Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens как модель для конструирования секреторных векторов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сорокин, Алексей Васильевич

Клонирование генов d -амилаз из ScxcuMU^o.

Большой интерес к секреторным ферментам бадшш,развитие систем клонирования генов в а также относительная простота тестирования работы гена ¿¿-амилазы,предопределили быстрый прогресс в клонировании генов -амилаз из различных бацилл.В настоящее время известно о выделении

• • О О I путем клонирования по-краинеи мере восьми генов -амилаз из .Наибольшее количество работ посвящено клонированию осахаривающей «¿-амилазы из /94,117,

118/.Во всех этих работах предпринималось изучение нуклео-тидной последовательности клонированного гена.Было обнаружено, что все клонированные гены сильно гомологичны и различаются лишь единичными заменами.Было также установлено,что экспрессия гена в £ приводит к структурной нестабильности несущих его плазмид /6,118/.Интересно также,что в двух случаях ген не содержал последовательности,кодирующей довольно большой С-концевой сегмент белка,но тем не менее, наблюдался синтез активного продукта /6,94/.Установлены изменения в промоторной части гена,приводящие к сверхпродукции Ы. -амилазы в ß. a^UUí^l /117/.Две серии работ /24, 102,113/ были посвящены экспрессии генов термостабильных oi -амилаз в клетках ¿сс^^с^л #это относится к ot -амилазам из tf. «h^^V24/ и из g fz&l&z/Ю2/.Показано,что в обоих случаях ¿¿-амилаза является периплазматическим белком .в случае «-амилазы из ся^рЛя^ч. наблюдалась структурная нестабильность плазмид, и было показано,что экспрессия гена ухудшает рост клеток на средах,содержащих в качестве источника углерода мальтозу или глицерин /ИЗ/.Были отобраны мутанты j для которых не наблюдалось такого ухудшения роста.В случае oL -амилазы из плазмидной нестабильности и угнетения роста бактерий не было обнаружено /102/.

Палва и др./78/ клонировали ген ¿-амилазы из В.ал^с- , EI8 с целью конструирования секреторного вектора для ß. и изучения секреции чужеродных белков из клеток й. .Удовлетворительный результат применения такой системы для экспрессии чужеродного гена был получен только для гена другой термостабильной -амилазы - из б*.-^j/jiH^ViW^ /76/.Из личного сообщения К.Лунд-стрема,сделанного им во время конференции ФЕБО в Москве в 1984 г.известно,что при слиянии регуляторной области, включающей сигнальный пептид d -амилазы ~ со структурной частью гена oi -амилазы из уА^ ,в клетках G. наблюдался синтез и секреция oL -амилазы в.^с/^^^и достигающий 50% от синтеза сА -амилазы 6. .Таким образом,показано, что секреция этих белков в л^U-MXi^ происходит по одинаковым механизмам.

Энзиматические свойства с<-амилаз.

При кратком обсуждении свойств амилаз как ферментов, остановимся на следующих вопросах: а)классификация амилаз; б)величина ¿с** и для амилаз; в)аминокислоты, участвующие в катализе; г)механизм связывания фермента с полимерным субстратом и распределение продуктов реакции.

На Рис.8 изображена цепь крахмала.Звенья глюкозы, соединённые <>¿-1-4 связями,называются амилозой, звенья, соединённые связями 1-6, называются пектином. оС-амилазы-это ферменты,осуществляющие разрыв связи 1-4.

В связи с таким определением,можно представить себе несколько типов (/-амилаз.Во-первых,это ферменты, осуществляющие гликолитиче о кую атаку,т.е. разрезающие субстрат изнутри.Такие амилазы называются эндоамилазами. К ним,в частности, относятся амилазы вах^^^ и ^с^^рп^^ /50/.Среди эндо-амилаз можно выделить разжижающие и осахаривающие /82/.Эти два типа ¿¿-амилаз различаются размерами образуемых продуктов реакции - у ¿¿-амилаз разжижающего типа более полимерные продукты.Такое различие -амилаз по распределению размеров продуктов связано с различием в механизме связывания полимерного субстрата,что будет обсуждаться несколько ниже.

