Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и оптимизация экспрессии гена термостабильной альфа-амилазы Bacillus licheniformis в клетках Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и оптимизация экспрессии гена термостабильной альфа-амилазы Bacillus licheniformis в клетках Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens"

i О В 1

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

БАЕВ ВАДИМ БОРИСОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ «-АМИЛАЗЫ Bacillus licheniformis В КЛЕТКАХ Bacillus subtilis И Bacillus amyloliqnefacieiis

(03.00.03 — Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в секторе радиохимических исследований во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители — доктор биологических наук Ю. И. Козлов; кандидат биологических наук А. В, Сорокин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. В. Машко; кандидат биологических наук Г. И. Морозов.

Ведущее учреждение—Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится /О 1992 г. в / */ часов на заседании специализированного ученого совета Д 025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу; 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгенетика,

Автореферат разослан_ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

РОССИЙСКАЯ ' ГОСУДЛГ<1Т»ЕННАЯ •'••■■'' БИБЛИОТЕКА

8 В Е Д Е Н Л 15

Актуальность теш. Альфа-сггшаБ!! - продукт 1фуппото»Л8гаого Снотохполог:1че>с;горо производства. Остбшпссг! протогсагпш ТОХИОЛОПИОСГ^.Т процессов В СШТрТОГО.Ч ПР0ГЗШДСГ2Э II в тсжсталыюй npoj.aiiiuioraoc'-i тробузт пспользовзщ'.л в итех а-атшаз с повнеошюЙ ТеКЛОрПТУрэй И:ОКТНВЕЦга. Нзпболю тормоотп-йтшьп^й, га кзучсшшх к настоящему вр:*©.й! ч-омялао, яшяотся «-схдаза й.Псьошгог-ы гсязкаал тешоратуру глсгслгоащга 90°С. гжсьросспя ггша «-агилпзи 1С." TICS.1 ПГ D. lictwiUforixiis ГОДВЭрТОПО КаТОбОЛЦТШЗ pC-iTfOiJCTi-T И

подостлгочпа для создав; ю шаима-иро/упоита cHocoCaiui • 'всачвспоД гйаэтша и солекцгпи

Методика рркоиблншшычг ДШС продлагг.т по::т?з способа увеличения продукт биотохполотаческого белка. Появляется возмоэлость кспшьзовапкл подходяеого ет£..мпа-хозя::71а. Ген wso'i зддщмться исходя из cdoCctd продукта, без учета свойств допорпого кикрооргаттазиа. Болоо того, вэзмоаяа ькдофткацил гена in vitro для достакятя как требу ем:х свойств продукта, так л максимального уроки экспрессия.

В иастояцоо время разработана шогочпехепжю вокторшю ciTCTorxj, содержала "сшгыкю" рогуляторшдз элементы, оРосшчгиовдяо Э!Моктпшое виражекзо рекомбшюотиого гена к увеличение ого коглОностл. Особое место занимают так тзизаомио секретарши векторы для граи-положитвлыгих г.скрооргашзмов и дрояжей, обеспэчиваэдио вноклэточпую локализация продуктов клошгровапшх в ш гелов. Показало успешное использование сигаальгал последовательностей гонов нейтральной протеазы

В. amyloliquefaciens ДЛЯ СбКрОЦШ ПеПИЦИЛЛШаЗН В. lichsni for mis И гормона роста человека И а-амилазы В.amyloliquefaciens длп секреции белка A si. aureus а-2-интер|ерона человек« н .uib'ta- амилазы в. licht-niformis.

R то же время, клонирование гэноп чужеродных белков в составе f'GKpBTopin-Jx BP.K'iopow выявило существенную зависимость способности зрелой часта эффективно проходить секреторный путь от свойств и-кощовой части зрелого Оелшг.. Присоединение сигнальной последовательности к нормально цитоплаимзпяескому белку не гарантирует ого экспорт. Доказано, что сущостпз1гшм Фактором для секрещпг яплявтея заряд и склтг-; >сть м-копп/люй части божа

образовывать вторичную структуру. В отличие от сигнального пептида, принимающего конформащт «-спирали, оптимальной для секреции 'является неструктурированная н-концевая часть белка.

Попытки ферментации лабораторных плазмидных штаммов d промышленных масштабах выявили проблему их нестабильности. При экспрессии клонированного гена наблюдалась нестабильность вектора как целого или структурная нестабильность клонированной части. Нестабильность становится существенной, если клонированный ген токсичен для клетки-хозяина и при крупномасштабных ферментациях, длящихся несколько дней. Альтернативой плазмидным штаммам г,»гут стать штаммы, d хромосому которых интегрирован рекомбинвнтный ген. Интегрирования копия гена может быть амплифицирована для повышения эффекта дозы гена па уровень экспрессии.

Другим подходом к решению про блока/, стабилизация штаммов является поиск стабильных векторов и исследование механизма стабильного наследования критических плазмад. В последнее время обнаружены и охарактеризованы Х'енетические элементы, названные par и обеспечивающие равное разделение критических нлазмид мезду дочерними клетками. Наличие этих элементов в с j s-положении приводит к качественному увеличении их стабильности. БдстйНовка_задачил В работе были поставлены следующие экспериментальны© задачи :

1. Клонировать геи термостабильной- «-амилазы в. ucheniformis. Исследовать1 Э2<спрессию гена а-амилозы в клетках е. coli и

В. subtil is.

2. Исследовать экспрессию гена, кодирующего зрелую часть термостабильной «-амилазы, под контролем регуляторных элементов секреторного вектора дая бацилл.

3. Оптимизировать область сопряжения сигнальной последовательности о-амилази В. amyloliquefaciens CO ЗрбЛОЙ Ч8СТЫ0 а-8МИЛ83Ы

в. 1 ichoni for mi s для повышения секреции рекомбинантного белка.

4. Исследовать влияние локализации и копийности гена термоствбиль-ной «-амилазы на продуктивность штамма.

Б. Получить стабильные рокомбинантныэ штаммы-продуценты термостабильной а-амилазы B.subtllis и В. amylol 1 quef aciens . ШШШйй1ШШШШ:. Научная новизна работы заключается в следующем :

s

о

1. Клошфопаи ген термостаОпльной л-ам-нлази в. íicheniío-mis. Изучена окспрессия В £3. subt-ilis гэна ' а-омилази В. llcheniformls, клонированного и состава мультнкопкйного вектора пол контролен собственных рогу.яягоршх оломентов.

2. Сконструирован ген, кодирующий, в единой рамкз, зрелую часть интерферона «~2 человека и зролго часть а-амилази в. iicheniformis, под контролем рогуляторных облаете:! гона а-аимази

В. &myloliquef¿cier,s. Получена ЗКСГфСССИЛ ГСПО И СОКр-ЗЦКЛ

гиОрддного бежа в клетках о. subtiiis.

3. Сокращением расстояния кезду сигнальной последовательность» гона а-г.;,тази В. amyloliquefacieris И ЗрбЛОЙ ЧЙСТКО «-йМЛЛаЗН В. llcheniformls ' ПОЛУЧЕН СЛучОЙШ!1 ИОбОр КОНСТРУКЦИЙ,

обеепдчшзащих секроцта клетками в. subtiiis амилозпоЯ активности с различной аффективностыэ. ■

4. Фештишчески отобрпш дво шгазиздц с оптимззировошшм роко;,;б;ш8НТ1ШМ геном термостабмьной с—амнлэзн; определена irx структура.

Б. Получены ШталМ! В. subt-ilis, СОДПржаВШИО одну и более КОПИЙ рекомбнпэптного гена термостабкльнок а-а:,вшззн :п1гегр:фовяттимя в хромосому. Ксслодованн слияние количества копий гона на стабильность и проективность птака.

1. Получен рокомбшатшй г он тормостабильноД «-зг.илвгц обесточивающий оптимальную сыфвцию фермента метками бацилл.

