), 36a' FEBS Congress (Torino, Italy, 2011).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в российских и зарубежных научных журналах.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на (Of страницах, содержит рисунков и / 2, таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов II библиографического списка, включающего /¿/источников.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Роль аллельных вариантов иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров KIR3D в определении генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилиту

Белки семейства иммуноглобулин-подобных рецепторов KIR экспрессируются на наружной мембране НК-клеток, а также Т-лимфоцитов, включая субпопуляцию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Семейство рецепторов KIR кодируется 15 функциональными генами и 2 псевдогенами. Кодируемые функциональными генами рецепторы разделяют на 2 группы: «активирующие», т.е. запускающие сигнальный каскад, приводящий к активации цитотоксических функций клетки, и «ингибирующие», передающие ингибирующий сигнал внутрь клетки. Отдельные субпопуляции НК-клеток экспрессируют свой набор рецепторов KIR из каждой группы. Предполагается, что от баланса между «активирующим» и «ингибирующим» сигналами от различных рецепторов, поступающими в лимфоцитарную клетку, зависит активация циготоксической функции при взаимодействии с клеткой-мишенью. Сигнал, обеспечиваемый связыванием KIR-рецептора, экспрессируемого лимфоцитарной клеткой, с молекулой MHC-I, вносит соответствующий вклад в общий уровень сигнала активации. Таким образом, рецепторы семейства KIR, могут быть вовлечены в процессы инициации и развития аутоиммунных процессов.

1.1 Распределение частот аллельных вариантов, кодирующих ингибирующий и активирующий рецепторы KIR3D, в выборке бальных АС

В настоящее время, в литературе опубликованы противоречивые данные о вкладе различных аллельных вариантов, кодирующих ингибирующий и активирующий рецепторы KIR3D (группы аллелей KIR3DL1 и KIR3DS1 соответственно), в определение генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилоартриту у пациентов разных этнических групп.

С целью выявления роли аллельных вариантов KIR3D нами было проведено генотипирование по локусу KIR3D образцов геномной ДНК (гДНК) выборки больных анкилозирующим спондилитом (АС) и образцов геномной ДНК контрольной выборки, состоящей из здоровых hlaB *2 7-положительных доноров. Выборка больных состояла на 96,6% из носителей аллельного варианта ШаВ*27, который наиболее жестко ассоциирован с риском развития АС у представителей европеоидной расы.

С учетом того, что АС сопровождается неоднородными клиническими проявлениями,

что приводит к сложности дифференцировки АС от ряда других спондилоартропатий и, как

следствие, возможным неоднозначным результатам генетических исследований,

значительное внимание в работе было уделено формированию анализируемой выборки

-6-

пациентов. В конечную выборку были включены только пациенты с признаками «классического» ЛС, подтвержденными клиническим диагнозом и данными радиологического обследования.

Определение генотипов образцов геномной ДНК пациентов и контрольной выборки ыло проведено методом двустадийной аллель-специфической ПЦР. На первом этапе работы ¡спользовали несколько пар аллель-специфических праймеров, специфичных к разным часткам локуса А7ДЗД позволяющих однозначно отличать группы аллельных вариантов ЖЗйи и КШЮЗ!. Схема расположения праймеров приведена на рис. 1.

301.3 2052 201-2 201.6В 2053/6 20Р1 201.1 30Р1 201.4 301.1/51 201.5А 20ЭЗ 2056 20Э1 301.2

■ Ж • •---•

* пГ*Кву иП/ОБРог-» ООШ»У 101/С7Рег2 001Кеу2

„ ♦* 0О5Ре^ 007Кеч

~ 3 ПН 4 Н 5 Н^П^-

ис. 1. Схема расположения праймеров для определения аллельных вариантов КЮЗО. [рямоугольниками с номерами показаны экзоны гена К1НЗИ. Стрелками схематично зображены праймеры для ПЦР с соответствующими названиями. Звездочками схематично оказано положение маркеров аллелей. В верхней части рисунка приведена схема локуса Ж

После статистической обработки результатов генотипирования было показано, что реди представителей исследованной выборки больных с центральной формой нкилозирующего спондилита российской популяции значимо повышена частота стречаемости «активирующей» группы аллелей КЖ3051 О<0,01, 011=1,90) и снижена астота встречаемости «ингибирующей» группы аллелей КШЗОИ (р<0,01, 011=0,53) по равнению с контрольной группой. Также в исследованной выборке пациентов существенно иижена распространенность гомозиготного генотипа, содержащего оба «ингибирующих» плеля К1МО (КтЗОН/КШЗОИ) й повышена частота встречаемости гетерозиготного гнотипа, несущего «активирующий» и «ингибирующий» аллельные варианты иЯЗйЫ/ЮЯЗОЗ]) (тябл. 1). В то же время, частоты генотипов, гомозиготных по активирующему» аллелю, не различаются существенно между выборками больных АС и вдровых Л/аВ*27-положительных доноров.

Полученные нами характеристики выборок российской популяции по частотам встречаемости аллельных вариантов КШЗО совпадают с рядом опубликованных данных для нескольких выборок больных европеоидной и азиатской рас и, в то же время, не совпадают с результатами других акторов. Выявленные особенности российской популяции больных АС могут быть связаны с многофакторной генетической природой анкилозирующего спондилита и, соответственно, различной вовлеченностью разных локусов, в условиях неоднородного генетического окружения, в риск развития заболевания.

Таблица 1. Распределение встречаемости генотипов по «активирующим» и «ингибирующим» аллельным вариантам гена рецептора К1Ю1) среди больных АС и в контрольной группе российской популяции____

Частота встречаемости среди больных АС, % (п=87) Частота встречаемости среди контрольной группы, % (п=107) Р OR** (95% доверительный интервал)

Генотип

3DL1/3DL1 49,4 (43) 69,2 (74) 0,008 0,44 (0,24-0,79)

3DL1/3DS1 40,2 (35) 24,3 (26) 0,026 2,09(1,13-3,90)

3DS1/3DS1 10,3 (9) 6,50(7) нз* -

Аллель

3DL1 69,5(121) 81,3 (174) <0,01 0,53 (0,33-0,84)

3DS1 30,5 (53) 18,7 (40) <0,01 1,90 (1,19-3,06)

*нз - статистически незначимые отличия; **OR— отношение шансов.

1.2 Распределение частот генотипов, несущих аллель кодирующий нефункциональный вариант ингнбирующего рецептора KIR3DL1.

К настоящему времени в группе аллелей, кодирующих ингибирующий рецептор KIR3DL1, описано более 65 аллельных вариантов, которые по уровню экспрессии белка на клеточной поверхности можно разделить на три подгруппы: высокоэкспрессирующиеся (например, аллели KIR3DL1*001 и *002), слабоэкспрессирующиеся (аллели *005, *006, *007) и неэкспрессирующиеся (например, «нефункциональный» аллель KIR3DL1 *004). Отсутствие на поверхности лимфоцита рецептора KIR3D, кодируемого «нефункциональным» аллелем KIR3DL1 *004, у гомо- или гетерозиготных по данному аллелю индивидуумов, может приводить к снижению общего уровня ингибиторного сигнала в некоторых субпопуляциях цитотоксических клеток, что может вносить вклад в инициацию аутоиммунного заболевания.

Для экспериментальной проверки данного предположения с помощью аллель-

специфической ПЦР (рис. 1) в описанных выборках доноров (больных АС и контрольной

группы) были определены частоты встречаемости группы аллелей KIR3DL!, кодирующих

аминокислотную замену Ser86Leu, наличие которой приводит к нарушению экспонирования

вновь синтезированной молекулы рецептора на поверхности клеточной мембраны.

Аллельные варианты, несущие кодон Ser86, объединены в настоящей работе обозначением

-8 -

KIR3DLI*F (functional), аплельные варианты с кодоном Leu86 объединены обозначением KIR3DL1 *nF (non-functional).

Проанализированные выборки больных ЛС и здоровых /г/ай*27-положительных доноров не отличаются по частоте встречаемости аллельных вариантов, кодирующих нефункциональный ингибирующий рецептор (KlR3DLI*nF) и по частоте носителей данного аллельного варианта. Также не найдено статистически значимых различий между выборками в частотах встречаемости гомо- и гетерозигот по данному аллелыюму варианту (табл. 2). В то же время, показано достоверное снижение частоты встречаемости генотипа KIR3DL1 *F/KIR3DL1 *F, гомозиготного по аллельным вариантам," кодирующим функциональный ингибирующий рецептор, и повышение частоты встречаемости генотипа KIR3DL1 *F/KIR3DS1, несущего аллельные варианты, кодирующие функциональные ингибирующий и активирующий рецепторы.

Таблица 2. Распределение генотипов по аллельным вариантам гена КЖЗО, кодирующим функциональный и нефункциональный ингибирующий, а также активирующий рецептор среди больных АС и контрольной группы российской популяции __

Генотип Частота встречаемости среди больных AC, % (n=87) Частота встречаемости среди контрольной группы, % (п=107) Р OR (95% доверительный интервал)

3DL1 *F/3DL1 *F 23,0 (20) 44,9 (48) 0,002 0,37(0,19-0,69)

3DLl*F/3DLl*nF 20,7(18) 19,6 (21) нз -

WLl*nF/3DLl*nF 5,8 (5) 4,7 (5) нз _

3DL1*F/3DSI 32.2 (28) 18,7 (20) <0,05 2,06(1,06-4,04)

3DL1 *nF/3DSl 8,1 (7) 5,6 (6) нз -

3DS1/3DS1 10,3 (9) 6,5 (7) нз -

Сниженная частота встречаемости генотипа К1ЯЗОЫ*¥!К1ЮОи*'? среди больных АС позволяет предположить протективный эффект присутствия функционального ингибирующего рецептора на всех КИОП-позитивных клетках носителя такого генотипа в гтношение риска развития АС. В то же время, доля гетерозиготных генотипов СШЗйЬ*Р/КШЗОЫ ♦пГ среди представителей обеих выборок примерно равна. Таким >бразом, снижение уровня ингибирующего сигнала, за счет отсутствия на поверхности мембраны функционального рецептора, возможно, чаще приводит к формированию специфических клеточных популяции, существенных для развития аутоиммунной реакции.

В то же время, значительное повышение частоты встречаемости генотипа ÍIRЗDL*F/KIRЗDS1 и заметное, хотя и статистически недостоверное при исследованном |бъеме выборок, повышение частоты «активирующего» генотипа (КШ3051/К1Я3051) среди больных АС, позволяет предполагать, что присутствие активирующего рецептора вносит больший вклад в процесс инициации АС.

1.3 Присутствие аллельных вариантов KIR3DLI*005 и *007, кодирующих низкоэкпрессирующийся продукт, в геномах пациентов с генотипами KJR3DL1 *F/KIR3DL1 *F

Наряду с отсутствием функциональной молекулы на мембране, низкий уровень экспрессии ингибирующего рецептора также может приводить к снижению иншбирующего сигнала в цитотоксической клетке, и, таким образом, вносить вклад в инициацию АС. Присутствие нмзкоэкспрессирующихся аллельных вариантов KIR3DLI возможно связано с развитием заболевания у тех индивидуумов, чей генотип содержит оба аллеля KIR3D, кодирующих функциональный ингибирующий рецептор.