Существует другой тип амилаз-экзоамилазы,отщепляющие по одному звену мальтозы или глюкозы от субстрата. В последнем случае фермент носит название глюкоамилаза.

-амилазы относятся к ферментам с наиболее эффективным механизмом действия,например,панкреатическая

6СН2ОН

Рис. 8. Цепькрахмала.Полимер из мономеров глюкозы,связанных связью </-1-4,называется амилозой и является субстратом для оС-амилаз.Боковые цепи,связанные связью 1-6,называются пектином. и -амилаза свиньи имеет число оборотов около 1000 в секунду на молекулу фермента /50/.Аналогичными параметрами характеризуются ферменты из других источников /41/. Константы Михаэлиса бактериальных ¿.-амилаз имеют значения около 1-2 мг/мл.

При изучении механизма ферментативного действия о^-амилаз исследователя прежде всего интересуют два вопроса. Первый заключается в выяснении групп,непосредственно участвующих в катализе,а также в выяснении вопроса об участии аминокислотных остатков в связывании субстрата. Второй вопрос заключается в выяснении того,сколько глю-козных остатков субстрата и с какой интенсивность^ связаны с ферментом.

Анализ зависимости активности амилаз от рН,а также температурное изменение этих зависимостей свидетельствуют о том,что каталитическими группайпг.в Ы- -амилазах являются карбоксильный анион аспартата или глутамата,которые выступают в качестве акцептора протона,а также имидазоль-ная группа гиствдина,которая выступает в качестве донора протона /9/.Рентгеноструктурный анализ -амилазы из си^ъо^ылси^ подтверждает эту точку зрения и позволяет обнаружить на ферменте два сближенных остатка А^р и ШУ /58/.Были также выполнены работы по химической модификации возможных активных групп,которые подтвердили эту точку зрения /26,37,38/.Показано также,что остатки тирозина,входящие в активный центр,несут субстрат-свя-зывающую функцию/39/.

Вопрос о связывании ©с-амилаз с субстратом активно изучался двумя группами исследователей /11,46,51,66,

99-101/.При построении моделей авторы пользовались общим для ферментов,гццролизувдих полимерный субстрат, положением о наличии в них подцентров связывания субстрата, имеющщих определённую аффинность к мономерным субстратным единицам,которыми в случае амилозы являются звенья глюкозы.Используя несколько различающиеся в деталях модели, авторы проанализировали кинетику расщепления амилазами олигосахаридов.Анализ этой кинетики позволил им построить распределение энергий связывания глюкозных мономерных звеньев с подцентрами фермента.Такие распределения были получены для оС -амилазы из # сы^М-^-^ф^-сХл^о- /II,46,99,100/,а также из (^.с^ил^ /11,66/. Распределения,полученные авторами,в целом похожие,несколько различались в деталях,что связано с различием используемых моделей.К сожалению,выбрать,какая модель более отражает действительность^ настоящее время не представляется возможным,мы будем пользоваться распределением полученным Аллен и Тома /II/ (Рис.9).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сорокин, Алексей Васильевич

ВЫВОДЫ

1.Ген оС-амилазы А50 зонирован в клетках ж . Показано, что в активная оС -амилаза секретируется в периплазму.

2.Определена нуклеотидная последовательность фрагмента,содержащего клонированный ген ¿¿-амилазы. Показано,что в его промоторную область встроился

-элемент.Показано,что это встраивание ослабляет экспрессию гена с собственного промотора в клетках <51сг>-&.( .в структурной части гена обнаружено 8 нук-леотидных и 5 аминокислотных замен по сравнению с геном из штамма с^^Л^^ук.сМи^ ^18.

3.На основе первичной структуры белка теоретически предсказана вторичная структура о(. -амилазы. Обнаружена корреляция между количеством и расположением относительно активного центра коротких ^-структур в С-концевой области белка,с энергетическим распределением сайтов связывания белка с амилозой.

4.Получено четыре плазмиды рТ&д ,которые можно использовать в качестве секреторных векторов для <Г.

