Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование ДНК-технологии для оценки воспроизводительных качеств свиней

ВАК РФ 06.02.07, Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Использование ДНК-технологии для оценки воспроизводительных качеств свиней"

На правах рукописи

НУРГАЛИЕВ ФАННУР МУДАРИСОВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК - ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫХ КАЧЕСТВ СВИНЕЙ

06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

12 ДЕК 2013

Казань-2013

005543394

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Ахметов Тахир Мунавирович

Официальные оппоненты: Мухаметгалиев Нурвахит Нургалиевич,

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», заведующий кафедрой кормления с.-х. животных

Фаизов Тагир Хадиевич,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, главный научный сотрудник научно-инновационного центра

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ижевская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится декабря 2013 г. в /S часов на

заседании диссертационного совета Д.220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» по адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35; тел. (8432) 7396-17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», автореферат размещен в сети интернет на сайтах http: //www.vak.ed.gov.ru/ и //www.ksavm.senet.ru/

Автореферат разослан Л ноября 2013 г. _____

/г

Ученый секретарь диссертационного совета, «•¿- ¿у Гильмутдинов

доктор биологических наук, профессор Рустам Якубович

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Свиноводство - динамично развивающаяся отрасль животноводства, однако, как показывает мировой опыт, дальнейшее повышение эффективности отрасли невозможно без внедрения в селекционную работу достижений в области молекулярной генетики, в частности, нахождения генетических маркеров, отвечающих за определённые показатели продуктивности (Каспирович ДА. Влияние полиморфизма генов - рецепторов EPOR, MUC4, IGF-2 на основные селекционируемые признаки свиней белорусской крупной белой и белорусской мясной пород: автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.02.07. Гродно. 2010.20 с).

Новые открытия в молекулярной генетике позволяют выделять и изучать специальные участки генома, которые влияют на важные продуктивные, в частности на воспроизводительные признаки.

В качестве маркеров плодовитости свиней рассматриваются следующие гены, которые признаны генами-кацдидатами, влияющими на размер гнезда, это ген эстрогенового рецептора - ESR и ген пролактинового рецептора - PRLR (Лобан НА. и др. Молекулярная генная диагностика в свиноводстве Беларуси. Дубровицы. ВИЖ. 2005. С. 34-37; Шейко И.П. и др. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики // Весщ нацыянальнай акадэмп навук Бэларусь 2006. № 3. С. 77-81).

Потребители и перерабатывающая промышленность нуждаются в улучшении качества мяса. Это требует от селекционеров использования новых методов генетической селекции, направленных на усовершенствование продуктивных признаков. Данные, полученные из литературных источников, показывают потенциальную значимость генов белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), рианодинового рецептора (RYR1) и меланокортш юго рецептора 4 (MC4R) в качестве маркеров мясной и откормочной продуктивности (Лобан НА., Василюк О Л. Карта генетического профиля свиней белорусской крупной белой породы // Вестник Белорусской Государственной Сельскохозяйственной Академии. 2010. № 2. С. 116-121; Гетманцева ЛВ. Степень влияния гена MC4R на фенотип организма. Тезисы докладов XVIII Международ, науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2011 ». М:. 2011. С. 89).

Некоторые исследователи, такие как Рыжова Н.В. (Рыжова Н.В. Полиморфизм гена RYR1 в популяциях свиней мясных пород: дис. кавд. бисш. наук: 06.02.01 Лесные Поляны. 2001. 107 с), Гришина Н.Б. (Гришина Н.Б. Использование генетических маркеров в селекции свиней крупной белой порода в Сибири: дас. канд. бисш. наук: 06.02.01. Новосибирск. 2008. 147 с), Плужникова ОБ. (Плужникова О.В. Естественная резистентность, воспроизводительные и мясные качества свиней в связи с их агшельным состоянием по локусу RYR-1 гена: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Ставрополь. 2009. 19 с) отмечают, что разные аллели и генотипы по локусу генов RYR1 и H-FABP наряду с непосредственным влиянием на откормочную и мясную продуктивность, оказывают некоторое действие на репродуктивные качества свиней.

Степень разработанности темы. Изучением генетической структуры по ДНК -маркерам в стадах свиней разных пород занимались многие, в том числе Банникова АД., Бублик Е.М., Лаломова Е.В., Kmicc M. et al., Vincent A.L. et al. - по гену PRLR; Банникова АД, Бублик E.M., Зиновьева H.A. и др., Косгенко С.А. и др., Полозюк О.Н., Korach K.S. -

по гену ESR; Кузнецов А.И. и др., Fujii J. et al., Mac Lennan D.H. et al., Смирнов H.H. no гену RYR1; Зиновьева НА. и др., Лобан H.A. и др., Максимов Г.В. и др., Gerbens F. et al. по гену H-FABP; Бублик Е.М., Гешанцева JI.B., Коспонина О.В., Зиновьева НА., Сизарева Е.И. и др., Шейко и др., Gantz L et al. по гену MC4R. Однако в научных трудах этих учёных не имеется данных по генотипированию свиней методами ДНК-технологии в условиях Республики Татарстан. Не изучен агшельный полиморфизм генов PRLR ESR, RYR1, Н-FABP и MC4R у свиней разных пород, разводимых в Республике Татарстан.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы- исследование полиморфизма генов PRLR ESR RYRJ, H-FABP и MC4R с помощью ДЬЖ-диагностики у свиноматок крупной белой породы, а также определение влияния разных генотипов и их комбинаций на воспроизводительные качества животных.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

— апробировать технику выделения ДНК из крови свиней для генно-мдаекулярных исследований;

— совершенствовать технику проведения ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РШЛ ESR RYR1, H-FABP и MC4R;

— изучить частоту встречаемости аллелей, генотипов по локусам генов PRLR ESR RYRJ, H-FABP, MC4R и их комбинаций PRLR / ESR PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / MC4R у свиноматок крупной белой породы;

— оценить воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов PRLR, ESR RYRJ, H-FABP, MC4R и их комбинаций PRLR / ESR PRLR /ESR/RYRJ/ H-FABP / MC4R;

— определить экономическую эффективность использования свиней крупной белой породы с разными комбинациями генотипов PRLR / ESR / RYRJ / H-FABP / MC4R.

Научная новизна работы. Усовершенствованы протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR, ESR RYRJ, H-FABP, MC4R. Впервые в условиях Республики Татарстан изучен полиморфизм и определена частота встречаемости генотипов по локусам генов PRLR ESR RYRJ, H-FABP, MC4R и их комбинаций PRLR / ESR PRLR / ESR / RYRJ / H-FABP / MC4R у свиноматок крупной белой породы. Изучены воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов PRLR, ESR RYRJ, H-FABP, MC4R и их комбинаций PRLR/ESR PRLR/ESR/RYRJ /H-FABP /MC4R.

Теоретическая и практическая значимость. Основные положения и выводы диссертации позволяют пополнить теоретические данные, касающиеся селекции свиней методами ДНК-технологии.

Апробированные методы экстракции ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR ESR RYRJ, H-FABP, MC4R позволяют результативно их использовать в генно-молекулярных исследованиях и в частности в скрининге перечисленных генов. Полученные результаты исследований, касающихся генотипов PRLR, ESR, RYRJ, H-FABP, MC4R и их комбинаций, возможно, использовать в свиноводстве для улучшения хозяйственно-полезных признаков, в том числе репродуктивных качеств свиней.

Методология и методы исследования. Основой диссертационного исследования выступает комплекс общенаучных и специальных методов. Для получения результатов исследования использовались общенаучные методы: аналогии, синтеза, индукции,

дедукции (обеспечивающие, прежде всего теоретическую составляющую) и наблюдения, сравнения, моделирования (обеспечивающие, прежде всего практическую составляющую). Наряду с этим применялись специальные методы, в систему которых входили зоотехнические и методы генно-молекулярной диагностики. Для расчёта количественных показателей использовали математический и статистический методы. Применение перечисленных методов позволило получить объективные и достоверные результаты исследования.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность исследования подтверждается использованием комплекса методов и программ, что, в конечном счёте, выражается согласованностью полученных выводов и результатов исследования.

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчётах кафедры технологии животноводства ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2011-2013 гг.); научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2012-2013 гг.); конкурсе пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан (Казань, 2011-2012 гг.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И. Лобачевского (Казань, 2012); всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и учащейся молодёжи (Казань, 2013); международной научно-практической конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития АПК», посвящённой 140-леггию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2013).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Апробированные нами способы выделения геномной высокомолекулярной ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я позволяет точно определять аллели и генотипы, связанные у животных с хозяйственно-полезными признаками.

- Определена частота встречаемости генотипов и комбинаций генотипов генов РЫЖ, ЕБЯ, ЯУЯ], Н-ЕАВР, МС4Я у свиноматок ]фупной белой породы в условиях Республики Татарстан.

- Выявлены желательные генотипы в стадах свиней крупной белой породы повышающие их репродуктивные качества

- Экономически обосновано исследовать свиней крупной белой породы по локусам генов РЯЩ ЕЯЯ, ЯШ1, Н-ЕАВР, МС4Я.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 24 таблицы, 31 рисунок. Состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, предложения производству, списка использованной литературы (всего 152 источника, в том числе 72 иностранных) и 15 приложений.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Материалы и методы исследования

Исследования по теме диссертационной работы проводились в период с 2011 по 2013 гг. на кафедре технологии животноводства ФГБОУ ВПО «Казанская государственный академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в отделе вирусологии и генно-молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», в подсобном хозяйстве «Новая Тура» Зеленодольского района и ООО «Алтын Саба» Сабинского района, которое было реорганизовано и вошло в состав новой фирмы ООО «ТАТМИТ Arpo» Сабинского района Республики Татарстан. Научно-хозяйственные опыты поставлены согласно схеме исследования (рисунок 1).