Для проверки данной гипотезы с помощью аллель-специфической ПЦР мы определили присутствие 2-х аллельных вариантов из группы KIR3DL1 *F, чей продукт экспрессируется на низком уровне - KIR3DL1 *005 и KIR3DL1 *007, у 20 пациентов с гомозиготными по функциональным аллельным вариантам KIR3DLl*Fгенотипами.

Генотипы 10 пациентов из проанализированной выборки содержат низкоэкспрессирующиеся аллельные варианты группы KIR3DL1: 6 -K1R3DL1 *F/KIR3DLl *005, 3 - KIR3DL1 *005/KIR3DLl *005 и 1 - KIR3DL1 *F/KJR3DL1 *007. Генотипы остальных 10 пациентов содержат другие аллельные варианты K1R3DL1, кодирующие функциональный ингибирующий рецегггор, предположительно, экспрессирующийся на высоком уровне.

Образцы крови 7 пациентов (негативных по аллелям K1R3DL1 *005 и KIR3DLI *007) были проанализированы на проточном цитофлуориметре, с использованием специфического антитела для KIR3DL1, не узнающего активирующий рецептор KIR3DS1 и остальные рецепторы семейства KIR. У 4-х пациентов по результатам цитофлуориметрии среди CD8+ клеток фракция KIR3DL1+ клеток разделялась на две субпопуляции, которые, предположительно, экспрессировали рецептор KIR на высоком (KIR3DL11"511) и низком уровнях (KIR3DLllow). У трех других пациентов наблюдалась лишь популяция CD8+KIR3DL lb'eh клеток. На рис. 2 приведен пример результатов цитофлуорометрии образцов крови 2 пациентов (KIR3DLlbigh и KIR3DLlh'sb/ KIR3DL11"™) и 3 контрольных образцов.

Наличие популяции CD8+KIR3DLl'°,v клеток может быть связано с особенностями регуляции транскрипции/трансляции отдельных аллельных вариантов группы KIR3DLI, а также с присутствием популяций клеток с различным уровнем экспрессии рецептора KIR3D на мембране в зависимости от состояния пациента. Однако, никакой корреляции с состоянием пациентов на момент забора крови (стадия острого воспаления или ремиссия) и наличием или отсутствием популяции клеток CD8+KIR3DLllow не выявлено.

Полученные результаты указывают на значимость уровня экспрессии ингибирующего рецептора K.IR3D на поверхности лимфоцитов для возникновения или развития заболевания.

-10-

Вместе с тем, сниженный уровень экспрессии ингибирующего рецептора представляет лишь дополнительный фактор риска, вклад которого не является решающим. Существуют другие генетические факторы, определяющие развитие заболевания при наличии двух аллелей группы К1КЗОи экспрессирующихся на высоком уровне. Определение детальных механизмов и уточнение роли низкоэкспрессирующихся аллельных вариантов К1К301,1*005 и *007 в развитии АС требуют дальнейших исследований.

КНШ)1.1*Ю5/К11иШ.1*005

ЮЫВП'ОШШНЗОи'пН ЫКЗШЛ*001/ЫЮЩД*СС5

ф г 1.1%

'-бГа-ГЦ

72 13%

книга.! '001/К.!ЮОИ *001

кииои *В01Л1ЖЗПи *ОС1

а 2

: 2 2% 2 1Л% 0.3% и

•Ж:

на ШШш ЯР

10° 10" V ' ' 7<н 1В' ю1

Рис. 2. Анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови пациентов с АС. А -контрольные образцы. В - образцы крови пациентов, гомозиготных по высокоэкспрессирующимся аллельным вариантам КШЗОЫ. Генотипы всех образцов указаны над графиками.

2. Анализ репертуара генов Т-клеточных рецепторов у пациента с анкилозирующим спондилитом.

Другим типом рецепторов, относящихся к семейству иммуноглобулин-подобных рецепторов являются специфические рецепторы Т-клеток (ТкР), распознающие пептиды в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости и в норме активирующие лимфоцит при связывании с чужеродными пептидами или пептидами трансформированных клеток собственного организма.

Специфичность распознавания ТкР антигена в комплексе с молекулой МНС определяется структурой вариабельного домена субъединиц рецептора, в основе разнообразия которой, лежит рекомбинация участков V, О и ] при созревании гена рецептора. Каждый клон Т-клеток несет на своей поверхности ТкР с уникальной структурой антигенсвязывающего участка вариабельного домена. Различные нарушения в системе

презентации антигена и его последующего распознавания, а также структурное сходство бактериальных (вирусных) и пептидоЕ собственного организма приводят к активации Т-лимфоцитов против нормальных клеток собственного организма и развитию аутоиммунных патологий. Активация Т-лимфоцитов сопровождается экспансией активированного клона.

.В нашей работе мы использовали один из существующих подходов для полуколичественной характеристики клонального разнообразия популяций Т-лимфоцитов из периферической крови пациента с анкилозируютцим спондилитом. В основе метода лежит анализ, с разрешением в I нуклеотид, репертуара длин ПЦР-продуктов, заключающих в себе гипервариабельную область (СРМ) зрелого гена Ь-цепи ТкР, образованную сочетанием 3'-концевой части V-сегмента, В-сегментом и .Т-сегментом. Метод позволяет выявить отличия от нормального распределения длин ПЦР-продуктов и детектировать наличие клональной экспансии внутри субпопуляции Т-лимфоцитов, несущих ТкР с определенным У-сегментом Ь-цепи.

В ходе работы были получены флуоресцентно меченые ПЦР-продукты с кДНК из мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациента с АС, а также с кДНК ядерных клеток этого пациента, выделенных из синовиальной жидкости пораженного сустава. Полученные ПЦР-продукты были проанализированы по длине и интенсивности флуоресценции с помощью капиллярного электрофореза в акриламидном геле (рис. 3).

Распределение длин ПЦР-продуктов полученных с праймеров специфичных к 1,2 и 4 У-сегмеитам соответствует характерной картине, получаемой в отсутствие выраженной клональной экспансии, когда кривая, проведенная через вершины пиков, соответствующих разным длинам ПЦР-продуктов (кратным 3 нуклеотидам) не отличается значительно от формы гауссовской кривой. На основе полученных результатов можно предположить наличие клональной экспансии в субпопуляциях Т-лимфоцитов, несущих ТкР, кодируемый зрелым геном с 3 и 11 У-сегментами (субпопуляции ЬУЗ и ЬУ11).

Из двух предположительно перепредставленных клонов в субпопуляции ЬУЗ в образце из периферической крови пациента один присутствует в значительном количестве также и в образце из синовиальной жидкости, что позволяет предполагать участие этого клона Т-клеток в патологическом процессе. Другой перепредставленный клон этой же субпопуляции значительно менее представлен в синовиальной жидкости пораженного сустава, чем в периферической крови. Кроме того, в образце синовиальной жидкости обнаружен еще один предположительно перепредставленный клон субпопуляции ЬУЗ, представленность которого в периферической крови существенно отличается.

Субпопуляция Т-лимфоцитов ЬУ11 в синовиальной жидкости пациента представлена в основном одним клоном, тогда как распределение длин ПЦР-продуктов с кДНК из периферической крови сходно с нормальным распределением в отсутствие клональной

экспансии. Присутствие перепредставленного клона субпопуляции ЬУ11 в образце синовиальной жидкости данного пациента было подтверждено секвенированием соответствующей библиотеки фрагментов кДНК

Л периферическая кровь

В синовиальная жидкость

(ООО 5500 $000 4 500 4000

2500 2000 1500 1000

3S00 3SOO 3700 3800 3SOO U0Q время удержания, отн. в д.

ЬУЗ

3500 3600 3700 3800 •ремя удержа ш. отм. сд.

6000

. 6500

« 6000

^ 4500

О шоо

| 3500 g 1000

£ 2Б00

« »00

О 1500

С 1000

4000 ct 3500 j эооо

2500 £ 20D0 ? 1SOO

00 3600 3S00 3700 3800 3900 4009 время удержания, отм. ед.

bV4

5300 3400 3500 3600 3700 ЗвСЮ 3800 4000 время удержания, отн. »д.

4Q0Q [ 3S00 : 3000 г 2500 ' 2000 Г 1500 " 1000

5800 5900 6000 6100 <200 6300 6409 6500

• МК удержания, отн. ед.

bVll

этой 5ВОО 5Э00 (ООО 61011 6200 6300 6400 Е500 время удержания, отн. ед.

Рис. 3. Репертуар пула специфических ПЦР-иродуктов с кДНК из образцов периферической крови и синовиальной жидкости пациента с АС, полученных с праймерами специфичными к разным У-сегментам гена Ь-цепи ТкР. В правом столбце рисунка указаны номера V-сегментов.

Обнаруженные перепредставленные клоны Т-лимфоцитов, локализующиеся в синовиальной жидкости пораженного сустава пациента с АС, возможно, связаны с патологическим процессом, что определяет необходимость установления первичной структуры вариабельного участка СОЮ ТкР таких клонов и проведения функциональных тестов, для определения их специфичности.

3. Роль аллельных вариантов гена аминопентидазы ЕКАР1 в риске развития АС

Связь определенных аллельных вариантов молекул МНС I типа и иммуноглобулин-подобных рецепторов цитотоксических лимфоцитов, распознающих эти молекулы, с предрасполоя;ешюстыо к развитию анкилозирующего спондилита позволяет предполагать также роль презентируемых МНС пептидов в процессе инициации и развития заболевания.

- 13-

Презентация пептида в контексте молекул МНС I типа зависит от функционирования иммунопротеасомного комплекса, а также от активности аминопептидаз ERAP1 и ERAP2, локализующихся, в основном, в зндопдазматическом ретикулуме и выполняющих функции дальнейшего N-концевого протеолиза пептидов, поступающих из иммунопротеасомы, для корректного связывания с молекулами МНС I типа. В настоящее время считается, что основную роль в этом процессе играет аминопептидаза ERAP1.

Для пеитидазы ERAP1 также описана протеолитическая активность в отношении ряда рецепторов провоспалительных цитокинов (рИЛ-I, рИЛ-6, рФНОа), приводящая к образованию растворимых форм данных рецепторов. Вариации структуры белка ERAPI, определяемые заменами в кодирующей части гена erapl, могут приводить к образованию функциональных продуктов различающихся по сродству или специфичности к субстрату, скорости его расщепления, а также уровню экспрессии данного белка. Различные варианты ERAP1, могут вносить вклад в общий риск развития АС.

3.1 Повышенная частота встречаемости ряда одионуклеотидных полиморфизмов гена erapl среди пациентов с анкилозирующнм спондилитом

Для выявления предполагаемых различий частот встречаемости аллельиых вариантов erapl среди больных аутоиммунными заболеваниями и в контрольной группе, мы провели генотипирование по пяти молекулярно-генетическим маркерам локуса erapl образцов геномной ДНК выборки из 84 пациентов с АС и контрольной группы, состоящей из 102 /!/аВ*27-положительныхздоровых доноров. Разработанный набор аллель-специфических праймеров (рис. 4), позволял отличать аллельные варианты гена erapl по 5 молекулярно-генетическим маркерам, представляющим собой несинонимичные одионуклеотидные замены: rs2287987 (С/Т, Met349Val), rs30187 (С/Т, Lys528Aig), rsl0050860 (С/Т, Asp575Asn), rsl7482078 (C/T, Arg725Gln) и rs27044 (C/G, G!u730Gln).