С помощью одной из этих плазмид,рТ(Зд278,получена экспрессия лейкоцитарного интерферона человека в £ .Показано,что секреция интерферона в ¡слетках отличается от секреции о!- -амилазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорокин, Алексей Васильевич, Москва

1.С.И. Алиханян,Л.М.Ермакова,Л.И.Ерохина.Получение мутантов вас. действием нитрозогуанидина и

2. К 191. Генетика,т.II,№5,1975,с.90-94.

3. Ю.И.Козлов,С.В.Машко,М.И.Лебедева,А.В.Сорокин,Б.А.Ребен-тиш,В.Г.Дебабов. Клонирование гена фибробластного интерферона человека в клетках ёлсАлл^Мас .Мол.генетика, микробиол. и вирусол. ,$7,1983,с.19-23.

4. М.А.Несмеянова. Молекулярные механизмы участия мембран в биосинтезе секретируемых белков и его регуляция у п!сЛ^ Л. % усп # совр . би0Лт. 94, )&2,1982, с. 225-242.

5. В.М.Попов.Эмпирические корреляции между аминокислотной последовательностью и пространственным строением белков. Мол.биол.,т.14, ЖЕ,1980,с.35-63.

6. Ю.В.Иомантас,Е.О.Добржанская,А.В.Сорокин,М.Ю.Фонштейн,

7. А.В.Трубников,А.Я.Стронгин,П.М.Рабинович,М.Л.Злочевский. Конструирование двурепликонной плазмиды,несущей ген ¿¿-амилазы .В кн. "Метаболические плазмиды",Таллин, 1982,с.108.

8. М.Я.Хайкинсон,П.М.Рабинович,А.И.Степанов.Модели трансформации плазмидной ДНК.Докл.Акад.наук СССР,т.265,$5,1982,с.1264-1267.

9. М.Я. Хайкинсон, П.М.Рабиновия, А.И. Степанов. Роль прямых И инвертированных повторов В трансформации Bacillus subtiiis плазмидной ДНК.Докл.Акад.наук СССР,т.265,М, 1982,с.975-978.9 .M.Abdullah and D.French.Arch.Biochem.Biophysv.137,1970,pp.433-493.

10. M.Achtman,P.A.Manning,C.Edolbluth,P.Herrlich.!3xport without proteolytic processing of inner and outer membrane proteins encoded by F sex factor tra cistrons in E.coli minicells.Proc.Wat.Acad.Sci.,USA, v.76,1979,pp.4837-4841.

11. J.D.Allen arid J.A.Thcma.Subsite mapping of Enzyines.Depolyinerase Computer Modelling. Biochem. J. ,v. 159,197S,pp. 105-131.

12. S.Benson and T.Silhavy.Information within the mature LamB protein necessary for localisation to the outer membrane of Escherichia coli K12.Cell,v.32,1983,pp.1325-1335.

13. G.Blobel and B.Dobberstein.Transfer of proteins across membranes.

14. G.Blobel.Intracellular protein topogenesis.Proc.Nat. Acad.Sci.,USA, v.77,1930,pp.1496-1500.

15. J.D.3oeke and P.Ifodel.A prokaryotic membrane anchor sequence : car-boxy 1 terminus of bacteriophage fl gene III protein retains it in the rnerabrane.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.79,1982,pp.5200-5204.

16. V.Broun.Covalent lipoprotein frcm the outer membrane of Escherichia coli.Biophys.Biochem.Acta.,v.415,1975,pp.335-377.

17. H.Bussey,O.Steimnets and D.Saville.Protein secretion in yeast: two chromosomal mutants that oversecrete killer toxin in S.cerevisiae. Curr.Genet.,v.7,1983,pp.449-456.

18. D.P.Ceretti,D.Dean,G.R.Davis,D.M.Bedwell,and M.Nomura.The spo ribo-somal protein operon of Escherichia coli: sequence and cotranscription of the ribosomal protein genes and a protein export gene.Wucl.Acids Res.,v.11,1983,pp.2599-2616.