Использование ДНК-технологии для оценки воспроизводительных качеств свиней

Выявление аллельных вариантов генов, оценка частоты встречаемости аллелей и _генотипов, степени гетерозиготное™, наличия генного равновесия_

Объекты исследований: основные свиноматки крупной белой породы в подсобном

т У т ▼ т

Группы Группы Группы Группы Группы

Генотип Генотип Генотип Генотип Генотип

PRLR ESR RYR1 H-FABP MC4R

S3 WW WM мм 1 § ч eq «3 <4 «5

Воспроизводительные качества свиноматок с разными генотипами и комбинациями генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R

Количество рождённых (всего и живых) поросят у свиноматок, процент мертворожденных

_ поросят__

Экономическая эффективность использования свиноматок с разными комбинациями генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R

Рисунок 1 - Схема исследования

Для определения полиморфизма генов пролакганового рецептора (PRLR), эсгрогенового рецептора (ESR), белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), рианодинового рецептора (RYR1) и меланокортиного рецептора 4 (MC4R), оценки воспроизводительных качеств свиней с разными генотипами PRLR, ESR, RYRl, H-FABP и MC4R было отобрано в подсобном хозяйстве «Новая Тура», ООО «ТАТМИТ Arpo» 100 и 87 основных свиноматок крупной белой породы. Определение аллельного полиморфизма генов PRLR, ESR, RYRl, H-FABP и MC4R осуществляли методами ДНК-технопогии (метод ПЦР и ПЦР-ПДРФ).

По принципу аналогов (Овсянников А.И. Основы опытного дела в животноводстве. М.: Колос. 1976. 303 с) были сформированы группы из основных свиноматок крупной белой породы с разными генотипами PRLR, ESR, RYRl, H-FABP и MC4R, а также с разными комбинациями соответствующих генотипов.

При проведении научно-хозяйственных опытов использовали документацию зоотехнического и племенного учёта подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТАгро».

В подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» рационы кормления свиноматок были составлены с учётом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (Калашников А.П. и др. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочное пособие. 3-е изд. перераб. и допол. М.: 2003.456 с).

Кровь отбирали из яремной вены свиней в вакуумные пробирки с ЭДГА. Выделение ДНК из крови свиней проводили аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Анализ локуса гена PRLR. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров PRLR1: 5-CGGCCGCAGAATCCTGCTTGC-3' и PRLR2: 5'-АССССАССГГСТААСССАТСАТСС-3', подобранных Linville R.C. et al. (Linville R.C. et al. Candidate gene analysis for ioci affecting litter size and ovulation rate in swine // J. Anim. Sci. 2001. V. 79. P. 60-67) для амплификации фрагмента гена PRLR длиной 161 п.н. Для определения аллельного полиморфизма гена PRLR по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 2 ед. эвдонуклеазы рестрикции AM в 1 хбуфере «У» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37°С в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 3% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в lxTBE буфере.

Анализ локуса гена ESR. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров ESR-F: 5-CCCTCTATGACCTGCTGCTG-3' и ESR-R: 5-TCAGATTGTGGTGGGGAAGTTC-3, подобранных Kaminski S.et al. (Kaminski S. Simultaneous identification of ryanodine receptor 1 (RYR1) and estrogene receptor (ESR) genotypes with the multiplex PCR-RFLP method in Polish Large White and Polish Landrace pigs // J. Appl. Genet 2002. V. 43 (3). P. 331-335) для амплификации фрагмента гена ESR длиной 185 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена ESR по вариантам М и W 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Апю871в ^буфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при ЗГС в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 3% агарозного геля с содерканием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в lxTBE буфере.

Анализ локуса гена RYR1. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцию> (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров:

1) Ryrl-p-f: 5'-TCCAGnTGCCACAGGTCCTACCA-3' и Ryrl-p-r: 5-TTCACCGGA GTGGAGTCTCTGAGT-3', подобранных Riojas-Valdes V.M. et al. (Riojas-Valdes V.M. et al. Allele frequency of porcine stress syndrome in Nuevo Leon by PCR-RFLP analysis // Vet Mexico. 2005. V. 36. № 003. P. 261-267) для амплификации фрагмента гена RYR1 длиной 659 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена RYR1 по вариантам N и п 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 2 ед. эндонуклеазы рестрикции Bbvl2l в 1 хбуфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37°С в течение ночи.

2) RYR1-F: 5/-CCACACCCTCCCCGCAAGTGC-3/ и RYR1-R: 5-GCCAGGGA GCAAGITCTCAGTAAM', подобранных Luerce T.D. et al. (Luerce T.D. et al. An improved method for characterization of the mutation associated to porcine stress syndrome by PCR amplification followed by restriction analysis // Ciencia Rural, Santa Maria 2009. V. 39. N. 5. P.

1577-1580) для амплификации фрагмента гена RYR1 длиной 144 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена RYR1 по вариантам 7V и « 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HspAI в 1><буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37°С в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5-4% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ХТВЕ буфере.

Анализ локуса гена H-FABP. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров H-FABP-F: 51-ATTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3' и H-FABP-R: 5-TCAGGAATGGGAGTTATTGG-3', подобранных Li C.L. et al. (Li C.L. et al. Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China // South African J. of Animal Sci. 2006. V. 36. N. IP. 1-6) для амплификации фрагмента гена H-FABP длиной 800 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена H-FABP по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции НаеШ в 1*буфере «G» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37°С в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1 хТВЕ буфере.

Анализ локуса гена MC4R. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров MC4R-F: 5-TACCCTG АССАТСТШАТШ-З' и MC4R-R: 5-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-S', подобранных Li C.L. et al. (Там же, С. 2) для амплификации фрагмента гена MC4R длиной 226 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена MC4R по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TagI в 1* буфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 °С в течение ночи. Д ля визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1 хТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов RYR1, PRLR, ESR, H-FABP, MC4R определяли по формуле: р = п: N, где р - частота определения генотипа, п—количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей. Частоту отдельных аллелей определяли по формулам: рА = (2пАА+пАВ) : 2N и qB = (2пВВ+пАВ) : 2N, где рА - частота аллеля A, qB -частота аллеля В, N-общее число аллелей.

Ожидаемые и наблюдаемые частоты генотипов в исследуемых популяциях свиноматок крупной белой породы подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» рассчитывали по закону Харди-Вайнберга (Петухов ВЛ. и др. Ветеринария генетика с основами вариационной статистики. М.: Агропромиздат. 1996.243 с).

Воспроизводительные качества основных свиноматок крупной белой породы с разными генотипами и комбинациями генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R оценивали по таким показателям: общее количество родившихся поросят в среднем на 1 свиноматку, количество живых родившихся поросят в среднем на 1 свиноматку и процент мертворождённых поросят.

Полученные результаты исследований обрабатывались биометрическим методом с применением вариационно-статистического анализа (Меркурьева Е.К Биометрия в селекции и генетике с.-х. животных. М.: Колос. 1970. 424 с). Достоверность полученных данных определяли по критерию Стыодента.

2 2 Результаты собственных исследований 2.2.1 Апробация аммиачного и комбинированного щелочного способов выделения ДНК из крови свиней ДНК из крови свиней выделяли аммиачным и комбинированным щелочным способами, предложенные Вафиным Р.Р. в 2006

экстракции ДНК из крови крупного рогатого скота группой исследовш^еи Вафиным Р.Р., Ахметовым Т.М., Валиулплиной Э.Ф., Зариповым О.Г., Тюлькиным С.В.

Выделенные наш* образцы ДНК из крови свиней как аммиачным, так и

комбинированным щелочным способами показали ™

и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по генам PRLR ESR RYR1, H-FABP и МС4К.

22.2 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену PRLR

Для оценки качества работы известного протокола по геншшшрованию — по гену PRLR нами была протестирована серия олигонуклеотадных праимеров: PRLR 1 и PRLR2, подобранных Linville R.C.et al. (Linville R.C. et al. Candidate gene analyse for ta affecting litter size and ovulation rate in swine. P. 62) по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ- Праймеры PRLR1+PRLR2 инициируют амшшфиицию ФР~та гена PRLR свиней длиной 161 bp, а ПДРФ-ЛМ профиль (АА=126/35 bp, №=91/35 bp и АВ=126/91/35 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 1).

Ml 2 3.4 .....5_6_ 7

300 bp-200 bp-

100 bp-

bp

—e-126 bp 6- 91 bp

e- 35 bp

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ генаРИЛ. с праимерами PELM+PRLR2 и эндонуклеазным расщеплением ферментомЛй!/ Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-2) ^^ генотип ВВ (91/35 bp),

5-6) генотип АВ (126/91/35), 7) дальний ПЦР-продукг re«aPRLR(\6\ bp).

Полученные результаты ПЦР гена PRLR свиней с праимерами PRLR 1+PRLR2 и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.3 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ ДЛ« генотипирования свиней

по гену ESR

Для оценки качества работы известного протокола по генотшшртванию свиней по гену ESR нами была протестирована серия

rCCTCTATGACCTGCTGCTG-З и ESR-R: 5 -TCAGATTGTGGTGGGGAAGTIС-3, подобранных Karniñski S. et al. (Kamiñsld S. Simultáneos identic 1 (RYR1) and estrogene receptor (ESR) genotypes with the multiplex PCR-RFLP method m Polish Large White and Polish Landmce. P. 332) по усовершенствованной нами технике ПЦР

и ПЦР-ПДРФ. Праймеры ESR-F+ESR-R инициируют амплификацию фрагмента гена ESR свиней длиной 185 bp, а ПДРФ - Ата871 профиль (MW=76/62/47 bp, WW=109/76 bp и MW=109/76/62/47 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 2).

Рис. 2. Элекхрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена ESR с праймерами ESR-F+ESR-R и звдонуклеазным расщеплением ферментом Ата871 Обозначения: М) ДНК-маркфы 100 bp (СибЭнзим); 1-2) генотип ММ (76/62/47 bp); 34) генотип MW (109/76/62/47); 5-6) генотип iW(109/76 bp); 7) цельный ПЦР-продуто-гена^/? (185 bp).