Аминокислотная замена Met349Val (маркер rs2287987), расположена вблизи цинк-связывающего мотива НЕХХН в составе той же альфа-спирали. Аминокислотные варианты, кодируемые остальными маркерами, расположены в удаленных от активных центров аминопептидазы частях молекулы.

По результатам генотипирования были определены частоты встречаемости 10 аллельиых вариантов гена erapl и соответствующих генотипов в обеих выборках. Показано, что частота встречаемости минорных аллельиых вариантов гена erapl по двум из пяти маркеров: rs2287987 (р < 0,004, OR = 0.39) и rsI0050860 (р < 0,018, OR = 0.45), статистически значимо снижена среди больных АС в российской популяции по сравнению со здоровыми донорами (табл. 3).

Полученные нами результаты позволяют говорить об ассоциации двух аллель них вариантов гена erapl с повышенным риском развития AC: rs2287987 [Т] (OR = 2.86) и

- 14-

гз10050860 [С] (СЖ = 2.54). Несмотря на значительную разницу в частоте встречаемости минорного аллеля маркера гя 17482078 статистически достоверность различий не подтверждается (р = 0,051), однако значение р близко к достоверному.

228 in(r rev

генотипирование:

gDNA + 228Afor/228intr rev + 228Gfor/228intr rev

генотип: A/A, A/G, G/G

J 00 A/Grev 100 A'G for

T T~]-1 12 I-С

100 ¿n«r rev

гаплотипирование:

cDNA + 228Afar/100Arev + 228Afor/100Grev + 228Gfor/1C0Arev + 228Gfor/100Grev

галлатил: AA/AA, AA/AG AA/GG ... etc.

Рис. 4. Схема расположения праймеров для тено- и гаплотипирования локуса erapl. Прямоугольниками с цифрами обозначены экзоны гена аминопептидазы. Стрелками схематично изображены праймеры для ПЦР с соответствующими названиями. Звездочками условно отмечено положение маркеров. В нижней части рисунка приведен пример определения генотипа по маркеру rs2287987 и гаплотипа по маркерам rs2287987 и rsl0050860.

Разница в частотах встречаемости минорных аллельных вариантов по маркерам rs30187 и rs27044 между двумя выборками (больных АС и контрольной группой) российской популяции незначительна. В то же время, согласно литературным данным, аминокислотная замена Glu730GIn, соответствующая маркеру rs27044, не оказывает влияния на расщепление пептидазой природных и синтетических субстратов. Этот факт, а также отсутствие достоверного генетического сцепления между указанными маркерами и маркерами, для которых показана ассоциация с АС, позволяют предполагать, что аминокислотные замены Glu730Gln и Lys528Arg не оказывают влияния на предрасположенность к развитию АС в российской популяции.

Таблица 3. Частоты встречаемости минорных аллельных вариантов по исследованным

Маркер [полиморфный нуклеотид1 Частота минорного аллеля Гнуклеотид] Р OR (95%С1)

Больные АС, п = 84 Здоровые доноры, п = 102

rs2287987 fC/Tl 0,091 С] 0,20 [С] <0,004 0,39 (0,20-0,72)

rs30187 ГС/Т] 0,38 [Т] 0,34 [Т] из -

rsl0050860 fC/Tl 0,11 ГП 0,21 ГП <0,018 0,45 (0,25-0,82)

rsl7482078 fC/Т] 0,12 ГП 0,20 fTl нз -

rs27044 fC/G] 0,33 [G] 0,33 [G] из -

Снижетше частоты встречаемости минорных аллелей по маркерам гз2287987, гз10050860 и «17482078 сопровождается снижением количества гетерозигот и возрастанием

количества гомозигот по ассоциированному с АС аллелыюму варианту гена в выборке больных (табл. 4). Гетерозиготность по маркерам «30187 и гз27044, не ассоциированным с АС в российской популяции, наоборот, возрастает у больных, однако частота минорного аллельного варианта при этом меняется незначительно.

Таблица 4. Частоты встречаемости генотипов по 5 маркерам гена егарI в выборке больных АС и контрольной группе__

Маркер [полиморф ный нуклеотид] Больные АС, п = 84 Здоровые доноры, и= 102 Р (Ж (95%С1)

Число генотипов (частота) Число генотипов (частота)

ге2287987 [С/Т] СС 1 (0,01) СС 3 (0,03) нз -

СТ 13(0,15) СТ 34 (0,34) <0,006 0,35 (0,17-0,76)

ТТ 70 (0,83) ТТ 62 (0,63) <0,003 2,97(1,48-6,15)

^30187 [С/Т] СС 28 (0,33) СС 46 (0,45) нз

СТ 49 (0,58) СТ 43 (0,42) <0,041 1,92 (1,07-3.45)

ТТ 7 (0,08) ТТ 13 (0,13) нз -

«10050860 [С/Т] СС 66 (0,79) СС 63 (0,63) нз -

СТ 18 (0,21) СТ 32 (0,32) нз -

ТТ - ТТ 5 (0,05) из -

«17482078 [С/Г] СС 65 (0,77) СС 64 (0,63) <0,045 2,02(1,06-3,94)

СТ 17(0,20) СТ 35 (0,34) <0,048 0,49 (0,25-0.95)

ТТ 2 (0.02) ТТ 3 (0,03) нз -

гз27044 [С/С] о/о 7 (0,08) ОАЭ 12(0,12) нз -

о/с 42 (0,5) б/С 42 (0,42) нз -

С/С 35 (0,42) с/с 45 (0,45) нз -

3.2 Определение гаплотипов по исследованным маркерам гена егар1 в выборках больных АС и здоровых допоров российской популяции.

По результатам генотипирования обеих выборок с использованием программы Нар1оу1е\у была определена степень неравновесного генетического сцепления между парами аллельных вариантов по исследуемым маркерам. Полиморфизмы ге2287987, г510050860 и ге 17482078 находились в статистически достоверном неравновесном сцецлении (Б' > 0.85, 95%С1 0.76-0.99) и были объединены в блок. Для маркеров в блоке были рассчитаны теоретические частоты встречаемости гаплотипов в выборке больных АС и контрольной группе для определения гаплотипов, возможно, связанных с риском развития АС.

С использованием парных комбинаций аллель-специфических праймеров к исследуемым маркерам и образцов кДНК той же выборки больных были определены фактические частоты встречаемости гаплотипов по всем пяти молекулярно-генетическим маркерам гена егар1 и сопоставлены с результатами теоретических расчетов.

Фактическая частота встречаемости предположительно рискового галлотипа ССТ (ге 17482078 -те 10050860-^2287987) среди больных АС составляет около 88%, что согласуется с теоретически рассчитанной частотой. В то же время, фактическая частота встречаемости предположительно протективного галлотипа 7ТС(гз 17482078 -^10050860-

-16-

гя2287987) составляет около 2%, тогда как теоретически рассчитанная величина равна примерно 8% (табл. 5). Эти различия, вероятно, связаны с недостаточным для точного определения фактической частоты встречаемости протективного гаплотипа размером выборки больных АС, а также с недостаточной точностью существующего алгоритма расчета.

Таблица 5. Расчетные и практические частоты встречаемости протективного и рискового гаплотипов по маркерам П2287987, ^10050860 и Г517482078 гена егар1 _

Гаплотип Частота встречаемости среди больных АС Частота встречаемости среди здоровых доноров Р OR (95%С1)

теоретическая, п = 84 практическая, п = 69 теоретическая, п= 102

ССТ 0,86 0,88 0.77 0.043 1.74(1.02-3.04)

TTC 0,08 0,02 0.18 0.003 0.38(0.19-0.73)

По результатам сравнения расчетных частот встречаемости гаплотип ССТ статистически достоверно ассоциирован с риском развития АС (р = 0.043, OR 1,74). Расчетная частота гаплотипа TTC достоверно ниже в выборке больных (р = 0.003, OR 0.38), что позволяет предполагать протективное свойство данного гаплотипа erapl в отношении риска развития АС (табл. 5).

4. Многолокусныи анализ фа!сторов генетической предрасположенности к апкилозирующему спондилиту

4.1. Анализ представленности аллельных вариантов гена МНС-подобного белка MICA среди пациентов с АС российской популяции.

MICA является поверхностным белком клеточной мембраны, экспрессирующимся на всех клетках организма. Структура MICA гомологична структуре молекул МНС-I, однако белок не принимает участия в антиген-презентации. Считается, что экспрессия MICA повышается при воспалительных и опухолевых процессах.

MICA является лигандом для активирующего рецептора Т- и НК-клеток NKG2D, связывание с которым приводит к выработке ко-стимулирующего сигнала у Т-лимфоцитов или прямой активации НК-клеток. Аффинность взаимодействия MICA с NKG2D зависит от вариабельной аминокислоты в положении 129 белка MICA, кодируемой маркером rsl051792. Вариант MICA-Met 129 связывается с рецептором с большей аффинностью, чем вариант MICA-Val 129.

В ряде опубликованных исследований па выборках различной этнической принадлежности получены противоречивые результаты относительно связи аллельных вариантов micA-Vall29a micA-Mell29 с риском развития хронических воспалительных

-17-

заболеваний кишечника (острого неспецифического язвенного колита, болезни Крона, которые часто встречаются у больных АС) и ранним развитием симптомов анкилозирующего спондилита. Мы провели первое исследование связи вариабельности Vall29Met белка MICA с риском развития анкилозирующего спондилита у представителей российской популяции. Учитывая вероятное неравновесное сцепление между аллельпыми вариантами micA и hlaB, расположенного на расстоянии 200 т.п.о., мы проанализировали частоты встречаемости групп аллельных вариантов micA, различаемых по варианту полиморфного маркера rsl051792, безотносительно остальных маркеров, различающих аллели micA. что позволяет оценить вклад функционально различающихся продуктов данных групп аллелей в риск развития АС.

С этой целью нами разработана система праймеров для аллель-специфической ПЦР, позволяющая определять варианты полиморфного нуклеотида маркера rs 1051792 в образцах геномной ДНК (рис. 6) и проведено генотипирование образцов выборки из 83 пациентов с АС и контрольной группы из 105 /г/аВ *27-положителы1ых здоровых доноров (табл. 6).

sp«otr specRev2

-И-//-1 2 |-1 з |-i 4 I-ГТ>//-ГбТ- 3'

70 6840 255 274 288 587 279 99 138 2551 125

3EF - 3ER-C

- 3ER-T

Рис. б. Схема расположения праймеров для определения полиморфного маркера rsl051792 локуса micA. Стрелками схематично показаны праймеры и даны соответствующие названия. Прямоугольниками с номерами обозначены экзоны гена micA. В нижней части рисунка схематично изображен продукт 1 раунда ПЦР и праймеры, используемые для 2 раунда; цифрами указаны размеры экзонов и интронов в парах оснований.