2. Получен прэтодний дал про-яжченного применения генно-шккшерщгй итакм-яродуцент термостабилытоа а-ажшази па -основе ¡слеток В. araylollquefacií-ns, СОДЗржаЩЯЙ реКОМбИНЗНТНиЙ Г61Х ТерМОСТабКЛЫЮЙ а-амилази в состава стабильно наследующейся нлаиздц. Штамм обеспечивает иакоплошгэ рькоибинаятного белка в количестве до 4г/л Сд]укту^а_работ11^ Диссертация изложена па "хзо стр машинописного текста, гешиач Ift рисунков и 7 тгЗлзщ. Работа состоит иг введения, экспо ра^зитальпей 1г-гтп, содержаще,/ услогия проведения экспериментов, полу'э:::шх результатов и их обсу»д&ю;,~ вшзодсчз и списка.использованной литература (160 hctovihkob).

Апробация работа. Материал! диссертация били доложонн -па их Всесоюзной конференции "Киоо^-г-"" ферментов микроорганизмами"

э

(Кобул^ти ISÖ8), и киздушзродаоЯ конфершщил "генетические

манипуляции в бациллах" (Хольцгау, ГДР 1990), сеишарах отдела биотехнологии КШтонотака (1990.1992).

М АТЕРИЛЛЫ И. НТО Д- Ы iiSiViTc^Sii^J^J-iTöL^J-tLOSSSLr'ISii Б работо использованы штаммы ß.lichenifornjs B-31W3LS0, АТСС-11964, 2ÖKA, ХраИЛЩШЗСЯ В ВКПМ ВНШгензтика ("о В-19БТ, В-2583, В-3086), е. coli те-i получентшй

ОТ ГйОСОЛВ Т., АНГЛИЯ, I1IT8MM В. suW.iljs <>myE4.inetE4.rifr И

юшамндч рВА91 любезно предоставлваи к>ч«шгасш Ю.В. .ВНИИгеиэтика. 2. Условия культ;тафовашя. Для виращядош клеток • испольг-овали L-бульои. Глшозу добавляли, npir' необходимости, до 1%. Для обеспечения селективного роста клеток использовали антибиотики г концентрациях: амшщиялмн - 60- г.йсг/о, эритромицин 20 мг/мл, хлорамфэнетол - 20 иг/мл. Дли селекции колоний бактерий, продадеруадих «-амялазу в агарнзованпуэ среду добавляли до 0Д5Ж омилогшктипазура (CaibUchs-m, США). Трансформацию клеток Е.coll проводили ПО КО ТОЛУ Коэнэ с Cohen S. , et al. , 1S72J, КЛЭТ0К Б. subtil is - ПО мотод;' Спсщейзела с Ariaqnoslopoulos С, et al 19817.

Амплификация гонов, штегрировашшх в хромосому B.subtnis, производилась культивировпшшм на возрастаниях (до 200 мкг/шг) концентрациях Х£ор8;,т1®илкола в еидкой срздо, ш отбором клонов с продольной снтибиоггаоре&лстелтностьй на чайках с градаетом шщонтрацин хдорвм)адккола.

__отдала. В' работа использованы

pocTpiiKU'ioHifflo нуклеази, eaisi экзопуклеаза и ДНК лпгазо фага Т4 Црагмвнт Клешса • ДШ-амишрвз», ь'элучешндо из ШО "5зркопт". Вйльнмс. в соогытсгшш с рзкомзвдэц:.яШ! Производителя. 4. Йог2В"JIV1 У._-1" зодп «• '..-cicok а;ттарста;. Атгззиую акте^аость в кулыурглмгоЯ жидкости клоток определяли' гч оиодап;) азурн от пчшхяюкт.'яозурч ("cauiin-hcam, СГ,'А) кал описано ррказ taol. Удпльная яктишость очвдошпго бело «-амил^си в. b-rhwiformls равна 6000.;од/;хг (57 зд.ГОСТ/мг).

б.01фрд&ле»я& пук?еотщ;юй поеледователык'зти jtfk. н^шютадано

ГГОСЛОДОВаТСЛЫЮСГЙ определяли МЗТО.'',ОМ СЗШ'Ора i".nger- F., et Ol.,

19/77. Фрагменты ДНК, последовательности которих необходимо било определить, клонировали в шн'овдцш.е фзгл, произшднне фага HI3.

то™«_болков.. Лиалнз болков производил:! раздолениом d

SDS-HOJITISKpiUÎCÎ.EytIÎOM голо d соотввтствил с изтодикой ломмли

fLaenrr.ii и., 19705. Бе лад культура лыюй жидкости при необходимости подвергали концентрированию путем осавдония холодным IOS раствором трихлоруксусиой кислоты. Для анализа внутриклэточтнс белков клетки, сусиоидированнно п буфере, содор:кащвм 50 мМ глжозп, 2ЕмЧ ЭДТЛ, 25м1! ТРКС рН-0,0. подвергали разрушения ультразвуком. Надосэдочпая хшдкость поело центрнфугировР'гия содержала внутриклеточные водорастворимо белки, а нстлбранно-евпзашвш бэлш! растворяли кипячением осадка d электродном буфере.

Для

идзптафжацли рокомбгашшшх белков, содержащих антнгетшо деТ0р?.ИНаНТ!1 зрелой части а-ШШСЗН О. licheniformis, белки, разделенные п sds-Плаг, переносили на гатроцеллалоонуп мембрану и инкубировали с конъюгат^?' полшшлшлытх антител к а-амтлазе с яорохсидэзоЛ хрена. Кокъюгат бил лобезно прэдоставлоп C.B. Вешволепсккм.

Ол?11роЗ&^бтаз^-ко1тсвдй_11дслэдо (совместно с

Ходовой O.t.î. ) u-кониевал последовательность очгсцошюЛ рекомбинантной а-амллази била определена на соквеноторо ¿эов по методу Эдаапа cHinkapn«r j.

Для определения

стабильности штаммов ночную культуру клеток разводили » I0'J-I07 раз средой L8 без антибиотика ü культивировав не менее 20 часов. Полученную культуру раститровивалк до отдельных колониЛ на песелектшзной агвризоозиноИ срсде, которые перекаливали на селективную агяризовянпую сроду. Стабильность штамма определялась как доля снросших клеток.

РЕЗУЛЬТАТ» ОБСУЖДЕН И F

I. Определенно свойств а-ямялчзн D. ] tcheniforn-l = . о-амидаза в. Мсь-ы forra s, по литературным дшпшм, является наиболее терчоетпбилыгой среди бактрриялышх «-.'«пинз. Дгцидазо в. îicheniformi s d-3i ..90 оинтезиронал.чсь натлчая с логарифмической фягн роста и достигала njx>4f?.¡;i rioro уровня к .?•")

часу культивирования на среде <-в. при росте клеток па среда с глюкозой в качестве основного источника углерода (среда Спяцайзена с добавлением Ix глюкоза, рн=7,0), ашигаза в культуральной жидкости ш тестировалась.

Для определения свойств свкретируемой а-вгалазы использовала

культург^льную ЖИДКОСТЬ клеток В. licheniformis B-31W3LQO ЦОСЛЗ 36 часов роста на среде lb. Била определена рн-завясшюсть сктшшостп фермента при различных температурах (РисЛ). Фермент сохранял более 95% активности в оптималадом буфоро после прогрева в тэчешш" 30 минут при температуре 90°С. Измерение активности фермента при повышенных температурах . выявило .интересную зашйошрность. Скорость ферментативной реакция возрастает практически до температуры необратимой термошактивацин.