Полученные результаты ПЦР гена ESR свиней с праймерами ESR-F+ESR-R и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

200 bp 100

50 bp

2.2.4 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней

по гену RYR1

Д ля оценки качества работы известных протоколов по генотипированию свиней по гену RYR1 нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: Ryrl-p-f и Ryrl-p-r, подобранных Riojas-Valdes V.M. et al. (Riojas-Valdes V.M. et al. Allele frequency of porcine stress syndrome in Nuevo Leon by PCR-RFLP analysis // Vet. Mexico. 2005. V. 36. № 003. P. 263-264); RYR1-F и RYR1-R, подобранных Luerce T.D. et al. (Luerce T.D. et al. An improved method for characterization of the mutation associated to porcine stress syndrome by PGR amplification followed by restriction analysis. P. 1578) по усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры Ryrl-p-f+Ryrl-p-r инициируют амплификацию фрагмента гена RYR1 свиней длиной 659 bp, a RYRJ-UffN)-Bbvl2I профиль AW=524/135 bp (здоровые особи), Мг=524/358/166/135 bp (особи-носители мутации, рис. 3) №ï=358/166/135 bp (больные особи) идентифицирует его генотипы.

600

500

400

ЗЮ

209

100—^

Рис. 3. Элекгрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена RYR1 с праймерами Ryrl-p-f+Ryrl-p-r и эццонуклеазным расщеплением ферментом Bbvl2I

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим); 1,2) генагап Ш (524/135 Ьр); 3,4) генотип Мг (524/358/166/135 Ьр); 5) цельный ПЦР-фрагмент гена КУК 1 (659 Ьр).

Праймеры КУИЛ-Р+ЯУРи-К шпщиируют амплификацию фрагмента гена КУШ свиней данной 144 Ьр, а яда-ПДРФ-Я^Л/-профиль здоровых животных = 102/42 Ьр (генотип 1Щ (рисунок 4), больных животных = 144 Ьр (генотип ли), а животных-

носителей мутантного аллеля п гена КШ1 =144/102/42 Ьр.

м 1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

тг -

- ^ л ; ;

'«•Ьр-К - 42 Ьр

Рис. 4. Элегарофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена КУЮ с праймерами КУШ-Р+КУШ-К и эвдонуклеазным расщеплением Н$рА1

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1-17) генотип NN (102/42 Ьр); 18) цельный ПНР-фрагмент генаЛШ (144 Ьр).

Полученные результаты ПЦР гена КУШ свиней с праймерами Куг1-р-Г+Куг1-р-г; ЮТи-Р+ЯУШ-К. и в дальнейшем проведение ПДРФ также являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.5 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотапирования свиней

но гену H-FABP

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену H-FABP нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров H-FABP-F и H-FABP-R, подобранных Li C.L. et al. (C.L. Li, Y.C. Pan, H. Meng Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China. P. 2) no усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры H-FABP-F+H-FABP-R инициируют амплификацию фрагмента гена H-FABP свиней длиной 800 bp, а ПДРФ-НаеШ профиль (4.4=683/117 Ьр, №405/278/117 Ьр и ЛВ=683/405/278/117 Ьр) идентифицирует его генотипы (рис. 5).

700 bp -

600 400

100 Ьр

Рис. 5. Элеюрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена Н-РАВР с праймерами Н-РАВР-Р+Н-РАБР-К и эндонутюгеазным расщеплением ферментом ИаеШ Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 Ьр (СибЭнзим); 1) генотип ВВ (405/278/117 Ьр); 2-3,6-9,11) генотап АВ (683/405/278/117 Ьр); 4-5,10,12) генотип АА (683/117), 13) цельный ПЦР-продаг гена Н-РАВР (800 Ьр).

Полученные результаты ПЦР гена Н-РАВР свиней с праймерами 1РРАВР-Р+Н-РАВР-К и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.6 Совершенствование техники ПЦР и ГЩР-ПДРФ дня генотипирования свиней

по гену MC4R

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену MC4R нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: MC4R-F и MC4R-R, подобранных Li C.L. et al. (C.L. Li, Y.C. Pan, H. Meng Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China. P. 2) no усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры MC4R-F+MC4R-R инициируют амплификацию фрагмента гена MC4R свиней длиной 226 bp, а ПЩ'Ф-Тсщ! профиль (АА-226 bp, ЯЙ=156/70 bp и ЛД=226/156/70 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 6).

М 1 2 3 4 567 8..........910 11........12 13 14

300 Ьр-»~ 200 Ьр~»~

100 Ьр~Э»

Рис. 6. Элекгрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена MC4R с праймерами MC4R-F+MC4R-R и эвдонуклеазным расщеплением ферментом Taql Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 Ьр (СибЭнзим); 1-2,5,7-8,11) генотип ВВ (156/70 Ьр); 34) генотип АА (226 Ьр), 6,9-10,12-13) генотип АВ (226/156/70); 14) цельный ПЦР-продукт гена MC4R (226 Ьр).

Полученные результаты ПЦР гена MC4R свиней с праймерами MC4R-F+MC4R-R и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.7 Лллельный полиморфизм гена PRLR у свиноматок После проведении ПЦР-анализа в подсобном хозяйстве «Новая Тура» 100 основных свиноматок крупной белой породы распределение свиноматок по генотипам локуса гена PRLR было следующим: 61 (61,0%) свиноматка имела генотип АА, 32 (32,0%) - генотип АВ и всего 7 (7,0¡%) свиноматок - генотип ВВ. Частота аллеля А достигла 0,77, аллеля В -0,32 (табл. 1). Несколько др;/гая встречаемость генотипов и аллелей гена PRLR была среди 87 основных свиноматок крупной белой породы в ООО «ТАТМИТ Arpo». Наибольшее количество животных было с генотипом АВ - 39 (44,8%) свиноматок, а наименьшее количество с генотипом АА - 23 (26,5%). Промежуточное местоположение занимали свиноматки с генотипом ВВ, количество которых составило 25 (28,7%) животных. При этом частота аллеля А была на уровне 0,49, аллеля 5-0,51.

Таблица 1 - Частота встречаемости генотипов и аллелей гена PRLR у свиней

Хозяйство п Частота генотипов Частота аллелей Х2

АА АВ ВВ

п % п % п % А В

Новая Тура Н 100 61 61,0 32 32,0 7 7,0 0,77 0,23 0,32

О 59 59,0 35 35,0 5 5,0

ТАТМИТ Arpo н 87 23 26,5 39 44,8 25 28,7 0,49 0,51 0,56

о 21 24,1 43 49,4 23 26,5

226 bp -156 bp • 70 bp

Н - наблюдаемая частота генотипов, О - ожидаемая частота генотипов

Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусу гена РШЛ в двух популяциях свиноматок крупной белой породы показал, что разница между генотипами (АЛ, АВ и ВВ) незначительная и составила 2,0-4,6%. При этом показатель вариабельности хи-квадраг (х2) у свиней крупной белой породы в двух стадах был в пределах от 0,32 до 0,56, что ниже табличных значений. Поэтому полученные данные говорят о том, что генное равновесие по гену РШЯ не нарушено.

2.2.8 Аллельный полиморфизм гена ЕЯЯ у свиноматок

При исследование в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» основных свиноматок крупной белой породы по локусу гена ЕБЯ методом ДНК-анализа получены следующие результаты, что из 100 и 87 свиноматок 22-30 (25,3-30,0%) свиноматок имели гомозиготный генотип ИЩ 34-47 (39,1-47,0%) - гетерозиготный генотип 1ГМи 23-31 (23,0-35,6%) свиноматка-гомозиготный ММ. В подсобном хозяйстве «Новая Тура» частота аллеля IVбыла 0,535, аллеля М- 0,465. Однако в ООО «ТАТМИТ Агро» частота аллеля Я7 была 0,450, аллеля М- 0,550 (табл. 2).

i аилица ¿ — Хозяйство п Частота генотипов Частота аллелей Х2

WW WU ММ

п % п % п % W М

Новая Тура Н 100 30 30,0 47 47,0 23 23,0 0,535 0,465 0,21

О 29 29,0 50 50.0 21 21,0

ТАТМИТ Arpo н 87 22 253 34 39,1 31 35,6 0,45 0,55 2,77

О 18 20,7 43 49,4 29 29,9

Г1 — HitUJ 1ЮДДСМаМ ш i а i wnv» i шюв, --------------

Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусу гена ESR в двух стадах свиноматок крупной белой породы потачал, что разница мевду генотипами {WW, WM и ММ) незначительная и составила 1,0-10,3%. Наибольшая разница была по генотипу WM в ООО «ТАТМИТ Arpo» - 103%. При этом показатель вариабельности хи-квадрат (у!) у свиней крупной белой бороды в двух стадах был в пределах от 0,21 до 2,77, что ниже табличных значений. Поэтому полученные данные говорят о том, что генное равновесие по гену ESR не изменено.

2.2.9 Аллельный полиморфизм гена RYR1 у свиноматок

Анализ результатов ДНК-тестирования в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» 187 основных свиноматок крупной белой породы показал, что представленные животные имели гомозиготный генотип NN по гену RYR1, при этом у животных не выявлено наличие в их геноме мутантного аллеля п.

2.2.10 Полиморфизм гена H-FABP у свиноматок

В подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» 187 основных свиноматок крупной белой породы проведены исследования по локусу гена H-FABP. Методом ДНК-диагностики подучены следующие результаты, что из 100 и 87 свиноматок 24-31 (27,6-31,0%) свиноматка имела гомозиготный генотип АА, 42-57 (48,3-57,0%) -гетерозиготный генотип АВ и 12-21 (12,0-24,1%) свиноматка - гомозиготный ВВ. Частота аллеля А достигла 0,520-0,595, аллеля В - 0,405-0,480 (табл. 3).

Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусу гена Н-FABP в двух стадах свиноматок крупной белой породы показал, что разница между

генотипами (АА, АВ и ВВ) незначительная и составила 0-9,0%. Наибольшая разница была по генотипу АВ в подсобном хозяйстве «Новая Тура» - 9,0%. При этом показатель вариабельности хи-квадрат (х?) у свиней крупной белой бороды в двух стадах был в пределах от 0,02 до 2,14, что ниже табличных значений. Поэтому полученные данные говорят о том, что генное равновесие по гену Н-ЕАВР не имеет сдвига.

Хозяйство п Частота генотипов Частота аллелей Х2

АА АВ ВВ

п % п % п % А В

Новая Тура» Н 100 31 31,0 57 57,0 12 12,0 0,595 0,405 2,14

О 35 35.0 48 48,0 16 16,0

ТАТМИТ Arpo Н 87 24 27,6 42 483 21 24,1 0,52 0,48 0,02

О 24 27,6 43 49,4 20 23,0

Н - наблюдаемая частота генотипов, О - ожидаемая частота генотипов

2.2.11 Полиморфизм гена MC4R у свиноматок

После проведении ДНК-анализа в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» 100 и 87 основных свиноматок крупной белой породы распределение свиноматок по генотипам локуса гена MC4R было следующим: 63-65 (63,0-74,7%) свиноматок имели геношп АА, 22-34 (25,3-34,0%) - генотип АВ и всего 3 (3,0%) свиноматок - генотип ВВ. При этом, необходимо отметить, что в ООО «ТАТМИТ Arpo» животных с генотипом ВВ вообще не встречалось. Частота аллеля А достигла 0,80-0,87, аллеля В- 0,13-0,20 (табл. 4).

Хозяйство п Частота генотипов Частота аллелей X?

АА АВ ВВ

п % п % п % А В

Новая Тура Н 100 63 63,0 34 34,0 3 3,0 0,80 ОД) 0,14

О 64 64,0 32 32,0 4 4,0

ТАТМИТ Arpo н 87 65 74,7 22 253 0 0 0,87 0,13 0,49

О 66 75,9 19 21,8 2 23

п — HiJLUlKWJCMo» 4<SLiUld iwnuillkiuo, V —

Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусу гена MC4R в двух стадах свиноматок крупной белой породы методом Харди-Вайнберга показал, что разница между генотипами (АА, АВ и ВВ) незначительная и составила 1,03,5%. При этом показатель вариабельности хи-квадрат (х?) у свиней крупной белой бороды в двух стадах был в пределах от 0,14 до 0,49, что ниже табличных значений. Поэтому полученные данные говорят о том, что генное равновесие по гену MC4R не нарушено.

2.Z12 Встречаемость комплексных генотипов генов, напрямую связанных с воспроизводительными качествами свиноматок

В исследуемых стадах подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo», состоящего из 100 и 87 основных свиноматок крупной белой породы выявлено 9 комбинации генотипов по генам PRLR/ESR.

Из 100 свиноматок подсобного хозяйства «Новая Тура» имели комбинацию генотипов: PRLRAA/ESR WW, PRLRAA/ESR MW по 24 (24,0%) свиноматок, PRLRAB/

ESR MW- 21 (21,0%), PRLR AA/ESR MM- 13 (13,0%), PRLR AB/ESR MM- 6 (6,0%), PRLR AB / ESR WW - 5 (5,0%), PRLR BB / ESR MM - 4 (4,0%), PRLR BB / ESR MfV - 2 (2,0%), PRLR BB/ESR WW-1 (1,0%) свиноматок соответственно.

Несколько другая частота встречаемости комбинаций PRLR / ESR наблюдалась в ООО «ТАТМИТ Arpo». Так, из 87 свиноматок данного свиноводческого хозяйства имели комбинацию генотипов: PRLRAB/ESR WM- 15 (17,2%), PRLRAB/ESR ММ- 14 (16,1%), PRLRAB/ESR WW, PRLR BB / ESR WM по 10(11,5 %),PRLRAA/ESR WM, PRLR BB / ESR MMno 9 (10,4%), PRLRAA /ESR MM- 8 (9,2%) и PRLRAA /ESR WW, PRIJi BB/ESR MM no 6 (6,9%) свиноматок соответственно.

Таким образом, исследования показали, что в двух популяциях основных свиноматок крупной белой породы наибольшей частой встречаемости характеризовались три (подсобное хозяйство «Новая Тура») и четыре (ООО «ТАТМИТ Arpo») комбинации генотипов генов PRLR / ESR, напрямую связанных с воспроизводительными качествами. Эта комбинации генотипов следующие PRLR AA/ESR WW, PRLR АА/ESR WM по 24 (24,0%), PRLRAB/ESR WM-21 (21,0%) и PRLRAB/ESR WM- 15 (17,2%), PRLRAB/ ESRMM-14 (16,1%), PRLRAB/ESR WW, PRLR BB / ESR WMno 10 (11,5%) свиноматок соответственно.

2.2.13 Встречаемость комплексных генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R у свиномат ок

В анализируемых популяциях, состоящих из 100 и 87 основных свиноматок крупной белой породы подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» выявлено 23 и 30 комбинаций генотипов по генам PRLR ESR RYRI, H-FABP, MC4R соответственно.

Из 100 свиноматок подсобного хозяйства «Новая Тура» имели комбинацию генотипов: PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/ H-FABP AB / MC4R AA, PRLR AA/ESR WM/ RYRI NN/H-FABP AB/MC4RAA no 14 (14,0%) свиноматок, PRLR AA/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4R AB, PRLR AA/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA / MC4RAB no 10 (10,0%), PRLR AB/ESR WM / RYRI NN/H-FABP AB / MC4R AA, PRLRAB/ESR WM/ RYRI NN/H-FABP AB/MC4RAB no 6 (6,0%), PRLRAA /ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AA /MC4RAA, PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP BB / MC4R AA, PRLR AB / ESR WM/ RYRI NN/H-FABP AA /MC4RAA no 5 (5,0%), PRLRAB/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AB /MC4R AA- 4 (4,0%), PRLR AB/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA / MC4R AA-3 (3,0%), PRLRAA/ESRMM/ RYRI NN / H-FABP AA / MC4RAA,PRLR AB / ESR WM/ RYRI NN/H-FABP AA /MC4R AB, PRLR AB/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA / MC4R AB, PRLR BB / ESR WM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAA, PRLR BB/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA / MC4RAA, PRLR BB/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAB no 2 (2,0%), PRLRAA / ESR MM/RYRI NN/H-FABP BB/MC4RAB, PRLR АВ/ESRWW/RYRI NN/H-FABPВВ/ MC4R BB, PRLR AB / ESR WM/ RYRI NN/ H-FABP BB/MC4RAA, PRLRAB/ESR WM/H-FABPAB/RYR1NN/MC4R BB, PRLRAB/ESR MAL/RYRI NN/H-FABP BB/MC4RAB, PRLR BB / ESR WW / RYRI NN / H-FABP BB / MC4R BB по 1 (1,0%) свиноматок соответственно.

Из 87 свиноматок ООО «ТАТМИТ Arpo» имели комбинацию генотипов: PRLR AB / ESR ММ /RYRI NN/H-FABP AB / MC4R AA- 8 (9,2%) свиноматок, PRLR AA/ESR WM/ RYRI NN/H-FABP AB/MC4RAA, PRLRAB/ESR WW/RYRI NN/H-FABPAA/MC4RAA, PRLRAB/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAB, PRLR BB/ESR MM/RYR1NN/H-FABPAB/MC4RAA no 5 (5,7%), PRLR BB/ESR IVM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAB,

PRLRBB/ESRMM/RYR1NN/H-FABPAA/MC4RAA no4 (4,6%), PRLRAA/ESR WW/ RYR1 NN/H-FABP AA /MC4RAA, PRLRAA /ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAA, PRLRАА/ESRMM/RYR1 NN/H-FABPBB/MC4RAB,PRLRАВ/ESR WW/RYR1NN/H-FABP AB/MC4RAA, PRLR АВ/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP AA/MC4RAA, PRLR АВ/ ESR WM/RYR1 NN/H-FABPAB/MC4RAA,PRLRАВ/ESR WM/RYR1 NN/H-FABPВВ/ MC4RAB, PRLR АВ/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA / MC4R AA, PRLR BB/ESR WW/ RYR1 NN/H-FABPAB/MC4RAA,PRLRBB/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLR BB/ESR WM/RYRI NN/H-FABP BB/MC4RAB no 3 (3,5%), PRLRAA /ESR WW/ RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAB, PRLRAA/ESR WM/RYRI NN/H-FABPBB/MC4RAA, PRLRAA /ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AA /MC4RAA, PRLR АВ/ESR WW/RYR1NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLR АВ/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLR ВВ/ ESR WM/RYRI NN/H-FABP AA /MC4R AA no 2 (2,3%), PRLR AA /ESR WW/RYR1 NN/ H-FABPBB/MC4RAA,PRLRAA/ESR WM/RYRI NN/H-FABPAA/MC4RAA, PRLRAA/ ESR WM/RYRI NN/H-FABP AA/MC4RAB, PRLR АВ/ESR WM/RYRI NN/H-FABPВВ/ MC4RAA, PRLR АВ/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP AB / MC4R AB, PRLRBB/ESR WM/ RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLR BB/ESR WM/RYRINN/H-FABP BB/MC4RAA только по 1 (1,1%) свиноматки соответственно.

