Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и характеристика новых генов нейропептидов виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Потеряев, Дмитрий Александрович

Список сокращений

Введение 7 Обзор литературы

1. Структурные особенности молекул - предшественников нейропептилов

2. Процессинг полипротеинов

3. Совместное хранение и секреция пептидных котрансмиттеров

4. Сортировка нейропептилов в зависимости от типа клеток. Механизмы, регулирующие пептидный состав в больших электронплотных везикулаях

5. 1)-аминокислоты в пептидах животных д.

5.1 Краткая история вопроса

5.2 Встречаемость и разнообразие

5.3 Биосинтез пептидов, содержащих Б-аминокислоты

5.4 Значение Б-аминокислот

7. Роль нейропептидов в половом поведении моллюсков

8. Семейство педального пептида

Материалы и методы

1. Материалы

2. Выделение суммарной РНК из органов улитки

3. Радиоактивнок мечение ДНК-зонда с помощью случайной затравки

4. Полимеразная цепная реакция

5. Получение неамплифицированных (полноразмерных) библиотек кДНК ЦНС виноградной улитки

6. «Спасение» рекомбинантной плазмиды из бактериофага А2АРII

7. Выделение плазмидной ДНК

8. Приготовление делеционных мутантов клонов кДНК для секвенирования

9. Приготовление компетентных клеток Е. coli и их трансформация рекомбинантными плазмидами

10. Опрелеление нуклеотидной последовательности кДНК

11. Синтез меченых дигоксигенином РНК-зондов

12. In situ гибридизация с целыми ЦНС виноградной улитки

13. Оптическая регистрация активности идентифицированных нейронов

14. Экспрессия рекомбинантного белка HCS

15. Выделение белка с His-tag с помощью Ni2+ агарозы

16. Препаративное выделение белка с His-tag на№2+ хелатной колонке Hi-Trap с помощью FPLC

17. Детекция изменения электрофоретической подвижности HCS2 при связывании Са2+

Результаты и их обсуждение Клонирование генов нейропептидов, обладающих регион-специфичной экспрессией в

ЦНС виноградной улитки 61 Часть I. GFAD, структура и функция

1. Структура белка, кодируемого геном preproGFAD

2. Экспрессия гена preproGFAD

3. Физиологические эффекты D-GFAD и L-GFAD

4. Природные пептиды, содержащие D-аминокислоты

5. Клеточные основы сексуального поведения виноградных улиток и GFAD

6. Поведенческие эффекты GFAD

7. Иерархия поведений у виноградной улитки

8. Нейрофизиологические эффекты GFAD

9. Сосуществование GFAD и других нейропептидов и биоаминов 77 Часть II. Педальный пептид, его предшественник и экспрессия

1. Клонирование кДНК педального пептида

2. Структура белка-предшественника педального пептида Helix

3. Экспрессия гена НРер во взрослых животных

4. Экспрессия гена НРер в онтогенезе

5. Экспрессия гена НРер в периферической нервной системе

6. Экспрессия гена НРер после стрессовых воздействий

7. Связь организации предшественника Pep с его возможной функцией

8. Pep как вероятный ко-трансмиттер

9. Pep возможно играет определенную роль в развитии и пластичности нервной системы

Часть III. HCS2 как уникальный гибридный белок

1. Физиологические действие пептидов кодируемых геном HCS

2. Значение и функциональность EF-hand домена белка HCS

3. Экспрессия рекомбинантного белка HCS2 и проверка способности его EF-hand домена связывать Са

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и характеристика новых генов нейропептидов виноградной улитки"