Термофильиость п широкая область ¡-н-оптКл</8Га при слабо щелочных значениях являются . благоприятны;.« свойствами - .для возможного практического применения. Однако наличие сильной катаболитной репрессии в клетках &licheniformis приводит к низкому уровнв амилазной ак-гивносвд - 10-15 ел/мл (соответствующий 0,2 мкг/мл белка) - d культуральиой ввдкоств (Табл.Д). Увеличения выхода фермента можно достичь при экспрессии гона, клонированного па мультикопийюй шюгвддв.

2. Клонирование гена термостабнльной а-титази о клетках

Е. coli И в. subt-ilis.

К началу нашей работы были опубликованы результаты по клонированию гелэв «-аидлоз о. иche.aгormi s штамма лтсс i4seo и

В. coagulans. Оба ГвИЙ бШМ ПОЛНОСТЬЮ ЛОКЭЛПЗОВаПП na EcoRI

фрагментах ДНГ. размером 3,4 и 4 т.пль и таили аналогичные рестршсционнш картц. Исходя из сходства свойств термостобилышх амалэз, логично Сило предположить большую степень гоыэлопш гег.ог. Поэтому, поиск гена юрмостабалыюй а-алг/лвзм ш' гелл с банке генов, полученных клонированиемecori фрагментов ДНК огрсшг^шюго размера (2-5 т.ц.п.). Траясформанта е. coi> шта:,ка tsi с $зенотвпом Арг Amy+ отбирала на срелэ с ампищшшяун н екшэпвкгнказуром по образовании Boicpyr колоний прозрачных зон' гидролиза. Среду 3000 трансформантов Арг были обнаружены б клопов, проявл;тших екклолитическув активность. Одоп из клонов, сох.оргзвшкй шгезйвду с

AJA №

Q) PtSDSP t-

CÍOKI D

0)

Kd»l Peí! 1.1

9 0»

malurj omyÍ7№

Solí 2,2

-h-h

HiniJJ Pstl Eco Г.1 3.4 %>

сигивлышЛ пептид „ а-ашлаза

Leu Pro liis Ser Alo Ala Ala Aja Ala Asn Leu Asn „ .

c(g ccl col tet gca 4ca gcg gcg gca aat cll oal СТрЭЛСОЙ ООКВ30Ш МЗСТО

1-' сшгга сигнального погггада

Pstl

Pec.I Зэзпсккость активности á-ашшази D.licherdformis ОТ pH гидролизуемого раствора крахмала при разлита« температурах.

Рис.2 а)-Физическая карта клонированного Ecori - Зрэгмепта ДНК

Q. 1 ichenif orrnis , СОДержаЩОГО ГОН

тэрмостаОнлыюй а-амалвзн. Указаны промотор сргз, и кодируете сигнальная последовательность серз, зрзлая часть «-аг.шази с maturo

arayl ase} .

0) Нуклеотидиая последовательность

гена и выведенная ат.ингакйслотпая последовательность а-амялазц

В. llchenlГогralп В ОбЛ^СТН СОЙТа

процесскнга сигнального пептида.

ПрОЦОС-

дошшитслышм ecdri-f¡yan;eiiTOM ДНК размером 3,4 т. п. п., обозначенную pvai , бил отобран для дальнвйпей работа.

Рестрикциошшм анализом установлено, что ecori фрагмент ДНК размером 3,4 т.п.н., содертал последовательности узнавания рОСТрИКЩЮПШИ эндонуклеаз Pstl. SalGI, Kpnl, HindlII . (Рис.2a) с их расположением аналогично ранее слубликовантшм ростршсциопиш картом KJIOinipODJjUnUX генов а-аГгШЮЗ в. licheniformi's и B.coagulans.

Последовательность ДНК клонированного • гена, в районе 500-I200H.H. была определена ' методом Сэпгера совместно с

A.Болотинш ' (ВШШгопетика). 15у1слеотадпап послодовэтилыюоть совпадала с опубликованной 5*-концевой облает; г тона ~-е.Н!;<пзи

B. 1 i cheni forini ^ ATCC27S11 И СОДОрЖвЛО 5' -НЗТрЗНСЛИрУеМУК» OO' O'JTb

гена, съдортаваув промотор, область связывания • с рибосомам, п начало структурного гепя термостабшгьгой п-атшзы, вкляпая 37 mjp

- в -

оснований (соответствующих 29 аминонислотним остаткам кодируемой сигнальной последовательности) (Рис2б).

Все это в сочетании с достаточно воспроизводимым фенотипом рекомбинантних iuiohob позволяет предположить, что в составе клонированного нами фрагмента локализован полаоразмершШ ген

«-ймилази в. licheniformis .

При пассировашы клеток штамма е.сои tgi (pvm ) на твердой среде колонии проявляли негомогенность в уровне синтеза a-амилазы, судя по размеру зон гидролиза емшюпектиназуро. До 25% коло1шй приобретали Amy" фенотип, при этом их размер бил существенно больше amy4" колоний. При рестршщдотюм анализе плвзмиднап ДНК. выделенная- из культури е. coi 1 tgi (pv/a), после роста в жидкой среде с ампициллином в течении 16 часов, оказывалась негомогешюй - было замечено наличие дополнительных минорных полос. Среда клонов, полученных при перетрансформащш к;:оток е. сои полученным препаратом шгазвддной ДНК, доля Any" колоний достигала 50%. Все это позволяло сделать вывод, аналогичный описанному в литературе, о структурной нестабильности плазмид, несущих экспрессирувдийся ген a-амилази в составе мультикопяйного вектора в клетках е.coi i.

С целью структурной стабилизации плазмнды с геном о-амилазы, ген бил переклоиирован в клетки в. =чьип=. Для этого ecori-фрагмент плазмида pvai, содержавший ген термоствбилыюй амилазц, . встраивали в ecori -сайт плазмида plaiio. amy+er»r трансформанты в. -аиы.шз отбирали на среде с амалопвктиназуром и эритромицином.

РестрикциошшЯ анализ плазмида plli , выделенной из полученных клонов показал, что ecori-фрагмент размером 3,4 т.н.н. из плазмидм pvai переклонирован без структурных .изменений.

Штамм в. subti us (pLLi) секретирует во внеклеточное» пространство торшстдбильнуи a-амилазу. Накопление амилаокой активности начинается в логарифмической фазе роста и выходит на плато после 36 часов роста iuíctok па среде lb с эритромицином. Максимальный уровень емшшзной активности в среде в поздней стационарной фазе роста вдвое превышает количество 5«рмонта секретируемаго глотками в.íichemirormis в-з1«зизо (Тебл.1). В дальнейшем для характеристики продуктивности штаммов уровень

«

о^ишзгюй ьлу-т-x ni 3о л я/льтури норетропался на

оптачоскуга плотность ку,..:,:у™.

Продукция «-амилазы клегксш в.зиьипг (plli ) подвержена катаболитпой репрессии. Добавление глпкозы в срзду культивирования в логарифмической фазе роста i слеток в. subtilis(plli ) приводило к прекращению сиптеза феруонта.

Таким образом, наш получена мультккопнйпая ш?ззгг«да plli , содержавшая ген термостаОллытай а-ашласи в.1 ícheniformis. Плазгаща стабильно наследуется клеткает з. subuits при роста в присутствии эритрощщина, и обеспечивает d'újoo болььео пак^и ч^штэ термостабшаиоЛ * амилазы в культуряльной агогсссти шммз

В. subtili s (pLI 1 ) t ПО СрЭВНвШШ С КЛЭТКаМИ П. llehenlforr. ■

D-3iY/3L90 (Таол.1). Экспрессия клонированного на мулътакопийюй плозм^де в в. subttiis гена а-амллези подвержена еттаболитной

репрессии. Наш бил сделан вывод, ч:о, излользуя собственные регуляторше зле".епти, па удастся полуют c¿V2KTiTffiTi'rj «кспрвсспв гона терг*остабдльной а-амнлазц. Еоозходплю бьио изменить условия виражептя гона и секроцпз а-ашлази. *

3. Оптимизации экспрессии гена тирмостабильнсй а-амилази

В. 11 chen i for mis В КЛС'ЛЮХ В. subtil is.