Таким образом, исследования показали, что в двух стадах основных свиноматок крупной белой породы наибольшей частой встречаемости отличались четыре (подсобное хозяйство «Новая Тура») и пять (ООО «ТАТМИТ Arpo») комбинаций генотипов PRLR/ ESR/RYRl /H-FABP/MC4R, а именно комбинации PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AB / MC4R AA, PRLR AA / ESR WM/RYRl NN / H-FABP AB / MC4R AA no 14 (14,0%), PRLR АА/ESR WM/ RYRl NN / H-FABP AB / MC4R AB, PRLR AA / ESR ММ/ RYRl NN/ H-FABP AA / MC4R AB no 10(10,0%)и PRLR АВ/ESR ММ/RYRl NN / H-FABP AB/MC4RAA - 8 (9,2%), PRLRAA/ESR WM/RYRI NN/H-FABP AB / MC4R AA, PRLR AB/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AA/MC4RAA, PRLR AB/ESR WM/RYRI NN/H-FABP AB / MC4R AB, PRLR BB / ESR ММ/ RYRl NN / H-FABP AB / MC4R AA no 5 (5,7%) свиноматок соответственно.

2.2.14 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена PRLR

Проанализировав воспроизводительные свойства свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусу гита PRLR по первому опоросу в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» выявлено, что свиноматки с генотипом ВВ гена PRLR превосходили свиноматок с другими генотипами как по общему количеству рождённых поросят (на 0,57-1,32 поросят), так и по количеству рождённых живых поросят (на 0,24-1,76 поросят) в среднем на одну свиноматку. Наименьшие показатели воспроизводительных качеств в разных хозяйствах отмечены у животных с генотипом АВ и АА соответственно. Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными генотипами по гену PRLR уменьшался в раду АВ>АА>ВВ (подсобное хозяйство «Новая Тура») и ВВ>АА>АВ (ООО «ТАТМИТ Arpo»).

Таким образом, исследования показали, что в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» наилучшие показатели по многоплодию имели свиноматки крупной белой породы с генотипом ВВ гена PRLR. У свиноматок с генотипом АВ и ВВ разных свиноводческих хозяйств наблюдались наихудшие показатели - по проценту мертворождённых поросят - 6,4 и 8,0, что в 1,1-2,9 выше, чем у сверстниц.

2Z15 Воспроизводительные качества свнней с разными генотипами по локусу гена ESR

Анализ свиноматок крупной белой породы с разными генотипами ESR в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» показал, что животные с генотипом ММ гена ESR превосходили свиноматок с другими генотипами по общему количеству рождённых поросят (на 0,10-1,26 поросят) и по количеству рождённых живых поросят (на 0,62-1,23 поросят) в среднем на одну свиноматку. При этом наибольшая разница по этим показателям была в ООО «ТАТМИТ Arpo» - 1,07-1,26 (Р<0,05) и 1,12-1,23 (Р<0,05-0,01) поросят соответственно. Наименьшие показатели воспроизводительных качеств отмечены у животных с гетерозиготным генотипом WM (подсобном хозяйстве «Новая Тура») и гомозиготным генотипом WW (ООО «ТАТМИТ Arpo»), Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными генотипами по гену ESR уменьшался в ряду WM> ММ> WW (подсобном хозяйстве «Новая Тура») и WM >WW> ММ (ООО «ТАТМИТ Arpo»).

Таким образом, можно сделать вывод, что в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» наилучшие показатели по многоплодию имели свиноматки крупной белой породы с генотипом ММ гена ESR. У гетерозигог (WM) наблюдались наихудшие показатели по проценту мертворождённых поросят - 5,4 и 7,3%, что в 1,1-1,7 раза выше, чем у гомозигот (WWи ММ).

ZZ16 Воспроизводительные качесша свиней с разными генотипами по локусу гена RYR1

Популяции свиноматок подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» было представлено особями, имеющими только один генотип по гену RYR1-NN. Животные с генотипом NN гена RYR1 имели общее количество рождённых поросят в среднем на одну свиноматку - 11,44 и 12,07. При этом количество рождённых живых поросят составило 10,93 и 11,25 поросят в среднем на одну свиноматку. Процент мертворождённых поросят от свиноматок, несущих в своём геноме N аллель гена RYR1 был на уровне 4,5-6,8%.

Таким образом, исследования показали, что воспроизводительные качества у основных свиноматок крупной белой породы с генотипом NN по гену RYR1 были на среднем уровне.

7717 Воспрошво/ц ггслы 1ые качества свиней с разными генотипами по локусу гена H-FABP

Проведённые исследования показали, что свиноматки с генотипом ВВ по гену Н-FABP превосходили свиноматок с другими генотипами по общему количеству рождённых поросят (на 0,66-2,03 поросёнка) и по количеству рождённых живых поросят (на 0,58-1,62 поросёнка) в среднем на одну свиноматку. При этом наибольшая разница по этим показателям была в ООО «ТАТМИТ Arpo» между животные с генотипом АВ, ВВ и АА - 1,37-2,03 (Р<0,01 и Р<0,001) и 1,62 (Р<0,05 и Р<0,001) поросёнка. Наименьшие показатели воспроизводительных качеств отмечены у животных с генотипом АА. Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными генотипами H-FABP уменьшался в ряду ВВ>АА >Л£(подсобноехозяйство «Новая Тура») иАВ>ВВ>АА (ООО «ТАТМИТ Arpo»).

Таким образом, в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» наилучшие показатели по многоплодию имели свиномапси крупной белой породы с генотипом ВВ гена H-FABP. У животных с данным гомозиготным генотипом (ВВ) в основном наблюдался более высокий процент мертворождённых поросят - 7,3-10,4%, что в 1,5-2,5 раза выше, чем аналогов.

12.18 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена MC4R

Исследования свиноматок также показали, что свиноматки, несущие в своём геноме В аллель гена MC4R превосходили свиноматок с гомозиготным генотипом АА по общему количеству рождённых поросят (на 0,33-0,60 поросёнка) и по количеству рождённых живых поросят (на 0,36-0,54 поросёнка) в среднем на одну свиноматку. Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными генотипами по гену MC4R уменьшался в ряду АВ> АА> ВВ (подсобное хозяйство «Новая Тура») и АА>АВ (ООО «ТАТМИТ Arpo»).

Таким образом, можно сделать вывод, что в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» наилучшие показатели по многоплодию имели свиноматки крупной белой породы с генотипами АВ и ВВ гена MC4R. При этом у аналогов с генотипом АЛ и АВ наблюдался самый высокий процент мертворождённых поросят - 3,87,1%, что в 1,2-2,0 раза выше, чем у сверстниц.

2.2.19 Воспроизводительные качества свиней с разными комбинациями генотипов генов PRLR и ESR, напрямую связанных с данными показателями

Нами были проанализированы воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов PRLR/ESR. В подсобном хозяйстве «Новая Тура» наибольшие показатели по количеству рождённых (12,25-14,00) и по количеству живых поросят при рождении (12,00-13,00) были у животных с комбинациями генотипов PRLR ВВ / ESR WW, PRLR ВВ / ESR WM и PRLR ВВ / ESR ММ. Данные комбинации генотипов превосходили по этим показателям аналогов с другими комбинациями генотипов PRLR / ESR на 0,56-2,86 и 0,80-2,76 поросят соответственно. Причём комбинация генотипов PRLR ВВ /ESR WW с показателями 14,00 и 13,00 поросят имела достоверное превосходство над генотипами PRLR АА / ESR WW, PRLR АА / ESR WM, PRLRAA/ESR ММ, PRLR AB/ESR WW, PRLR АВ / ESR WM на 2,31-2,83 (P<0,01 и 0,001) и 1,92-2,76 (Р<0,05 и 0,001) поросят соответственно. Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными комбинациями генотипов по гену PRLR / ESR уменьшался в ряду PRLRAB/ESR WM> PRLR ВВ / ESR WW> PRLR АА/ ESR MM> PRLR AA/ESR WM> PRLRAB/ESR WW>PRLRAA /ESR WWw. PRLR АВ/ESRMM>PRLRBB /ESR MM> PRLR BB/ESR WM.

Тогда как в ООО «ТАТМИТ Arpo» наибольшие показатели по количеству рождённых (11,90-13,78) и по количеству живых поросят при рождении (11,20-12,33) были у животных с комбинациями генотипов PRLR AA/ESR ММ, PRLR АВ /ESR ММ, PRLR ВВ /ESR WMu PRLR BB/ESR ММ.

Представленные комбинации генотипов превосходили по этим показателям сверстниц с другими комбинациями генотипов PRLR/ESR на 0,17-2,38 и 0,20-1,89 поросят соответственно. Причём комбинация генотипов PRLR BB/ESR ММ с показателями 13,78 и 12,33 поросят имела достоверную разницу с комбинациями генотипов PRLR АА / ESR WM, PRLR AA/ESR ММ, PRLRAB/ESR WW, PRLRAB/ESR WM, PRLR AB/ESR ММ и PRLR BB/ESR WM на 1,21-2,38 (P<0,05-0,001) и 1,40-1,89 (P<0,05-0,01) поросят соответственно. Процент мертворождённых поросят от свиноматок с разными комбинациями генотипов по гену PRLR/ESR уменьшался в ряду PRLR ВВ/ESR ММ> PRLRAA/ESR WM> PRLR BB/ESR WW> PRLRAB/ESR WW > PRLR AB / ESR WM> PRLRAA /ESR MM> PRLR BB/ESR WM> PRLRAA/ESR WW> PRLR АВ/ ESR MM.

Таким образом, исследования показали, что только две комбинации генотипов PRLR BB/ESR WMh PRLR BB/ESR ММ среди изучаемых основных свиноматок крупной белой породы характеризуются достаточно высоким многоплодием и встречались как в подсобном хозяйстве «Новая Тура», так и в ООО «ТАТМИТ Arpo».