19. C.N.Chang,G.Blobel,and P.Model.Detection of prokaryotic signal peptidase in Escherichia coli membrane fraction: endoproteolitic cleavage of nascent fl pre-coat protein.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.75, 1978,pp.361-365.

20. P.Y.Chou and G.D.Fasman.a)Conformational Parameters for Amino Acids in Helical, j?-Sheet,and Random Coil Regions Calculated from Proteins. b)Prediction of Protein Conformation.Biochemistry,v.13,1974,pp.211-245.

21. P.Cornells,C.Digneffe,and H.Willemot.Cloning and Expression of a Bacillus coagulans Amylase Gene in Escherichia coli.Mol.Gen.Genet.,v.136,1932,pp.507-511.

22. T.Date and W.Wickner. Isolation of the Escherichia coli leader peptidase gene and effects of leader peptidase overproduction in vivo. Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.73,1981,pp.6105-6110.

23. S.D.Detera and F.Friedberg.folecular weight of B.subtilis ¿¿-arnylase derived from chemical studies.Int.Journ.Pept.and Prot.Res.,v.14,1979, pp.354-372.

24. D.Dobberstein,G.Blobel and N.-K.Chua.In vitro synthesis and putative precursor for the small subunit of ribuloso-l,5-biphosphate carboxylase of Chlairr/domonas reinhardtii.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.74,1977, pp.1082-1085.

25. B.Dobberstein.Structure and function of components of the system of protein transfer accross endoplasmic reticullum mer±»rane.FEBS Meeting, Moscow, 1984.

26. S.D.Emr and P.J.Bassford,Jr. Localisation and processing of outer membrane and periplasmic proteins in E.coli strains harboring export-specific supressor mutations.Journ.Biol.Chera.,v.257,1982,pp.5352-5860.

27. S.D.S.'.tt,R.Shekman ,M.C.Flessel and J.Therner.An MF oU-SUC2 ( c4-factor-invertase) gene fusion for study of protein localisation and gene fusion in yeast.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.80,1933,pp.7030-7084.

28. S.D.2mr and T.J.Silhavy.Mutations effecting localization of an E.coli outer membrane protein,the bacteriophage ^ receptor.Journ.Mol.Biol., v.141,1981,pp.63-90.

29. S.D.Emr,M.H.Hall and T.J.Silhavy.A mechanism of protein localization: the signal hypothesis and bacteria.Journ.Cell.Biol.,v.86,1980,pp.701-11.

30. D.Enr,S.Hanley-Way,and T.J.Silhavy.Suppressor mutations that restore export of a protein with a defective signal sequence.Cell,v.23,1931, pp.79-88.

31. S.D.Emr and T.J.Silhavy.Inportance of secondary structure in the signal sequence for protein secretion.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.80,1983,pp.4599-4603.

32. J.Gamier,D.Osgatherpe,and B.Robson.Journ.Mol.Biol.,v.120,1973,pp.97-120.

33. M.3.Ingle and R. J.Erickson.Bacterial --ainylases.Adv.Appl.ilicrobiol., v. 24,1973,pp.257-278.

34. S.Iwasa,H.Aoshirtia,K.Hiroroi,and H.Hetano.Subsite affinities of Bacterial Liquefying ¿/-amylase Evaluated from the Rate Parameters of Linear Substrates.Journ.Biochem. ,v.75,1974,pp.969-978.

35. J.D.Jamieson and G.E.Palade.Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell.I.Role of peripheral elements of the Golgi complex.Journ.Cell.Biol.,v.34,1967,pp.577-5S7.

36. J.D.Jamieson and G.E.Palade.Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell.II.Transport to condensing vacuoles and zymogen granules.Journ.Cell Biol.,v.34,1967,pp.597-515.

37. L. Johnsmd.Mol.Gen.Genet.,v. 159,1979,op.213-218.

38. K.L.Kindle.Characteristics and Production of Thermostable cL-amylase. Appl.Biochem. and Biotechnol.,v.8,1983,pp. 153-170.