Ген мезофнгьноз с<-ЭМИЛЭЗи areylolic;.¡?facien:j, клонированный ранее в нашей лаборатории, зксцрессируглдайся под контролем собственшгх рогуллторпнх элокентои па мультйкопаЙной плаз;,гаде, обеспечивает накопление до 14000 оданац анилазной актхшносга в культуральной жидкости клеток в. subtnis. Регуляторше элементы гена а-амнлазц били использованы для понструировапйл се1фоторного вектора для бацялл, с помощью которого получена и исследована в различных штаммах в.subtnis секреция•во внеклеточное пространство интерферона человека и прошсулина.Мц предполагали, • что подстановка зрелой части термостабйльноЙ а-амнлазн под контроль аффективных регуллтортя 'элементов гена а-амилазы

В. arayl oliquef acl ens, ПОЗВОЛИТ СУЩбСТВеННО УВОЛЯЧИТЬ СШГГеЗ И секреции целевого фермента.

Была сконструирована плазмида pací, содержащая p=ai-фрагмент. гэдаруирй структурную часть гена а-амилази, встроенный в р-лл сайт вектора рис« (вместо гена резистентности к кпноми'шну),

Табхлца I

XapaKTepiiOTiaca штгкйов, еекротцрувдах «фшстабильпув а-еиидазу Назвашю Продуктивность ^стабильность

_______________1едлш_ие_среаэ_У!?_______

В. licheniformis 10

B-31V/3LS0

В. subtil i sCpLLl^ 20 £3

В. subtil isCpVSl} iso 13

В. subtil isCpAE23 £000 IS

В. subtil isCpLV75 4700 io

В. subtilisepLV43> 4500 10

В. subtilis EAEj 1500 100

В. subUlis EACAÖ 2700 97

В. subtilisCpBATA>¡35 ssoo 100

В. suhtilisCрйТБЗ 14000«

« - активность КЗЗОфйЯЫЮЙ a-EbŒM83U В. amyloliquefaciens.

Таблица 3 Свойства птоммов-продуцентов тврхостабнлыюй а-елЕлазн, нолучошш интеграцией рекокбкнантдаго гэна в хромосом.

Етамм Стабильность (ост*«) Активность

ErrT C,nr а-ОгЯШЗЗа

B. subtilis EA3 75 - 1400

B. subtl Iis EA5 100 - 1320

B. subtilis EA13 Э4 - 1440

B. subtilis EAie 42 - 2300

B. subtilis EA19 GO - 1470

B. subtilis EACA5 63 S3 1GOO

B. subtilis EACAO 97 S7 • 2700

B. subtilis EACAÖ 64 84 3100

B. subtilis EACA14 94 SO ' £300

B. subtilis EACA16 S3 S3 3000

B. subtilis EACA17 93 QO ESOO

B.subtilis CpLV7)K 10 - 4700

"-плазмщщый штамм

Силлзтргпгрл! полззяатгзр позволял» талутзть ессрл, или rstx

фратмоши ЛПК. содэрзадао структурную чзсть г она а-ажяззу с тагастной рслсой счдтавашш (Рпс.З).

Епс.З Нуклоспус-зя послздоватоль-" ность области ползшшкора п

< , —, 'с'—и'-оОлсст& гепа, кодпрукпоя с.родую

СГА ш ссс сзв /д: С-г сса ест сси сгт с=\ CÎ.4 ста чзсть уормоСТПбЕЛЬКОЙ e-sr.L'lJiacn S

шгазг.шдо pAci.

Глтогр2д:ю:г Ваглп -iTpsrj.DUïo ДНК m ш;аг:.'дг.'1 paci , ко?лруг5ого

СТУГЛУРПУВ ЧЕСТЬ 0.-аГ.".УГаСЦ В. lichenlforrr.is, за гзпол гапер-Гзропа чолосока а состапо соктротор^го соктора дея бащгля (вгш'Х'Л рптле ) Сила получекз плазьгчдз pvsi. В отоЯ плазмою под КОШрОЛеМ рвгуляторшх 06;КСТ01£ гена а-П!ШЛС1Я!1 В. arayloliqucfpcioris бал расположен габрцддой гол, кодаругщий полягоптод, состояв га СПТНаШЮ** иослодоватедьяоста а-ЗШИаЗЫ В. i,aylollquef&elens, полюй последовательности гатврГеропа-аЗ человека л полкой П0СЛ0ДОВаТОЛЪПОСТП а-амалаза В. licheniforuds.

Культуральпап ";гдкость клеток шта.*.г»а с. =ъышй (pvsi ) обладает такой огжолитпчоско" актшзяоетыэ, irpruiopiTc? в 100 раз ег.:;8, чом у атом:.га, пзеущзго клоярровашиД г;щ в-а;пшш

В -imylollfiuoraciens - 13. subtl 1 is (pKT'J) (ТабЛ.1>. ZOTfl С'ЛЛТСЗ И

сокрои;.::о Солкошго продукта гибридного гопа тпиравляют рогуляторзшо ЭЛСМЗИТЦ - иромотор, участок СВЯЗиВЗЩШ с рлбосомой к спгиалыюл последовательность этой мосо-т-шыгаи а-аг/ллазн. Это сгязано, по-шглиоглу, с пеоЭДоктавшстьп секреция из-за пзоптшаяыюа структура гибридного белка. -Другим ойъяопапием межет бить сшсгаппая активность «-ашлаги в составе гибридного болтса, пли нестабильность гибридной мШС или белка.

При электрофоротлческом разделении белков культуральпой яидкости штамма в. 5им m в (Pvsi ) но бил обнаружен бэлок, ижвша;! шлвкулярну» массу в облас--. н 75иДа {молекулярная касса, вичислошшя из последовательности гпбр-.щпого бота М=74468). Для визуализация сштез-.руемшс в клетках о. subtiiis оелкогух продуктов гонов, кодируемах рекомбинантиой плизмпдой pvsi, ' бил проведен анализ белков культурал ыюЛ жидкости, мембрашю-спязсгпгой и внутриклеточной фракций методом ку-^ьоблотннга (Рпо.Л) с

il

- ia -

проявлением белковых продуктов, сохранявших антигеннне детормлшаптн а-гшлази В. licher>iformis. Методом

Вестерн-гибридизации удалось зарегистрировать Оэлковпе продукты с молекулярной кассой - 70 кДа в мембранно-связанной Фракции и полипептиды с М=55 кДа во внеклеточных фракциях.

Возможным объяснением получешшх результатов может быть следующая модель секрации гибридного пра-белка интерферон человека а-амилаза в. i tchenifor-mis. Неоптимальпая, из-за наличия ннт о р|а р о! го о а Я части, пэрьичная я/или вторичная структура гибридного Озлка замедляет процессию1 пре-пептида и прохождение полипэптвдной цепи через кзмбрану, что способствует ого накоплению в мембранио-связанной фракции. При секреции пре-о-амилази тского накопления не происходит. В культура.пьной жидкости наиболее подверженная протеолизу - кптерфороновая - часть бэлка деградирует, а вмилазная - продполохительнз свернутая в кошактнуи глобулу - сохраняется и обеспэчшазт там амшшзнув активность.