2.2.20 Воспроизводительные качества свиней с разными комбинациями генотипов генов PRLR, ESR,RYR1,H-FABP,MC4R

Нами были изучены воспроизводительные качества свиноматок 1фупной белой породы с разными комбинациями генотипов PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / MC4R. Исследования показали, что в подсобном хозяйстве «Новая Тура» свиноматки с наиболее распространёнными комбинациями генотипов PRLRAA /ESR WW/RYR1NN/H-FABPAB /MC4RAA, PRLRAA/ESR IVM/RYR1 NN/H-FABPАВ/MC4R АА, PRLRAA /ESR WM/ RYR1NN/H-FABPAB/MC4RAB, PRLRAA/ESRMM/RYR1NN/H-FABPAA/MC4RAB обладали показгггелями по количеству рождённых (11,07-11,86) и по количеству живых (10,57-11,43) поросят при рождении, близкими к средним значениям по стаду - 11,44 и 10,93 поросят. У шести комбинаций генотипов PRLRAB/ESR WW/ RYR1 NN/H-FABP BB/MC4R ВВ, PRLRAB/ESRMM/RYR1 NN / H-FABP АА / MC4R АВ, PRLRAB/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP ВВ/MC4RAB, PRLR BB/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP ВВ/ MC4R ВВ, PRLR BB/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAA и PRLR BB/ESR ММ/ RYR1 NN/H-FABP AA /MC4RAA показатели по количеству рождённых (12,00-14,00) и по количеству живых (12,00-13,00) поросятбыли выше или равны количеству-12 поросят.

При проведении исследовании в ООО «ТАТМИТ Arpo» было выявлено, что свиноматки с наиболее встречающимися комбинациями генотипов: две комбинации генотипов имели более высокие показатели по количеству рождённых (13,25-14,4) и по количеству живых (12,75-13,00) поросят при рождении по сравнению со средними значениями по стаду - 12,07 и 11,25 поросят, однако три аналогичные комбинации генотипов имели данные ниже, чем в среднем по стаду - 11,00-11,60 и 10,20-10,40 поросят соответственно. У девяти комбинаций генотипов PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAB, PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/H-FABPBB/MC4RAA, PRLRAA/ESR MM/RYR1 NN/H-FABP BB /MC4RAB, PRLRAB/ESR JVM/RYR1 NN/H-FABP ВВ/ MC4RAA, PRLR AB/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP BB /MC4R AB, PRLR AB/ESR ММ/ RYR1 NN/H-FABP AB/MC4RAA,PRLRAB/ESRMM/RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLR BB/ESR WM/RYR1 NN/H-FABP BB/MC4RAB и PRLR ВВ/ESR MM/RYR1 NN/ H-FABP AB / MC4R AA показатели по количеству рождённых (1233-14,40) и по количеству живых (12,00-13,33) поросят были выше или равны количеству -12 поросят.

Таким образом, исследования показали, что использование комбинаций генотипов из пяти генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R позволило увеличить в подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Arpo» показатели воспроизводительной способности у основных свиноматок крупной белой породы, в частности количество рождённых и количество живых поросят в сравнение со средними значениями по стаду на 0,06-2,33 и 0,07-2,08 поросят соответственно.

2.2.21 Экономическая эффективность использования свиней с разными комбинациями генотипов генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R

Экономическая эффективность использования свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов генов PRLR, ESR RYRI, H-FABP, MC4R определялась

согласно методических рекомендаций Шмакова ЮЛ и др. (Шмаков ЮЛ, Комаров JIJI., Черекаев НВ. Методические рекомендации по определению экономического эффекта от внедрения результатов научно-исследовательских работ в животноводство. Дубровицы. 1984.30 с) с учётом методики расчёта стоимости новорождённых поросят (Никитин ИЛ, Апапькин В .А. Организация и экономика ветеринарного дела. 5-е изд. прераб. и допол. М.: «КолосС». 2006.368 с). Для этого использовали следующие формулы:

От свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов генов PRLR ESR RYR1, H-FABP, MC4R с учётом коэффициента (10,9) получена расчётная живая масса поросят при рождении от 1 свиноматки 82,84-141,70 кг - подсобное хозяйство «Новая Тура» и 98,10-145,30 кг- ООО «ТАТМИТ Arpo».

В результате этого свиноматки с разными комбинациями генотипов генов PRLR ESR RYR1, H-FABP, MC4R в сравнении с аналогами с комбинациями генотипов PRLRAA/ ESR WW/RYR1NN/H-FABPAA/MC4RAA (подсобное хозяйство «Новая Тура») и PRLRBB/ ESR WM/RYR1NN/H-FABP ВВ / MC4RAA, PRLRAA /ESR WM/RYR1Ш/H-FABP АА / MC4R АА (ООО «ТАТМИТ Arpo») выдали дополнительное количество основной продукции (в виде живой массы) в пределах 9,81-58,86 кг (11,8-71,1%) и 3,60^-7,20 кг (3,748,1%) соответственно. При этом разница по стоимости дополнительной продукции в расчёте на 1 свиноматку составила 691,61-4149,63 руб. (подсобное хозяйство «Новая Тура») и 248,77-3264,17 руб. (ООО «ТАТМИТ Arpo») соответственно.

Таким образом, расчёт экономической эффективности убедительно показал, что от свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов PRLR ESR, RYR1, H-FABP, MC4R получено прибыли на 248,77-4149,63 руб. больше, чем от сверстниц с комбинациями PRLRAA/ESR WW/RYR1 NN/H-FABP AA/MC4RAA и PRLR BB/ESR WM/RYRl NN/H-FABP BB/MC4RAA, PRLRAA/ESR WMRYR1 NN/H-FABPАА/ MC4RAA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. Апробированная техника (аммиачный и комбинированный щелочной способы) экстрагирования ДНК из крови свиней по сравнению с ранее разработанной и оптимизированной техникой на крови крупного рогатого скота также пригодна для проведения генно-молекулярных исследований.

2. Усовершенствованные протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR ESR, RYR1, H-FABP, MC4R являются допустимыми в плане точности определения аллельного полиморфизма искомых генов.

3. В стадах основных свиноматок крупной белой породы по частоте встречаемости преобладал только один аллель: по гену RYR1 это аллель N—1,0, по гену H-FABP аллель А - 0,595-0,520, по гену MC4R аллель А - 0,80-0,87; тогда как по другим генам данные показатели были противоположные: то гену PRLR аллели А — 0,77 и В—0,51, по гену ESR аллели W- 0,535 и М- 0,550 соответственно.

4. В стадах основных свиноматок крупной белой было 9 из 9 возможных комплексных генотипов PRLR / ESR Наибольшей встречаемостью комплексных генотипов (в пределах от 11,5 до 24,0%) характеризовались группы животные с комбинациями PRLRAA/ESR WW, PRLRAA/ESR WM, PRLR АВ/ESR WM, PRLRAB/ ESR WM, PRLR AB/ESR MM, PRLR AB/ESR MV, PRLR BB/ESR WM.

5. Выявлено, что в стадах основных свиноматок крупной белой породы было 23 и 30 из 243 возможных комплексных генотипов РЯЬЯ / ЕБЯ / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР / МС4Я. Более высоким распространением отличались 7 групп свиней с комплексными генотипами РЯЬЯ АА/ЕБЯ \V\VZRYRI Ж/Н-ЕАВР АВ/МС4Я АА, РЯЬЯ А А /ЕБЯ 1Ш/ЯУЯ1Ж/Н-ЕАВР АВ/МС4ЯАА по 14,0%, РЯЬЯАА/ЕБЯ 1УМ/ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВРАВ/МС4ЯАВ, РЯЬЯАА /ЕБЯ ММ/ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВР .АА /МС4ЯАВ по 10,0% и РЯЬЯАВ/ЕБЯ ММ/ЯУЯ1Ж/ Н-ЕАВР АВ / МС4Я АА - 9,2%, РЯЬЯ АА/ЕБЯ 1УМ/ ЯУЯ1 NN / Н-ЕАВР АВ / МС4Я АА, РЯЬЯАВ/ЕБЯ ту/ПУШ Ж/Н-ЕАВР АА /МС4ЯАА, РЯЬЯАВ/ЕБЯ ШМ/ЯУЯ! Ж/Н-ЕАВР АВ /МС4Я АВ, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ ММ/ЯУЯ1Ж/Н-ЕАВР АВ /МС4Я АА по 5,7%.

6. Анализ основных свиноматок крупной белой породы с разными генотипами РЯЬЯ, ЕБЯ, Н-ЕАВР и МС4Я по репродуктивных качествам показал, что животные с генотипами ВВ по гену РЯЬЯ, ММ по гену ЕБЯ, ВВ по гену Н-ЕАВР, АВ и ВВ по гену МС4Я имели наибольшие значения по общему количеству и по количеству рождённых поросят 12,5212,57 и 11,52-12,29; 11,70-12,81 и 11,22-12,00; 12,92-12,95 и 11,58-12,00; 11,67-12,32 и 11,15-11,59; это несколько выше, чем у свиней с другими генотипами на 0,57-1,23 и 0,241,76 (РЯЬЯ); 0,10-1,26 и 0,62-1,23 (ЕБЯ); 0,66-2,03 и 0,58-1,62 (Н-ЕАВР); 033-0,60 и 0,360,54 (МС4Я) поросят соответственно.

7. Исследования основных свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов РЯЬЯ/ЕБЯ по воспроизводительным качествам показал, что 7 групп свиньи с комбинациями РЯЬЯ ВВ /ЕБЯ т¥, РЯЬЯ ВВ / Е5Я ШМ, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ ММ, РЯЬЯ АА/ЕБЯ ММ, РЯЬЯ АВ/ЕБЯ ММ, РЯЬЯ ВВ /£Ж и РЯЬЯ ВВ / ЕБЯ ММ выгодно отличались от сверстниц с другими комбинациями (11,90-13,78 и 11Д0-13,00 -количество рождённых и живых поросят) на 0,17-2,86 и 0,20-2,76 поросят соответственно.