Статистически значимых различий между частотами встречаемости аллелей micA, кодирующих Val 129 или Met 129, и соответствующих генотипов между исследованными выборками Л/я5*27-положительных больных АС и здоровых доноров найдено не было. В то же время, отмечено повышение частоты гомозиготного генотипа\fetl29/\{etl29 среди больных АС, а также снижение частоты группы аллелей кодирующих Vail 29.

Таблица 6. Распределение генотипов и аллельных вариантов гена пне А, кодирующих Уа1129 или МеИ29, в выборке больных АС и в контрольной группе___

Частота встречаемости, (кол-во) Р OR (95%С1)

больные АС здоровые hlaB* 2 7+ доноры

генотип п=83 п=105

Vall29/Vall29 0,04 (3) 0,06 (6) из -

Vall29/Metl29 0,61 (51) 0,70 (74) нз -

Metl29/Met¡29 0,35 (29) 0,24 (25) нз -

аллель 2п=166 2п=210

Vall29 0,34 (57) 0,41 (86) нз -

Met 129 0,66(109) 0.59(124) нз -

Для выявления возможной фенотигшческой связи, проявляющейся в повышенном риске развития АС, между функционально различающимися аллелями гена писЛ и ассоциированными с АС аллелями гена КШЗО, кодирующими активирующий вариант рецептора (КЮЗОЭ!), были проанализированы частоты генотипов по т/сЛ среди ЛЖЗ£>57-положительных и КШЗРЭ!-отрицательных индивидуумов обеих выборок (табл. 7).

Таблица 7. Частоты встречаемости гомо- и гетерозиготных генотипов по аллелям писА-Уа1129 и тгсА-МеИ29 среди выборок больных и здоровых допоров ранжированных по аллелю КШЗВЗ! ___

Генотип Частота встречаемости, (кол-во)

Больные АС Здоровые ЫаВ*27+ доноры

KIR3DS1+ п = 43 п = 32

Vall29/Val¡29 0,02 (1) - 0,06 (2) -

Val¡29/Met)29 0,54 (23) 0,56 (24)_ 0,66 (21) 0,72 (23)

Metl29/Metl29 0,44 (19) 0,44(19) 0,28(9) 0,28 (9)

KIR3DS1- п = 39 п = 73

Vall29/Vall29 0,05 (2) - 0,06 (4) -

Vall29/MetI29 0,69 (27) 0.74 (29) 0,73 (53) 0,79 (57)

Metl29/Metl29 0,26 (10) 0,26 (10) 0,22(16) 0,22 (16)

Примечание: во втором столбце для каждой выборки приведены частоты гомозиготного генотипа Ме11291МеЧ29 и суммарные частоты для генотипов включающих аллель Уа!129.

По результатам сравнения отмечено выраженное увеличение частоты встречаемости гомозиготного генотипа Metl29/Metl29 в группе K1R3DS1 -положительных больных АС по сравнению с аналогичной группой /?/аВ *27-положительиых здоровых доноров. Различия в частотах встречаемости генотипов по локусу micA, при сравнении групп KIR3DS1-отрицательных больных АС и здоровых доноров, отсутствуют. Частоты встречаемости генотипа Metl29/Metl29 в обеих группах здоровых доноров примерно совпадают с частотой для всей контрольной выборки в целом. Частота встречаемости генотипа Metl29/Metl29 среди KIR3DS1 -отрицательных больных также приблизительно совпадает с частотой встречаемости в контрольной выборке, однако в объединенной выборке больных она выше (0,35 в выборке больных против 0,24 в выборке здоровых; табл. 6). Изменение средней частоты встречаемости генотипа Metl29/Metl29 среди больных АС происходит за счет группы KIR3DS1 -положительных пациентов (табл. 7). Проведенное сравнение позволяет предположить, что наличие гомозиготного генотипа Metl29/Metl29 в присутствии аллельного варианта K1R3DS1 приводит к возрастанию риска развития анкилозирующего спондилита.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что соответствующая rs 1051792

аминокислотная замена Va!129Met белка MICA, повышающая аффинность активирующего

-19-

рецептора иммунных клеток NKG2D к MICA, не вносит решающий вклад в риск развития анкилозирующего спондилита Однако генотипы гомозиготные по варианту micA-Metl29 и несущие также и активирующий аллельный вариант рецептора KIR3D чаще встречаются среди больных АС и, возможно, определяют более высокий риск развития заболевания. Описанный факт требует дальнейшего изучения на выборках большего объема, а также проведения функциональных исследований.

4.2 Выявление генетических паттернов по локусам KIR3D, eriipl, micA, ассоциированных с риском развития АС

Генетическая предрасположенность к развитию АС определяется вкладом нескольких локусов, продукты которых вовлечены в различные иммунные процессы. С помощью программы, использующей модифицированный алгоритм Metropolis-Hastings, был проведен поиск специфических для АС комбинаций аллельных вариантов (генетических паттернов) локусов KIR3D, erapl, micA в выборках больных АС и контрольной группе hlaB*27 -положительных доноров российской популяции (табл. 8).

Таблица 8. Генетические паттерны, различающиеся по частоте встречаемости между исследованными выборками российской популяции__ __

Генотип Частота генотипов в выборке (N) Pperm FDR OR (95%CI)

Больные AC, n = 88 Контрольная группа, n= 109

rs228*C- 0,16(14) 0,34 (37) 0,005 0,020 0,34 (0,17-0,68)

rs228TT 0,80 (70) 0,57 (62) 0,005 0,020 2,98 (1,48-6,03)

KIR3DS1-/rsl 74СС 0,38 (33) 0,17(19) 0,005 0,020 2,85 (1,46-5,54)

KIR3DS1-/ rsIOOCC 0,36(32) 0,17(18) 0,007 0,027 2,82 (1,44-5,55)

KIR3DS1-/ rs228T-/rslOOC- / rsl 74C- 0,48 (42) 0,25 (27) 0,005 0,020 2,66 (1,43-4,93)

KIR3DS1-/rslOOC-/rsl 74C- 0,48 (42) 0,26 (28) 0,005 0,021 2,60 (1,41-4,80)

rs30T-/rsl00CC/rs27C- 0,48 (42) 0,25 (27) 0,005 0,020 2,59 (1,40-4,80)

KIR3DSI-/ rs27C- 0,46 (40) 0,24 (26) 0,009 0,034 2,58 (1,38-4,80)

KIR3DSJ-/micA-Metl29 - 0,47(41) 0,28 (30) 0,011 0,039 2,50 (1,36-4,58)

_________j_ —

* rs228 - rs2287987; rs30- rs30187; rsl 00 - rs 10050860; rsl74 - rsl7482078; rs27 - rs27044;

Pperm - значение p с поправкой на множественность (метод пермутаций); FDR - средняя доля ложных отклонений нулевой гипотезы; N- число генотипов в выборке.

Среди паттернов, различающихся по встречаемости между исследованными выборками, только один однолокусный паттерн является протективным (rs2287987-C), в то время как его

-20-

противоположный вариант {п22879Ю-Т) является рисковым только в гомозиготном состоянии. Большая часть выявленных паттернов относится к одной группе, которая включает в себя варианты, состоящие из аллелей локуса егар1, входящих в определенный нами ранее рисковый гаилотип, и аллеля КШЗОЯ!. Эти результаты позволяют предполагать, что сочетание двух рисковых факторов: аллеля К1КЗО$1 и гаплотипа ССГ(гз17482078-г810050860-гз2287987) существенно повышает риск развития АС.

В то же время, один из паттернов (гвЗО-Т/гзЮО-СС/п27-С) включает аллели маркеров Г530187 и гз27044, для которых не показана ассоциация с риском АС в исследованной выборке больных. Аллель гз27044-С также входит в состав еще одного рискового паттерна в сочетании с аллелем На основе этого можно предположить, что аллельные

варианты несущие маркеры п30187-Т и гз27044-С также вносят вклад в риск развития АС либо в сочетании с аллелем либо в сочетании с гаплотипом СС7" (учитывая

неравновесное сцепление между аллелями маркеров «10050860 и ге 17482078).

Результаты проведенного анализа также статистически подтверждают наше предположение о взаимосвязи распределения аллелей ЛЖЗ£Ш и 1тсЛ-Ме1129 у больных АС российской популяции.

Выводы

1. Показана повышенная встречаемость группы аллелей КШ3051, кодирующей активирующий вариант иммуноглобулин-подобного рецептора КШЗО, в выборке больных анкилозирующим спондилитом российской популяции по сравнению с выборкой здоровых ЫаВ"27- положительных доноров. Высказано предположение, о функциональной роли активирующих рецепторов КШЗОЗ! в инициации анкилозирующего спондилита.

2. Показано, что присутствие в генотипе аллельных вариантов, кодирующих функциональный ингибирующий рецептор КЖЗПЫ, оказывает протективный эффект.

3. Показана ассоциация нескольких несинонимичных однонуклеотидных замен гена аминопептидазы ЕЯАР1 с риском развития анкилозирующего спондилита.

4. Определены предположительно рисковый и протективный гаплотипы, включающие три несинонимичные однонуклеотидные замены гена егар/; определена фактическая частота встречаемости рискового гаплотипа в выборке больных АС.

5. Выявлены сочетания аллельных вариантов по локусам К1НЗО, егар1, т/'сА, частоты встречаемости которых статистически достоверно различаются между выборкой больных АС и контрольной 1-руппой.

Список опубликованных работ:

1) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina А. V., Staroverov D.B., Amosova A. L., Mishin A.S., Kumikova MA., Zvyagin I.V., MutovinaZ.Y., Gordeev A.V., Kbaidukov S.V., Sharonov G. V., Shagin D.A., Chudakov D M., Lebedev Y.B. Individual characterization of stably expanded T cell clones in ankylosing spondylitis patients // Autoimmunity. 2009; 42(6): p. 525-536.

2) A.B. Чкалина, И.В. Звягин, И.З. Мамедов, О.В. Британова, Д Б. Староверов, Ю.Б. Лебедев. Олигоклональная экспансия Т-клеток: изучение ее стабильности во времени// Биоорганическая химия. 2010; 36(2): с. 206-214.

3) I.V. Zvyagin, IZ. Mamedov, O.V. Britanova, D.B. Staroverov, E.L. Nasonov, A.G. Bochkova, A.V. Chkalina, A.A. Kotlobay, D O. Korostin, D.V. Rebrikov, S. Lukyanov, Y.B. Lebedev, D.M. Chudakov. Contribution of functional KIR3DL1 to ankylosing spondylitis // Cellular and Molecular Immunology. 2010; 7(6): p. 471-476.

4) Звягин И.В., Дородных В.Ю., Мамедов И З., Староверов Д.Б., Бочкова А.Г., Ребриков Д.В., Лебедев Ю.Б. Ассоциация аллельного варианта гена аминопептидазы ERAP1 с риском развития анкилозирующего спондилита// Acta Naturae. 2010; 2(3): с.86-92.

5) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Bolotin D., Chkalina A.V., Staroverov D.B., Zvyagin I.V., Kotlobay A.A., Turchaninova M.A., Fedorcnko D.A., Novik, A. A., Sharonov G. V., Lukyanov S., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. Quantitative tracking of T cell clones after hematopoietic stem cell transplantation // EMBO Mol Med. 2011; 3(4): p. 201-207.