Подобние результаты подучена при исследовании выражения гвпа интерферопа-а2 человека в составе секреторного вектора для бацилл pRTAe, исходного для конструирования нашего гибридного гв;;а с Аваков A.C. 1Э87з, (Селиванова Г.Н. I99D. До 20 часа ферментации происходит умеренное накопление интерферона (тестируемого кммуыологачески).как в культуральной гадкости, тек н в мембранной фраКЩС! КЛОТОЯ UiTQMiria В. subtllis AJ80 СPRTA65. в соотношении 1:1. Су;,парное тсоличество слмунологически активного ннтэрфрона не Еровиыоот 2,5'Ю4 кБ/л. К 40 часу форг.&иташы оукмариоо количество шторфорояо достигает Ю'Ю9 кЕ/л, прдчом болоэ i'3% Сэжв локализсия'1-7 на мзнбреяе клеток d. subtllis, а количество иммунологичосют актягаого ячтср^ороиа в культуральной жидкости умэныаоется в 5 раз. Нлихг^нта на кекбрапэ

цршаснваотся ыеъ.гфоктляп:.."1 с&крвцка пзопткмальной структуры полипоптцг.;> i: района места процзссинга сигнальной поелвдовательвоегт п п^г-л&ос'-аости кттер^орона, а уывнызонзэ количества шггэ|л1чро;п м» внеклеточном пространстве - протоолизу. ишкцему место, к^с-отрл из исяодьзовашю итамма с погашшш уровней синтеза прзт&аз.

Диализ секреция интерферона к гибридного пре-белка кзтерферон

94 I

64 +

43

30

го\-

I

■_ «=£»

Рис. 4 Результат Еэстэрн гкбридгаащгл лпутриклеточтта:: (дорожи 1-4.), кекбраттосвязашшз; (доронси 5 в) и гатоклоточши (дорожки 9-12) белков С ОЯТИТОЛеГ.Г,! Г? а-С'Ш1а39 П. ИсЬ«г>1ГоггДп. Проявлялись Срлкое::о продуши меток в.5мыш = , штаг.юо, рзсущис плазмидн рЬАНО (вэктор) Сдорокл 1,5,9), рга (доджей 2,0,10), раез (дорогзш 0,7,11), рс^ (дерзим ¿,0,12). ■ Полоса в мзчЗракгосвязагоой в^аяцш! ятат в.:>и>л1.11Б£р721э п области 74 Юа, обусловленная глбр;т!сшм бзлсом уксг-гр? стрелкой. »-ямплаза ПрОЯВЛЯОТСЯ и СбЛССГЯ 55 коя го пшся07оч1шх фракциях ПТГ.НМОВ в.5иыш!, '"одйр^аяих гогасготл , рлва, рь\>7. Числа слова' укякгааот молвкулг.рпно иассн паркеует белков. Анализировались количества Сз;.';ов, соотеетствугааго : внутриклеточная и мемЗрснпая фракции - IV3 клеток, внеклеточная Фракция ; 2,10 дорожки - 300 '1лкл, II дорегда - 80 «хл, 12 дорожа - 15 ксл.

ЧОЛОВЗКЗ - а-«.£ШШ В. liehen! foriBis ЩЙШОДИТ К Е130Д7, ЧТО

существенном для секреции является структура гибридного белка, и процесс секреции и локализация продуктов гзбрпдюго гена блокируется за счет наличия в ого составе интер1ороповой *тсстп.

Еэпзк оггке.юльного сопряжения сигналыюа последовательности со грел >Д чйопу t'.vi:a г- ссгротсрпс-:'. кзкторо представляет собой граптачесг-уя задачу длл кезда кошпзз'ЫоЛ пари поляаопидав, поскольку на суцестгг.'от ойобдетгдх моделей ccpoioai рокоиЗашлг.аого гре-бедка. Для укшзьзкшд ватт области, раод«--'вдэй екгпольпуо иэеледовательность секротор.гого векторе ц зрелий белок а-аихлази, било проведено поелодоватолшоэ сокращенно этой области. Для этого сначала делецч&й ошгактелыюй част гена iiuiopjopoiia человека в юшзш&> pvs1 (есогл - egiii ipparmirr дашой 453 п.н.) била получена шгаомзда рлса. Плазццзп рлнг содержала область размером 57 "дополнительнах" иукжеотрдах пар, разделявшую фраплоити ДНК, кодировавшая препэптед и зрелый белок тер:, га стабильной «-амилозы. Для достижения статистически случайного сопряжения, опткиальЕого дал секреции тершетабокыюй «-амилазы, cubiicopir'D область в .штмаде рЕда сокращали экзонуглоазой в*131 (Рис.5). ];з 200Q независимых клогмв били отобраш и прояналлзщкшаии 50, образунщн разлачшю по размеру зону гидролиза ямалопектаназура ца »ндикатервцх чашках. Количественно уровень сшггоза внеклеточной «-амилоид определяли после культивирования штаммов в жидкой ервдо. Разброс в нродуктавпости различных штаммов бил значительным, но только, 15 из них превышали уровень исходного штамма

B.subtilis (рЛЕЗ).

• Камрронно <—; о'сташости в жидкой среде показало, что

'ШТЩ'/ЧП'Л'; Тфо.луцолг* г>. nubtllis (pLV7) И В. subUlis (pLV43)

n трл раза болхло торгасгабилыюй «-аиялазн, чем штамм н .-.и'-'• i -а (р/чг) я почти и 30 раз больше, чек в.subtilis(pvsi)

Г/брцдш.о гонн а-ошиазы в составе плазыид серии plv были . a'.v. Нукяеотяднаа последовательность места стыковка

rtVitii п даго гона с сигпалыюЗ последовательностью да лучших п- ^змддднх лтюдуцйитов Auw и ALV43 была определена методом С'. *-эра. Дпал.13 -первичной последовательности ДНК .показал, что в

Pr SD SP HüFN

КГУ» ^

«t

p m из m вор

а) долецпя гена mrreprfapoHO |

Pr SD SP в ту les о

emylcao

-Hl-pl/S? - hin

-H+-

-t-

____p m Bsp з

б )_ удаленна кэлгонюй области .

АЭЛОЦДОй 0K3O2/y№J83Ofii Bal 31 } Pr SO SP amylase

-i-

//

EcoRI , Bql.II, Kl enow,

EcoRi-линкер, лггаза, отбор В В.subtilis

t+i- рАЕ2

II PS!)

EcoRI , Bal3!. , Kl enow,

лигазз, Сонотатиесгай

ОТбОр 13 В. subtil í.s - PLV

Рис.5 Фпзичоскга карта плазквд руэх, рлсг, и рьу в области кодирования гибридных белков с а-и.олазой о. ИсЬепигогпаэ и схема сх конструирования. Сайты рестрикции обозначена : ' га -ксоет.

н-ыаох, Р-ГзЪ1, Э-БаЮ!, Н-Н1пс1111 . Указаны промотор СРгЗ, сцгпальная последовательность а-агхолази О. агау1о11яиоГас1«?т СЕГО , последовательность, кодарупцая зрзлуи часть человеческого лэЕкоцптарпого интор»ерона-а2 снит , последоватильность;

кодерукцая зрелуа часть а-амилази В.11сЬе111Гогт1я СЛту1азеЭ.

H PS 0

обоих случает структурная часть .гена термостабильной а-аиалазн в. iicheníformis осталась интактпой (Piic.Ga). Последовательность, кодгругщая сигнальную последовательность а-аммлазн

В. amy!oilquefaeiens НО НЗКеШНа В Случае ALV7, 8 В СЛуЧаО ALV43

Езкепепа незначительно (произошла загона серина на аланин). Наличие добавочных аминокислот в белковом продукте ме:гду спгналытоЛ последовательность!) и зрелым балком (аланин в сдучаз alv7 и кза елмгана в случае alv43) но является,. но-видаюму, препятствием для'секреции, тем более, что слегли текла - послодгшя вшшоккслога сигнальной нослелоштодшоста «-егяглаз«

В. 1 i Chen 1 for ral (РПС.66)

ФШКЮЙТ! учеь'«р,31 CHemlla and Slbakov 1S91D аПЭЛИЗКрОЕЗЛЗСЬ продуктивность ШТПКМОВ В. subtil is, несущих ПОДОбШлЭ конструкции. Ранее полученные секреторные ввкторц для бацилл на основе КЛО НИро В а НПО ГО гена а-амллази В. amylol irtnefaciens eis, содержали 5*-кодирующую область гена и предусматривали возможность трансляционного сопряжения чуяиродгых структурных гонов с

is

- 1Q -

Г?П

Hlad»

Рпс.Р г) Фззкчоская плаигд г^рки plv.