8. Оценка основных свиноматок крупной белой породы с разными комбинациями генотипов РЯЬЯ/ЕБЯ/ЯУЯ1 /Н-ЕАВР/МС4Я по репродукшвным качествам показали, что 5 комбинаций (РЯЬЯАА/ЕБЯ ШУ/ЯУЮ NN1 Н-ЕАВР ВВ/МС4Я АА, РЯЬЯАВ/ЕБЯ ММ/ЯУЯ1 Ш/Н-ЕАВР АА /МС4ЯАВ, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ 1Ш/ЯУЯ1 ШГ/Н-ЕАВР ВВ/ МС4Я ВВ, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ 1¥М/ЯУЯ1 Ж/Н-ЕАВР АВ / МС4Я А А, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ ММ/ ЯУЯ1 т/Н-ЕАВР АА/МС4Я АА) одно хозяйства и 8 комбинаций (РЯЬЯ АА /ЕБЯ МУ/ ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВР АВ/МС4ЯАВ,РЯЬЯАА /ЕБЯ ШУ/ЯУЯ! Ж/Н-ЕАВР ВВ/МС4ЯАА, РЯЬЯ АВ/ЕБЯ ШМ/ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВР ВВ/МС4ЯАА, РЯЬЯАВ/ЕБЯ ШМ/ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВР ВВ / МС4Я АВ, РЯЬЯ АВ / ЕБЯ ММ/ ЯУЯ1 NN / Н-ЕАВР АВ / МС4Я АА, РЯЬЯАВ/ ЕБЯ ММ/ЯУЯ1 т'/Н-ЕАВР ВВ /МС4Я АА, РЯЬЯ ВВ/ЕБЯ 1УМ/ЯУЯ1Ш/Н-ЕАВР ВВ/ МС4Я АВ, РЯЬЯ ВВ / ЕБЯ ММ/ЯУЯ1 NN/ Н-ЕАВР АВ / МС4Я АА) другого хозяйства с количество рождённых (12,00-15,00) и живых (11,80-13,33) поросят превосходили средние значения по стаду на 0,56-2,56 и 0,75-2,08 поросят соответственно.

9. Использование ДНК - анализа в генотипировании свиноматок крупной белой породы по локусам генов РЯЬЯ ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я позволило дополнительно получить за опорос 3,7 - 71,1% расчётной живой массы поросят при рождении, что составляет в денежном выражении 248,77 - 4149,63 руб.

На основании проведенных исследований предлагается производству:

1. Лабораториям, проводящим генно - молекулярные исследования, рекомендуем использовать апробированные способы экстракции ДНК и усовершенствованную технику генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я.

2. Свиноводческим хозяйствам, занимающимся разведением племенных свиней разных пород, с целью повышения и улучшения у них хозяйственно-полезных признаков рекомендуем в качестве дополнительного критерия при отборе свиней использовать комбинации генотипов по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R.

3. Исключить из селекционного процесса свиней с нежелательными генотипами и комбинациями генотипов по локусам генов PRLR ESR RYR1, H-FABP, MC4R.

Перспективы дальнейшей разработки темы:

Дальнейшая работа в области селекции свиней по генам-маркерам будет направлена на совершенствование разных пород Республики Татарстан на повышение воспроизводительных качеств у животных, в области ДНК-анализа — на разработку, совершенствование и расширение методов генотипирования свиней.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахмегов, Т.М. Оптимизация техники выделения ДНК из крови и спермы. / Т.М Ахметов, СБ. Тюлькин, Ф.М. Нургалиев // Учёные записки Казанской ГАВМ. - Т. 205. -Казань, 2011.-С. 18-23.

2. Нургалиев, Ф.М Оптимизация способов выявления у животных рецессивных мутаций / Ф.М. Нургалиев. СВ. Тюлькин, Т.М. Ахмегов // Учёные записки Казанской ГАВМ. -Т. 208. - Казань, 2011,- С. 39-44.

3. Ахмегов, Т.М. Использование ДНК-маркёров в диагностике наследственных мутаций у крупного рогатого скота и свиней / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, Ф.М. Нургалиев. PP. Вафин // Учёные записки Казанской ГАВМ. - Т. 210. - Казань, 2012 - С. 7-13.

4. Нургалиев, Ф.М. Воспроизводительные качества свиноматок с разными генотипами по гену пролактинового рецептора / Ф.М. Нургалиев // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК». Учёные записки Казанской ГАВМ.-Т. 212.-Казань, 2012,-С. 100-104.

5. Тюлькин, СБ. Идентификация мутаций генов MSTN и RYR1, связанных с мясной продуктивностью животных / C.B. Тюлькин, Ф.М. Нургалиев. Т.М. Ахметов, Р.Р. Вафин // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК». Учёные записки Казанской ГАВМ. -Т. 212. -Казань, 2012,- С. 390-395.

6. Нургалиев, Ф.М Воспроизводительные качества свиноматок с разными генотипами ESR, H-FABP, MC4R / Ф.М. Нургалиев // Учёные записки Казанской ГАВМ. -Т. 215. - Казань, 2013.- С. 267-272.

7. Нургалиев, Ф.М. Полиморфизм генов ESR, H-FABP, MC4R у свиноматок чистопородной крупной белой породы / Ф.М. Нургалиев. Т.М. Ахметов, СБ. Тюлькин // Учёные записки Казанской ГАВМ. -Т. 215.-Казань, 2013 -С. 272-276.

8. Нургалиев, Ф.М Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по генам PRLR, ESR, H-FABP, MC4R / Ф.М. Нургалиев. ТМ Ахмегов, И.И. Гиниятуллин, СБ. Тюлькин, PP. Вафин // Фундаментальные исследования. - Москва, 2013.-№6(4).-С. 918-921.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 25.11.2013 г ТТеч.л. 1,3 Заказ № К-7343. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Нургалиев, Фаннур Мударисович, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Н.Э. БАУМАНА

На правах рукописи

НУРГАЛИЕВ ФАННУР МУДАРИСОВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИК-ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫХ КАЧЕСТВ СВИНЕЙ

Специальность: 06.02.07 - разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных

животных

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент

Ахметов Тахир Мунавирович

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................... 4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................... 9

1.1 ДНК-маркеры и гены-кандидаты, их сущность и применение...... 9

1.2 Гены, влияющие на воспроизводительные качества свиней......... 14

1.2.1 Аллельный полиморфизм гена пролактинового рецептора (PRLR)

и его характеристика......................................................... 14

1.2.2 Аллельный полиморфизм гена эстрогенового рецептора (ESR) и

его характеристика............................................................ 18

1.3 Гены, влияющие на ростовые показатели свиней и качество мяса. 26 ч 1.3.1 Аллельный полиморфизм гена рианодинового рецептора (RYR1)

и его характеристика........................................................ 26

1.3.2 Аллельный полиморфизм гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP) и его характеристика................................. 34

1.3.3 Аллельный полиморфизм гена меланокортиного рецептора 4 (MC4R) и его характеристика............................................... 39

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 44

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 44

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................ 53

2.2.1 Апробация аммиачного и комбинированного щелочного

способов выделения ДНК из крови свиней.............................. 53

2.2.2 Совершенствование техники ИТ IP и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену PRLR.................................... 53

2.2.3 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену ESR.................................... 54

2.2.4 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену RYR1................................... 55

2.2.5 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену H-FABP............................... 57

2.2.6 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену MC4R.................................. 58

2.2.7 Аллельный полиморфизм генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP,

MC4R у свиней............................................................... 59

2.2.7.1 Аллельный полиморфизм гена PRLR у свиноматок.................. 60

2.2.7.2 Аллельный полиморфизм гена ESR у свиноматок...................... 62

^ 2.2.7.3 Аллельный полиморфизм гена RYR1 у свиноматок.................... 63

2.2.7.4 Аллельный полиморфизм гена H-FABP у свиноматок................ 64

2.2.1.5 Аллельный полиморфизм гена MC4R у свиноматок................... 65

2.2.8 Встречаемость комплексных генотипов генов PRLR и ESR, напрямую связанных с воспроизводительными качествами свиноматок....................................................................... 67

2.2.9 Встречаемость комплексных генотипов генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я у свиноматок............................................... 70

2.2.10 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами

по локусам генов РШ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ГАВР, МС4Я.................. 74

2.2.10.1 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами

генов, напрямую связанных с данными показателями............... 75

2.2.10.1.1 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена РЯЬЯ.............................................................. 75

2.2.10.1.2 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена ЕБЯ................................................................. 77

2.2.10.2 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами

генов, косвенно связанных с данными показателями.................. 78

2.2.10.2.1 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена Я УЯ1................................................................. 78

2.2.10.2.2 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена Н-ЕАВР............................................................. 79

2.2.10.2.3 Воспроизводительные качества свиней с разными генотипами по локусу гена МС4Я................................................................ 80

2.2.11 Воспроизводительные качества свиней с разными комбинациями генотипов генов РЯЬЯ и ЕБЯ, напрямую связанных с данными показателями.......................................................................... 82

2.2.12 Воспроизводительные качества свиней с разными комбинациями генотипов генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я.......................... 85

2.3 Экономическая эффективность использования свиней

с разными комбинациями генотипов генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я.............................................................................. 88

2.4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................. 92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................ 103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 106

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................... 108

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................ 126

Актуальность темы. Свиноводство - динамично развивающаяся отрасль животноводства, однако, как показывает мировой опыт, дальнейшее повышение эффективности отрасли невозможно без внедрения в селекционную работу достижений в области молекулярной генетики, в частности, нахождения генетических маркеров, отвечающих за определённые показатели продуктивности (Каспирович Д.А. Влияние полиморфизма генов - рецепторов EPOR, MUC4, IGF-2 на основные селекционируемые признаки свиней белорусской крупной белой и белорусской мясной пород: автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.02.07. Гродно. 2010.20 с).

Новые открытия в молекулярной генетике позволяют выделять и изучать специальные участки генома, которые влияют на важные продуктивные, в частности на воспроизводительные признаки.