Материалы конференций:

1) Звягин И.В., Чкалина А.В., Котлобай А.А., Анисимова В.Е., Мамедов И З., Лебедев Ю.Б. Создание гибридных белков, содержащих TCR-Vb, для элиминации семейства Т-лимфоцитов // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 58.

2) Чкалина А.В., Звягин И.В., Мамедов И З., Лебедев Ю.Б. Новый метод выявления клоналыюй экспансии Т-лимфоцигов. // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 60.

3) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina A.V., Zvyagin I.V., Staroverov D.B., Amosova A.L., Chudakov DM., Lebedev Y.B. Detection, study of stability and characterization of expanded T cell clones in patients with AS // 15th International Summer School on Immunology "IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION", Hvar, Croatia, 2009; Abstract book, p. 134.

4) I.V. Zvyagin, I.Z. Mamedov, A.V. Chkalina, D.M. Chudakov, S.A. Lukyanov, Y.B. Lebedev. Involvement of K.IR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis initiation. // New Biotechnology. Abstracts of the 4,h ESF Conference on Functional Genomics & Disease. Dresden, Germany, 2010; 275: p. s60.

5) I. V. Zvyagin, V. У. Dorodnykh, I. Z. Mamedov, A. V. Chkalina, D. M. Chudakov, Y. B. Lebedev. Analysis of association of 5 ERAP1 SNPs and KIR3D alleles in patients with ankylosing spondylitis. // 14th International Congress on Immunology, Kobe, Japan, 2010; Abstract book, p. il28.

6) Звягин И.В., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Разработка подходов к восстановлению толерантности цитотоксических клеток при аутоиммунных патологиях. // школа-конференция «Фундаментальная наука для биотехнолопш и медицины 2010», Москва. 2010; материалы конференции, с. 34.

7) Dorodnykh Valeria, Zvyagin Ivan, Mamedov Ilgar, Chudakov Dmitry, Lukyanov Sergey, Lebedev Yuriy. Individual genome variability of patients with ankylosing spondilitis. // Human genome meeting 2011, Dubai, UAE, 2011, Abstract book, p. 216.

8) I. V. Zvyagin, I. Z. Mamedov, A, V. Chkalina, V. Y. Dorodnykh, D. M. Chudakov, S. A. Lukyanov, Y. B. Lebedev. Role of K.IR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis. // European Journal of Human Genetics. Abtracts of the European Human Genetics Conference 2011. Amsterdam, The Netherlands, 2011; 19(S2): p. 383.

9) I. Zvyagin, V. Dorodnykh, I. Mamedov, D. Khmelkova, A. Chkalina, D. Chudakov, S. Lukyanov, Y. Lebedev. Analysis of association of several non-MHC loci with ankylosing spondylitis in Russian population // FEBS Journal. Abstracts of the 36th FEBS Congress. Torino, Italy, 2011; 278(S1): p. 255.

Подписано в печать:

25.08.2011

Заказ №5810 Тираж-75 экз. Печать трафаретная. Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Звягин, Иван Владимирович

СПИСИОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Факторы генетической предрасположенности к развитию анкилозирующего спондилита

1. Анкилозирующий спондилит

2. Геномные локусы ассоциированные с развитием АС

2.1 Гены, относящиеся к локусу МНС

Роль аллеля НЬА-В*27 и его субтипов

Связь неВ*27 аллелей локуса МНС с риском развития АС

2.2 Вклад аллелей генов, расположенных вне локуса МНС в риск развития АС

Локус ЬЯС и рецепторы смейства К1Я

Локусы 2-й хромосомы и локус 2Ц22, ассоциированные с АС

САКЛЯ

СУР2Пб

ТС1'В1 39 Другие гены, возможно ассоциированные с АС у представителей европеоидной и азиатской рас

2.3 Исследование полоногеномных профилей транскрипции генов при АС 43 3. Гипотезы развития АС

Гипотеза артритогенного пептида

Некорректный фолдинг НЬА-В

Присутствие гомодимера НЬА-В27 на мембране клеток 51 Присутствие свободной тяжелой цепи НЬА-В комплекса МНС на мембране клетки 52 Нарушения в ходе ассоциации пептида с комплексом МНС-1 5 2ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

1. Роль иммуноглобулин-подобных рецепторов в АС

1.1 Роль аллельных вариантов иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров KIR3D в определении генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилиту

1.1.1 Распределение частот «ингибирующего и «активирующего» аллелей гена KIR3D в выборке больных АС

1.1.2 Распределение частот аллельных вариантов, кодирующих «нефункциональный» вариант ингибирующего рецептора KIR3DL

1.1.3 Вклад аллелей KIR3D, экспрессирующихся на низком уровне, в риск развития АС у пациентов российской популяции

1.2 Анализ репертуара генов Т-клеточных рецепторов у пациента с анкилозирующим спондилитом

2. Роль аллельных вариантов гена аминопептидазы ERAP1 в риске развития АС

2.1 Повышенная частота встречаемости ряда однонуклеотидных полиморфизмов гена ERAP1 среди пациентов с анкилозирующим спондилитом

2.2 Определение гаплотипов по исследованным маркерам гена ERAP1 в выборках больных АС и здоровых доноров российской популяции

2.2.1 Определение теоретической частоты встречаемости гаплотипов на основе результатов генотипирования

2.2.2 Определение фактических частот встречаемости гаплотипов ERAP1 в выборке больных АС из российской популяции

3. Многолокусный анализ факторов генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилиту

3.1 Анализ представленности аллельных вариантов гена МНС-подобного белка MICA среди пациентов с АС российской популяции

3.2 Определение не независимого распределения аллельных вариантов MICA с аллельными вариантами гена рецептора KIR3D в выборке больных АС

3.3 Выявление генетических паттернов по локусам KJR3D, ERAP1, micA, ассоциированных с риском развития АС

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ аллельных вариантов генов иммуноглобулин-подобных рецепторов у пациентов со спондилоартропатиями"

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Факторы генетической предрасположенности к развитию анкилозирующего спондилита

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Звягин, Иван Владимирович

Выводы

1. Показана повышенная встречаемость группы аллелей KIR3DS1, кодирующей активирующий вариант иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D, в выборке больных анкилозирующим спондилитом российской популяции по сравнению с выборкой здоровых hlaB*27- положительных доноров. Высказано предположение, о функциональной роли активирующих рецепторов KIR3DS1 в инициации анкилозирующего спондилита.

2. Показано, что присутствие в генотипе аллельных вариантов, кодирующих функциональный ингибирующий рецептор KIR3DL1, оказывает протективный эффект.

3. Показана ассоциация нескольких несинонимичных однонуклеотидных замен гена аминопептидазы ERAP1 с риском развития анкилозирующего спондилита.

4. Определены предположительно рисковый и протективный гаплотипы, включающие три несинонимичные однонуклеотидные замены гена ERAP1; определена фактическая частота встречаемости рискового гаплотипа в выборке больных АС.

5. Выявлены сочетания аллельных вариантов по локусам KIR3D, ERAP1, MICA, частоты встречаемости которых статистически достоверно различаются между выборкой больных АС и контрольной группой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Звягин, Иван Владимирович, Москва

1. Ahmad, T., S. E. Marshall, et al. (2002). "High resolution MIC genotyping: design andapplication to the investigation of inflammatory bowel disease susceptibility." Tissue Antigens 60(2): 164-179.

2. Amroun, H., H. Djoudi, et al. (2005). "Early-onset ankylosing spondylitis is associated with a functional MICA polymorphism." Hum Immunol 66(10): 1057-1061.

3. Anfossi, N., J. M. Doisne, et al. (2004). "Coordinated expression of Ig-like inhibitory MHC class I receptors and acquisition of cytotoxic function in human CD8+ T cells." J Immunol 173(12): 7223-7229.

4. Anfossi, N., V. Pascal, et al. (2001). "Biology of T memory type 1 cells." Immunol Rev 181: 269-278.

5. Antoniou, A. N., S. Ford, et al. (2004). "Formation of HLA-B27 homodimers and their relationship to assembly kinetics." J Biol Chem 279(10): 8895-8902.

6. Armaka, M., M. Apostolaki, et al. (2008). "Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases." J Exp Med 205(2): 331-337.

7. Assassi, S., J. D. Reveille, et al. (2011). "Whole-blood gene expression profiling in ankylosing spondylitis shows-upregulation of toll-like receptor 4 and 5." J Rheumatol 38(1): 87-98;

8. Aujla, S. J., P. J. Dubin, et al. (2007). "Thl7 cells and mucosal host defense." Semin Immunol ■ 19(6): 377-382.

9. Azuz-Lieberman, N., G. Markel, et al. (2005). "The involvement of NK cells in ankylosing spondylitis." Int Immunol 17(7): 837-845.

10. Bang, S. Y., T. II. Kim, et al. (2011). "Genetic studies of ankylosing spondylitis in Koreans confirm associations with ERAP1 and 2pl5 reported in white patients." J Rheumatol 38(2): 322-324.

11. Barrett, J. C., S. Hansoul, et al. (2008). "Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease." Nat Genet 40(8): 955-962.

12. Ben Dror, L., E. Barnea, et al. (2010). "The HLA-B*2705 peptidome." Arthritis Rheum 62(2): 420-429.

13. Beyeler, C., M. Armstrong, et al. (1996). "Relationship between genotype for the cytochrome P450 CYP2D6 and susceptibility to ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis." Ann Rheum Pis 55(1): 66-68.

14. Brown, M. A. (2008). "Re: Zhu et al, "A novel gene variation of TNF alpha associated with ankylosing spondylitis: a reconfirmed study"." Ann Rheum Pis 67(3): 434; discussion 434-436.

15. Brown, M. A., S. Edwards, et al. (2000). "Polymorphisms of the CYP2P6 gene increase susceptibility to ankylosing spondylitis." Hum Mol Genet 9(11): 1563-1566.

16. Brown, M. A., L. G. Kennedy, et al. (1997). "Susceptibility to ankylosing spondylitis in twins: the role of genes, HLA, and the environment." Arthritis Rheum 40(10): 1823-1828.

17. Brown, M. A., S. H. Laval, et al. (2000). "Recurrence risk modelling of the genetic susceptibility to ankylosing spondylitis." Ann Rheum Pis 59(11): 883-886.

18. Brown, M. A., K. P. Pile, et al. (1996). "HLA class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom." Ann Rheum Pis 55(4): 268-270.

19. Brown, M. A., K. P. Pile, et al. (1998). "A genome-wide screen for susceptibility loci in ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 41(4): 588-595.

20. Burney, R. O., K. P. Pile, et al. (1994). "Analysis of the MHC class II encoded components of the HLA class I antigen processing pathway in ankylosing spondylitis." Ann Rheum Pis 53(1): 58-60.

21. Burton, P. R., P. G. Clayton, et al. (2007). "Association scan of 14,500 nonsynonymous SNPs in four diseases identifies autoimmunity variants." Nat Genet 39(11): 1329-1337.

22. Caffrey, M. F. and D. C. James (1973). "Human lymphocyte antigen association in ankylosing spondylitis." Nature 242(5393): 121.

23. Carter, K. W., A. Pluzhnikov, et al. (2007). "Combined analysis of three whole genome linkage scans for Ankylosing Spondylitis." Rheumatology (Oxford) 46(5): 763-771.