Интерес к роли пептидов в нервной системе пробудился более 20 лет назад, когда Guillemi, Schally и их коллеги впервые идентифицировали пептидэргическую природу гормонов гипоталамуса (гормон высвобождения лютеинизирующего гормона, гормон высвобождения тиротропина, соматостатин) ( Guillemi, 1978, Schally et al., 1973). За их открытиями вскоре последовали другие: устаовление последовательности субстанции Р (Chang et al., 1971) и ее роль как проводника боли. В дальнейшем, после выделения двух эндогенных опиоидных пептидов, являющихся лигандами морфиновых рецепторов (Hughes et al., 1975), метионин- и лейцин-энкефалина, стало очевидным, что пептиды представляют собой новый класс химических трансмиттеров, а изучение этого класса может привести к появлению новых подходов к проблеме боли. Кроме того, было обнаружено, что пептиды участвуют и в других функциях нервной системы и высшей нервной деятельности, включая сознание. Например, вазопрессин влияет на научение и память (De Wied, 1971). Нейропептиды заставили по новому взглянуть на биохимическое разнообразие нейронов. В частности, открытие сосуществования в одном нейроне пептида (соматостатина) и классического низкомолекулярного медиатора (норадреналина) (Hokferlt et al., 1977) вызвало новые важные вопросы о синаптической передаче: могут ли нейроны использовать более чем один трансмиттер? Если так, действительно ли нейроны выполняют какие-то другие функции в нервной системе, кроме быстрой передачи сигналов? Ответы на эти и другие вопросы позволяли надеяться, что исследования пептидов могут многое добавить к нашему пониманию функционирования мозга.

Наши знания о распределении нейропептидов, их сосуществовании и их биологической активности постоянно увеличивались в течение последних двух десятилетий. Разработка новых антагонистов пептидов позволила анализировать физиологическую роль нейропептидов. Вдобавок к их вспомогательной роли в синаптической и несинаптической передаче, появлялось все больше данных об их трофическом действии. Концепция котрансмиссии получила дальнейшее определение после установления того, что химическая трансмиссия (или передача сигнала) дополнительно настраивается путем высвобождения быстрого трансмиттера и пептида в частотно-зависимой манере. Таким образом, пептиды редко высвобождаются в базальных условиях, но их выброс происходит только при высокочастотной активации или залповой активности нейронов. В отдельных случаях, нейропептиды играют свою роль, когда нейроны повреждены или испытывают другие условия сильного стресса. На самом деле, они могут даже синтезироваться в таких условиях, проявляя высокую степень пластичности.

Прогресс в понимании биологического значения неропептидов был достигнут не только в исследованиях млекопитяющих. На самом деле, многие беспозвоночные оказываются даже более удобными моделями в определенных аспектах клеточной и молекулярной нейробиологии и, в частности, в изучении структуры и действия нейропептидов.

Нервная система виноградной улитки Helix lucorum является полезной моделью для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе свойств и функционирования отдельных нейронов и небольших нейронных групп. ЦНС Helix содержит относительно небольшое количество нейронов и обладает структурной простотой, вследствии этого она была детально изучена и картирована (Балабан и Захаров, 1992). Были исследованы определенные нейронные популяции и отдельные гигантские нейроны, играющие роль в различных поведенческих актах животного, таких как пищевое, половое и оборонительное поведение. Наши итсследования были сфокусированы следующих вопросах:

• Какие гены (возможно секретируемых субстанций, таких как нейропептиды) экспрессируются преимущественно в функционально различных нейронах?

• Какова роль продуктов этих генов в выполнении физиологических функций нейронов, их экспрессирующих?

• Каким образом структура зрелого продукта а также его предшественника находит отражение в его функции?

В той или иной степени настоящая диссертация дает ответы на эти вопросы.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Потеряев, Дмитрий Александрович

Заключение и выводы

Суммируя описанную здесь работу, приведем основные выводы:

1. Клонирована кДНК предшественника нейропептида GFAD виноградной улитки и определена картина распределения мРНК npenpoGFAD в ЦНС этого животного. Показана высокая степень экспрессии данного гена в нейронах, контролирующих половое поведение улитки.

2. Согласно литературным данным, нейропептид GFAD существует в виде двух стереизомеров, L- и D-GFAD, различающихся конфигурацией фенилаланинового остатка. Нами показано, что нейропептид D-GFAD имеет кардиоактивный эффект и активизирует мужские половые органы при условии сохранения их иннервации ЦНС; кроме того, он подавляет активность нейронов, ответственных за конкурирующие формы поведения, в частности, пищевое.

3. Сделан вывод, что ген npenpoGFAD кодирует предшественник нейропептида, участвующего в контроле мужского полового поведения.

4. Клонирована кДНК гена предшественника нейропептида Pep и предсказано существование двух форм Pep у виноградной улитки; методом гибридизации in situ изучено распределение соответствующей мРНК в ЦНС улитки.

5. Предположено, что чрезвычайно высокий уровень биосинтеза Pep в ЦНС объясняется многокопийной организацией белка-предшественника Pep, а экспрессия Pep в функционально различных группах нейронов свидетельствует о существовании множественных функций данного пептида.