39. H.Kondo,H.Wa3catani,R.Ilatsmo,K.Hiroroi.Product distribution in amylase-catalyzed- hydrolysis of amylose.Comparison of experimental results with theoretical predictions.Journ.Biochem.,v.37,1930,pp.1053-1070.

40. D.Koshland and D.Botstein.Secretion of beta-lactamase requires the carboxy end of the protein.Cell,v.20,1980,pp.749-760.

41. J.A.Lepesant,F.Kunst,J.Lepesant-Kejzlarova,and R.Dedonder.Chromosomal location of mutations affecting sucrose metabolism in Bacillus subti-lis Marburg.Mol.Gen.Genet.,v.118,1972,pp.135-160.

42. L.Lehle,R.E.Cohen,and C.E.Bellow.Carbohydrate structure of yest inver-tase. Demonstration of a form with only core oligosaccharides and a form with completed chains.Journ.Biol.Chem.,v.254,1979,pp.12209-12213.

43. K.Lundstrom. Expression of" the vesicular stomatitus virus mernbrane glycoprotein in Bacillus subtilis.FEMS Microbiology Lett. ,v.23,1984,pp.65--71.

44. Y. Matsuura ,M. Kusunoki ,W.Date, S. Harada, S.Eando. Tanaka ,M.Kakudo. Low resolution crystal structures of Taka-amylase A and its complexes with inhibitors. J.Biochem., v. 36,1979,pp. 1773-1783.

45. P.S.F.Mezes,Wu Wang,B.C.H.Yeh,J.O.Larnpen.Construction of pen ^1, Bacillus licheniforrais 749/C j?-Lactamase Lacking Site for Lipoprotein .Modification.Journ.Biol.Chem., v. 258,1933,pp.11211-11218.

46. H.C.Neu and L.A.Heppel.The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during formation of spheroplasts.Journ.Biol. Chem.,v.240,1955,pp. 3685--3692.

47. J.B.K.Nielsen and J.0.Lampen.Glycerid-Cysteine Lipoproteins and Secretion by Gram-Positive Bacteria. Joum.Bacterid.,v. 152,1982,pp.315-322.

48. J.B.K.Nielsen,M.P.Canifield and J.O.Lampen.Lipoprotein nature of Bacillus licheniformis meribrane penicillinase.Proc.Nat.Acad.Sei.,USA, v. 78,1981,pp.3511-3515.

49. J.B.K.Nielsen and J.0.Larapen.I^fembrane-bound Penicillinases in Grampositive Bacteria.Journ.Biol.Chem.,v.257,1932,pp.4490--4495.

50. Y.Nitta,.■ lizüshiraa,K.Hiromi,and S.Qno.Journ.Biochem.,v.59,1971, pp.557-575.

51. P.Novick,anc R.Schekman.Secrition and cell-surface growth are blocked in a temperature-sensitive metant of S.cerevisiae.Proc.Nat.Acad.Sei., USA, v.75,1979,pp.1853-1362.

52. P.Novick,C.Field and R.Schekman.Identification of 23 complementation groups required for posttranslational evants in the yest secretory pathway.Cell,v.21,1930,pp.295-215.

53. H.0htsubo and N.Ohtsubo.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.75,1978,pp.615-619.

54. D.B.Oliver and J.Beckwith.Identification of a nevz gene (secA) and gene product involved in the secretion of envelope proteins in E. coli.Journ.Bacteriol.,v.150,1932,pp.686-691.

55. D.B.Oliver and J.Beckwith.Regulation of a membrane component required for protein secretion in coli.Cell.,v.30,1982,pp.311-319.

56. D.C.Oliver,C.Kumamoto,M.Quinlan,and J.3eckwith.Pleiotropic mutants affecting the secretory apparatus of Escherichia coli.Ann.iiicrobiol., v.133,1982,pp.105-110.

57. D.B.Oliver and J.Beckwith.Escherichia coli mutant pleiotropically defective in the export of secreted proteins.Cell,v.25,1981,pp.765-772.