карта

-

HÍCÍ3

б) Нуклеотядоая п аппнохпслот-^ нал последовательности области виаш сайта процессшга сигнальной последовательности в лучшх продуцентах ptw л pLV43. СтролкоЛ даказакп шста про-цессинга сигнального пептида

а-01сыазц В. amyloliquefaciens

en «я esa eciec» got rep c=e ees tst 0:1 т ея ко c'ü ,. „ д ГЕбрИДа СО СТРУКТУРОЙ pLV7. аг тяттйшяилмлАиллмтеиАМлгтиии PL*" J * r* T

ell «от usa вол toa caí ¡PS £»* sat at tat ira sep c.» . w7 u миамчгя w Д» <u M«uu»«a»™iuu и<-"

■с .

u тяия птееяыл *iAAs»uu«»c-i.yTwitfU

различной дашой спейсершй области ■ за сайтом процесспнге Сигнальной последовательности, фрагмент ДНК. кодируадцй зрелую часть а-ШШШЗЦ В. licheni forml s субКЛОНИрОВаЛИ В СОСТаВО секреторных векторов либо чероз Hindu i -линкер, либо непосредственна. D качество параметра, описывающего конструкции был принят размер области сю мзжду сигнальной последовательностью и первой аминокислотой зрелого белка термостоСильной а-амилазы.

В' конструкциях, полученных финскими учешми оказалось, что рптимальпш значением d для максимальной продукции белка является 4-5 омшюкнсдотшдс остатков. Уровень секреции белка достигал ОТ продуктивности итаиг.и С геном а-амилазы В. amyl ol i quef aci ons , клонированном на том же векторе. (Для конструирования использовались регуляторнне области гена а-амилазы

B.AmyloU quafaclensИНТврвСНО ОТМСТИТЬ, ЧТО КОНСТРУКЦИИ D=0 Н8

обзотешали максимального выхода белка. В то же время, максимальное значение ферментативной активности наблюдалось при использовании структур, имевших минимальное количество добавочннх амшокисяотных остатков (d=o и d=3) (Рис.7). Расхождения в уровнях «птоза балка и его активности объяснялись различием удельной

активности форманта при изменении ого ы-концэ. Таким образом, был сделал вывод, что поиск оптимальной . структурц для с&кроции является экспериментальной задачей, так как ни одна из "естественных" конструкций - ни "точная подстыковка", ни гомологичное сочленение, ни исходное окружение сайта процосашга сигнальной последовательности - не являются оптимальными для секреции.

Вполне естествешю, набор кснструкц'.л, получении!) Минскими исследователями не Сил полним. Максимальную активность во вноклоточном пространстве обеспечивали конструкции d=0 и 'd--3, причем в последнем случао три избыточные аминокислоты у:кэ сказываются на удельной активности а-омилазы, понитая со. Наш результата можно рассматривать как дополнявшие рассмотрены!."? выео, поскольку, пользуясь предложенным обозначением, ми имо;.л конструкции D=i и d=2 (alv7 и alv43 соотвотств0шю). продукцнл тормостабилыюй а-амилазы штаммами .в.subtilisCpLV7i и в. subuuscpLv-t33 достигает 3t>; от уровня итамиа в. subtiii-. (¡л:Т5) (аналогично itemlla and Gibakov Mi срОШИШПОМ продуктивность полученных штаммов со штаммом в. subtui-, несусда ген о-а:л;и:азы B.amyioiiq4-?faciens, клоштрованшч на плагмидв), в то время как активность лучших ¡фодуцентов Нети» и Sihatw (D-0) достигает лишь 15'* от активности мезофилыгой амилазы п культуралыюЯ зддкости нлязкидного итамма.

Совместно с М.Орловой Сила проведено очистка белков культуральной жидкости клеток в. subuns (plv7). в лаборатории химии белка В1Ш1генетика была 01гродолена к-концввял аминокислотная последовательность "-амилозы. Рокспбшюнтннй Салок :а:эл дополнительный остаток аланила на м-коицо по сравнотга с о-а?.силззой, секрстируемой клетками в. j lehoni formis. Сравпенио аминокислотной и нуклеотвдюЛ последовательностей (Рис.Сб) позволяет сделать вывод о совладении моста отрезания сигнальной последовательности в нашей конструкции и в исходно,! для. К"нструи[юпшмн секреторного вектора а-амнлазе

[3 - <\>ту] <Л 1 я с l .

5. Получение штаммов-продуцентов термостабильной «-амилозы.

Гешшон плазмндо рзтчозз, использованный нош при

Ö) а-8?.шла30 B.amyloliquef¿cic-ns . а-амиллза В. liehen! fr.rnds

1

2

3

4

5 ß

7

8 !

pLV7 pLV43

D=7 D-7 D=9 D=G D=0 D=3 D=0 D=-2

D=I

D=2

У зрелая часть

. . TSA VNGTLMQYFEWYTR. . . . AAA /wMLMGTLMQYFEV/YHP

.TSA VMOTAKL ANLHGTL. . ,1S\ VUÜTLQACNLNGTL. . . TSA VIÍGTLQACAANLNG. . . TSA ASLPAAANLNGTLM. . .TSA VNLNGTLMQYFEWY. -TSA VNGA'JLNGTLMQYF. . .TSA VNGNGTLMQYFEWY. . . TS/. VHGTLMQYFEWYMP. . .

У

. TSA AANLKGTLMQYFEWYMP. . . TSA AAANL.NGTL.MQYFEWYMP.

ft гс„? а) Уровень продугсщш вяеклэточной а-аьпшзи it ах функция расстояшхл D от последней рмапокислота сигнального пептида до первой аминокислоты зрелой части а-аглиюзи В. licheniformis. Количество сокротзрованпэго Солка (крупен) и амилазиой активности (квадрат) прздетатшшы в долях от исходного для конструирования итзмма, содзрлжщого ген а-ашияози в. amyloliquefaeiens, КЛ}ИИрОВ8ШйЛ Ш «У-КЬТИКОПИДШЙ ГОИЗЗДДО. Пр0ДУКТ1ШН0СТЬ штаммов, получению; в данной роботе (plw и Римз), указана болнми квадрата?»!, Итомчи, получению iieriu - чериами.

б) Аашюкислотнно последовательности конструкция сопрлюния

СИТНаЛЬНоЛ ПЭСЛПДОВВТОЛЪШСТИ a-a.VfflJI33U В. amyloliquefixcieris СО

зр^лоП частьэ а-вмтлези в.í'ch-niiormis, различающихся величиной г>

- IS -

конструирования всех пшэупоиянушз плазкод ДЛЯ B.subUUs, сегрегацдошо нестабилен при фершггацгм в отсутствие эрнгрог.пщина. После 20 генераций в нэселзктшзншс услогаях только от 25 (для вектора plaiio) до г0% (для plw) гслоток в культуре содержали пхазмдду (см.Табл.1). Для преодоления пэстаблльаосга штамма геи шжэт быть интегрирован в хромосому в. subtiiis, вря этом он стабильно наследуется а возиозгаа . его агшянЯннацая. Интересным вродставлллось тагспэ оценить шпулею. локализация roiia на уровень экспрессии амышзи.