6. Проведена начальная характеризация продуктов гена HCS2, экспрессирующегося в командных нейронах оборонительного поведения. Показано, что физиологический эффект трех синтетических пептидов, соответствующим предсказанным зрелым продуктам гена HCS2, сходен с действием командных нейронов на регулируемые ими мотонейроны закрытия пневмостома.

7. Экспрессирован и выделен рекомбинантный белок HCS2. Показано, что EF-hand домен HCS2 обладает кальций-связывающей способностью.

8. Предположено, что ген HCS2 кодирует гибридный белок-предшественник, продукты процессинга которого являются нейротрансмиттерами или нейромодуляторами оборонительного поведения улитки, и, в добавление к этому, могут участвовать в регулируемом кальцием переносе сигналов или в кальциевом гомеостазе в командных нейронах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Потеряев, Дмитрий Александрович, Москва

1. Балабан ПМ и Захаров ИС (1992) Обучение и развитие: общая основа двух явлений. Наука, Москва.

2. Adamo SA, Chase R (1991) The interactions of courtship, feeding, and locomotion in the behavioral hierarchy of the snail Helix aspersa. Behav Neural Biol 55: 1-18.

3. Alkon DL, Nelson TJ, Zhao W, Cavallaro S (1998) Time domains of neuronal Ca2+signaling and associative memory: steps through a calexcitin, ryanodine receptor, K+ channel cascade. Trends Neurosci 21):529-37

4. Amiche M, Sagan S, Мог A, Delfour A, Nicolas P (1989) Dermenkephalin (Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp-NH2): a potent and folly specific agonist for the 8-opioid receptor. Mol Pharmac 35: 774-779.

5. Amiche M, Sagan S, Мог A, Pelaprat D, Rostene W, Delfour A, Nicolas P (1990)

6. Characterization and visualization of 3H. dermorphin binding to ц- opioid receptors in the rat brain. Eur JBiochem 189: 625-635.

7. Barker JL, Gainer H (1974) Peptide regulation of bursting pacemaker activity in a molluscan neurosecretory cells. Science 184: 1371-1372.

8. Barra D, Mignogna G, Simmaco M, Pucci P, Severini C, Falconieri-Erspamer G, Negri L, Erspamer V (1994) D-Leu2.deltorphin, a 17 amino acid opioid peptide from the skin of the Brazilian hylid frog, Phyllomedusa burmeisteri. Peptides 15:199-202.

9. Benjamin PR, Burke JF (1994) Alternative mRNA splicing of the FMRFamide gene and its role in neuropeptidergic signalling in a defined neural network. Bioessays 16(5):335-42

10. Benjannet S, Rondeau N, Day R, Chretien M, Seidah NO (1991) PCI and PC2 are proprotein convertases capable of cleaving proopiomela-nocortin at distinct pairs of basic residues. Proc Natl Acad Sci USA 88:3564-3568.

11. Bevins CL, Zasloff M (1990) Peptides from frog skin. Annu Rev Biochem 59: 395-414.

12. Bogdanov YuD, Balaban PM, Zakharov IS, Poteryaev DA, and Belyavsky AV (1996)1.entification of two novel genes specifically expressed in the D-group neurons of the terrestrial snail CNS. Invert. Neurosci. 2: 61-69.

13. Bogdanov YuD, Balaban PM, Poteryaev DA, Zakharov IS, and Belyavsky AV (1998) Putative neuropeptides and an EF-hand motif region are encoded by a novel gene expressed in the four giant interneurons of the terrestrial snail. Neuroscience 85: 637647.

14. Brezina V, Bank B, Cropper EC, Rosen S, Vilim FS, Kupfermann I, Weiss KR (1995) Nine members of the myomodulin family of peptide co-transmitters at the B16-ARC neuromuscular junction otAplysia. JNeurophysiol 74:54-72.

15. Broccardo M, Erspamer V, Falconieri Erspamer G, Improta G, Linari G, Melchiorri P,

16. Montecucchi PC (1981) Pharmacological data on dermorphins, a new class of potent opioid peptides from amphibian skin. Br J Pharmacol 73:625-31

17. Buchman GW, Banerjee S, Hansen JN (1988) Structure, expression, and evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein antibiotic. J Biol Chem 263:16260-6

18. Buck, L. В., Bigelow, J.M., and Axel, R. (1987) Alternative splicing inindividual Aplysia neurons generates neuropeptide diversity. Cell 51: 127133.