58. S.A.Ortlepp,J.F.Ollington and D.J.McConnel.Molecular cloning in Bacillus subtilis of a Bacillus licheniformis gene encoding a thermostable alpha-amylase.Gene,v.23,1933,pp.267-276.

59. G.E.Palade.Intracellular aspects of the process of protein synthesis .Science,v.189,1975,pp.347-358.

60. Palva,.Sarvas,P.Lentovaara,M.Sibakov,and L.Kaariainen.Secretion E.coli j?-lactamase from B.subtilis by the aid of -amylase signal sequence.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.79,1982,pp.5582-5586.

61. I.Palva.Construction of a Bacillus subtilis secretion vector.Ph.D. Thesis,Univ.of Helsinki,1983.

62. Palva,P.Lehtovaara,L.Kaariainen, 11. Sibakov,K.Cantell,C.H.Schein, K.Kashiwagi and C.Weissman.Secretion of interferon by 3acillus subtilis .Gene,v.22,1983,pp.229-235.

63. D.Perlman and H.O.Halvorson.A Putative Signal Sequence in Eukaryotic and Prokaryotic Signal Peptides.Journ.Mol.Biol.,v.167,1983,pp.391-409.

64. F.Priest.Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacterid.Rev.,v.41,1977,pp.711-753.

65. C.M.Redman and D.D.Sabatini.Vectorial discharge of polypeptides released by puramycin from attached ribosomes.Proc.Nat.Acad.Sci., USA, v. 55,1965,pp.608-615.

66. J.Sekiguchi,N.Takeda,and H.Okada.Genes affecting -the productivity of c/ --anoylase in Bacillus subtilis Marburg. Journ.Bacteriol., v.121,1975,pp.638-694.

67. J.Shultz,T.J.Silhavy,M.L.Belgian,N.Fiil and S.D.Emr.A previously unidentified gene in the spc operon of Escherichia coli XI2 specified a component of the protein export machinery.Cell,v.31,1982, pp.227-235.

68. H.A.Shuman,T.J.Silhavy,and J.R.Beckwith.Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. Journ.Biol.Chen. ,v.255,1980,pp.158-174.

69. P.Siekevitz and G.E.Palade.A cytochemical study on the pancreas of guinea pig.V.In vivo incorporation of leucine-1- ~C into the chymo-trypsinogen of various cell fractions.Journ.Biol.Biochem.Cytol.,v.7, 1960,pp.619-631.

70. T.J.Silhavy,H.A.Shurnan,J.Beckwith and M.Schwartz.Use of gene fusions to study outer membrane protein localization in E.coli.Proc.Nat.Acad. Sci.,USA,v.74,1977,pp.5411-5415.

71. T.J.Silhavy,S.A.Benson,and S.D.Emr.,Mechanisms of Protein Localization. Microbiol. Rev. ,v.47,1983,pp.313-344.

72. Y.Tal:eichi,K.Obmura,A.Nakayama,K.Otozai,and K.Yamane.Cloning of Bacillus subtilis amylase gene in plasmid pUBllO.Agric.Biol.Chem., v.47,1983,pp.159-161.

73. K.Takkinen,R.F.Petterson,N.Kalkkinen, I. Palva,H. Soderland and L.Kaa-riainen.Amino Acid Sequence of (/-amylase from Bacillus amylo-liquefaciens Deduced from the Nucleotide Sequence of the Cloned Gene.Journ.3iol.Chem.,v.258,1983,pp.1007-1013.

74. K.Talmage,W.Gilbert.Construction of plasmid vectors with unique PstI cloning sites in a signal sequence coding region.Gene,v.12, 1980,pp.235-241.

75. K.Talmage,S.Stahl,and W.Gilbert.Eukaryotic signal sequence transports insulin antigene in Escherichia coli.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA, v.77,1980,pp.3369-3373.

76. K.Talmage,J.Kaufman,and W.Gilbert.Bacteria mature preproinsulin to proinsulin.Proc.Nat.cad.Sci.,USA,v.77,1980,pp.3988-3992.

77. J.A.Thama,C.3rothers,and J.Spradlin.Subsite Mapping of Enzymes.Studies on Bacillus subtilis Amylase.Biochemistry,v.9,1970,pp.1768-1775.