Для этой цолн била" сконструирована плазмида р"пм, способная реплицироваться только в платках е. coli. При гпдролпзе растршстазой ватш плазмида р"пн дазт одая фрагмеи, а при гидролизе Hindi и - два, один пз которых содорнпт ген, обуславливающей устойчивость юта ток в. иышг к эру.тро'вдтиу.

Плазгеща pBva.3 (Рис.8) била получена цитированием фрагмента ДНК. кодирующего .синтез и секреция тэрмостабнльйой «-амялази из шюзквдц pLvr в один из tundiii сайтов пдазмвя* рта-t.

Г:?..О Сйо^эскал карта штз?дядв р^УЗЗ". сайт'ШШ31.Я1ДЦ PBV23,

кснользуекйг "д.: л клоштровення xpor<ocoMEUS фрагментов ДНК для последуицэй клтогреции в ÄpOFwCO'^j, подчеркнут.

' поделенной . рз получению" Apr.vmy+ всфеашшгсь сдуЧаЯлуе sau3.\ фрагмента хрокюсош в. subtiiis. Лкгпрошашя '.даоь

ПСНОЛЬЕОс'ЗЛ 'СЬ ДЛЯ ТраасфОрМОЦШ КЛРТС1С Э. subtil 1 s гос* к Ф&ПТШУ EarAmy*, Ч.'О &Ш U03MO,". jio ЩЯГ СП0С6ПЯЗ ГСЯСйЕ**; С обои-ш

н8ркора:.-.л в zpomccvy клоток-рзцигогеитсв. Кз ЗСЭ пезоЕОТгий: колоний, щрсаш на среде с эритромицином rr öi* ло,тск"Тй<:зуром дт;л дальнейшего анализа была отобрана 30, oöpattfSföScÄts цгкбодыш?) во разбору зое! гидролиза.

В BamHI сойт ПЛЗЗ?£!ГЛ, кло::сп-транс<5ор;,;антов фз нотипл

Прошриа стабильности ¡:так.\ов проводилась как описано в раздолэ "материалы и методу"» Из 30 атаклов-пдтегрантов

(В. s-ubtllis ЕА1-30) BlCWaiEia ПРПВЛОК ОДИН (B.subtiiis ЕА16),

которой производи столько хо фермента, сколько плазмзднпй. Однако оказалось, что стабильность данного итак,¡а всего вдвое вш'.-э 1хлос?«5дногэ. Казбодький литорее продставляли та штеггш, в которых поело роста в тошга 23 гедорацЯ в жидкой среде без антибиотика У SO-iOOS I^TOTC:; сохракллсл Arnylcr/ (J-SHOTim. Это суцсотвонко отличается от плез&едпого пта;".:з D.subuiis(puv7) (DOS клеток теряли плазмиду после 20 генераций) (Табл.2).

Наличие всого од:;.ой копии гена тормостабильпой а-амалазы в клетке сказалось но продуктивности штамма. Уровень синтезз а-аьплаои при роста в селективных условиях - Юккг эритромицина в I мд среда - штампом в. subtiiis eas (ЮОк стабильность после 40 генераций боз антибиотика) в 3 раза ;пта, чем у штамма в.subtiliS (pLvr). содержащего тот же ген на мультикопийыой плаз?.51дэ (Табл.1). Разброс по уровни синтеза а-амалазы стабильными штаммами серии b.subtiiis ел но превышал (Табл.2).

Для увеличения дозы гена тормостабильной а-амалазы в хромосоме D.subtiiis била проведена повторная трансформация клеток штихча b.subtiiis eas плазмидой pBva.3.

Гея устойчивости к хлорамфениколу из плазмвды pcis*, локализс-вашшй на BamHi -фрагменте ДНК, и встроенный в ватш сайт аяэзмиды pbvz. з, служил маркером, по которому определяли спасение плазмида с геном а-амилази. Рекомбинация В данном случае происходила по ебсолютиой гомологии с ys:o встроенной плазг.'дой psvs.3. Кз 50 независимых клонов для подробного анализа были

ОТОбраШ! два : B.subtiiis ЕАСАЭ И B.subtiiis ЕЛСАЭ (ТабЛ.2).

Критерием длч отбора слузяыа одинаковая (и желательно большая стабильность) по обоим маркерам устойчивости к антибиотиком, и наибольшая продуктивность (Табл.2).

Отобранные ШТ8*:ЧЫ-ПрОД;.ЧеНТЫ R.suMllls КДСЛв И B.subtiiis ЕАСА9 с двумя когшями гена и хромосома обеспечивали продукцию тормостаб^льного формонта в количестве f>;iшз болы:,ом, чом исодннй ст." мм, что '.аиько в-полтора раза монш» плмзмидн'тп ('PiiiU.l). г Некоторый уровень носта«5яшкч,т.» п -добинх структур в

В.зиЫЛИя, гозду наличия прямых повторов фряшзнтсю, по которым шло встртшзняо, неизбежен. Структурная стабильность, разная у рпзличтге штамкоп, зависит в больной степми от того, ::акоЛ фрагмент ДНК использовался для гомологичной интеграции. Язезстпо, "то частота одпвплвнля фрагмош'.э в в.ьиыли^ пропорциональна протяженности прямое повторов, Яшашсиругацих {рзгмеят. В вповотх серии р. гчьипк вдел ген устойчивости к хлорам/ш-колу фланкирован Д!1К шшмиди г-г^/г.з, размером 9 т.н.«., в добавляю» к хромосомалышч участком, поэтому ввдолдатгв его происходит с болыавй частотой, чем м-»ркг<рои г«' я лт/\ .

Полученные дяшшо свидэтельствуот о теп. что зкспреосин 1ч»на в состат''< хромосомы су«чвстс9шю более з-ЭДектавна, чем того ж-: гена, клишфоодшого в 'состаге мультакопийного' вектора. Наши результата соответствует выводам Финских исследователей, что увол"ло!п:о количества хроросо?ото-локолизовашюх когад гона до двух, обесдочишют иропо.ящоральпоо увеличение продукция амьяаяа. р. ш1о удалось получить стачм в.^иылц- с 8 копиями гена я >:ро"<. >';оче. При ферментации отвмча но селективной сродв было падун :к> двукратное превшюшге уровня синтеза «-амилазн по ерзвшгот с шншвдш штечтом. Культивирование кзток в несолектин'гчх условиях приводило к бистро»'/ пгожш коппйности гонг, И, ссотвотстпэшю, продуктивности штемуп [КаШо Г', япс! РлХ уа

I . . 1 &Г>7 ! .

ДальнагЬзю наши попытки ачхлаф^езцдо оптагазировашгого г"ла «• ажшжи в хромосома п. г,чы.ш? при), ели к сувсЕютооипону ирояплзиля структурно.'! нестабильности. Гйбриддай «я тс'р'-юстрбидыюЯ о-ажлазч ль'-т, сод-раэтщП иря'отор, участок еннзнванил с ргбэссмой, 5' -когщоку» область гена, сигои;мц •» . ПУС.,13ДО|13ТОЛЫ!СС7Ь о-ОМЯЛПЗЫ в. ату1о1, огттшю совря^а.1уп с фратштом Ш(, №Мруяяш срелун част.*» а-амилазн в, Гогтг!?, Оил рзсиолоаш на ¡Цпгии фрагданто

размером 4,4 т.п.п., что позволяло поизносил» ого па друп^» вчкторн. Дл>« солдапи^' аеггсча продуцота гот Фрагмент Д1!К бшг встроек и ст-ЮаньиШ поат'ор для- Озпилг рклеи , оконструирорушл.'й и охарактеризованыый в днборогораа' гояшб' янгэпориз ВШОДолотявп. Совместно с: сотрудниками лабораторий' гьшой' шкДзиорш Ю.Иомвнтасом

и Б.Лбал^жлой паг;"1бпа• шазиздч - рватауз (Fhc.9) - стабальпо поддер^шаздаяся в клетках в.^ьииг на протяжении болое 40 генераций и направляющая синтез и секрецию термостабилыюй -амилазы в количестве ке цсшоо 5000 едшшц в г.иллплнтре.