19. Chase R (1986) Brain cells that command sexual behavior in the snail Helix aspersa. J Neurobiol 17: 669-679.

20. Chisholm RL, Rushforth AM, Pollenz RS, Kuczmarski ER, Tafori SR (1988) Dictyostelium discoideum myosin: isolation and characterization of cDNAs encoding the essential light chain. Mol Cell Biol 8:794-801.

21. Chiu, A.Y., and Strumwasser, F. (1981) An immunohistochemical study of neuropeptidergic bag cells in Aplysia. JNeurosci 1: 812-826.

22. Comb, M., Seeburg, P.H., Adelman, J., Eiden, L. (1982) Primary structure of the human Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295: 663-666.

23. Cooke NE, Coit D, Weiner RI, Baxter JD, Martial JA (1980) Structure of cloned DNA complementary to rat prolactin messenger RNA. J Biol Chem 255: 6502-10

24. Cropper EC, Lloyd PE, Reed W, Tenenbaum R, Kupfermann I, Weiss KR (1987a) Multiple neuropeptides in cholinergic motor neurons of Aplysia: evidence for modulation intrinsic to the motor circuit. Proc Natl Acad Sci USA 84:3486-3490.

25. Cropper EC, Tenenbaum R, Kolks MAG, Kupfermann I, Weiss KR (1987b) Myomodulin: a bioactive neuropeptide present in an identified cholinergic buccal motor neuron of Aptysia. Proc Nati Acad Sci USA 84:5483-5486.

26. De Castro E, Nef S, Fiumelli H, Lenz SE, Kawamura S, Nef P (1995) Regulation ofrhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors. Biochem Biophys Res Commun 216:133-40

27. Eipper, BA, Staffers, DA, and Mains, RE (1992) The biosynthesis of neuropeptides: peptide a-amidation. Ann Rev of Neurosci 15: 57-85

28. Erspamer V, Melchiorri P, Falconieri Espramer G, Montecucchi PC, de Castiglione R (1985) Phyllomedusa skin: a huge factory and store-house of a variety of active peptides. Peptides 6, Suppl 3: 7-12.

29. Fisher JM, Sossin W, Newcomb R, Scheller RH (1988) Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell 54:813-822.

30. Fricker, L.D., and Snyder, S.H. (1983) Purification and characterization of enkephalinconvertase, an enkephalin synthesizing carboxypeptidase E. J Biol Chem 258: 1095010955.

31. Fujisawa Y, Ikeda T, Nomoto K, Yasuda-Kamatani Y, Minakata H, Kenny PTM, Kubota I, Muneoka Y (1992) The FMRFamide-related decapeptide of Mytilus contains a D-amino acid residue. Comp Biochem Physiol (C) 102: 91-95.

32. Fuller, R.S., Sterne, R.E., and Thorner, J. (1988) Enzymes required for yeast prohormone processing. Ann Rev Physiology 50: 345-362.

33. Gerlai R, Marks A, and Roder J (1994) T-maze spontaneous alternation rate is decreased in SI00 beta transgenic mice. Behav Neurosci 108: 100-106.

34. Gluschankof P, Morel A, Gomez S, Nicolas P, Fahy C, Cohen P (1984) Enzymes processing somatostatin precursors: an Arg-Lys esteropeptidase from the rat brain cortex converting somatostatin-28 into somatostatin-14. Proc Natl Acad Sci USA 81: 66626.

35. Gubler, U., Seeburg, P., Hoffman,B.J., Cage, L.P., and Udenfriend, S. (1982) Molecular cloning establishes proenkephalin as precursor of enkephalin-containing peptides. -Nature 295: 206-208.

36. Hall JD , Lloyd PE (1990) Involvement of pedal peptide in locomotion in Aplysia: modulation of foot muscle contraction. JNeurobiol 21: 858-868.

37. Hall JD , Lloyd PE (1991) Release of pedal peptide from Aplysia neurones in primary culture. JNeurobiol 22: 583-589.

38. HashimotoS,FumagalliG, Zanini A, MeldolesiJ (1987) Sorting of three secretory proteins to distinct secretory granules in acidophilic cells of cow anterior pituitary. J Cell Biol 105:1579-1586.