78. J.A.Thoma,G.V.K.Rao,C.Brothers,J.Spradlin,and L.H.Li. Subsite Mapping of Enzymes.Correlation of Product Patterns with Michaelis Parameters and Substrate-induced Strain.Journ.Biol.Chern., v.246,1971,pp.5621-5635.

79. E.M.Torgerson,L.C.Brevier,J.A.Thoma.A substrate mapping of enzymes. Use of subsite map to simulate complete time course of hydrolysis of a polymeric substrate.Arch.Biochem.and Biophys.,v.196,1979, pp.13-22.

80. N.Tsiicagoshi,H.Ihara,H.Yamagata,and S.Udaka. Thermophilic oL -Amylase gene from Bacillus stearothermophilus in Escherichia coli. Mol.Gen.Genet.,v.193,1934,pp.58-63.

81. G.Von Heijne.Patterns of Amino Acids near Signal-Sequence cleavage Sites.Eur.Journ.Biochem.,v.133,1983,pp.17-21.

82. P.Walter and G.Blobel.Purification of a membrane-associated protein complex required for protein translocation across -the endoplasmic reticullum.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.77,1980,pp.7112-7116.

83. P.Walter and G.3lobel.7S small cytoplasmic RNA is an integral component of the signal recognition particle.Nature,v.299,1982,pp.691-693.

84. M.E.E.Watson.Compilation of published signal sequences.Nucl.Acids Res.,v.12,1934,pp.5145-5164.

85. C.P.Watts,P.Silver,and W.Wickner.Membrane assembly from purified components.2.Assembly of M13 procOat into liposomes reconstituted with purified leader peptidase.Cell,v.25,1981,pp.347-353.

86. G. M. WeinstockapPhys ,M. L. Berman, B. Kairraar, D. Jackson ,T. J. Silhavy, J.Weisemann,and M.Zweig.Open reading frame expression vectors:

87. A general method for antigen production in Escherichia coli using protein fusions to J>-galactosidase.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.80, 1983,pp.4432-4436.

88. W. »vickner. Asymmetric orientation of phage M13 coat protein in Escherichia coli cytoplasmic membranes and in synthetic lipid vesicles. Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,v.73,1976,pp.1159-1163.

89. W.Wickner.Assembly of proteins into biological membranes:membrane trigger hypothesis.Ann.Rev.Biochem.,v.43,1979,pp.23-45.

90. W.Wickner.Assembly of proteins into membranes.Science,v.210,1980, pp.861-863.

91. K.Willemot and P.Cornells.Growth defects of Escherichia coli cells which contain the gene of an <?C -amylase frcm Bacillus coagulans on a multicopy plasmid.Journ.Gen.Microbiol.,v.129,1933,pp.311-319.

92. P.B.Wolfe,P.Silver,and W.Wickner.The isolation of homogeneous leader peptidase from a strain of 2.coli wich overproduce the enzyme. Journ.Biol.Chern.,v.257,1982,pp.7898-7902.

93. P.B.Wolfe,W.Wickner,J.M.Goodman.Sequence of the leader peptidase gene of E.coli and the orientation of leader peptidase in the bacterial envelope.Journ.Biol.Chem.,v.258,1983,pp.12073-12080.

94. M.Yang,A.Gelissi,and D.Henner.Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis.Nucl.Acids Res.v.11,1983,pp.237-249.

95. Y.Yoneda,I\.Yamane,and £.Maruo.Membrane mutation related to the production of extracellular -amylase and protease in Bacillus subtilis.Biochem.Biophys.Res.Carm.,v.50,1973,pp.765-770.

96. C.Zwizinski,T.ûate,and W.Wickner.Leader peptidase is found in both the inner and outer membranes of E.coli.Journ.Biol.Chem., v. 256,1981,pp.3593-3597.

97. C.Zwizinski,and W.Wickner.Purification and characterization of leader (signal) peptidase from E.coli.Journ.Biol.Chem.,v.255, 1980,pp.7973-7977.