В качестве маркеров плодовитости свиней рассматриваются следующие гены, которые признаны генами-кандидатами, влияющими на размер гнезда, это ген эстрогенового рецептора - ESR и ген пролактинового рецептора — PRLR (Лобан H.A. и др. Молекулярная генная диагностика в свиноводстве Беларуси. Дубровицы. ВИЖ. 2005. С. 34-37; Шейко И.П. и др. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики // Весщ нацыянальнай акадэми навук Бэл ару ci. 2006. № 3. С. 77-81).

Потребители и перерабатывающая промышленность нуждаются в улучшении качества мяса. Это требует от селекционеров использования новых методов генетической селекции, направленных на усовершенствование продуктивных признаков. Данные, полученные из литературных источников, показывают потенциальную значимость генов белка, связывающего жирные кислоты {H-FABP), рианодинового рецептора (RYR1) и меланокортиного рецептора 4 (MC4R) в качестве маркеров мясной и откормочной продуктивности (Лобан H.A., Василюк О .Я. Карта генетического профиля свиней белорусской крупной белой породы // Вестник Белорусской Государственной Сельскохозяйственной Академии. 2010. № 2. С. 116-121; Гетманцева Л.В. Степень влияния гена MC4R на фенотип организма.

Тезисы докладов XVIII Международ, науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2011». М:. 2011. С. 89 .).

Некоторые исследователи, такие как Рыжова Н.В. (Рыжова Н.В. Полиморфизм гена RYR1 в популяциях свиней мясных пород: дис. канд. биол. наук: 06.02.01 Лесные Поляны. 2001. 107 с), Гришина Н.Б. (Гришина Н.Б. Использование генетических маркеров в селекции свиней крупной белой породы в Сибири: дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Новосибирск. 2008. 147 с), Плужникова О.В. (Плужникова О.В. Естественная резистентность, воспроизводительные и мясные качества свиней в связи с их аллельным состоянием по локусу RYR-1 гена: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Ставрополь. 2009. 19 с) отмечают, что разные аллели и генотипы по локусу генов RYR1 и H-FABP наряду с непосредственным влиянием на откормочную и мясную продуктивность, оказывают некоторое действие на репродуктивные качества свиней.

Степень разработанности темы. Изучением генетической структуры по ДНК - маркерам в стадах свиней разных пород занимались многие, в том числе Банникова А.Д., Бублик Е.М., Лаломова Е.В., Kmiec M. et al., Vincent A.L. et al. - по гену PRLR; Банникова А.Д., Бублик E.M., Зиновьева H.A. и др., Костенко С.А. и др., Полозюк О.Н., Korach K.S. - по гену ESR; Кузнецов А.И. и др., Fujii J. et al., Mac Lennan D.H. et al., Смирнов H.H. - по гену RYR1; Зиновьева H.A. и др., Лобан H.A. и др., Максимов Г.В. и др., Gerbens F. et al. по гену H-FABP; Бублик Е.М., Гетманцева Л.В., Костюнина О.В., Зиновьева H.A., Сизарева Е.И. и др., Шейко И.П. и др., Gantz I. et al. по гену MC4R. Однако в научных трудах этих учёных не имеется данных по генотипированию свиней методами ДНК-технологии в условиях Республики Татарстан. Не изучен аллельный полиморфизм генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R у свиней разных пород, разводимых в Республике Татарстан.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование полиморфизма генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R с помощью ДНК-диагностики у свиноматок крупной белой породы, а также определение влияния разных генотипов и их комбинаций на воспроизводительные качества животных.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- апробировать технику выделения ДНК из крови свиней для генно-молекулярных исследований;

- совершенствовать технику проведения ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, Е8Я, ЯУЯ1, Н-ЕАВР и МС4Я-

- изучить частоту встречаемости аллелей, генотипов по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я и их комбинаций РЯЬЯ / ЕБЯ, РЯЬЯ / £57? / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР / МС4Я у свиноматок крупной белой породы;

- оценить воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов РЯЬЯ, Е8Я, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я и их комбинаций РЯЬЯ / ЕБЯ, РЯЬЯ / ЕБЯ / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР / МС4Я\

- определить экономическую эффективность использования свиней крупной белой породы с разными комбинациями генотипов РЯЬЯ / ЕБЯ / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР / МС4Я.

Научная новизна работы. Усовершенствованы протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я. Впервые в условиях Республики Татарстан изучен полиморфизм и определена частота встречаемости генотипов по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я и их комбинаций РЯЬЯ / ЕБЯ, РЯЬЯ / ЕБЯ / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР / МС4Я у свиноматок крупной белой породы. Изучены воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я и их комбинаций РЯЬЯ / Е$Я, РЯЬЯ / ЕБЯ / ЯУЯ1 / Н-ЕАВР/МС4Я.

Теоретическая и практическая значимость. Основные положения и выводы диссертации позволяют пополнить теоретические данные, касающиеся селекции свиней методами ДНК-технологии.

Апробированные методы экстракции ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я позволяют результативно их использовать в генно-молекулярных исследованиях и в частности в скрининге перечисленных генов. Полученные результаты исследований, касающихся генотипов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я и их комбинаций,

возможно, использовать в свиноводстве для улучшения хозяйственно-полезных признаков, в том числе репродуктивных качеств свиней.

Методология и методы исследования. Основой диссертационного исследования выступает комплекс общенаучных и специальных методов. Для получения результатов исследования использовались общенаучные методы: аналогии, синтеза, индукции, дедукции (обеспечивающие, прежде всего теоретическую составляющую) и наблюдения, сравнения, моделирования (обеспечивающие, прежде всего практическую составляющую). Наряду с этим применялись специальные методы, в систему которых входили зоотехнические и методы генно-молекулярной диагностики. Для расчёта количественных показателей использовали математический и статистический методы. Применение перечисленных методов позволило получить объективные и достоверные результаты исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

- апробированные нами способы выделения геномной высокомолекулярной ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я позволяет точно определять аллели и генотипы, связанные у животных с хозяйственно-полезными признаками.

- определена частота встречаемости генотипов и комбинаций генотипов генов РЯЬЯ, Е8Я, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я у свиноматок крупной белой породы в условиях Республики Татарстан.

- выявлены желательные генотипы в стадах свиней крупной белой породы повышающие их репродуктивные качества.

- экономически обосновано исследовать свиней крупной белой породы по локусам генов РЯЬЯ, ЕБЯ, ЯУЯ1, Н-ЕАВР, МС4Я.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность исследования подтверждается использованием комплекса методов и программ, что, в конечном счёте, выражается согласованностью полученных выводов и результатов исследования.

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчётах кафедры технологии животноводства ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2011-2013 гг.); научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2012-2013 гг.); конкурсе пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан (Казань, 2011-2012 гг.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И. Лобачевского (Казань, 2012); всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и учащейся молодёжи (Казань, 2013); международной научно-практической конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития АПК», посвящённой 140-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2013).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 ДНК-маркеры и гены-кандидаты, их сущность и применение

Каспирович Д.А. (Каспирович Д.А. Влияние полиморфизма генов -рецепторов EPOR, MUC4, IGF-2 на основные селекционируемые признаки свиней белорусской крупной белой и белорусской мясной пород : автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.02.07. Гродно. 2010. 20 с.) и Гончаренко Г.М. (Гончаренко Г.М. Генетическая структура популяций сельскохозяйственных животных западной Сибири и использование маркёров в селекции: автореф. дис. д-ра. биол. наук: 06.02.07. Новосибирск. 2009. 38 с.) и Толоконцев А.И. (Толоконцев А.И. Генетическая структура свиней породы дюрок по генам ESR, PRLR, RYR 1 // Главный зоотехник. 2012. № 2. С. 12-16) отмечают, что дальнейшее повышение эффективности отрасли невозможно без внедрения в селекционную работу достижений в области молекулярной генетики, в частности, нахождения генетических маркеров, таких как группы крови, биохимические белки, ферменты, а также новых маркёров, выявляемых с помощью ПЦР - анализа (полимеразная цепная реакция). Эти маркеры отвечают за определённые показатели продуктивности, способствуют исключению из селекционного процесса животных с нежелательными генными мутациями, приводящими к снижению продуктивности и качества получаемой продукции.

Ведущие иностранные компании для совершенствования линий свиней широко используют новые подходы, основанные на применении генетических маркеров признаков продуктивности. Маркирование признаков на уровне генома в дополнение к традиционным классическим методам селекции позволяет значительно повысить эффективность селекционно-племенной работы и быстрее достигнуть желаемого результата (Зиновьева H.A. Система внедрения генетических маркеров в свиноводстве // Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». ВИЖ. 2005. Вып. 4. С. 61-74; Гришина Н.Б. Использование генетических маркеров в селекции свиней крупной белой породы в Сибири: дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Новосибирск. 2008. 4 е.).

Молекулярная генная диагностика (ДНК-диагностика) является формой применения геномного анализа. Ею задачей является выявление полиморфных вариантов генов. Генная диагностика базируется непосредственно на ДНК-анализе, поэтому фенотипическое проявление признака не имеет большого значения. Это и есть главное отличие генной диагностики от традиционных методов оценки животных (Арсиенко Р.Ю. Полиморфизм гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP) и его влияние на хозяйственно-полезные признаки свиней: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.23. Дубровицы: ВИЖ. 2003. 20 е.; Гетманцева JI.B., Святогоров Н.В. Генетическое детерменирование толщины шпика свиней товарных гибридов // Научный журнал КубГАУ. 2011. № 69. С. 1-10).

С использованием ДНК-маркёров возможна массовая оценка генетического материала на наличие желательных аллельных форм генов, которые напрямую или косвенно связанны с хозяйственно-полезными признаками - геномный анализ (Гончаренко Г.М. Генетическая структура популяций сельскохозяйственных животных западной Сибири и использование маркёров в селекции: автореф. дис. д-ра. биол. наук: 06.02.07. Новосибирск. 2009. 38 е.; Зиновьева H.A., Эрнст JI.K. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. Дубров