24. Cascino, I., F. Paladini, et al. (2007). "Identification of previously unrecognized predisposing factors for ankylosing spondylitis from analysis of HLA-B27 extended haplotypes in Sardinia." Arthritis Rheum 56(8): 2640-2651.

25. Cella, M., A. Longo, et al. (1994). "NK3-specific natural killer cells are selectively inhibited by Bw4-positive HLA alleles with isoleucine 80." J Exp Med 180(4): 1235-1242.

26. Chan, A. T., S. D. Kollnberger, et al. (2005). "Expansion and enhanced survival of natural killer cells expressing the killer immunoglobulin-like receptor KIR3DL2 in spondylarthritis." Arthritis Rheum 52(11): 3586-3595.

27. Chen, C., X. Zhang, et al. (2010). "Analysis of JAK2 and STAT3 polymorphisms in patientswith ankylosing spondylitis in Chinese Han population." Clin Immunol 136(3): 442-446.

28. Chen, C., X. Zhang, et al. (2010). "ANTXR2 and IL-1R2 polymorphisms are not associated with ankylosing spondylitis in Chinese Han population." Rheumatol Int.

29. Cheng, N., Q. Cai, et al. (2009). "No significant association between genetic polymorphisms in the TNAP gene and ankylosing spondylitis in the Chinese Han population." Rheumatol Int 29(3): 305-310.

30. Choi, C. B., T. H. Kim, et al. (2010). "AJRTS1 polymorphisms are associated with ankylosing spondylitis in Koreans." Ann Rheum Pis 69(3): 582-584.

31. Cipriani, A., S. Rivera, et al. (2003). "HLA-B27 subtypes determination in patients with ankylosing spondylitis from Zulia, Venezuela." Hum Immunol 64(7): 745-749.

32. Colbert, R. A., M. L. DeLay, et al. (2010). "From HLA-B27 to spondylarthritis: a journey through the ER." Immunol Rev 233(1): 181-202.

33. Consortium, T. A.-A.-A. S. (2010). "Genome-wide association study of ankylosing spondylitis identifies non-MHC susceptibility loci." Nature Genetics 42(2): 123-127.

34. Consortium, W. T. C. C. C. T. A.-A.-A. S. (2007). "Association scan of 14,500 nonsynonymous SNPs in four diseases identifies autoimmunity variants." Nature Genetics 39(11): 13291337.

35. Cook, J. L., D. N. Ikle, et al. (1995). "Natural killer cell ontogeny in the athymic rat.

36. Relationship between functional maturation and acquired resistance to El A oncogene-expressing sarcoma cells." J Immunol 155(12): 5512-5518.

37. Cui Xinle, R. N. F., Hawari Feras, Levine J. Stewart (2003). "An aminopeptidase, ARTS1, is required for interleukin-6 receptor shedding." The Journal of Biological Chemistry 278: 28677-28685.

38. Cui Xinle, R. N. F., Hawari Feras, Levine J. Stewart (2003). "Shedding of the Type IIIL-1decoy receptor requires a multifunctional aminopeptidese, aminopeptidase regulator of TNF receptor type 1 shedding." The Journal of Immunology 171(12): 6814-6819.

39. Danchin, E., V. Vitiello, et al. (2004). "The major histocompatibility complex origin." Immunol Rev 198: 216-232.

40. Dangoria, N. S., M. L. DeLay, et al. (2002). "HLA-B27 misfolding is associated with aberrant intermolecular disulfide bond formation (dimerization) in the endoplasmic reticulum." J Biol Chem 277(26): 23459-23468.

41. Davidson, S. I., X. Wu, et al. (2009). "Association of ERAP1, but not IL23R, with ankylosing spondylitis in a Han Chinese population." Arthritis Rheum 60(11): 3263-3268.

42. DeLay, M. L., M. J. Turner, et al. (2009). "HLA-B27 misfolding and the unfolded proteinresponse augment interleukin-23 production and are associated with Thl7 activation in transgenic rats." Arthritis Rheum 60(9): 2633-2643.

43. Dhaliwal, J. S., C. L. Too, et al. (2003). "HLA-B27 polymorphism in the Malays." Tissue Antigens 62(4): 330-332.

44. Diaz-Pena, R., A. M. Aransay, et al. (2011). "Fine mapping of major histocompatibility complex in ankylosing spondylitis: Association of HLA-DPA1 and HLA-DPB1 region." Arthritis Rheum.

45. Diaz-Pena, R., M. A. Blanco-Gelaz, et al. (2008). "Activating KIR genes are associated with ankylosing spondylitis in Asian populations." Hum Immunol 69(7): 437-442.

46. Diaz-Pena, R., J. R. Vidal-Castineira, et al. (2010). "Association of the KIR3DS1*013 and

47. KIR3DL 1*004 alleles with susceptibility to ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 62(4): 1000-1006.

48. Diefenbach, A., E. Tomasello, et al. (2002). "Selective associations with signaling proteins determine stimulatory versus costimulatory activity of NKG2D." Nat Immunol 3(12): 1142-1149.

49. Dixon, A. L., L. Liang, et al. (2007). "A genome-wide association study of global gene expression." Nat Genet 39(10): 1202-1207.

50. Douik, H., A. Ben Chaaben, et al. (2009). "Association of MICA-129 polymorphism with nasopharyngeal cancer risk in a Tunisian population." Hum Immunol 70(1): 45-48.

51. Duan, R., P. Leo, et al. (2010). "Gene expression profiling reveals a downregulation in immune-, associated genes in patients with AS." Ann Rheum Pis 69(9): 1724-1729. •

52. Erden, G., F. S. Acar, et al. (2009). "Frequency of mutated allele CYP2D6M in the Turkishankylosing spondylitis patients and healthy controls." Rheumatol Int 29(12): 1431-1434.

53. Evans, D. M., C. C. Spencer, et al. (2011). "Interaction between ERAP1 and HLA-B27 inankylosing spondylitis implicates peptide handling in the mechanism for HLA-B27 in disease susceptibility." Nat Genet 43(8): 761-767.

54. Feltkamp, T. E. (1996). "Non-HLA-B27 genetic factors in HLA-B27 associated diseases." Clin Rheumatol 15 Suppl 1: 40-43.

55. Feng, M., B. Yin, et al. (2009). "TAPI and TAP2 polymorphisms associated with ankylosing spondylitis in genetically homogenous Chinese Han population." Hum Immunol 70(4): 257-261.

56. Fernandez-Sueiro, J. L., C. Alonso, et al. (2004). "Prevalence of HLA-B27 and subtypes of

57. HLA-B27 associated with ankylosing spondylitis in Galicia, Spain." Clin Exp Rheumatol 22(4): 465-468.

58. Ferreira, M. A., M. Mangino, et al. (2010). "Quantitative trait loci for CD4:CD8 lymphocyteratio are associated with risk of type 1 diabetes and HIV-1 immune control." Am J Hum Genet 86(1): 88-92.

59. Feske, S., Y. Gwack, et al. (2006). "A mutation in Orail causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function." Nature 441(7090): 179-185.

60. Fiorillo, M. T., A. Cauli, et al. (2003). "Two distinctive HLA haplotypes harbor the B27 alleles negatively or positively associated with ankylosing spondylitis in Sardinia: implications for disease pathogenesis." Arthritis Rheum 48(5): 1385-1389.

61. Fiorillo, M. T., M. Maragno, et al. (2000). "CD8(+) T-cell autoreactivity to an HLA-B27restricted self-epitope correlates with ankylosing spondylitis." J Clin Invest 106(1): 4753.

62. Fiorillo, M. T., C. Ruckert, et al. (2005). "Allele-dependent similarity between viral and self-peptide presentation by HLA-B27 subtypes." J Biol Chem 280(4): 2962-2971.

63. Fonseca, S. G., F. A. Procopio, et al. (2011). "Unique features of memory T cells in HIV elite controllers: a systems biology perspective." Curr Opin HIV AIDS 6(3): 188-196.

64. Fraile, A., M. D. Collado, et al. (2000). "TAPl and TAP2 polymorphism in Spanish patients with ankylosing spondylitis." Exp Clin Immunogenet 17(4): 199-204.

65. Fraile, A., A. Nieto, et al. (1998). "HSP70 gene polymorphisms in ankylosing spondylitis." Tissue Antigens 51(4 Pt 1): 382-385.

66. Fundamental immunology 6th edition", Paul W. // Lippincott Williams & Wilkins. 2008.

67. Furuichi, T., K. Maeda, et al. (2008). "Association of the MSX2 gene polymorphisms with ankylosing spondylitis in Japanese." J Hum Genet 53(5): 419-424.

68. Gabriel, S. B., S. F. Schaffner, et al. (2002). "The structure of haplotype blocks in the human genome." Science 296(5576): 2225-2229.

69. Galocha, B. and J. A. de Castro (2008). "Folding of HLA-B27 subtypes is determined by the global effect of polymorphic residues and shows incomplete correspondence to ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 58(2): 401-412.

70. Gardiner, C. M. (2008). "Killer cell immunoglobulin-like receptors on NK cells: the how, where and why." Int J Immunogenet 35(1): 1-8.

71. Gilfillan, S., E. L. Ho, et al. (2002). "NKG2D recruits two distinct adapters to trigger NK cell activation and costimulation." Nat Immunol 3(12): 1150-1155.

72. Gonzalez-Roces, S., M. V. Alvarez, et al. (1997). "HLA-B27 polymorphism and worldwide susceptibility to ankylosing spondylitis." Tissue Antigens 49(2): 116-123.

73. Gonzalez-Roces, S., C. Brautbar, et al. (1994). "Molecular analysis of HLA-B27 haplotypes in Caucasoids. Frequencies of B27-Cw in Jewish and Spanish populations." Hum Immunol 41(2): 127-134.

74. Goto, K., M. Ota, et al. (1998). "Association between MICA gene A4 allele and acute anterioruveitis in white patients with and without HLA-B27." Am J Ophthalmol 126(3): 436-441.

75. Goto, K., M. Ota, et al. (1997). "MICA gene and ankylosing spondylitis: linkage analysis via a transmembrane-encoded triplet repeat polymorphism." Tissue Antigens 49(5): 503-507.

76. Goto, Y., A. Hattori, et al. (2006). "Reduced activity of the hypertension-associated Lys528Arg mutant of human adipocyte-derived leucine aminopeptidase (A-LAP)/ER-aminopeptidase-1." FEBSJLett 580(7): 1833-1838.

77. Goto, Y., K. Ogawa, et al. (2011). "Secretion of endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 isinvolved in the activation of macrophages induced by lipopolysaccharide and interferon-gamma." J Biol Chem 286(241: 21906-21914.

78. Gu, J., E. Marker-Hermann, et al. (2002). "A 588-gene microarray analysis of the peripheral blood mononuclear cells of spondyloarthropathy patients." Rheumatology (Oxford) 41(7): 759-766.

79. Gumperz, J. E., V. Litwin, et al. (1995). "The Bw4 public epitope of HLA-B molecules confers reactivity with natural killer cell clones that express NKB1, a putative HLA receptor." J Exp Med 181(3): 1133-1144.