39. Heck SD, Siok CJ, Krapcho KJ, Kelbaugh PR, Thadeio PF, Welch MJ, Williams RD, Ganong AH, Kelly ME, Lanzetti A J, et al (1994) Functional consequences of posttranslational isomerization of Ser46 in a calcium channel toxin. Science 266: 1065-8.

40. Heck SD, Faraci WS, Kelbaugh PR, Saccomano NA, Thadeio PF, Volkmann RA (1996) Posttranslational amino acid epimerization: enzyme-catalyzed isomerization of amino acid residues in peptide chains. Proc Natl Acad Sci U SA 93: 4036-9.

41. Hokfelt T (1991) Neuropeptides in perspective: the last ten years. Neuron 7: 867-879.

42. Huang XF, Arvan P (1995) Intracellular transport of proinsulin in pancreatic B-cells:structural maturation probed by disulfide accessibility. J Biol Chem 270:20417-20423.

43. Hudson, P., Haley, J., Crank, M., Shine, J., and Niall, H. (1981) Molecular cloning and characterization of cDNA sequence coding for rat relaxin. Nature 291:127-131.

44. Huttner, W.B. (1988) Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Ann Rev Physiology 50: 363-376.

45. Jack R, Bierbaum G, Heidrich C, Sahl HG (1995) The genetics of lantibiotic biosynthesis. Bioessays 17: 793-802.

46. Jimenez EC, Olivera BM, Gray WR, Cruz LJ (1996) Contryphan is a D-tryptophan-containing Conus peptide. J Biol Chem 271: 28002-5.

47. Jonas EA, Knox RJ, Smith TC, Wayne NL, Connor JA, Kaczmarek LK (1997) Regulation by insulin of a unique neuronal Ca2+ pool and of neuropeptide secretion. Nature 385: 343-6.

48. Jornvall, H., Carlquist, M., Kwauk, S., Otte, S.C., Mcintosh, C.H.S., Brown, J.C., and Mutt, V. (1981) Amino acid sequence and heterogenity of gastric inhibitory polypeptide (GIP). FEBSLetters 123: 205-210.

49. Josefsson E, O'Connell D, Foster TJ, Durussel I, Cox JA (1998) The binding of calcium to the B-repeat segment of SdrD, a cell surface protein of Staphylococcus aureus. J Biol Chem 273: 31145-52.

50. Julius, D., Blake, A., Blair, L, Kunisawa, R., and Thorner, J. (1984) Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-a-factor. Cell 37: 1075-1089.

51. Jung, L.J., and Scheller, R.H. (1991) Peptide processing and targeting in the neuronal secretory pathway. Science 251: 1330-1335.

52. Kakidani, H., Fararani, Y., Takahshi, H., Noda, M., Marimoto, Y., Hirose, T., Asai, M., Inayame, S., Nakanishi, S., andNuma, S. (1982) Cloning and sequence analysis of porcine neoendorphin/dynorphin precursor. Nature, 298: 245-249.

53. Kamatani Y, Minakata H, Iwashita T, Nomoto K, In Y, Doi M, Ishida T (1990) Molecular conformation of achatin-I, an endogenous neuropeptide containing D-amino acid residue. X-ray crystal structure of its neutral form. FEBS Lett 276: 95-7.

54. Katz B and Miledi R (1965) The effect of calcium on acetylcholine release from motor nerve terminals. Proc R Soc Lond. 161: 496-503.

55. Kellett E, Saunders SE, Li KW, Staddon JW, Benjamin PR, Burke JF (1994) Genomic organization of the FMRFamide gene in Lymnaea: multiple exons encoding novel neuropeptides. JNeurosci 14: 6564-70

56. Kim KH, Takeuchi H, Kamatani Y, Minakata H, Nomoto K (1991) Structure-activity relationship studies on the endogenous neuroactive tetrapeptide achatin-I on giant neurones of Achatina fulica Ferussac. Life Sci 48: 91-96.

57. Kirchmair R, Egger C, Gee P, Hogue-Angeletti R, Fischer-Colbrie R, Laslop A, Winkler H (1992) Differential subcellular distribution of PCI, PC2 and furin in bovine adrenal medulla and secretion of PCI and PC2 from this tissue. Neurosci Lett 143:143-145.

58. Kobayashi M, Takamatsu K, Fujishiro M, Saitoh S, Noguchi T (1994) Molecular cloning of a novel calcium-binding protein structurally related to hippocalcin from human brain and chromosomal mapping of its gene. Biochim Biophys Acta 1222: 515-8

59. Korner J, Chun J, O'Bryan L, Axel R (1992) Prohormone processing in Xenopus oocytes: characterization of cleavage signals and cleavage enzymes. Proc Natl Acad Sci USA 88(24): 11393-7.

60. Kreil G (1994) Peptides containing a D-amino acid from frogs and molluscs. J Biol Chem 269: 10967-10970.

61. Kreil G, Barra D, Simmaco M, Espramer V, Melchiorri P, Negri L, Severini C, Corsi R (1989) Deltorphin, a novel amphibian skin peptide with high selectivity and affinity for 5-opioid receptors. Eur J Pharmacol 162: 123-128.

62. Kreiner T, Sossin W, Scheller RH (1986) Localization of Aplysia neurosecretory peptides to multiple populations of dense core vesicles. J Cell Biol 102: 769-782.

63. KW, Smit AB, Geraerts WP (1992) Structural and functional characterization ofneuropeptides involved in the control of male mating behavior of Lymnaea stagnalis. Peptides 13: 633-638.

64. Madsen P and Celis J (1996) S100A7. In Guidebook to the Calcium-Binding Proteins (eds Celio MR, Puis TL, Schwaller B) pp 145-146. Oxford University Press, Oxford.

65. Mahon, A.C., Nambu, J.R., Taussig, R., Malladi, S., Roach, A., and Scheller, R.H. (1985) Structure and expression of the egg-laying hormone family in Aplysia. JNeurosci 5: 707-719.

66. Maurer P (1996) SPARC. In Guidebook to the Calcium-Binding Proteins (eds Celio MR, Puis TL, Schwaller B) pp 169-172. Oxford University Press, Oxford.

67. McAllister, L.B., Scheller, R.H., Kandel, E.R., and Axel, R. (1983) In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science 222: 800-808.

68. Michalak M (1996) Calreticulin. In Guidebook to the Calcium-Binding Proteins (eds Celio MR, Puis TL, Schwaller B) pp 220-220. Oxford University Press, Oxford.

69. Mignogna G, Simmaco M, Kreil G, Barra D (1993) Antibacterial and haemolytic peptides containing D-alloisoleucine fromthe skin of Bombina variegata. EMBOJ 12:4829-32.

70. Miller MW, Beushausen S, Cropper EC, Eisinger K, Stamm S, Vilim FS, Vitek A, Zajc J (1993) The buccalin-related neuropeptides: isolation and characterization of an Aplysia clone encoding a family of peptide cotransmitters cDNA. JNeurosci 13: 3346-57

71. Montecucchi PC, de Castiglione R, Erspamer V (1981) Identification of dermorphin and Hyp6-dermorphin in skin extracts of the Brazilian frog Phyllomedusa rhodei. Int J Pept Protein Res 17: 316-21.

72. Moore, H.-P., Walker, M.D., Lee, F., and Kelly, R. (1983) Expressing a human proinsulin cDNA in a mouse ACTH-secreting cell: intracellular storage, proteolytic processing, and secretion on stimulation. Cell 35: 531-538.

73. Mor A, Amiche M, Nicolas P (1992) Enter a new post-translational modification: D-amino acids in gene encoded peptides. Trends Biochem Sci 17: 481-485.

74. Mor A, Pradelles P, Delfour A, Montagne JJ, Quintero FL, Conrath M, Nicolas P (1990) Evidence for Pro-dermorphin processing products in rat tissues. Biochem Biophys Res Commun 170(l):30-8.

75. Mor A, Delfour A, Nicolas P (1991) Identification of a D-alanine-containing polypeptide precursor for the peptide opioid, dermorphin. J Biol Chem 266: 6264-6270.

76. Nagle, G.T., vanHeumen,W.R., Knock, S.L., Garcia, A.T., McCullough, D.A., Kurosky, A. (1993) Occurrence of a furin-like prohormone processing enzyme in Aplysia neuroendocrine bag cells. Comp.Biochem.Physiol (B) 105: 345-348.

77. Nakanishi, S., Inoue, A., Kita, T., Nakamura, M., Chang, A.C., Cohen, S.N., andNuma, S. (1979) Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-B-lipotropin precursor. Nature 278: 423-427.

78. Nambu, J.R., and Scheller, R.H. (1986) Egg-laying hormone genes of Aplysia : evolution of the ELH gene family. JNeurosci 6: 2026-2036.

79. Nawa, H., Hirose, T., Takashima, H., Inayama, S., and Nakanishi, S. (1983) Nucleotide sequences of cloned cDNAs for two types of bovine brain substance P precursors. -Nature 306: 32-36.

80. Negri L, Melchiorri P, Erspamer GF, Erspamer V (1981) Radioimmunoassay ofdermorphin-like peptides in mammalian and non-mammalian tissues. Peptides 2 Suppl 2:45-9.

81. Newcomb R, Scheller RH (1987) Proteolytic processing of the Aplysia egg-laying hormone and R3-14 neuropeptide precursors. JNeurosci 7: 854-63

82. Newcomb R, Fisher JM, Scheller RH (1988) Processing of the egg-laying hormone (ELH) precursor in the bag cell neurons of Aplysia. J Biol Chem 263: 12514-21

83. Noda, M., Furutani, Y., Takahashi, H., Toyosato, M., Hirose, T., Inayama, S., Nakanishi, S., and Numa, S. (1982) Cloning and sequence analysis of cDNA for bovine adrenal preproenkephalin. Nature 295: 202-206.

84. Pearson WL, Lloyd PE (1989a) Immunocytological localization of pedal peptide in the central nervous system and periphery of Aplysia. JNeurosci 9: 318-325.

85. Pearson WL, Lloyd PE (1989b) Actions of pedal peptide on neuron L5 in Aplysia. Soc Neurosci Abstr 15: 736.

86. Pearson WL, Lloyd PE (1990) Distribution and characterization of pedal peptide immunoreactivity in Aplysia. JNeurobiol 21: 883-892.

87. Pedrocchi M, Schafer BW, Durussel I, Cox JA, Heizmann CW (1994) Purification andcharacterization of the recombinant human calcium-binding SI 00 proteins CAPL and CACY. Biochemistry 33: 6732-8.

88. Persechini A, Moncrief ND, Kretsinger RH (1989) The EF-hand family of calcium-modulated proteins. Trends Neurosci 11: 462-7

89. Petersen O (1996) Can Ca2+ be released from secretory granules or synaptic vesicles? Trends Neurosci 19: 411-413.

90. Poteryaev DA, Zakharov IS, Balaban PM, Uvarov PN, Belyavsky AV (1997)

91. Characterization of a cDNA clone encoding pedal peptide in the terrestrial snail. NeuroReport 8: 3631-3635.

92. Poteryaev DA, Zakharov IS, Balaban PM, and Belyavsky AV (1998) A novel neuropeptide precursor gene is expressed in the terrestrial snail CNS by a group of neurons that control mating behavior. J. Neurobiol. 35: 183-197.

93. Quimet, T., Mammarbachi, A., Cloutier, T., Seidah, N.G., Castellucci, V.F. (1993) cDNA structure and in situ localization of the Aplysia californica prohormone convertase PC2. FEBS Letters 330: 343-346.

94. Richter K, Egger R, Kreil G (1987) D-Alanine in the frog skin peptide dermorphin is derived from L-alanine in the precursor. Science 238: 200-202.

95. Smit, A.B., Vreugdenhil, E., Ebberink, R.H.M., Geraerts, W.P.M., Klootwijk, J., and Joosse, J. (1988) Growth-controlling molluscan neurons produce the precursor of an insulin-related peptide. Nature 331: 535-538.

96. Sossin W, Sweet-Cordero A, Scheller RH (1990a) Dale's hypothesis revisited: differentneuropeptides derived from a common prohormone are targeted to different processes. Proc Natl Acad Sci USA 87: 4845-4848.

97. Sossin WS, Fisher JM, Scheller RH (1990b) Sorting within the regulated secretory pathway occurs in the trans-Golgi network. J Cell Biol 110:1-12.

98. Soyez D, Van Неф F, Rossier J, Le Caer J-P, Tensen CP, Lafont R (1994) Evidence for a conformational polymorphism of invertebrate neurohormones. J Biol Chem 269: 18295-18298.

99. Steiner DF (1991) Prohormone convertases revealed at last. Curr Biol 6:375-377.

100. Stindl A, Keller U (1994) Epimerization of the D-valine portion in the biosynthesis of actinomycinD.Biochemistry 33: 9358-64

101. Takamatsu K, Kobayashi M, Saitoh S, Fujishiro M, Noguchi T (1994) Molecular cloning of human hippocalcin cDNA and chromosomal mapping of its gene. Biochem Biophys Res Commun 200: 606-11

102. Tanner ME, Gallo KA, Knowles JR (1993) Isotope effects and the identification of catalytic residues in the reaction catalyzed by glutamate racemase. Biochemistry 32: 3998-4006.

103. Taussig, R., and Scheller, R.H.(1986) The Aplysia FMRFamide gene encodes sequences related to mammalian brain peptides. DNA 5: 453-461.

104. Teramoto T, Kuwada M, Niidome T, Sawada K, Nishizawa Y, Katayama К (1993) A novel peptide from funnel web spider venom, omega-Aga-TK, selectively blocks, P-type calcium channels. Biochem Biophys Res Commun 196: 134-40.

105. Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G., and Fils, N.P. (1986) Secretion and processing of insulin precursors in yeast. Proc Natl Acad Sci USA 83: 6766-6770.

106. Thomas, G., Herbert, E., and Hruby, D.E. (1986) Expression and cell-type specificprocessing of human proenkephalin with a vaccinia recombinant. Science 232: 16411643.

107. Thomas, G., Thorne, B.A., and Hruby, D.E. (1988a) Gene transfer techniques to study neuropeptide processing. Annual Revue of Physiology 50: 323-332.

108. Thomas, G., Thorne, B.A., Thomas, L., Allen, R.G., Hruby, D.E., Fuller, R., and Thorner, J. (1988b) Yeast KEX2 endopeptidase correctly cleaves a neuroendocrine prohormone in mammalian cells. Science 241: 226-230.

109. Tooyama I, Abe H, Renda T, Erspamer V, Kimura H (1993) d-Ala2.deltorphin I-likeimmunoreactivity in the adult rat brain: immunohistochemical localization. Proc Natl Acad Sci USA 90: 9635-9.

110. Tooze SA, Chanat E, Tooze J, Huttner WB (1993) Secretory granule formation. In:

111. Mechanisms of intracellular trafficking and processing of proproteins (Peng Loh Y, ed), pp 157-178. Boca Raton, FL; CRC.

112. Tooze, J., and Tooze, S.A. (1986) Clathrin-coated vesicular transport of secretory proteins during the formation of ACTH-containing secretory granules of AtT20 cells. J Cell Biol 103: 839-850.

113. Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R, Tischer, E., Rutter, W.J., and Goodman, H.M. (1977) Rat insulin genes : constructions of plasmids containing the coding sequences. -Science 196: 1313-1319.

114. Van Golen FA, Li KW, Chen S, Jimenez CR, Geraerts WP (1996) Various forms ofmyomodulin identified from the male copulatory organ of Lymnaea show overlapping yet distinct modulatory effect on the penis muscle. JNeurochem 66: 321-329.

115. Van Golen FA, Li KW, De Lange RPJ, Van Kesteren RE, Van der Schors RC, Geraerts WP (1995) Co-localized neuropeptides conopressin and Ala-Pro-Gly-Trp-NH2 have antagonistic effects on the vas deferens of Lymnaea. Neuroscience 69: 1275-1287.

116. Vilim FS, Cropper EC, Rosen SC, Tenenbaum R, Kupfermann I, Weiss KR (1996)

117. Structure, localization and action of buccalin b: a bioactive peptide from Aplysia. Peptides 15: 959-969.von Heijne, G. (1986) A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucl Acid Res 14: 4683-4690.

118. Я хочу поблагодарить д.б.н. Игоря Захарова, как коллегу и соавтора, выполнившего основную часть нейрофизиологической работы для наших статей. Его идея о биологической роли ОБАБ явилась главной составляющей и основным мотивом этого проекта.

119. Мои искренние благодарности сотрудникам Лаборатории клеточных основ поведения ИВНД и НФ РАН: к.б.н. Виктору Иерусалимскому, к.б.н. Наталье Браваренко, к.б.н. Ольге Максимовой, Алексею Малышеву за создание уникальной атмосферы дружелюбия и партнерства.