EüH __f-^l.E'stl йдm"i

!~Ск]

Ria.9 Физпчоская карта стабильно насл..>дуке;ейся в клотках с;<цплл пл^омлди рвдтАмг, посудой ген тормостабилыюй а-акилази.

Вектор рВА4в

¿10

стаб:: Плазылда

цэддирлииаотся и в клетках

В. ату1о11чивГас1ег.5. ПЛЗЗЫЛДа рВАТАН2, БВОДеШШЛ В 1СЛ8ТКН В. ¿г.1у1оПчиеГас1епз трансформаций НрОТОПЛаСТОВ, ПрОЯВЛЯЛЭ сегрегационную и структурную стабильность при ферментации в ызеелзктившае условиях к обеспечивало ' синтез и секретно во внеклеточное пространство термостаоилыюИ а-амилази. Совместно с сотрудниками лаборатории технической микробиологии ВНИИгенетики Д.Поповым н Л.Вольфовичем отработаш условия ферментации в ферментере магиыгы мэ-15о с рабочей емкостью 0.75 литра при температуре 37°С в промышленных ферментационных средах следущего состава (г/л) : картофельный крахмал, осахаренный а-амилазой - 2, кукурузная экстракт - 10, дрогкевой акстракт-2,4, лактоза - 0,6,

(NlpgHPOj- 8,<1

K2S°4

З.МаСЬ -0,3

MgSO х7Н О - 0.15,

CuSO.

0,0039, рн=7,2. Подбором оптимальной среды и условий форментацяа получен выход фермента 200000 ед/мл, что соответствовало концентрации белка 4г/л. В ст.шнтере с контрэлируешмп ОНТИМаЛЫММИ УСЛОВИЯМИ роста клетю* в. arnyloliquefaciens ДОСТНГаЮТ оптической плотности IG0 O.E., что нздоеттог-о при росте !:ультуры в' колбах, Почтому сравизяпз от.-.-с- количества а-аиплезы с активностями, измерен, ими дл.м итам>«ш на осново в. ечыш; , опмсашшх 'выше, -не является керрект^м. Вместе с тем,

ПС;ГОЛЬЗОВГ'ЧЦ0 В КВЧОСТШ рОЦИЛИОНТч В. am> ^ ol i quofaci спз ЯГЛЯ0ТСЯ

опталалышм, поскольку дал в. subtilis не удалось получить сопоставимого вихода а-амилазн (Д.Попов, частное сообщение).

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген тормостабильной а-аМЯЛЭЗи B.llchoniiormis. Рекомбинантние плазмиды с экспрессирувдимся геном а-амилази структурно нестабильны в клетках е. сои. Экспрессия .гена под контролем собствогашх регуллтор;шх элементов в в. subtms подверкена репрессии при росте клеток на среде с г.пакозой.

2. Фрагмент ДИК, кодирующий зрелую часть тормостабильной ■ «-аиилази, подставлен под контроль регулятор:шх элементов

а-амилази в. amyioiiqu«?raciens. Получены конструкции сопряжения сигаальной последовательности «-0МИЛ03Ы в. amyloliquofaclons со зрелой частью «-амилазы в. lichenirormis, различавшиеся длиной разделяющего их нолинептвда.

3. Конструкт«'сопряжения зрелой части <х-а.\млази в. uchoniformis с сигнальной последовательностью ст-8МНЛаЗЫ B.amyloliquefaciens, обеспечивающие секрецию максимальной яшяазной акказиостх, отбирали Фенотигшчески после получения статистически случайных делений. Иаксямальнуга секреции гибрэдгюй тармостабилыюЯ с—амилазы обеспечивало наличие одного (в случае alv?) ет д;;ух (в случае alv43) остатков алатша за местом прочее синга сигнальной последовательности. Зрелой белок, секретируешй штаммом в. subtili sfpLWD, имеет одая избыточный остаток зланжш на м-конце. Клетки в. r,ubtiiisCpLv?:> накапливают до 4700 единиц активности тармостабильной а-амилази в миллилитре культурально'! жидкости.

4. Получены штаммы u.subtiiis, содержавши;} одну и более копий рекомбинантного гона термостабильной о-акглази структуры alv7, интегрированными, в хромосому. Показано стабальноо наследование не более двух копий гена, тандешо расположенных в хромосоме в. subtnis, в не селективных условиях роста. Штамм, имеющий две • копии гена, обеспечивает накопление до 3100 единиц активности термостабильноЯ о-амилазы в миллилитре культуралыгой жидкости.

5. Получен пригодный для промышленного применения гешю-тшэкершй штамм-продуцент териостабилыгой «-амилазн1 B.iicheniformis на

ОСНОПО Ь'. air.ylol'i 'Г^.-'fi cie.is, СОДОрйаНУ.й реко^бишэташй КЧ1 торкостабилшэа а-йг'шшзи структуры alv7 в coctubd C'faOiJJH.liJ

иаследзющ&ся рэкомояишглюй пдазмздд. В октамчлышх условиях роста г» {орчзнтэрэ кташ обосаочкзаот яаконлензо рвкомбижтяого бОДКЭ В КОЛ1Ч0С'Л!0 4 г/л.

I .'Лепольсовотю гона тор:;остобйшк>а «-омолаои для конструирован'«.!

Васи В.Б., Сорокин А.В., Aboicod А.С.,.Козлов 0.11. В Сб. "Виослтпез iopmoh'i'cb i.ciiq^opveuiibi.nwr', uycshlo 190". С.G. Й.Фрагмэит ¿СП alw, кодпрувди!} сиатоз «--амилазы; способ ого копструирозяпкч И шта?.г.5 бакторцй Baci 11 'jus subtil is продуцент тормостабилыгой <а-ам;тлаг>п Бас-з В.Б., Попов Д.Г., Орлова м.Н., йомаитас D.B., Сорокин А.В., Рябченко Н.Ф., Болотин A.II., Народицкая В.Д., Козчов D.M., Старкш В.Э., Стронгин А.Я., Добабов В.Г., Вольфович Л.Д: Заявка па изобретение N4794136 от 2.03.1990, положит, решение от 27.12.1990.

3.Рокомблнантная плазмщная ДНК рватамз, кодирующая «-амилазу

Bacillus licheniformis, ЩТаММ бОКТСрИЙ Bacillus arnyl cl iquofaciens

цюдуцйнт а-ашзн, Баев В.В., Попов Д.Г., Орлова М.Н., йомаитас И.В., Сорокин А.В., Рябченко Н.Ф., Болотин А.П., Народицкая В.А., Козлов О.И., Стерши Н.Э., Стронгап А.П., Дэбабов В.Г., Вольфович Л.Д. З&.шка па изобретение n-S8377G9/Io от 12.06.1990, положит, решение от II.12.1990.

4. Штамм бактврнй Bacillus amyloliquefaciens продуцонт «-ЯМИЛаЗЫ. Баев В.Б., Попов Д.Г., Орлова МЛ!., йомаитас Ю.В., Сорокин А.В., Рябченко Н.Ф., Болотин А.П., Паролю скал В.А., Козлов Ю.И., Сторкин В.Э., Стронгин А.Я., Добабов В.Г., УолыЬвич Л.Д. Заявка на изобретение »4912479 от 18.02.199П, положит. решение от и. 12.1999.

5. Construction of fusion protein.- vitli" ci-an>yl aso Ггиш FSacillus 1 iche.nifc.rmis. baev V. B. , Sor ok t ' A.'.'. Abstracts of II Workshop "sr?n<? wsTitpul at ion ih Baci Hi" Hoi гЬам. 1ОГ.О. P.O.