80. Guo, Z. S., C. Li, et al. (2010). "Association of IL-1 gene complex members with ankylosing spondylitis in Chinese Han population." Int J Immunogenet 37(1): 33-37.

81. Hammer, R. E., S. D. Maika, et al. (1990). "Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders." Cell 63(5): 1099-1112.

82. Haroon, N., F. W. Tsui, et al. (2010). "Serum cytokine receptors in ankylosing spondylitis: relationship to inflammatory markers and endoplasmic reticulum aminopeptidase polymorphisms." J Rheumatol 37(9): 1907-1910.

83. Hohler, T., T. Schaper, et al. (1997). "No primary association between LMP2 polymorphisms and extraspinal manifestations in spondyloarthropathies." Ann Rheum Pis 56(12): 741743.

84. Hosokawa, N., I. Wada, et al. (2001). "A novel ER alpha-mannosidase-like protein accelerates ER-associated degradation." EMBO Rep 2(5): 415-422.

85. Hou, T. Y., H. C. Chen, et al. (2007). "Usefulness of human leucocyte antigen-B27 subtypes in predicting ankylosing spondylitis: Taiwan experience." Intern Med J 37(11): 749-752.

86. Howe, H. S., P. L. Cheung, et al. (2005). "Transforming growth factor beta-1 and genepolymorphisms in oriental ankylosing spondylitis." Rheumatology (Oxford) 44(1): 51-54.

87. Hugot, J. P., M. Chamaillard, et al. (2001). "Association of NOP2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease." Nature 411(6837): 599-603.

88. Hulsmeyer, M., M. T. Fiorillo, et al. (2004). "Pual, HLA-B27 subtype-dependent conformation of a self-peptide." J Exp Med 199(2): 271-281.

89. Jaakkola, E., A. M. Crane, et al. (2004). "The effect of transforming growth factor betal gene polymorphisms in ankylosing spondylitis." Rheumatology (Oxford) 43(1): 32-38.

90. Jaakkola, E., I. Herzberg, et al. (2006). "Finnish HLA studies confirm the increased riskconferred by HLA-B27 homozygosity in ankylosing spondylitis." Ann Rheum Pis 65(6): 775-780.

91. Jandus, C., G. Bioley, et al. (2008). "Increased numbers of circulating polyfunctional Thl7memory cells in patients with seronegative spondylarthritides." Arthritis Rheum 58(8): 2307-2317.

92. Jarvis, L. B., M. K. Matyszak, et al. (2005). "Autoreactive human peripheral blood CP8+ T cells with a regulatory phenotype and function." Eur J Immunol 35(10): 2896-2908.

93. Jiao, Y. L., C. Y. Ma, et al. (2008). "Polymorphisms of KIRs gene and HLA-C alleles in patients with ankylosing spondylitis: possible association with susceptibility to the disease." J Clin Immunol 28(4): 343-349.

94. Kamphausen, E., C. Kellert, et al. (2010). "Pistinct molecular mechanisms leading to deficient expression of ER-resident aminopeptidases in melanoma." Cancer Immunol Immunother 59(8): 1273-1284.

95. Karaderi, T., P. Ilarvey, et al. (2009). "Association between the interleukin 23 receptor andankylosing spondylitis is confirmed by a new UK case-control study and meta-analysis of published series." Rheumatology (Oxford) 48(4): 386-389.

96. Khare, S. P., H. S. Luthra, et al. (1995). "Spontaneous inflammatory arthritis in HLA-B27transgenic mice lacking beta 2-microglobulin: a model of human spondyloarthropathies." J Exp Med 182C4): 1153-1158.

97. Kim, T. J., T. H. Kim, et al. (2008). "Interleukin 1 polymorphisms in patients with ankylosing spondylitis in Korea." J Rheumatol 35(8): 1603-1608.

98. Kollnberger, S., L. Bird, et al. (2002). "Cell-surface expression and immune receptor recognition of HLA-B27 homodimers." Arthritis Rheum 46(11): 2972-2982.

99. Kollnberger, S., A. Chan, et al. (2007). "Interaction of HLA-B27 homodimers with KIR3PL1 and KIR3PL2, unlike HLA-B27 heterotrimers, is independent of the sequence of bound peptide." Eur J Immunol 37(5): 1313-1322.

100. Konno, Y., J. Numaga, et al. (1998). "TAP polymorphism is not associated with ankylosingspondylitis and complications with acute anterior uveitis in HLA-B27-positive Japanese." Tissue Antigens 52(5): 478-483.

101. Mahfoudh, N., M. Siala, et al. (2011). "Association and frequency of HLA-A, B and HLA-DR genes in south Tunisian patients with spondylarthritis (SpA)." Clin Rheumatol 30(8): 1069-1073.

102. Maksymowych W.P., I. R. D., Gladman D.D., Reeve J.P., Pope A., Rahman P. (2009).

103. Association of a specific ERAP1/ARTS1 haplotype with disease susceptibility in ankylosing spondylitis." Arthritis&Rheumatism 60(5): 1317-1323.

104. Maksymowych, W. P., N. Adlam, et al. (1997). "Polymorphism of the LMP2 gene and disease phenotype in ankylosing spondylitis: no association with disease severity." Clin Rheumatol 16(5): 461-465.

105. Maksymowych, W. P., R. D. Inman, et al. (2009). "Association of a specific ERAP1/ARTS1haplotype with disease susceptibility in ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 60(5): 1317-1323.

106. Maksymowych, W. P., P. Rahman, et al. (2006). "Association of the IL1 gene cluster with susceptibility to ankylosing spondylitis: an analysis of three Canadian populations." Arthritis Rheum 54(3): 974-985.

107. Maksymowych, W. P. and A. S. Russell (1995). "Polymorphism in the LMP2 gene influences the relative risk for acute anterior uveitis in unselected patients with ankylosing spondylitis." Clin Invest Med 18(1): 42-46.

108. Maksymowych, W. P., M. Suarez-Almazor, et al. (1995). "Polymorphism in the LMP2 gene influences susceptibility to extraspinal disease in HLA-B27 positive individuals with ankylosing spondylitis." Ann Rheum Pis 54(4): 321-324.

109. Maksymowych, W. P., S. Tao, et al. (1995). "Allelic variation at the TAP 1 locus influencesdisease phenotype in HLA-B27 positive individuals with ankylosing spondylitis." Tissue Antigens 45(5): 328-332.

110. Maksymowych, W. P., S. Tao, et al. (2000). "LMP2 polymorphism is associated with extraspinal disease in HLA-B27 negative Caucasian and Mexican Mestizo patients with ankylosing spondylitis." J Rheumatol 27(1): 183-189.

111. Malnati, M. S., M. Peruzzi, et al. (1995). "Peptide specificity in the recognition of MHC class I by natural killer cell clones." Science 267(5200): 1016-1018.

112. Martin, M. P., R. M. Single, et al. (2008). "KIR haplotypes defined by segregation analysis in 59 Centre d'Etude Polymorphisme Humain (СЕРН) families." Immunogenetics 60(12): 767774.

113. Martinez-Borra, J., S. Gonzalez, et al. (2000). "HLA-B27 alone rather than B27-related class I haplotypes contributes to ankylosing spondylitis susceptibility." Hum Immunol 61(2): 131-139.

114. McCappin, J., P. Harvey, et al. (2010). "No association of KIR3PL1 or KIR3PS1 or their alleles with ankylosing spondylitis." Tissue Antigens 75(1): 68-73.

115. McGarry, F., R. Walker, et al. (1999). "The -308.1 polymorphism in the promoter region of the tumor necrosis factor gene is associated with ankylosing spondylitis independent of HLA-B27." J Rheumatol 26(5): 1110-1116.

116. Mear, J. P., K. L. Schreiber, et al. (1999). "Misfolding of HLA-B27 as a result of its В pocket suggests a novel mechanism for its role in susceptibility to spondyloarthropathies." J Immunol 163(12): 6665-6670.

117. Milicic, A., F. Lindheimer, et al. (2000). "Interethnic studies of TNF polymorphisms confirm the likely presence of a second MHC susceptibility locus in ankylosing spondylitis." Genes ¡mmun 1(7): 418-422.

118. Molecular autoimmunity", ed. by Talal N. / Academic Press, 1991.

119. Mousavi, Т., H. Poormoghim, et al. (2010). "Inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor KIR3PL1 in combination with HLA-B Bw4iso protect against ankylosing spondylitis." Iran J Immunol 7(2): 88-95.

120. Nasution, A. R., A. Mardjuadi, et al. (1997). "HLA-B27 subtypes positively and negatively associated with spondyloarthropathy." J Rheumatol 24(6): 1111-1114.

121. Nurzia, E., F. Panimolle, et al. (2010). "CP8+ T-cell mediated self-reactivity in HLA-B27context as a consequence of dual peptide conformation." Clin Immunol 135(3): 476-482.

122. Ogura, Y., P. K. Bonen, et al. (2001). "A frameshift mutation in NOP2 associated with susceptibility to Crohn's disease." Nature 411(6837): 603-606.

123. Paladini, F., F. Belfiore, et al. (2009). "HLA-E gene polymorphism associates with ankylosing spondylitis in Sardinia." Arthritis Res Ther 11(6): R171.

124. Pando, M. J., С. M. Gardiner, et al. (2003). "The protein made from a common allele of

125. KIR3PL1 (3PL1*004) is poorly expressed at cell surfaces due to substitution at positions 86 in Ig domain 0 and 182 in Ig domain 1." J Immunol 171(12): 6640-6649.

126. Parham, P. (2005). "Immunogenetics of killer cell immunoglobulin-like receptors." Mol Immunol 42(4): 459-462.

127. Pazar Borbala, S. E., Gergely Peter, Szanto Sandor, Szekanecz Zoltan, Poor Gyula (2010). "Association of ARTS1 gene polymorphisms with ankylosing spondylitis in the Hungarian population: The rs27044 variant is associated with HLA-B*2705 subtype in

128. Hungarian patients with ankylosing spondylitis." Journal of Rheumatology 37(2): 379384.

129. Pedersen, O. B., A. J. Svendsen, et al. (2008). "Ankylosing spondylitis in Danish and Norwegian twins: occurrence and the relative importance of genetic vs. environmental effectors in disease causation." Scand J Rheumatol 37(2): 120-126.

130. Peh, C. A., S. R. Burrows, et al. (1998). "HLA-B27-restricted antigen presentation in the absence of tapasin reveals polymorphism in mechanisms of HLA class I peptide loading." Immunity 8(5): 531-542.

131. Pimentel-Santos, F. M., D. Ligeiro, et al. (2009). "Association of IL23R and ERAP1 genes with ankylosing spondylitis in a Portuguese population." Clin Exp Rheumatol 27(5): 800-806.

132. Pointon, J. J., D. Harvey, et al. (2010). "Elucidating the chromosome 9 association with AS; CARD9 is a candidate gene." Genes Immun 11(6): 490-496.

133. Pointon, J. J., D. Harvey, et al. (2011). "The histone demethylase JARID1A is associated with susceptibility to ankylosing spondylitis." Genes Immun 12(5): 395-398.

134. Rahman, P., R. D. Inman, et al. (2008). "Association of interleukin-23 receptor variants with ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 58(4): 1020-1025.

135. Rajagopalan, S. and E. O. Long (1997). "The direct binding of ap58 killer cell inhibitoryreceptor to human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-Cw4 exhibits peptide selectivity." J Exp Med 185(8): 1523-1528.

136. Rajagopalan, S. and E. O. Long (1998). "Zinc bound to the killer cell-inhibitory receptor modulates the negative signal in human NK cells." J Immunol 161(3): 1299-1305.

137. Ramos, M., I. Alvarez, et al. (2002). "Molecular mimicry of an HLA-B27-derived ligand ofarthritis-linked subtypes with chlamydial proteins." J Biol Chem 277(40): 37573-37581.

138. Ramos, M., A. Paradela, et al. (2002). "Differential association of HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing spondylitis correlates with limited peptide subsets but not with altered cell surface stability." J Biol Chem 277(32): 28749-28756.

139. Rashid, T. and A. Ebringer (2007). "Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiella—the evidence." Clin Rheumatol 26(6): 858-864.

140. Remtoula, N., A. Bensussan, et al. (2008). "Cutting edge: selective expression of inhibitory or activating killer cell Ig-Iike receptors in circulating CD4+ T lymphocytes." J Immunol 180(5): 2767-2771.

141. Reveille, J. D. (2011). "The genetic basis of spondylarthritis." Ann Rheum Pis 70 Suppl 1: i44-50.

142. Ricci-Vitiani, L., A. Vacca, et al. (2000). "MICA gene triplet repeat polymorphism in patientswith HLA-B27 positive and negative ankylosing spondylitis from Sardinia." J Rheumatol 27(9): 2193-2197.

143. Ruckert, C., M. T. Fiorillo, et al. (2006). "Conformational dimorphism of self-peptides and molecular mimicry in a disease-associated HLA-B27 subtype." J Biol Chem 281(4): 2306-2316.

144. Rueda, B., G. Orozco, et al. (2008). "The IL23R Arg381Gln non-synonymous polymorphism confers susceptibility to ankylosing spondylitis." Ann Rheum Pis 67(10): 1451-1454.

145. Said-Nahal, R., C. Miceli-Richard, et al. (2002). "The role of HLA genes in familialspondyloarthropathy: a comprehensive study of 70 multiplex families." Ann Rheum Pis 61(3): 201-206.

146. Sanchez, A., M. Szczypiorska, et al. (2010). "Association of the intergenic single-nucleotidepolymorphism rsl0865331 (2pl5) with ankylosing spondylitis in a Spanish population." J Rheumatol 37(11): 2345-2347.

147. Saveanu, L., O. Carroll, et al. (2005). "Concerted peptide trimming by human ERAP1 and

148. ERAP2 aminopeptidase complexes in the endoplasmic reticulum." Nat Immunol 6(7): 689-697.

149. Sesma, L., V. Montserrat, et al. (2002). "The peptide repertoires of HLA-B27 subtypesdifferentially associated to spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by specific changes at three anchor positions." J Biol Chem 277(19): 16744-16749.

150. Sheehan, N. J. (2010). "HLA-B27: what's new?" Rheumatology (Oxford) 49(4): 621-631.

151. Shih, H. C., S. C. Liu, et al. (2001). "Positive association of ankylosing spondylitis withhomozygous HLA-B2704, but protection with B2705 in Taiwan Chinese." Kaohsiung J Med Sei 17(10): 509-516.

152. Sims, A. M., M. Barnardo, et al. (2007). "Non-B27 MHC associations of ankylosing spondylitis." Genes Immun 8(2): 115-123.

153. Sims, A. M., A. E. Timms, et al. (2008). "Prospective meta-analysis of interleukin 1 genecomplex polymorphisms confirms associations with ankylosing spondylitis." Ann Rheum Dis 67(9): 1305-1309.

154. Single, R. M., M. P. Martin, et al. (2007). "Global diversity and evidence for coevolution of KIR and HLA." Nat Genet 39(9): 1114-1119.

155. Smith, J. A., M. D. Barnes, et al. (2008). "Gene expression analysis of macrophages derivedfrom ankylosing spondylitis patients reveals interferon-gamma dysregulation." Arthritis Rheum 58(6): 1640-1649.

156. Steinle, A., P. Li, et al. (2001). "Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB, and homologs of the mouse RAE-1 protein family." Immunogenetics 53(4): 279-287.

157. Su, H., B. L. Wang, et al. (2006). "Disequilibrium linkage between the polymorphism in exons 2,3 and 4 of the MICA gene and HLA-B antigen of patient with ankylosing • spondylitis." Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 23(4): 446-448.

158. Sudarsono, D., S. Hadi, et al. (1999). "Evidence that HLA-B*2706 is not protective against spondyloarthropathy." J Rheumatol 26(7): 1534-1536.

159. Sung, I. H., T. H. Kim, et al. (2009). "IL-23R polymoiphisms in patients with ankylosing spondylitis in Korea." J Rheumatol 36(5): 1003-1005.

160. Taurog, J. D. (2007). "The mystery of HLA-B27: if it isn't one thing, it's another." Arthritis Rheum 56(8): 2478-2481.

161. Thomas, G. P. and M. A. Brown (2010). "Genetics and genomics of ankylosing spondylitis." Immunol Rev 233(1): 162-180.

162. Thomas, R., E. Yamada, et al. (2008).-"Novel KIR3DL1 alleles and their expression levels on NK cells: convergent evolution of KIR3DL1 phenotype variation?" J Immunol 180(10): 6743-6750.

163. Timms, A. E., Y. Zhang, et al. (2003). "Investigation of the role of ANKH in ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 48(10): 2898-2902.

164. Tran, T. M., M. L. Dorris, et al. (2006). "Additional human beta2-microglobulin curbs HLA-B27 misfolding and promotes arthritis and spondylitis without colitis in male HLA-B27-transgenic rats." Arthritis Rheum 54(4): 1317-1327.

165. Trundley, A., H. Frebel, et al. (2007). "Allelic expression patterns of KIR3DS1 and 3DL1 using the Z27 and DX9 antibodies." Eur J Immunol 37(3): 780-787.

166. Tsuchiya, N., M. Shiota, et al. (1998). "MICA allele typing of HLA-B27 positive Japanese patients with seronegative spondylarthropathies and healthy individuals: differential linkage disequilibrium with HLA-B27 subtypes." Arthritis Rheum 41(1): 68-73.

167. Tsui, F. W., N. Haroon, et al. (2010). "Association of an ERAP1 ERAP2 haplotype with familial ankylosing spondylitis." Ann Rheum Dis 69(4): 733-736.

168. Tsui, F. W., H. W. Tsui, et al. (2003). "Novel genetic markers in the 5-flanking region of ANKH are associated with ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 48(3): 791-797.

169. Tsui, II. W., R. D. Inman, et al. (2005). "ANKH variants associated with ankylosing spondylitis: gender differences." Arthritis Res Ther 7(3): R513-525.

170. Tsui, H. W., R. D. Inman, et al. (2007). "Association of a TNAP haplotype with ankylosing spondylitis." Arthritis Rheum 56(1): 234-243.

171. Turner, M. J., D. P. Sowders, et al. (2005). "HLA-B27 misfolding in transgenic rats is associated with activation of the unfolded protein response." J Immunol 175(4): 2438-2448.

172. Uhrberg, M. (2005). "The KIR gene family: life in the fast lane of evolution." Eur J Immunol 35(1): 10-15.

173. Vargas-Alarcon, G., R. Gamboa, et al. (2004). "Association study of LMP gene polymorphisms in Mexican patients with spondylarthritis." Hum Immunol 65(12): 1437-1442.

174. Vargas-Alarcon, G., J. D. Londono, et al. (2002). "Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with spondyloarthropathies." Ann Rheum Pis 61(1): 48-51.

175. Velasco, J., M. T. Zarrabeitia, et al. (2010). "Wnt pathway genes in osteoporosis andosteoarthritis: differential expression and genetic association study." Osteoporos Int 21(1): 109-118.

176. Wang, W., J. Xu, et al. (2005). "Role of the progressive ankylosis gene (ank) in cartilage mineralization." Mol Cell Biol 25(1): 312-323.

177. Wei, J. C., W. C. Tsai, et al. (2004). "HLA-B60 and B61 are strongly associated with ankylosing spondylitis in HLA-B27-negative Taiwan Chinese patients." Rheumatology (Oxford) 43(7): 839-842.

178. Wei, J. C., J. H. Yen, et al. (2011). "Association of ORAI1 haplotypes with the risk of HLA-B27 positive ankylosing spondylitis." PLoS One 6(6): e20426.

179. Wendling, P., J. P. Cedoz, et al. (2007). "Serum IL-17, BMP-7, and bone turnover markers in patients with ankylosing spondylitis." Joint Bone Spine 74(3): 304-305.

180. Westman, P., J. Partanen, et al. (1994). "HSP70-Hom Ncol polymorphism and HLA-associations in the Finnish population and in patients with ankylosing spondylitis or reactive arthritis." Eur J Immunogenet 21(2): 81-90.

181. Westman, P., J. Partanen, et al. (1995). "TAPI and TAP2 polymorphism in HLA-B27-positive subpopulations: no allelic differences in ankylosing spondylitis and reactive arthritis." Hum Immunol 44(4): 236-242.

182. Wigginton, J. E., P. J. Cutler, et al. (2005). "A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium." Am J Hum Genet 76(5): 887-893.

183. Wu, W., Y. Ping, et al. (2011). "Susceptibility to ankylosing spondylitis: evidence for the role of ERAP1, TGFbl and TLR9 gene polymorphisms." Rheumatol Int.

184. Yabuki, K., M. Ota, et al. (1999). "Triplet repeat polymorphism in the MICA gene in HLA-B27 positive and negative caucasian patients with ankylosing spondylitis." Hum Immunol 60(1): 83-86.

185. Yang, X. O., B. P. Pappu, et al. (2008). "T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma." Immunity 28(1): 29-39.

186. Zappacosta, F., F. Borrego, et al. (1997). "Peptides isolated from HLA-Cw*0304 confer different degrees of protection from natural killer cell-mediated lysis." Proc Natl Acad Sei USA 94(12): 6313-6318.

187. Zhang, L., L. B. Jarvis, et al. (2009). "Regulatory IL4+CD8+ T cells in patients with ankylosing spondylitis and healthy controls." Ann Rheum Pis 68(8): 1345-1351.

188. Zhao, J., Y. Jiang, et al. (2011). "Functional MICA-129 polymorphism and serum levels ofsoluble MICA are correlated with ulcerative colitis in Chinese patients." J Gastroenterol Hepatol 26(3): 593-598.

189. Zhernakova, A., E. M. Festen, et al. (2008). "Genetic analysis of innate immunity in Crohn's disease and ulcerative colitis identifies two susceptibility loci harboring CARD9 and IL18RAP." Am J Hum Genet 82(5): 1202-1210.

190. Zhu, X., Y. Wang, et al. (2007). "A novel gene variation of TNFalpha associated withankylosing spondylitis: a reconfirmed study." Ann Rheum Pis 66(11): 1419-1422.

Информация о работе

Звягин, Иван Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ аллельных вариантов генов иммуноглобулин-подобных рецепторов у пациентов со спондилоартропатиями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы