Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки

Гринкевич, Лариса Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки"

РГб од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 2 4 ИЮП 2000

Институт Физиологии им.И.П.Павлова

Па правах рукописи

ГРИНКЕВИЧ

Лариса Пнколаевпа

Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки

Специальность: 03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат

диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2000

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (лаборатория регуляции функций нейронов мозга)

Научный консультант : д.м.н., профессор М.О. Самойлов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биол. наук, профессор Б. И. КЛЕМЕНТЬЕВ Доктор биол. наук, профессор Н. Г. ЛОПАТИНА Доктор мед. наук В.П. НИКИТИН

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт биолог ии развития РАН, Москва.

Защита состоится " /" " 2000 г., в 13 часов на заседании

Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 002.36.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова , 6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Автореферат разослан " Ii " _2000г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биол. наук Н.М.Вавилова

ЕЬкЧЛЪЪ, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ Проблема молекулярио-генетических механизмов обучения и памяти одна из важнейших в современной нейробиологни. Многообразие ингегративных процессов, участвующих в обучении, значительно усложняют исследования, проводимые в этой области. Экспериментальных работ, показывающих вовлечение конкретных генов п процесс обучения, сравнительно немного. Широкий круг исследований как на моллюсках и дрозофиле, так и на позвоночных развернулся вокруг, так называемых, «немедленных ранних генов», играющих значительную роль в запуске диффсренцировки и пролиферации. В ряде работ показано усиление экспрессии «ранних генов» при обучении (Анохин, 1997; Kaang et al., 1993; Alberini et al., 1994; Kaczmarek, Chandhuri, 1997), а также необходимость их экспрессии для формирования долговременных следов памяти (Demincr et al., 1993; Bourtchuladze et al., 1994; Yin et al., 1994).

Экспрессия "ранних генов" находится под контролем предсуществующих белковых транскрипционных факторов, активируемых экстраклеточными сигналами через системы различных протеинкиназ (Frank, Grenbcrg, 1994). Белковые же продукты "ранних генов" сами образуют транскрипционные факторы, способные регулировать экспрессию эффекторных генов, непосредственно определяющих механизмы пластичности (Curran, 1988; Armstrong, Montmini, 1993). Процессы регуляции экспрессии функционально важных генов пластичности достаточно сложны и многокаскадны, часто включают в себя взаимодействие нескольких внутриклеточных сигнальных путей. Вторичные мессенджеры, опосредующие действия экстраклеточных сигналов через системы соответствующих протеинкиназ, могут оказывать значительное влияние на экспрессию 'транскрипционных факторов и их ДНК-связывающие и активирующие свойства (Karin, Smeal, 1992; Armstrong, Montminy, 1993; Mellstrom et al., 1993; Kormhauser, Greenberg, 1997). Таким образом, фанскрипционные факторы способны интегрировать информацию, приходящую от мембраны к ядру и, соответственно, запускать экспрессию функционально важных генов, поэтому их часто относят к третичным мессенджерам.

Известно, что экспраклеточные стимулы, активируя соответствующие системы вторичных посредников, могут регулировать экспрессию генов - мишеней в ядре (Armstrong, Monlminy, J993; Bacskai et al., 1993; Karin, Hunter, 1995; Kaczmarek, Chandhuri, 1997; Самойлов, 1999). Усиление сигнала может быть достигнуто активацией альтернативных сигнальных систем через фосфорилирование транскрипционных факторов, взаимодействующих с иными регуляторными сайтами.

В настоящее время разворачивается широкий фронт работ в данной области. Однако многокомпанентность регуляториой системы экспрессии генов значительно усложняет проведение исследований. Многие аспекты работы "ранних генов" еще не выяснены. Это касается как функциональных последствий их активации (регуляции активности "поздних генов"), гак и механизмов регуляции их собственной экспрессии. Неясно, в частности, на каком этапе происходит конвергенция условных и безусловных стимулов. Она может осуществляться как в примембранной области, на уровне систем вторичных посредников, так и в ядре, на уровне регуляции экспрессии генов, благодаря множественности сайтов регуляции и интегрирующим возможностям транскрипционных факторов, активирующие свойства которых могут контролироваться несколькими протеинки-назами. Основные сведения в этой области получены в экспериментах на клеточных культурах и в немногочисленных исследованиях, выполненных in vivo. Таким образом, изучение механизмов регуляции экспрессии генов, активирующихся при обучении, направлено на решение актуальных задач современной нейробиологии.

Одним из наиболее удобных объектов для изучения молекулярных механизмов обучения и памяти являются моллюски. Способность этих животных к формированию условных рефлексов, наличие гигантских функционально значимых нейронов, возможность их идентификации,.жизнестойкость ЦНС в условиях in vitro позволяет изучать на этом объекте нейрональные сети, определяющие формирование условных рефлексов, а также имитировать простые формы обучения. Благодаря изучению нейронных механизмов пластичности у Aplysia, Hemiissenda, Helix получены основные сведения, касающиеся молекулярно- клеточных и генетических механизмов обучения и памяти (Соколов, 1981; Балабан, Захаров, 1992; Никитин, Судаков, 1997; Montarolo, et al., 1986; Greenberg et al., 1987;

Nelson, Alkon., 1988; Abrams et al„ 1991; Bacskai et al, 1993; Alberini clal., 1994).

В качестве объекта исследования нами выбран моллюск -виноградная улитка (Helix). Благодаря работам Коштоянца Х.С., Соколова Е.Н., Сахарова Д.А., Косткжа П.Г и созданным им научным школам, виноградная улитка стала излюбленным объектом отечественных "клеточных" физиологов. У этих животных описано несколько видов условных оборонительных рефлексов. Идентифицированы сенсорные, командные, модуляторные и моторные нейроны, включенные в формирование данных рефлексов. Описаны пластические перестройки нейрональных сетей при обучении (Соколов, 1981; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992). Однако молекулярные процессы, происходящие в ЦНС Helix при обучении, остаются еще мало изученными. Особенно это касается механизмов транедукции экстраклеточных сигналов от мембраны к ядру и молекулярных субстратов, определяющих конвергенцию условных и безусловных стимулов.

В связи с этим представлялось необходимым проведение поэтапного комплексного исследования, включающего изучение участия различных белков нервных клеток в формировании долговременных форм пластичности, а также внутриклеточных механизмов сигнальной транедукции, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов, вовлекаемых в процессы обучения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целыо настоящего исследования явилось изучение молекулярпо-генетических механизмов формирования ассоциативных и неассоциативных форм обучения виноградной улитки. Основные задачи исследования:

1. Провести анализ характера вовлечения белков ЦНС и командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки в формирование условных оборонительных рефлексов.

2. Сравнить вклад ключевых внутриклеточных регуляторных систем в формирование долговременных форм пластичности виноградной улитки на клеточном уровне.

3. Изучить вклад цАМФ- регулируемых транскрипционных факторов CRE, С/ЕВР и АР-1 -семейств в формирование ассоциативных и неассоциативных форм обучения у Helix.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые методами макро- и микроэлектрофореза проведены комплексные исследования белковых спектров клеток ЦНС и отдельных идентифицированных нейронов виноградной улитки и показано участие кислых мозгоспецифиче-ских белков в формировании условных.оборонительных рефлексов у этих животных. Наиболее длительные изменения содержания кислых нейроспецифических белков зарегистрированы в командных нейронах оборонительного поведения ЛПаЗ, вовлеченых в выработку данного рефлекса. Установлено, что формирование условного оборонительного рефлекса пищевого избегания сопровождается активацией G-белков и цАМФ- зависимых протеинкиназ (ПКА).

Впервые проведено определение ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов семейств CRE, С/ЕВР и API, играющих значительную роль в онтогенезе, пролиферации и формировании долговременных следов памяти. Показано наличие этих факторов в ЦНС Helix и их значительная активация при обучении и моделировании обучения в условиях интактной ЦНС. Установлено, что цАМФ-нндуцируемая активация транскрипционных факторов С/ЕВР и АР-1 в ЦНС Helix потенциируется кальциевой регуляторнои системой, что может лежать в основе механизмов конвергенции условных и безусловных стимулов при обучении Helix. Показано, что в этом процессе принимают участие митогенактивнруемые и Са/кальмодулин- зависимые протеишеина-зы.

Установлен ранее неизвестный факт наличия в клетках ЦНС Helix транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов через SRE-элемент (serum response element), играющих важную роль в интеграции митогенактивируемых и Са/фосфолипид (ПКС)-завнсимых регуляторпых каскадов.

В онтогенетических исследованиях по изучению ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов в ЦНС виноградной улитки впервые обнаружена корреляция задержки развития механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов Helix с незрелостью ностсинаптических механизмов передачи экстраклеточного сигнала серотонина, а также с нарушением формирования транскрипционных факторов семейства АР-1, играющих значительную роль в регуляции экспрессии «поздних генов» нейрональиой пластичности.

Выдвинута гипотеза о том, что нарушение формирования транскрипционных факторов АР-1, регулирующих экспрессию генов, кодирующих белки пластичности, может быть причиной неспособности ювенильных животных к формированию долговременных форм условных оборонительных рефлексов.

НАУЧНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Теоретическое значение полученных результатов состоит в углублении и расширении представлений о молекулярно-клеточных основах пластических перестроек в нервной системе, происходящих при формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения, и о роли генома в регуляции данных процессов.

Знания об онтогенетических аспектах формирования механизмов обучения и значении транскрипционных факторов С/ЕВР, АР-1, и 8ЯЕ семейств в механизмах пластичности могут быть использованы для разработки способов генной терапии врожденных нарушений деятельности ЦНС и повышения адаптивных возможностей мозга.

Развиваемые в работе теоретические представления о роли транскрипционных факторов в механизмах конвергенции стимулов различной модальности, вовлекаемых в обучение, могут найти практическую реализацию в учебных процессах медицинских и биологических высших учебных заведений.

Сконструированная автором геномная библиотека виноградной улитки может быть использована для секвенирования как транскрибируемых, так и регуляторных участков генов, что особенно важно для расширения работ, связанных с изучением роли транскрипционных факторов в механизмах обучения и памяти.

Предложенный комплексный методический подход может быть применен в различных областях научных исследований, связанных с изучением регуляции экспрессии генов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы неоднократно докладывались на всесоюзных и международных симпозиумах, конференциях, съездах физиологического общества:

г.

машинописного текста, содержит Л"2 рисунков и // таблиц. Список литературы включает¿^¿источников.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Эксперименты выполнены на виноградных улитках Helix pomatia и Helix lucorum. Ювенильные улитки выращены в лабораторных условиях. В опытах исследовано свыше 1200 животных. Использованы поведенческие, биохимические, микрохимические, молекулярно-генетнческие и генно-инженерные методы исследований.

Поведенческие методы.

В качестве моделей обучения использовали выработку условных оборонительных рефлексов у виноградной улитки (Максимова, Балабан, 1983). 1.) Условный рефлекс пищевой аверзии (условный стимул - морковь, безусловный стимул-электрошоковое воздействие электрическим током 10 мА, 0,5 с), интервал между сочетаниями 10-15 минут. Критерием выработки рефлекса являлся отказ от пищи или оборонительбная реакция на ее предъявление. Для формирования стойкого рефлекса обычно требуется около 10 сочетанных стимулов. 2.) Условный оборонительный рефлекс закрытия дыхательного отверстия (условный стимул - постукивание но раковине, безусловный стимул - дувок воздуха в дыхательное отверстие), интервал между сочетаниями 3-5 минут (улитки получали 15 пар стимулов в день). Рефлекс вырабатывается после получения улитками 150-180 сочетанных стимулов. Постукивание и вдувание воздуха дозировалось и подавалось автоматически.

Биохимические методы.

Для изучения белковых спектров ЦНС Helix применяли метод диск-электрофореза в 7,5-9,5% полиакриламидном геле (система Орнстейна-Дэвиса) и метод изоэлектрофокусирования в ультратонких слоях нолиакриламидных гелей. Для анализа белковых фракций отдельных идентифицированных нейронов использовали эту же электрофоретическую систему, адаптированную к микрохимическим исследованиям. Электрофорез вели в 7,5% ПАА -геле в капиллярах диаметром 300 мкм ( объем 4,5

mkji). Сканирование проводили на 2-х волновом микроспектрофотометре (НИОХ СО РАН).

Активность протеинкиназ определяли по переносу (32)Р с [ гамма <32)Р] АТФ на гистон III по методу Корбина и Реймана (Corbin, Reimann, 1971). Ингибитор Г1КА выделяли по методу Гнлмана (Gilman, 1970). Содержание белка в пробах определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976)

Молекулярно-гечетинеские методы.

Для анализа экспрессии «ранних генов» применяли метод блот-гибридизационного анализа, для которого суммарную РНК из ЦНС или отдельных нейронов выделяли фенол-хлороформным или гуанадин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом. РНК подвергали электрофорезу в 1,2% формальдегид-агарозном геле. Перенос РНК на нейлоновые фильтры (Hybond-N, Amersham) и блот-гибридизацию проводили по (Lentola et al, 1991). В качестве гибридизациопного зонда использовали Pstl-PstI фрагмент v-fos (ЮООЬр), меченный [альфа- (32)Р] dNTP. Специфическая радиоактивность пробы 5х108 срт/мкг.

Для изучения активности транскрипционных факторов применялся метод задержки в геле - «gel shift assay». Метод основан на том, что при взаимодействии белковых транскрипционных факторов с радиоактивно меченными ДНК-зондами, содержащими последовательности нуклеотидов, связывающих данный фактор, подвижность комплекса в электрофорезе уменьшается по сравнению с подвижностью зонда, а интенсивность полосы пропорциональна количеству активных транскрипционных факторов. В качестве зондов использовали олигонуклеотиды, соответствующие обеим цепям известных сайтов связывания API гена коллагеназы (Collagenase - TRE:

AGCTTGATGAGTCAGCCGGATC), CRE-гена соматостатина ( SOM-CRE: CAgTGTCTCT GACGTCAGCCAAGGAGAGAG, ACTGC, AGTCG, СТТСС, TTGAC), С/ЕВР-связывшощую последовательность Aplysia -(BS2 С/ЕВР):

gatccggcACTATTGGGCAATCtcaagcta, С/ЕВРр-связывающая

последовательность c-fos промотора (ERE):

gatcCÀTATTAAGGACATGCCG, SRE последовательность c-fos MbiuiHxagt ACAGGATGTCC AT ATT AG G AC ATCTG CGT семейств

транскрипционных факторов, которые были синтезированы Кобзевым В.Ф. на автоматическом синтезаторе САМ-102 И ( Биоссет, Новосибирск). После отжига нуклсотиды мстили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии {32-Р} АТР.

Реакционная смесь содержала 10 мкл буфера для экстракции, 3 пГ меченного олигонуклеотнда; 20 мкг белка экстракта, преинкубированного с 2 мкг ДНК тимуса теленка в течение 10 мин. при 0°С. После инкубации при 20° С в течение 10 мин. смесь подвергали электрофорезу в 5% НАЛ геле. После чего гель фиксировали, сушили и закладывали в кассету с рентгеновской пленкой сроком на 7 дней для получения автографа.

Генно-инжененерные методы.

Для создания геномной библиотеки виноградной улитки в векторе EMBL-ЗЛ ДНК выделяли методом, рекомендованным в работах (Prushard, Cuttler, 1976; Blin, Stafford, 1976). Молекулярное клонирование осуществляли согласно Маниатису (Маниагис и др., 1984).

Данные экспериментов обрабатывались статистически. Вероятности сравнивали с помощью t критерия Сподента, точного метода Фишера, углового фи-преобразования или критерия хи-квадрат (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

' МЕТАБОЛИЗМ БЕЛКОВ В ЦНС HELIX ПРИ ОБУЧЕНИИ. При анализе выработки условного оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия у Helix методом диск - электрофореза в полиакриламидном геле было обнаружено 2 класса белков, содержание которых значительно увеличивается при обучении в ЦНС Helix. Белки с подвижностью Rf 0,58, количество которых резко увеличивается на ранних стадиях обучения (15-60 соч.) в водорастворимой фракции ЦНС, и белки, движущиеся вблизи анодного фронта, увеличение содержания которых регистрируется у обученных животных в командных нейронах оборонительного поведения, преимущественино ЛПаЗ, принимающих участие в формировании данного рефлекса. В процессе обучения также

наблюдается сложная картина негативной и позитивной регуляции синтеза отдельных фракций белков. На ранних стадиях обучения и в фазу консолидации наблюдается значительное увеличение синтеза белков наиболее кислой зоны. Резкое же увеличение количества белка Rf 0,58 на 200-300% происходит без увеличения его синтеза. По-видимому, наблюдается освобождение белка RiU.58 из связанного состояния и его транслокация в цитозоль. К 120 сочетаниям количество белка RiD.58 снижается к норме. Сходная динамика изменения содержания этого белка наблюдается также при псевдообусловливании и пробуждении животного из гибернации и, как показано в работе О. Г. Сафроновой, при выработке сенситизации (Сафронова, 1987).

Этот процесс был имитирован с использованием серотопина (5-НТ), медиатора, играющего значительную роль в организации оборонительных форм пластичности у моллюсков. Было показано, что инкубация подглоточного комплекса ЦНС Helix в физиологическом растворе, содержащим 10"4 М 5-НТ, в течении одного часа вызывает резкое увеличение белка Rf 0,58 в водорастворимой фракции спустя 1-2 ч после отмывания серотопина. Сигнальное действие серотопина, по-видимому, передается через систему ГТФ-связывающих (Gs) белков, так как инкубирование ЦНС в растворе, содержащем активатор Gs -белков фторид натрия, вызывает значительное увеличение белка Rf 0,58 в водорастворимой фракции, сравнимое с обучением и инкубацией с серотонином. На факт участия G-белков в формировании пластичности оборонительного поведения указывают также полученные нами данные по усилению СТФ-азной активности у

Таким образом, начальные стадии формирования условного оборонительного рефлекса у Helix являются серотонин -индуцибильными. Активация серотонином внутриклеточной цени регуляции происходит через систему G-бслков, что сопровождается транслокацией белка RiO,58 в цитозоль. Подтверждением важной роли белка Rf 0,58 являются наши эксперименты по исследованию белковых спектров ЦНС ювенильных улиток, неспособных к формированию сенситизации и долговременных форм условных оборонительных рефлексов (Балабан, Захаров, 1992). У этих улиток электрофоретическими методами анализа не обнаруживается даже

следовых количеств белка Rf 0,58. Белок не появляется также при инкубации с серотонином и фторидом натрия, тогда как у взрослых животных количество этого белка достигает 3% разделяемых электрофорезом белков, увеличиваясь до 9-12% при обучении и инкубации с серотонином и фторидом нагрия.

Данные эксперименты показали, что у ювенильных улиток наряду с недостаточной зрелостью системы серотонинэргичсских нейронов незрелым является также постсинаптическое звено. Введение в инкубационную систему экзогенного серогонина не вызывает появления белка Rf 0,58. у ювенильных животных в отличие от взрослых.

Таким образом, формирование пластичности оборонительного поведения Helix сопровождается длительным изменением белкового метаболизма. Процесс запускается серотонином и опосредуется системой СГФ-связывающих белков. Известно, что Gs -белки могут запускать каскад регуляторпых реакций как цАМФ-зависимых, так и опосредуемых протеинкиназой С (ПКС). Более того, и ПКА, и ПКС - могут принимать участие в регуляции механизмов пластичности. Поэтому следующей нашей задачей являлся анализ степени участия этих киназ в механизмах формирования условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.

УЧАСТИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ РЕГУЛЯТОРПЫХ СИСТЕМ В МЕХАНИЗМАХ ПЛАСТИЧНОСТИ ОБОРОНИТЕЛЬНОГО РЕФЛЕКСА У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ. В этой серии экспериментов у улиток вырабатывали рефлекс пищевого избегания. Условный стимул -морковь, безусловный - удар током 1=10мА. Стойкий рефлекс образуется после получения животными 10-15 сочетанных стимулов с интервалом 15 мин. После 4-х сочетаний появляются первые ответы на условный стимул, а также наблюдается увеличение белка Rf 0,58. Ганглии извлекали спустя 1 ч после получения улитками 4-х сочеташплх стимулов. Об активности протеинкиназ судили по переносу 32Р с (32Р) АТФ на гистон Ш.

При исследовании мембранной и цитозольной фракций ЦНС Helix обнаружили увеличение активности ПКА как в мембранной, так и в цитозольной фракциях. Также наблюдалось появление

протеинкиназной активности в ядре. При разделении мембранных и цитозольных экстрактов методом ДЭАЭ-хромато графин было показано, что активность ПКА регистрируется как и у позвоночных животных в 2-х пиках, получивших название ПКА1 и ПКА2. В питозольной фракции активность П К А1 значительно больше, чем активность ПКА2. В мембранной фракции отмечается противоположная картина. При обучении наблюдается увеличение активности как ПКА1, так и ПКА2. Причем наблюдаемый нами эффект обучения на протеинкиназную активность в очищенной питозольной фракции был существенно выше, чем в неочищенной.

Известно, что активность Г1КА у позвоночных животных может регулироваться не только цАМФ, по и термостабильным белковым ингибитором (ТБИ). Поэтому мы предположили, что в процессе очистки ПКА на ДЭАЭ целлюлозе отделяется ингибитор, присутствующий в неочищенном гомогенате. Однако фактора, аналогичного ТБИ позвоночных животных, нам обнаружить не удалось.

Что же касается ПКС, то мы нашими методами анализа не обнаружили увеличения ее активности спустя 20 мин и 1 ч после обучения ни в питозольной, ни в мембранной, ни в ядерной фракциях. Также не было зарегистрировано увеличения активности ПКС и при разделении гомогенатов на ДЭАЭ целлюлозе. Кроме того, активность ПКС в ЦНС Helix была существенно ниже, чем активность ПКА.

Данные о существенных изменениях в белковом синтезе, активации G-белка и Г1КА в процессе обучения создали предпосылки для дальнейшего изучения нами экспрессии генов, принимающих участие в длительных пластических перестройках ЦНС Helix.

Извест но, что значительную роль в регуляции экспрессии генов играют ДНК-связывающие транскрипционные факторы, активация которых может осуществляться через различные протеинкиназные системы, опосредующие действия экстраклеточных стимулов. Тем самым транскрипционные факторы могут интегрировать действия условных и безусловных стимулов и запускать экспрессию функционально важных генов, связанных с обучением.

УЧАСТИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ОБУЧЕНИИ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ. Известно, что регуляция цАМФ-завнсимых «ранних» генов осуществляется через CRE сайты путем активации (фосфорилирование Г1КА) транскрипционных факторов семейства CRE. С другой стороны, продукты цАМФ-зависимых «ранних» генов сами могут образовывать транскрипционные'факторы, регулирующие экспрессию «поздних» генов, белки, продукты которых необходимы для формирования долговременных форм пластичности. Поэтому основное внимание в нашей работе было уделено изучению формирования транскрипционных факторов семейств CRE, сайты связывания для которых имеются в регуляторных участках таких «ранних» генов как c-fos и c/ebp, факторов AIM (димеры белков ранних генов семейств Fos, Jun), а также цАМФ-регулируемых факторов С/ЕВР.

Эксперименты по определению ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов в ЦНС виноградных улиток при обучении и моделировании обучения в системе in vitro проведены на нескольких сотнях животных. Сделано 48 электрофорезов, в которых проанализировано 570 экстрактов кластеров нейронов ЦНС, содержащих транскрипционные факторы, связавшиеся с соответствующими олигонуклеотидами.

Методом "gel shift assay" нами было показано, что в ЦНС Helix lucorum, как и у многих других видов животных, присутствуют транскрипционные факторы CRE, С/ЕВР и АР-1 семейств.

Определение ДНК-связывающей активности транкрипционных факторов семейств CRE н С/ЕВР в ЦНС Helix при формировании у улитки условного оборонительного рефлекса пищевого избегания, позволило обнаружить вовлечение этих факторов в процесс обучения. Результаты gel shift анализа показали увеличение ДНК-связывающей активности транкрипционных факторов семейства CR£ в ЦНС обученных животных спустя 15 мин после окончания обучения по сравнению с псевдообученными животными, а также с необучавшимися улитками. Спустя 3 ч после обучения уровень активности этих факторов снижается к уровню интактных животных. Спустя 15 мин и 1ч после окончания обучения наблюдается также значительная активация транскрипционных факторов семейства С/ЕВР по сравнению с псевдообученными животными, а также с необучавшимися улитками. Активность этих

факторов остается еще значительно высокой спустя 3 ч после окончания обучения.

Известно, что значительную роль в формировании ассоциативных и неассоциативных форм пластичности у моллюсков играет серотонин. Нами проведена серия экспериментов по выявлению влияния серотонина на активацию транскрипционных факторов семейства С/ЕВР, а также исследована возможность модуляции этой активности через другие сигнальные системы, возможно опосредующие действия стимулов других модальностей, включаемых в механизмы обучения.

ЦНС Ilelix инкубировали 1,5 ч в физрастворе, содержащем серотонин (5-НТ, 10'4 М). На цЛМФ-зависимый пугь действовали активатором аденнлатциклазы форсколином (5х 1(Г5М). Индукцию 1ЖС вызывали форболовым эфиром (ТРЛ, 80нМ). Для повышения внутриклеточной концентрации Са2+ использовали Са2+- ионофор (Л23187, 5 мкМ). Спустя 1 ч после инкубации экстрагировали транскрипционные факторы и осуществляли gel shift анализ.

Проведенные эксперименты показали, что как воздействие серотонина, так и форсколина вызывает увеличение ДНК-связывающей активности транкршщиоиных факторов семейства С/ЕВР. В то время как ни активатор ПКС форболовый эфир, ни повышение внутриклеточного Са2+ существенного влияния на формирование факторов С/ЕВР не оказывали. При воздействии на ЦНС форболовым эфиром наблюдается даже уменьшение ДНК-связывающей способности факторов С/ЕВР по отношению к контролю.

Для изучения возможного модулирующего влияния системы ПКС на цАМФ-зависимый регуляторный путь за 30 мин до внесения 5-НТ в физраствор добавляли форболовый эфир (ТРА 80нМ). Спустя 1,5 ч ганглии переносили на 1 ч в физраствор, после чего использовали для выделения транкрипционных факторов. Показано, что форболовый эфир потенциирует активацию факторов С/ЕВР, вызываемую действием серотонина. Таким образом, существует принципиальная возможность усиления цАМФ-зависимой регуляции экспрессии генов через систему ПКС. Однако, из-за незначительности эффекта мало вероятно, чтобы эта модуляция являлась функционально значимой.

Значительно больший эффект на формирование транскрипционных факторов С/ЕВР оказывает кальциевая регуляторная система. Повышение внутриклеточной концентрации Ca24 на фоне предъявления активатора аденилатциклазы форсколина вызывает значительное повышение образования транскрипционных факторов семейства С/ЕВР но сравнению с воздействием одного форсколина.

ФОРМИРОВАНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ АР-1 И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ИХ АКТИВНОСТИ ПРИ ОБУЧЕНИИ HELIX. Транскрипционные факторы семейства АР-1 это ДНК- связывающие и активирующие факторы, узнающие последовательность для связывания TGAC/ GTCA (Montmini, Belezikjiam, 1987; Angel, Karin, 1991). Членами этого комплекса являются белки семейства Fos: c-Fos, Fos В, Fra 1, Fra 2; Jun: c-Jun, JunD, в состав комплекса могут входить также белки ATF.

Гены, кодирующие c-Fos, содержат в своем промоторном участке несколько регулярных сайтов для связывания транскрипционных факторов, в частности, сайт CRE, активируемый семейством CREB-белков, сайт SRE , который может регулироваться транскрипционными факторами SRF и ELK-1, а также сайты, регулируемые цАМФ- зависимыми белками семейства С/ЕВР. В качестве зондов для связывания транскрипционных факторов АР-1 применяли олигонуклеотиды, соответствующие последовательности АР-1 из гена коллагеназы (Jonat et al., 1990).

Используя метод "gel shift" мы показали, что в ЦНС виноградной улитки содержатся транскрипционные факторы семейства АР-1. Определение ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов АР-1 семейств в ЦНС Helix при формировании у улитки условного оборонительного рефлекса пищевого избегания показало участие факторов семейства АР-1 в процессе обучения. Результаты gel shift анализа показали увеличение ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов семейства АР-1 (особенно зона 2) у обученных животных спустя 1-3,5 ч после окончания обучения по сравнению с псевдообученными животными, а также с необучавшимися улитками.

Так как для образования активных транскрипционных комплексов необходимо не только наличие транскрипционных факторов, но и их фосфорнлиропание, полученные нами данные говорят о том, что при обучении происходит не только активация экспрессии генов, входящих в семейство АР-1, но и осуществляется фосфорнли-рованис транскрипционных факторов, вызываемое активацией соответствующих протсникиназ.

Учитывая, что основными белками, составляющими транскрипционный комплекс АР-1, связывающийся с последовательностью гена коллагеназы, являются c-Fos и c-Jun, мы осуществили анализ экспрессии этих генов в ЦНС Helix.

ЭКСПРЕССИЯ РАННИХ ГЕНОВ В ЦНС HELIX ПРИ ОБУЧЕНИИ. Экспрессию генов c-fos, c-j'un изучали методом блот-гибридизации. У улиток вырабатывали рефлекс избегания пищи. Эксперименты по определению экспрессии ранних генов в ЦНС виноградных улиток проведены на 8 ннтактных и 12 обученных животных.

Обнаружено резкое увеличение экспрессии гена c-fos у обученных улиток но сравнению с контрольными. Сканирование и количесгвення обработка полученных денситограмм показала, что различие между контролем и обучением достоверно при р<0,01 по t-кригерию Сттодента (рис.).

С целыо выяснения сходства механизмов экспрессии гена c-fos у виноградной улитки и позвоночных животных были проведены до-ШЧШИТедьные иссггепппяння. Известно что мощным ичиуппппи ■игг-

прессии гена с-Го 8 в ЦНС у позвоночных животных является коразол [Анохин, 1997]. Нами было обнаружено, что коразол вызывает значительную активацию гена с-Гоэ и в ЦНС виноградной улитки. Так же как и у позвоночных, происходит негативная регуляция экспрессии этих генов их собственными белковыми продуктами. Так, при инкубации ЦНС в растворе, содержащем циклогексемид (блокатор белкового синтеза), наблюдается супериндукция экспрессии гена с-Кк.

Анализ экспрессии гена с-К« в отдельных идентифицированных нейронах показал, что данный геи экспресснруется во всех изучаемых клетках. При этом наблюдается неодинаковое влияние процедуры обучения на экспрессию гена с-йи в различных нейронах. Так, в ней-

ронах оборонительного поведения (сумма нейронов ЛПа2, ЛПаЗ, ППа2, ППаЗ, ЛПл1, ППл !) наблюдается увеличение экспрессии c-fos, тогда как в нейронах, не включенных в дугу этого рефлекса (сумма нейронов ППа5, Г1Па1, ППа9), экспрессия уменьшается, а в нейронах пула D уровень экспрессии при обучении сравним с интактными улитками.

Количество мРНК гена c-jun в ЦНС улитки находилось на пределе разрешающей способности метода как в контроле, так и при обучении, что не позволило нам сделать однозначных выводов о его участии в обучении.

Показанное нами наличие гена c-fos в ЦНС у Helix и значительная его индукция в процессе обучения хорошо согласуется и дополняет имеющиеся на сегодняшний день сведения о роли ранних генов в механизмах пластичности оборошггельных рефлексов моллюсков.

ВЛИЯНИЕ СИСТЕМ ВТОРИЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ ФАКТОРОВ АР-1. В этой серии экспериментов изучали индукцию формирования транскрипционных факторов посредством цАМФ-зависимой и кальций зависимой рсгуляторными системами. Индукцию цАМФ-зависимого сигнального пути осуществляли серотонином или активатором аденилатциклазы форсколи-ном (5хЮ"5М). Для повышения внутриклеточной концентрации кальция использовали кальциевый ионофор (А23187, 5 мкМ). Индукцию ИКС вызывали форболовым эфиром (ТРА, 80нМ). Спустя 1 ч после инкубации ЦНС в течении 1,5 ч в физрастворе, содержащем вышеперечисленные вещества, экстрагировали транскрипционные факторы и осуществляли gel shift анализ.

Проведенные эксперименты показали, что как воздействие серотошша, так и форсколина, вызывает увеличение ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов семейства АР-1. В то время как ни активатор ПКС форболовый эфир, ни повышение внутриклеточного каЛьЦия существенного влияния на формирование факторов АР-1 не оказывали.

Для изучения модулирующего влияния системы rikc на ссро-тонин-индуцируемый цАМ<Ь-завис1йшй регуляторныи путь iäj 3 ) мин до внесения 5-НТ в физраствЬ(э добавляли форЙЬловый Ьфй)

ТРЛ(80нМ). Показано, что в результате совместного действия форболового эфира и 5-НТ наблюдается увеличение активности факторов АР-1 по сравнению с действием одного ссротонина.

Однако, значительно больший эффект на формирование транскрипционных факторов АР-1 оказывает кальциевая регуляторная система. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ на фоне предъявления серотонина и активатора аденилатциклазы форсколина вызывает повышение образования •фанекрипционных комплексов семейства АР-1 по сравнению с воздействием одного форсколина.

При этом ДНК-связывающая активность данных транскрипционных факторов, вызываемая совместным действием кальция и се-ротонин-индуцируемых систем, может быть существенно понижена посредством ингибиторов тирозинкипаз-генистеином ( 20 мкг/мл), МАР-киназ- PD 98059 ( 20 мкм ) и CMKII - KN-62 ( 10 мкм ).

ОСОБЕННОСТИ УЧАСТИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ОБОРОНИТЕЛЬНЫХ ФОРМ ПЛАСТИЧНОСТИ п ОНТОГЕНЕЗЕ Ншж Известно, что созревание механизмов сенсигизации и условных оборонительных рефлексов у Melix происходит в постнатальном онтогенезе. У виноградной улитки в возрасте до 4 месяцев огсутсвует механизм формирования сенсигизации и связанный с ней механизм образования оборонительных условных рефлексов (Балабан, Захаров, 1992). У этих улиток недостаточно сформирована сеть серотопипергнческих нейронов и, как показано нами, незрелым является также постсинаптическос звено транедукции серотонинового сигнала. Как известно, у виноградной улитки серотопин вызывает эффект сенситизации, аналогичный Действию ноцицептивного стимула (Шевелкин и др., 1997) и его присутствие необходимо для формирования долговременной поеттета-нической потеициации (Малышев и др., 1997).

С другой стороны, показано, что серотонин путем цАМФ-зависимой регуляции может влиять па экспрессию ранних генов, в частности, генов АР-1-семейства, посредством фосфорилирования иротеинкипазой А CREB-белка, представителя транскрипционных факторов семейства CRE (Karin et al, 1992; Kaang et al, 1993). Поэтому представлялось интересным сравнить механизмы формирования данных транскрипционных факторов у животных разного возраста,

способных и неспособных к формированию долговременных форм пластичности.

Эксперименты выполнены на взрослых половозрелых улитках и ювенильных улитках, неспособных к формированию условных оборонительных рефлексов. В качестве модулятора обучения применяли ссротонин.

ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов CRE, С/ЕВР и АР-1 оценивали методом задержки в геле (gel shift assay).

Применяя данный метод анализа, мы обнаружили наличие транскрипционных факторов семейства CRE у ювенильных улиток, как и у взрослых. Что же касается транскрипционных факторов АР-1 семейства, то у ювенильных (до 4-х месячного возраста) улиток данные факторы либо не выявляются, либо у них отсутствует одна из изоформ, активируемых при обучении. При этом активность факторов CRE у ювенильных животных достаточно высока. Применяемый в качестве модулятора пластичности у Helix серотонин в концентрации 10"4 М, как и у взрослых, вызывает значительную активацию транскрипционных факторов CRE-семейства. Аналогичные результаты наблюдаются при инкубации ганглия в тех же условиях с активатором аденилатциклазы форфсколином (5x10"3 М). Причем степень активации в этом случае сопоставима со степенью активации, вызываемой серотонином.

Несмотря на значительное увеличение активности факторов CRE, инкубация ЦНС ювенильных улиток ни с серотонином, ни с форсколииом не вызывает появления активности транскрипционных факторов АР-1 семейства. Учитывая, что экспрессия транскрипционных факторов семейства АР-1 может активироваться С/ЕВР -зависимым путем, мы провели сравнительный анализ активации факторов С/ЕВР взрослых и ювенильных улиток, который показал отсутствие видимых различий между активацией данных транскрипционных факторов у ювенильных и взрослых животных.

Известно, что активация транскрипционных факторов семейства CRE, в частности, белков CREB может происходить путем их фосфорилирования по серину протеиикиназой А, что приводит к образованию димера и взаимодействию последнего с CRE элементами эффекторных генов, вызывая их активацию. При

этом CRE элемент присутствует в генах многих транскрипционных факторов семейства АР-1 (Karin, Hunter, 1995).

В связи с этим результаты, полученные на ювенильных животных, неспособных к формированию долговременных форм пластичности, представляются интересными. IIa основе анализа проведенных исследований следует отметить, что у ювенильных улигок, как и у взрослых, присутствуют белки СRE-семейства. Более того, эти факторы активируются по классическому для взрослых животных пути через серотониновую индукцию цАМФ-зависимой регуляции, о чем свидетельствуют данные об инкубации ЦНС ювенильных животных с серотонипом и активатором аденилатциклазы форсколииом. Также наблюдается и активация транскрипционных факторов семейства С/ЕВР! Однако, у ювенильных улиток мы не зарегистрировали наличия активных транскрипционных факторов ЛР-1 семейства. Более того, в наших условиях эти факторы ие активируются ни серотонипом, ни форсколииом, ни активированными факторами семейства CRE и С/ЕВР, содержание которых в ЦНС ювенильных животных достаточно высоко.

Таким образом, у ювенильных улиток 4-х месячного возраста отсутствие способности к формированию селснгизации и условных оборонительных рефлексов коррелирует с нарушением формирования в ЦНС активных транскрипционных факторов семейства AP-I. Отсутствие активных АР-1 факторов у ювенильных улиток может объяснятся как повышенной репрессией отдельных генов этого семейства (Bartsh et al., 1995), так и незрелостью других путей активации, обеспечивающих фосфорилирование белков этих генов, или рассинхронизацией этих путей.

Учитывая, что при обучении Helix увеличивается экспрессия гена c-fos, мы предположили, что нарушения в формировании факторов АР-1 у ювенильных улиток могут быть связаны с индукцией этого гена. Так как регуляция экспрессии гена c-fos может контролироваться кроме элементов CRE и С/ЕВР также через SRE элемент, мы провели сравнительный анализ формирования транскрипционных факторов SRE у ювенильных и взрослых улиток. Данные gel shift анализа показали наличие дополнительной полосы задержки при электрофорезе у ювенильных животных по сравнению со взрос-

лыми, что, возможно, отражает наличие ипгибиторных форм факторов SRE у ювенильных животных

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На современном этапе развития нейробиологии одной из важных проблем является проблема молекулярно-генетических механизмов обучения и памяти. Результаты проведенных нами комплексных исследований с применением биохимических и молеку-лярно-генетических методов анализа позволили углубить и расширить существующие представления о механизмах вовлечения генома в формирование долговременной памяти и установить некоторые закономерности регуляции экспрессии генов при выработке ассоциативных и неассоциативных форм обучения. Наше внимание было сосредоточено на выяснении следующих аспектов этой проблеммы: активируется ли белковый синтез в ЦНС виноградной улитки при обучении, какие внутриклеточные сигнальные системы включены в этот процесс, какие транскрипционные факторы участвуют в регуляции экспрессии генов при формировании долговременных следов памяти и каков механизм их активации.

На первом этапе.работы было обнаружено, что в процессе обучения в ЦНС виноградной улитки происходят значительные изменения метаболизма белков, связанные как с посттранскрипционной модификацией, так и с их синтезом. В этой связи формирование оборонительного условного рефлекса у виноградной улитки можно разделить на три стадии.

белка с Rf 0,58, вероятно, необходимы для оптимизации условий замыкания условной связи. Для осуществления этого неспецифического процесса нет необходимости в повышении синтеза белка, однако, в это же время увеличивается синтез кислых нейроспецифических белков, необходимый, очевидно, доя формирования долговременной памяти.

На второй стадии (90-120 сочетаний) количество белка Rf 0,58 в цитозоле возвращается к исходному уровню. Повышенная возбудимость мембран наблюдается только в некоторых нейронах. Продолжается интенсивный синтез наиболее кислых белков.

На третьей стадии (120-240 сочетаний) выработка обучения стабилизируется на максимально высоком уровне. Достоверные изменения в уровне белков наблюдаются только в командных нейронах оборонительного рефлекса, коррелируя со степенью нагрузки их рецепторных зон. Это кислые мозгоспецифические белки (МСБ), движущиеся вблизи анодного фронта. Корреляции обучения с увеличением, либо синтезом кислых МСБ у высших позвоночных животных установлена в работах Хидена с соавторами (Hyden et al., 1977). Однако следует отметить, что количественные эффекты, получаемые при обучении моллюсков, выражены гораздо сильнее.

Таким образом, нами обнаружено два класса -белков, наиболее сильно изменяющихся в процессе обучения. Это, во-первых, белок с Rf 0,58, количественное перераспределение которого происходит между мембраной и цитозолем на ранних стадиях обучения, и, во-вторых, вновь синтезированные наиболее кислые нейроспецифиче-ские белки.

Процесс активации белка Rf 0,58 оказалось возможным имитировать серотонином (5-НТ), медиатором, играющим значительную роль в организации оборонительных форм пластичности у моллюсков (Балабан, Захаров, 1992; Малышев и др., 1997; Шевелкин и др., 1997). Инкубация подглоточного комплекса ЦНС Helix в физиологическом растворе, содержащем 10"4 М 5-НТ, вызывает значительное увеличение белка Rf 0,58 в водорастворимой фракции спустя 1-2 ч после отмывания серотонипа. Сигнальное действие серотоиина, по-видимому, передается через систему ГТФ-связывающих белков, так как инкубирование ЦНС в растворе, содержащем активатор ГТФ-связывающих белков фторид натрия, вызывает увеличение белка RfO,58 в водорастворимой фракции, сравнимое с обучением и инку-

бацией с серотонином. На факт участия G-белков в механизмах формирования пластичное™ оборонительного поведения указывают также полученные нами данные по усилению ГТФ-азной активности у обученных животных по сравнению с контрольными.

. Следовательно, начальные стадии формирования условного оборонительного рефлекса у Helix являются серотонин -индуци-бильными. Активация серотонином внутриклеточной цепи регуляции происходит через систему G-белков, что сопровождается транслокацией белка Rf 0,58. Подтверждением важной роли белка Rfl},58 в обучении являются наши эксперименты по исследованию белковых спектров ЦНС ювенильных улиток, неспособных к формированию сенситизации и долговременных форм условных оборонительных рефлексов (Балабан, Захаров, 1992). У этих улиток электрофо-ретическими методами анализа не обнаруживается даже следовых количеств белка Rf 0,58. Белок не появляется также при инкубации с серотонином и фторидом натрия . Данные эксперименты показали, что у ювенильных улиток наряду с недостаточной зрелостью системы серотонинэргических нейронов (Zacharov, Balaban, 1987), незрелым является также постсинаптическос звено. Подведение экзогенного серотонина не вызывает появления белка Rf 0,58.

Таким образом, формирование пластичности оборонительного поведения Helix сопровождается длительным изменением как мембранных характеристик нейронов ЦНС (Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992), так и изменением белкового метаболизма. Процесс запускается серотонином и опосредуется системой ГТФ-связывающих белков. Известно, что Gs -белки могут запускать каскад регуляторных реакций как цАМФ-зависимых, так и опосредуемых нротеиикиназой. Более того, и ПКА, и ПКС могут принимать участие в регуляции механизмов пластичности (Abrams et al., 1991; Bacskai et al., 1993; Cooper et al., 1995). Анализ степени участия этих киназ в механизмах пластичности Helix показал увеличение активности ПКА как в мембранной, гак и цитозольной фракциях, тогда как уровень ПКС был значительно ниже и не изменялся при обучении.

клеточных регуляторных систем. В этой области в настоящее время разворачивается широкий фронт работ, однако ввиду сложности и многокаскадности регуляторных систем, вовлеченных в индукцию экспрессии генов, полученные данные носят еще фрагментарный характер.

цАМФ-индуцируемая активация транскрипционных фаеторов семейств С/ЕВР и АР-1 может быть значительно усилена повышением уровня внутриклеточного кальция. Учитывая, что у виноградной улитки при обучении наблюдается активация цАМФ и кальций-зависимых регуляторных систем, опосредующих действие условных и безусловных стимулов, можно предположить, что изучаемые нами транскрипционные факторы обеспечивают механизмы конвергенции этих стимулов, что, в свою очередь, может определить индукцию экспрессии определенных «поздних» генов пластичности, определяющих функционирование каналов цАМФ-зависимого тока (Щер-батко, 1988) или формирование новых синаптических связей (Martin, Kandel, 1996) и другие внутриклеточные процессы, лежащие в основе ассоциативного обучения.

Схема возможной конвергенции стимулов различной модальности при обучении на уровне транскрипционных факторов и протеинкиназ, составленная на базе данных литературы и результатов собственных исследований, представлена па рис.1.

Экстраклеточныс сигналы, опосредующие действие безусловных стимулов (у моллюсков-серотонии) через Gs белки могут активировать цАМФ зависимый регуляторный каскад, вызывая транслокацию каталитической субьединицы ПК А в ядро. Фосфорилироваиие ПКА транскрипционного фактора CREBI

♦К*

РКА

R|0,58

Ca2

PKs

"'/ I

» " г А-*'" * *

РКА —► ' MAP1 СаМК РКС s

« \ /

j* j gene c-fos

С/ЕВР

^JuñhD^ (^FosJB^

late genes /

Nucleus

Рис. 1 Схема регуляции экспрессии генов при формировании долговременных форм пластичности

Возможные активационные пути;

Возможные ингибиггорные пути;

Модуляторные пути;

СаМК - кальмодупин-зависимая протеинкиназа;

• MAP - митоген-актавируемэл протеинкиназа;

• РКС, РКА-протеинкиназа С, А;

• СК-2 - кэзеинкиназа 2;

. CREB, CREB2, С/ЕВР, CREM, Elk-1, SRF, c-Fos, с-Jun, Jun-D, Fos-B - транскрипционные факторы;

• СВР - CREB-связывающий белок;

• CRE, SRE, AP-1, ERE -сайты pci-улящш;

• R, 0.58-белок.

(семейства CRH) активирует последний, вызывая индукцию экспрессии «немедленных ранних генов», в частности, c/ebp и c-fos. Эффективность экспрессии зависит от присутствия ингибиторных факторов CRE- семейства CREB II и CREM, активность которых модулируется иными прогеикиназами, например MAP. Показана возможность индукции последней цЛМФ-зависимым путем (Martin, Kandel, 1996). Свой вклад в регуляцию экспрессии c-fos также могут вносить другие цАМФ-зависимые транскрипционные факторы, например С/ЕВР, действуя через свои регуляторные сайты.

Эффективность работы данного каскада может быть усилена через альтернативные сигнальные системы, в частности, кальций-зависимые, опосредующие действие стимулов других модальностей, активируемых при обучении.

Так, увеличение активности фактора С/ЕВР зависит не только от экспрессии, регулируемой цАМФ зависимым путем, но и от его фосфорилирования кальций-зависимыми протеинкиназами. В свою очередь, индукция экспрессии c-fos может быть усилена через элемент SRE, активация которого зависит от формирования тройного комплекса (2xSRF+ELK-l). При этом фосфорилирование SRF может осуществляться посредством ПКС, а фактора ELK-1 протеинкиназой RSK, индуцируемой МАР-киназой. Таким образом, процесс регуляции активности генов обусловливается взаимодействием нескольких прогеинкииаз: ПКА, ПКС, СаМК, MAP, опосредующих эффекты нескольких сигнальных систем, отражающих влияние мотивационных, arousal, сенсорных и иных функционально-значимых стимулов, вовлекаемых в формирование ассоциативных форм обучения. Таким образом, различные сигнальные пути могут конвергировать, значительно усиливая (либо модулируя) экспрессию «ранних генов».

Второй уровень регуляции обеспечивается на уровне транскрипционных факторов семейства АР-1 (димеры белков семейства Fos и Jun). Транскрипционная активность этих комплексов зависит как от их состава (наиболее активен c-Fos + с-Jun), так и от фосфорилирования (МАР-киназой и СК2 для c-Jun).

достигаться как через увеличение экспрессии гена c-fos, так и фос-форилирование c-jun. Проведенные эксперименты показали увеличение экспрессии гена c-fos в процессе формирования данного вида пластичности. CRH- индуцированная безусловным стимулом экспрессия гена c-fos может быть усилена как через С/ЕВР-связывающие регуляторные элементы, так и через сайты SRE путем кальций-зависимой активации протеинкиназ MAP и ИКС и фосфо-рилирование ими факторов SRF и Elk-1. В свою очередь, СаМК может участвовать в фосфорилировании CREB связывающего белка СВР, сопрягающего транскрипционные факторы с РНК-полимсразным комплексом.

Проведенные нами эксперименты с блокированием Са/кальмодулин-зависимых и митогенактивируемых протеинкиназ в условиях взаимодействия цАМФ-индуцируемых и кальций- зависимых регуляторных путей показали значительное уменьшение активности факторов АР-1 при их применении. При блокаде СаМК и особенно МАР-киназ наблюдается также значительное снижение активности транскрипционных факторов С/ЕВР.

Следует отметить, что наряду с ПК А, значительное место в активации факторов 'Транскрипции принадлежит MAP- киназе. Ее возможная роль в механизмах пластичности в настоящее время интенсивно исследуется.

Кроме фосфорилировалия транскрипционных факторов CREBII и С/ЕВР (Martin et al., 1997)), эта кнпаза играет исключительно важную роль в механизмах формирования новых синаптических контактов. Введение антител против MAP- киназы или ее блокаторов предотвращает интернализацию мембранно-ассоциированной формы молекулы клеточной адгезии (САМ) у Aplysia. Предполагается, что интерпализация мембранно-ассоциированной формы САМ нарушает аксон-аксональные адгезивные контакты, что приводит к формированию новых синаптических связей (Bailey et al., 1997). Следует отметить, что этот процесс также зависит от РИК-белкового синтеза и связан с цАМФ-зависимой индукцией синтеза гидролазы, фермента разрушающего интернализованную САМ (Hegde et al. 1997) и легкой цепи клатрина (необходим для формирования покрытых впадин и везикул, с помощью которых идет процесс интернализации (Ни et al. 1993).

Данные, свидетельствующие о важности AIM факторов в формировании долговременных оборонительных условных рефлексов, получены нами также в онтогенетических исследованиях.

Известно, что созревание механизмов сеиситизаиии и условных оборонительных рефлексов у Helix происходит в постнаталыюм онтогенезе. В возрасте до 4,5-х мес у виноградных улиток затруднена выработка этих форм поведения, что связывают с недостаточной зрелостью системы серотошшэргических нейронов. Как показано нами, у этих улиток нарушенным является также метаболизм белков, принимающих участие в обучении. Наши эксперименты с применением "gel shift" анализа показали, что уровень ДНК-связывающей активности факторов CRE и С/ЕВР у ювенильных животных сравним со взрослыми. Однако у ювенильных животных наблюдается значительное нарушение формирования факторов АР-1 (нашими методами анализа у ювенильных улиток не выявляются активированные транскрипционные факторы АР-1 семейства, активирующиеся при обучении в ЦНС взрослых улиток). Не наблюдается также появления этих изоформ факторов АР-! при инкубации ЦНС с серотонином, форсколином, кальциевым ионофором.

Таким образом, у ювенильных улиток отсутствие способности к формированию сенситизации и условных оборонительных рефлексов сопровождается нарушением формирования и/или активации транскрипционных факторов семейства АР-1. Отсутствие этих факторов у ювенильных улиток может быть обусловлено как повышенной репрессией отдельных генов этого семейства, так и незрелостью путей активации, обеспечивающих фосфорилирование белков этих генов. Учитывая, что при обучении Helix увеличивается экспрессия гена c-fos, представлялось вероятным, что нарушения в формировании факторов АР-1 у ювенильных Helix могут быть связаны с нарушением экспрессии c-fos, предположительно обусловленной элементами SRE, так как нарушения транскрипционных комплексов CRE и С/ЕВР у этих улиток нами не обнаружено. Сравнительные онтогенетические эксперименты по изучению формирования комплексов SRE показали наличие дополнительной полосы задержки этих факторов при электрофорезе у ювенильных животных по cnaRHRiiwo г.о взрослыми. Наличие этих полос отражает присутствие дополнительных форм транскрипционных факторов, возмож-

но ингибиторных, взаимодействующих с элементом SRE у ювениль-ных улиток.

Учитывая, что АР-1 элементы содержатся в регуляторных участках многих генов, непосредственно участвующих в пластических перестройках , любые нарушения их активации могут привести к существенным нарушениям формирования обучения и памяти.

Таким образом, наряду с недостаточной зрелостью формирования серотонипэргической системы нейронов (Балабан, Захаров, 1992), у ювенильных улиток наблюдаются различия в формировании транскрипционных факторов семейства АР-1, что, в свою очередь, вероятно является причиной нарушения сигнальной трансдукции се-ротонина.

Полученные нами данные вносят вклад в понимание механизмов экспрессии генов, вовлекаемых в процесс приобретения новых навыков. Как нам представляется, перспективными в дальнейшем исследованиями в этом направлении являются: определение композиционного состава транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, участвующих в формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения, а также изучение вклада различных внутриклеточных регуляторных систем в активацию транскрипционных факторов в отдельных функционально различных нейронах.

Для расширения исследований по изучению регуляции экспрессии генов, участвующих в формировании пластических перестроек ЦНС Helix, на основе вектора EMBL-3A нами была сконструирована геномная библиотека виноградной улитки.

В отличие от распространенных библиотек кДНК клоны геномной библиотеки содержат не только транскрибируемые участки генов, но и регуляторные последовательности, что позволяет картировать сайты связывания транскрипционных факторов в функционально важных генах и, исходя из спектра этих факторов, планировать работы по регуляции экспрессии. Другим важным моментом планируемых исследований является постановка вопроса о степени гомологии транскрипционных факторов виноградной улитки факторам позвоночных животных.

Дальнейшее изучение путей активации транскрипционных факторов, их композиционного состава, изучение механизмов

конвергенции внутриклеточных сигнальных систем в различных компартменгах к легки будут способствовать углублению наших знаний в области молекулярных и генетических механизмов памяти и обучения.

ВЫВОДЫ

1.Выработка ассоциативных и неассоциативных форм оборонительного поведения виноградной улитки вызывает существенные ' изменения метаболизма кислых мозгоснецифических белков, заключающиеся как в модификации и перераспределении предсушествующих белков (ранние стадии обучения), гак и синтезе новых (ранние и поздние стадии обучения), что свидетельствует о вовлечении генома в процесс формирования долговременных форм обучения. Анализ водорастворимых белков идентифицированных нейронов показал, что наиболее длительные изменения содержания кислых нейроснецифиче-ских белков, движущихся с анодным фронтом, наблюдаются в командных нейронах оборонительного поведения, вовлекаемых в формирование условного оборонительного рефлекса.

2. Моделирование действия безусловного стимула серотонином вызывает однонаправленное с обучением влияние на динамику белка Rf 0.58, что подтверждает важную роль серотонина в обучении Helix. Эффекты серотонина на внутриклеточные процессы опосредуются ГГФ-связывшощими белками, о чем свидетельствуют наши данные о сходном влиянии серотонина и активатора G-белков фторида натрия па индукцию белка Rf 0,58, а также полученные сведения об активации G-белков при обучении Helix.

3. В формировании условного оборонительного рефлекса пищевого избегания Helix принимает участие цАМФ -зависимая ре-гуляторная система. Активация ПКА может осуществлятся безусловным стимулом посредством серотониновой индукции G-белков. В пользу этого предположения свидетельствуют как литературные сведения об имитации серотонином эффектов ноцицептивных стимулов и повышение уровня цАМФ в нейронах под действием серотонина, так и наши данные об индукции серотонином белка Rf 0,58 активируемого при обучении.

4. Выработка условного оборонительного рефлекса пищевого избегания Helix приводит к увеличению ДНК-связывающей активности цАМФ-регулируемых транскрипционных факторов семейств CRE, С/ЕВР и АР-1, при этом наблюдается последовательная активация этих факторов. . Данные об увеличении ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов свидетельствуют о том, что в процессе обучения происходит не только активация экспрессии "ранних генов", продукты которых являются компонентами транскрипционных факторов, ио и осуществляется их фосфорилирование, необходимое для формирования активных димеров.

5. Однонаправленные с обучением эффекты на формирование активных транскрипционных факторов АР-1 и С/ЕВР в условиях изолированной ЦНС вызывает серотонин-индуцируемый, цАМФ-зависимый регулягорный путь. При этом значительное усиление серотониновой активации данных транскрипционных факторов достигается посредством увеличения концентрации внутриклеточного кальция. Кооперативная активация транскрипционных факторов цАМФ и кальций -зависимыми регуляторными системами очевидно лежит в основе одного из механизмов конвергенции путей условного и безусловного стимулов.

6. Важная роль в опосредовании кальциевых сигналов принадлежит митогепактивируемым и Са/кальмодулин-зависимым протеинкиназам. Нами показано, что ингибирование мигогенакгнвируемых и Са/кальмодулип- зависимых протеинкиназ (блокаторами РД 98059 и KN62- соответственно) снимает эффекты кальций- зависимого потенциироваиия серотонин-иидуцируемой активации транскрипционных факторов семейств С/ЕВР и АР-1.

7. Незрелость рецеиторного звена серотонин-обусловлениой модуляции оборонительного поведения Helix, а также нарушения в формировании транскрипционных факторов АР-1 может явиться причиной неспособности ювенильных улиток к выработке сеиситизации и условных оборонительных рефлексов. Нарушения формирования транскрипционных' комплексов АР-1 у ювенильных улиток возможно связаны с наличием у них ингибиторных форм транскрипционных факторов, взаимодействующих с элементом SRE.

8. Транскрипционные факторы участвуют в обеспечении механизмов конвергенции стимулов различной модальности, взаимодействующих при выработке обучения. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о нотенциацни цАМФ-зависимой активации транскрипционных факторов семейств С/ПВР и АР-1 кальдий-иидуцируемыми регуляторными системами.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гринкевич Л.И., Штарк М.Б., Гайнутдинов X.J I. К микрохимическому исследованию белкового спектра идентифицированных нейронов виноградной улитки Helix pomatia. Докл. АН СССР. 230(5): ]254-1256. 1976.

2. Гринкевич Л.Н., Микрохимические исследования белковых спектров командных нейронов условного оборонительного рефлекса. Докл. АН СССР. 252(1): 248-250. 1980.

3. Sbtark М.В., Grinkevich L.N., Deriy R.N., Zapara Т.A., Tretyakov V.P. On the plastisity of a Simple Nervous Syslem. In: Neuronal plasticity and memory formation (Eds. A.Marsati,H.Matties). Raven Press, N.-Y.: 271-283. 1982.

4. Гринкевич Л.Н., Сафронова О.Г, Штарк М.Б. Водорастворимые белки нодгологочного комплекса ганглиев виноградной улитки на ранних стадиях обучения. Бюлл. эксперим биологии и медицины. (10): 429-432. 1984.

5. Гринкевич Л.Н. Изучение обмена мозгоспецифических белков виноградной улитки при обучении. Всес.конф.:"Простые нервные системы и их значение для теории и практики". КГУ. Казань. 50-51. 1985.

6. L.N. Grinkevich, O.G. Safronova, M.B.Slitark. Water soluble proteins of Snail subesopbageal Ganglia at early stages of learning. Advances in the Biosciences, Pergamon Press ed.H.Matties Oxford-New York. 59: 209-212. 1986.

7. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Штарк М.Б. Влияние ацетилхолина на синтез белка в идентифицированных нейронах виноградной улитки. Нейрохимия. 7(2): 251-254. 1988.

8. Крылова И.II., Кумарев В.П., Боровков АЛО, Гринкевич Л.Н. Изоляция и частичный анализ геномных клонов виноградной улитки, гомологичных ДИК эндогенного лиганда ГАМКа рецепторов человека. В сб.: Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы. Международный симпозиум, Ялта. Тезисы. Типография АгроНИИТЭИНП (Москва) С.52. 1988.

9. Гринкевич Л.Н. Молекулярные основы формирования оборонй1-ельНого поведения моллюсков. В сб.: Простые нервные системы, ред. Д.Л.Сахаров. Наука. Л. 74-78. 1988.

10. Гринкевич Л.Н, Динамика включения [3Й]-^ейЦина в белки ЦНС виноградной улитки гфв обучении. Нейрохимия. 8(1): 56-63. 1989.

25. Грникевич Л.Н., Меркулова Т.И., Лисачев П.Д. Активация транскрипционных факторов CRE и API семейств коррелирует с развитием пластичности у Helix. Журн. высш. нерв. деят. имени И.П. Павлова 48(6):1037-1042. 1998.

26. Гринкевич Л.П., Лисачев Г1.Д. Роль транскрипционных факторов и пути регуляции их активности в механизмах пластичности Helix. В сб.: "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино. С.141-144. 1998.

27. Grinkevich L.N., Merculova T.I.CRE and API families of DNA transcription factors and Helix memory. J.of Ncurocliem. 71(1):61. 1998.

28. Grinkevich L.N., Toporkova L.B., Lisachev P.D., Izvarina N.L. Role of G-proteins and second messanger systems in the plasticity of the avoidence reflex in Helix. Neurosci. and Behav. Physiol. 28(2):101-106. 1998.

29. Лисачев П.Д., Гринкевич Л.II. Изменение характера нейромодулярных эффектов серогоннна при обучении виноградной улитки.-17й Всероссийский съезд физиологов, Ростов-на-Дону. С.29. 1998.

30. Гринкевич Л.Н., Васильев Г.В., Возможные молекулярно-клеточные механизмы регуляции экспрессии генов при обучении. Российский физиологический журнал, им. И.М.Сеченова. 85(1):48-бб. 1999.

31. Grinkevich L.N., Nagibneva I.N., Lisachev P.D. A transcription factors AP-1 and Helix memory Formation. Iiv.ISIN-9th symposium on neurobiology of in-vertebates, Tiliany (Hungary). P.30. 1999.

32. Grinkevich L.N. A transcriptional factor C/EBP and Helix memory formation IBRO, Israel, July, 1999.

Подписано в печать 10. 05. 2000. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,09. Тираж 100 экз. Заказ № 137.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199034, С-Петербург, наб. Макарова, 6.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гринкевич, Лариса Николаевна

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Модели, используемые для анализа молекулярно-клеточных механизмов обучения.

1.1.1. Выработка ассоциативных и неассоциативных форм обучения у виноградной улитки.

1.1.2. Выработка неассоциативных и ассоциативных форм обучения у Aplysia.

1.1.3. Выработка ассоциативных форм обучения у гермиссенды (Hermissenda crassicornis).

1.1.4. Долговременная потенциация синаптической передачи.

1.2. Участие внутриклеточных регуляторных систем в механизмах обучения.

1.2.1 Участие системы цАМФ в регуляции нейрональной пластичности.

1.2.2 Участие кальциевой сигнальной системы в регуляции нейрональной пластичности.

1.2.3. Участие фосфоинозитидной системы вторичных посредников в регуляции нейрональной пластичности.

1.2.4.Участие митогенактивируемых (MAP) киназ в механизмах нейрональной пластичности.

1.2.5.Участие казеинкиназ в механизмах нейрональной пластичности.

1.3. ДНК - связывающие транскрипционные факторы

1.3.1. Транскрипционные факторы семейства CRE

1.3.1.1. Белки CREB-семейства.

1.3.1.2. Белки CREM-семейства

1.3.1.3. CREB-связывающий белок СВР.

1.3.2. Транскрипционные факторы семейства АР-1.

1.3.2.1. Белки семейства FOS.

1.3.2.2. Белки семейства JUN

1.3.2.3. Гены содержащие АР-1 регуляторный элемент.

1.3.3. Транскрипционные факторы семейства С/ЕВР.

1.3.4. Транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов через SRE - элемент.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования - ВИНОГРАДНАЯ УЛИТКА.

2.1.2. Выработка условного оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия у виноградной улитки.

2.1.3. Выработка условных оборонительных рефлексов избегания пищи.

2.2. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3. Выделение идентифицированных нейронов и экстрагирование водорастворимых белков.

2.4. Микродискэлектрофорез в полиакриламидном геле.

2.5. Изучение экспрессии генов методом "Nothern"6noT-гибридизации.

2.6. Определение активности G-белков.

2.7. Определение активности протеинкиназ А, С.

2.8. Метод задержки в геле (gel retardation assay, gei shift assay).

2.9. Конструирование геномной библиотеки виноградной улитки

ГЛАВА Iii. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Метаболизм белков в ЦНС Helix при обучении.

3.1.1. Метаболизм белков в ЦНС виноградной улитки на разных стадиях формирования оборонительного условного рефлекса.

3.1.2. Иследование белковых спектров командных нейронов оборонительного поведения при обучении виноградной улитки.

3.1.3. Белок Rf 0,58 в молекулярных механизмах обучения Helix.

3.1.4. Формирование механизмов пластичности в онтогенезе

3.2. Участие внутриклеточных регуляторных систем в механизмах пластичности оборонительного рефлекса у виноградной улитки

3.3. Формирование транскрипционных факторов и возможные пути регуляции их активности при обучении Helix

3.3.1. Формирование транскрипционных факторов CRE при обучении Helix.

3.3.2. Формирование транскрипционных факторов С/ЕВР при обучении Helix.

3.3.2.1. Влияние функциональных воздействий на образование транскрипционных факторов семейства С/ЕВР.

3.3.2.2. Влияние систем вторичных посредников на формирование факторов С/ЕВР.

3.3.3. Формирование транскрипционных факторов АР-1 и возможные пути регуляции их активности при обучении Helix.

3.3.3.1. Анализ ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов семейства АР-1 в ЦНС Helix при обучении

3.3.3.2. Экспрессия ранних генов в ЦНС Helix при обучении

3.3.3.3. Влияние систем вторичных посредников на формирование факторов АР-1.

3.3.4. Особенности участия транскрипционных факторов в формировании оборонительных форм пластичности в онтогенезе Helix.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки"

АКТУАЛЬНОСТЬ Проблема молекулярно-генетических механизмов обучения и памяти одна из важнейших в современной нейробиологии. Многообразие интегративных процессов, участвующих в обучении, значительно усложняют исследования, проводимые в этой области. Экспериментальных работ, показывающих вовлечение конкретных генов в процесс обучения, сравнительно немного. Широкий круг исследований как на моллюсках и дрозофиле, так и на позвоночных развернулся вокруг, так называемых, «немедленных ранних генов», играющих значительную роль в запуске дифференцировки и пролиферации. В ряде работ показано усиление экспрессии «ранних генов» при обучении (Анохин, 1997; Kaang et al., 1993; Alberini et al., 1994; Kaczmarek, Chandhuri, 1997), а также необходимость их экспрессии для формирования долговременных следов памяти (Demmer et al., 1993; Bourtchuladze et al., 1994; Yin et al., 1994).

Экспрессия "ранних генов" находится под контролем пред-существующих белковых транскрипционных факторов, активируемых экстраклеточными сигналами через системы различных протеинкиназ (Frank, Grenberg, 1994). Белковые же продукты "ранних генов" сами образуют транскрипционные факторы, способные регулировать экспрессию эффекторных генов, непосредственно определяющих механизмы пластичности (Curran, 1988; Armstrong, Montmini, 1993). Процессы регуляции экспрессии функционально важных генов пластичности достаточно сложны и многокаскадны, часто включают в себя взаимодействие нескольких внутриклеточных сигнальных путей. Вторичные мес-сенджеры, опосредующие действия экстраклеточных сигналов через системы соответствующих протеинкиназ, могут оказывать значительное влияние на экспрессию транскрипционных факторов и их ДНК-связывающие и активирующие свойства (Karin, Smeal, 1992; Armstrong, Montminy, 1993; Mellstrom et al., 1993; Kormhauser, Greenberg, 1997). Таким образом, транскрипционные факторы способны интегрировать информацию, приходящую от мембраны к ядру и, соответственно, запускать экспрессию функционально важных генов, поэтому их часто относят к третичным мессенджерам.

Известно, что экстраклеточные стимулы, активируя соответствующие системы вторичных посредников, могут регулировать экспрессию генов - мишеней в ядре (Armstrong, Montminy, 1993; Bacskai et al., 1993; Karin, Hunter, 1995; Kaczmarek, Chandhuri, 1997; Самойлов, 1999). Усиление сигнала может быть достигнуто активацией альтернативных сигнальных систем через фосфо-рилирование транскрипционных факторов, взаимодействующих с иными регуляторными сайтами.

В настоящее время разворачивается широкий фронт работ в данной области. Однако многокомпанентность регуляторной системы экспрессии генов значительно усложняет проведение исследований. Многие аспекты работы "ранних генов" еще не выяснены. Это касается как функциональных последствий их активации (регуляции активности "поздних генов"), так и механизмов регуляции их собственной экспрессии. Неясно, в частности, на каком этапе происходит конвергенция условных и безусловных стимулов. Она может осуществляться как в примембранной области, на уровне систем вторичных посредников, так и в ядре, на уровне регуляции экспрессии генов, благодаря множественности сайтов регуляции и интегрирующим возможностям транскрипционных факторов, активирующие свойства которых могут контролироваться несколькими протеинкина-зами. Основные сведения в этой области получены в экспериментах на клеточных культурах и в немногочисленных исследованиях, выполненных in vivo. Таким образом, изучение механизмов регуляции экспрессии генов, активирующихся при обучении, направлено на решение актуальных задач современной нейробиологии.

Одним из наиболее удобных объектов для изучения молекулярных механизмов обучения и памяти являются моллюски. Способность этих животных к формированию условных рефлексов, наличие гигантских функционально значимых нейронов, возможность их идентификации, жизнестойкость ЦНС в условиях in vitro позволяет изучать на этом объекте нейрональные сети, определяющие формирование условных рефлексов, а также имитировать простые формы обучения. Благодаря изучению нейронных механизмов пластичности у Aplysia, Hermissenda, Helix получены основные сведения, касающиеся молекулярно-клеточных и генетических механизмов обучения и памяти (Соколов, 1981; Балабан, Захаров, 1992; Никитин, Судаков, 1997; Montarolo, et al., 1986; Greenberg et al., 1987; Nelson, Alkon., 1988; Abrams et al., 1991; Bacskai et al, 1993; Alberini et al., 1994).

В качестве объекта исследования нами выбран моллюск -виноградная улитка (Helix). Благодаря работам Коштоянца Х.С., Соколова Е.Н., Сахарова Д.А., Костюка П.Г и созданным им научным школам, виноградная улитка стала излюбленным объектом отечественных "клеточных" физиологов. У этих животных описано несколько видов условных оборонительных рефлексов. Идентифицированы сенсорные, командные, модуляторные и моторные нейроны, включенные в формирование данных рефлексов. Описаны пластические перестройки нейрональных сетей при обучении (Соколов, 1981, 1992; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992). Однако молекулярные процессы, происходящие в ЦНС Helix при обучении, остаются еще мало изученными. Особенно это касается механизмов трансдукции экстраклеточных сигналов от мембраны к ядру и молекулярных субстратов, определяющих конвергенцию условных и безусловных стимулов.

В связи с этим представлялось необходимым проведение поэтапного комплексного исследования, включающего изучение участия различных белков нервных клеток в формировании долговременных форм пластичности, а также внутриклеточных механизмов сигнальной трансдукции, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов, вовлекаемых в процессы обучения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярно-генетических механизмов формирования ассоциативных и неассоциативных форм обучения виноградной улитки. Основные задачи исследования:

3. Изучить вклад цАМФ- регулируемых транскрипционных факторов CRE, С/ЕВР и AP-1-семейств в формирование ассоциативных и неассоциативных форм обучения у Helix.

4. С целью поиска молекулярных механизмов конвергенции стимулов различной модальности, участвующих в обучении, в условиях in vitro провести сравнительное исследование активации транскрипционных факторов посредством индукции различных внутриклеточных сигнальных систем.

5. Провести поиск молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе неспособности ювенильных улиток к выработке сенситизации и условных оборонительных рефлексов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Выработка ассоциативных и неассоциативных форм оборонительного поведения виноградной улитки вызывает в нейронах значительные изменения метаболизма кислых нейроспеци-фических белков, заключающиеся как в модификации и перераспределении предсуществующих, так и синтезе новых белков, что свидетельствует о вовлечении генома в процесс обучения. Наиболее длительные изменения содержания кислых нейроспецифических белков наблюдаются в командных нейронах оборонительного поведения, принимающих участие в формировании данного вида рефлекса.

2. В формирование условного оборонительного рефлекса пищевого избегания виноградной улитки включены G-белки и цАМФ- зависимая регуляторная система. Индукция этих систем внутриклеточной регуляции лежит в основе активации при обучении цАМФ-регулируемых транскрипционных факторов семейств CRE, С/ЕВР и АР-1.

3. Серотонин-индуцируемый, цАМФ-зависимый регулятор-ный путь, опосредующий действие безусловного стимула, вызывает активацию транскрипционных факторов семейств АР-1 и особенно С/ЕВР. Данный эффект может быть потенциирован посредством стимуляции Са2+-регуляторного пути. Кооперативная активация транскрипционных факторов цАМФ- зависимыми и кальций-индуцируемыми протеинкиназами может являться одним из механизмов конвергенции условного и безусловного стимулов.

4. Нарушения экспрессии и/или активации транскрипционных факторов АР-1 могут обусловливать неспособность животных к выработке оборонительных форм как неассоциативного, так и ассоциативного обучения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые методами макро- и микроэлектрофореза проведены комплексные исследования белковых спектров клеток ЦНС и отдельных идентифицированных нейронов виноградной улитки и показано участие кислых мозгоспе-цифических белков в формировании условных оборонительных рефлексов у этих животных. Наиболее длительные изменения содержания кислых нейроспецифических белков зарегистрированы в командных нейронах оборонительного поведения ЛПаЗ, вовлеченых в выработку данного рефлекса. Установлено, что формирование условного оборонительного рефлекса пищевого избегания сопровождается активацией О-белков и цАМФ- зависимых протеинкиназ (ПКА).

Впервые проведено определение ДНК -связывающей активности транскрипционных факторов семейств СЯЕ, С/ЕВР и АР 1, играющих значительную роль в онтогенезе, пролиферации и формировании долговременных следов памяти. Показано наличие этих факторов в ЦНС Helix и их значительная активация при обучении и моделировании обучения в условиях интактной ЦНС. Установлено, что цАМФ-индуцируемая активация транскрипционных факторов С/ЕВР и АР-1 в ЦНС Helix потенциируется кальциевой регуляторной системой, что может лежать в основе механизмов конвергенции условных и безусловных стимулов при обучении Helix. Показано, что в этом процессе принимают участие митогенактивируемые и Са/кальмодулин- зависимые протеинкиназы.

Установлен ранее неизвестный факт наличия в клетках ЦНС Helix транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов через SRE-элемент (serum response element), играющих важную роль в интеграции митогенактивируемых и Са/фосфолипид (ПКС)-зависимых регуляторных каскадов.

В онтогенетических исследованиях по изучению ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов в ЦНС виноградной улитки впервые обнаружена корреляция задержки развития механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов Helix с незрелостью постсинаптических механизмов передачи экстраклеточного сигнала серотонина, а также с нарушением формирования транскрипционных факторов семейства АР-1, играющих значительную роль в регуляции экспрессии «поздних генов» нейрональной пластичности.

НАУЧНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ

ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Теоретическое значение полученных результатов состоит в углублении и расширении представлений о молекулярно-клеточных основах пластических перестроек в нервной системе, происходящих при формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения, и о роли генома в регуляции данных процессов.

Знания об онтогенетических аспектах формирования механизмов обучения и значении транскрипционных факторов С/ЕВР, АР-1, и 811Е семейств в механизмах пластичности могут быть использованы для разработки способов генной терапии врожденных нарушений деятельности ЦНС и повышения адаптивных возможностей мозга.

XIII съезд Всесоюзн. физиол. общ. им. И.П. Павлова (Алма-Ата, 1980), I Всесоюзн. биофизический съезд (Москва, 1982), IX Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы (Ереван, 1983), Всесоюзный симпозиум "Нейрохимические механизмы регуляции памяти" (Пущино, 1984), Всесоюзные конференция по нейронаукам (Киев, 1986, 1988, 1990), Международный симпозиум «Интегративная деятельность нейрона.Молекулярные основы», (Ялта, 1988 ),1 и 2-Всесоюзные конференции «Простые нервные системы и их значение для теории и практики» (Казань, 1985, 1988), XXVIII совещание по проблемам ВНД, посвященное 140-летию со дня рождения И.П.Павлова (Ленинград, 1989), II и III Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока ( Новосибирск, 1995, 1996), Региональная конференция международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) «Простые нервные системы» (Минск, 1991; Пущино, 1994), Международная конференция «Физиологические и биохимические основы активности мозга» (Санкт-петербург, 1994), 8-й и 9-й симпозиум по нейробиологии беспозвоночных ISIN (Тихань (Венгрия) 1995, 1999), 5-й Восточно-Европейский конгресс «Простые нервные системы» (Москва, 1997), Satellite symposia of XXXIII International Congress of Physiological Sciences (Колтуши (Россия), 1997), XXXIII International Congress of Physiological Sciences (Санкт-Петербург, 1997), Конгресс Международного общества нейрохимии (ISN) (Санкт-Петербург, 1998), Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998), 17-й Всероссийский съезд физиологов

Ростов-на-Дону, 1998), XIII Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1999), International symposium dedicated to academician I.P.Pavlov's 150-anniversary "Mechanisms of adaptive beliavior" (Санкт-Петербург, 1999), Fifth IBRO world congress of neuroscience (Израиль, 1999), Международная конференция посвященная 150-летию И.П.Павлова "Новое в концепциях о механизмах ассоциативного обучения и памяти" (Москва, 1999), Международный симпозиум посвященный профессору Е. В. Науменко "Genetic and developmental Psychoneuroendocrinology" (Новосибирск, 1999).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 65 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гринкевич, Лариса Николаевна

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И PIX ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Метаболизм белков в ЦНС Helix при обучении.

Раскрытие механизмов обучения и памяти - одна из сложнейших проблем современной биологии, решение которой невозможно без комплексных биофизических, биохимических и физиологических исследований функционирования клетки и клеточных ансамблей. Одним из наиболее удобных и многосторонне изучаемых объектов в этой связи является виноградная улитка. Однако многочисленным поведенческим, морфологическим и электрофизиологическим исследованиям, проводимым на этом объекте соответствуют крайне скудные знания, касающиеся молекулярных процессов, происходящих в ЦНС этих животных. В наибольшей степени это относится к молекулярным исследованиям механизмов формирования долговременных форм обучения.

У виноградных улиток вырабатывали условный оборонительный рефлекс закрытия дыхательного отверстия. В качестве условного стимула применяли легкое постукивание по раковине, безусловным стимулом служила струя воздуха в дыхательное отверстие. Интервалы между сочетаниями 3-4 минуты. Улитки получали по 15 пар стимулов в день. Псевдообученным улиткам условный и безусловный стимулы предъявлялись в несочетан-ном порядке.

Проведено 12 серий экспериментов с обучением. Каждая серия включала по 9 улиток: 3-обученных, 3 -псевдообученных и 3- интактных. Таким образом, в экспериментах проанализировали 36 обученных, 36 псевдообученных и 36 контрольных улиток (по 6 улиток на каждую точку).

Динамика обучения приведена на рис. 4. Из кривой обучения видно, что до 60 сочетаний практически нет реакций на предъявление условного стимула. Спустя 100 сочетаний стимулов процент положительных ответов достигает 30-40%. Резкое же увеличение числа реакций закрытия дыхальца наблюдается после предъявления улитке 120 сочетаний. 90-100% уровня обучаемости улитка обычно достигает после 165-180 сочетанных предъявлений условного и безусловного стимулов. Обучение улиток носит достаточно индивидуальный характер. Кривые обучения зачастую отличаются как по временной динамике обучения, так и по времени выхода на плато. Очень редко обучаемость не достигает 100%, останавливаясь на 80-90%.

После получения улитками 15, 30, 60, 90, 120, 240 сочетанных или несочетанных стимулов водорастворимые белки под-глоточного комплекса ганглиев подвергали диск-электрофорезу в 9,5% ПАА-геле, в системе Орнстейна-Дэвиса. В каждой дорожке нанесены белки экстрагированные из ЦНС одного животного.

Система буферов была подобрана для оптимального разделения нативных кислых относительно низкомолекулярных белков, к которым относятся многие нейроспецифические.

123

10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230

Рис. 4. Динамика выработки условного оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия на постукивание по раковине.

А - ассоциативное обучение (сочетанные стимулы). В - псевдообусловливание (несочетанные стимулы). По оси абсцисс - число предъявлений стимулов; по оси ординат - число закрытий дыхальца на 10 условных стимулов. Усреднение по 16 животным.

При анализе электрофореграмм обнаружили резкое увеличение количества белка с подвижностью ЯГ 0,58 на ранних стадиях обучения по сравнению с контролем (рис. 5, рис. 6). Сканирование гелей и количественная обработка денситограмм показали, что относительное содержание белка ИТ 0,58 у интактных животных составляет 3,0%±0,4% от содержания белков, разделяемых данным электрофоретическим методом. У улиток, получивших 15 сочетанных стимулов, относительное количество белка ИГО,58 возрастает в среднем в 2,9 раза по отношению к интакт-ным животным (отличие достоверно при р<0,01 по 1>критерию Стюдента) (рис. 7). При дальнейшем обучении (30-60 соч.) содержание этого белка начинает медленно снижаться, оставаясь достоверно (р<0,05) выше уровня контроля. К 90-120 сочетаниям количество белка ЯШ,58 возвращается к контрольному уровню (рис.7). Также не наблюдалось изменений по сравнению с контролем в содержании белка ни у одной из 6-ти улиток, получивших 240 сочетанных стимулов. В остальных белковых фракциях достоверных изменений нашими методами анализа не обнаружено.

Сходная динамика изменения содержания этого белка наблюдается и у псевдообученных животных (рис.7). При ассоциативном обучении, по сравнению с псевдообусловливанием, увеличение количества этого белка было несколько большим. Различие между ассоциативным обучением и псевдообусловливанием на ранних стадиях формирования данного оборонительного рефлекса в зоне белков ИТ 0,58 было статистически недостоверным.

Исследуемые стадии (от15 до 60 сочетаний) являются первым этапом обучения улиток и характеризуются высоким уров 5

Ям ЯН Ж

Rf 0.58

1 2 3 4 5 6

Рис. 5. Диск-электрофорез водорастворимых белков клеток ЦНС Helix при обучении. (9.5% ПАА-гель)

1, 2, 6 - Контроль

3 - Обучение 30 сочетаний

4 - Псевдообучение 30 сочетаний

5 - Обучение 60 сочетаний

Рис. 6. Денситограммы водорастворимых белков ЦНС виноградной улитки (9,5% ПАА-гель).

Обучение 30 соч. Псевдообучение 30 соч. Контроль. Полярность электродов Направление движения белков.

127

350 -г

300

15 30 60 90 120

Рис. 7. Изменение содержания белка Rf0,58 при обучении и псевдообучении Helix.

А- обучение В- псевдообучение

По оси абцисс- число пар стимулов; по оси ординат—содержание белка ( в % по отношению к контролю ). * Отличие от контроля достоверно при р<0,05 по t- критерию Стьюдента. (Усреднение по 6-ти независимым измерениям на каждую точку). нем ориентировочного рефлекса на "новизну", низким и неустойчивым числом положительных реакций на условный стимул, повышенным уровнем возбудимости нервной системы (Соколов, 1970; Максимова, Балабан, 1983).

Для проверки корреляции увеличения содержания этого белка с возникновением и угашением ориентировочных реакций была проведена серия экспериментов по пробуждению улиток из гибернации. Проснувшихся улиток помещали в аквариум и оставляли там на 2, 3, 6 и 24 часа. Результаты анализа полученных фореграмм показали резкое увеличение количества белка 0,58 в ЦНС виноградных улиток спустя 2, 3 и 6 ч после пробуждения. К концу суток уровень этого белка снижается (рис. 8 ). Эффект выражен значительно, относительное содержание белка при 6-часовой активности возрастает в среднем в 3,6 раза по сравнению с длительно ползающими (2 недели) животными. Отличие достоверно при р<0,01 (п=6).

Сравнение электрофореграмм водорастворимых белков ЦНС, почек, печени, придаточной железы показало отсутствие белка ЯГ 0,58 в почках, печени и придаточной железе (Гринкевич и др, 1984). На рисунке 9 в качестве иллюстрации приведены элек-трофореграммы белков ЦНС и придаточной железы, из которых видно отсутствие зоны Я!" 0,58 в придаточной железе. Кроме того, из нескольких пластин гелей нами была вырезана зона белка ЯШ,58 (в электрофорезах использовали гомогенаты, полученные из 40 животных получивших 1 5 стимулов), проиммуни-зированы кролики и получена иммунная сыворотка с титром 1/32. Методом радиальной иммунодиффузии не обнаружено линий преципитации с белками печени и почек (Гринкевич, 1992).

130

1 2 3

Рис. 9. Диск-электрофорез водорастворимых белков Helix в 9,5% ПАА геле.

1-половая железа,

2,3- ЦНС виноградной улитки

Таким образом, белок ИТ 0,58, вероятно, следует отнести к моз-госпецифическим (МСБ).

Для более полного описания белковых спектров подглоточ-ного комплекса ганглиев в процессе обучения водорастворимую фракцию ЦНС обученных и необученных животных подвергали изоэлектрофокусированию в ультратонких слоях ПАА гелей. Это позволило резко улучшить степень разрешения и четко выявить до 50~ти белковых зон. Наиболее сильные изменения были зарегистрированы при получении животными 15, 60 сочетаниях (рис.10). Однако, выявлены всего три фракции, количество белков в которых сильно увеличивается. По сравнению с контролем наблюдалось значительное увеличение количества белка в 3 фракции обозначенные стрелками при получении животными 15-ти стимулов и уменьшение во фракцию, обозначенную (рис.10).

При 60-сочетаниях растет количество белков, увеличивающихся при обучении, в кислой зоне спектра и уменьшается в основной. В остальных зонах достоверных изменений не зарегистрировано (рис.10).

Для изучения механизмов столь сильного увеличения количества кислого белка ИТ 0,58 нами была проведена серия экспериментов с включением радиоактивного предшественника в водорастворимые белки ЦНС виноградной улитки на разных стадиях обучения ( спустя 30 мин, 7ч и 24 ч после обучения).

У животных вырабатывали условный оборонительный рефлекс закрытия дыхальца. В этой серии экспериментов обработаны данные, полученные на 36-ти обученных и 18-ти контрольных животных. Проведено по шесть независимых экспериментов на каждую точку.

При сопоставлении оптического и радиоактивного профилей водорастворимых белков ЦНС виноградной улитки, получившей 15 сочетанных воздействий, обнаружено, что белок фракции N 10 (ИТ 0,58), количество которого резко возрастает при обучении, является относительно медленно обменивающимся, его количественный и интенсивный рост (на 200-300%) при 15-30 сочетаниях не сопровождается интенсификацией включения метки в расчете на 1 мг белка (рис.7, рис.11, рис.12, таблица 2). В отдельные сроки обучения наблюдается тенденция к снижению включения ниже контроля (таблица 2). Анализ оптических и радиоактивных профилей спустя 7 и 24 ч после обучения (30 и 120 сочетаний) также не выявил увеличения включения метки в эту фракцию (таблица 2, рис.11, рис.12 ). Спустя 24 ч после получения улитками 120 сочетаний наблюдается достоверное (р<0,05) снижение включения меченного предшественника в данную фракцию.

На всех этапах обучения отмечен рост включения метки во фракции наиболее кислых низкомолекулярных белков (фракции N 12,13). Особенно ярко этот эффект был выражен спустя 30 мин после обучения при 15 сочетаниях (рис.12).

Исходя из полученных данных, можно заключить, что динамика обмена исследуемых кислых белков у виноградной улитки на разных этапах обучения характеризуется достаточно сложной картиной. Интенсивность включения метки широко изменяется от фракции к фракции и претерпевает существенные изменения при воздействии активной функциональной нагрузки. Наряду с увеличением включения меченного предшественника в одни белковые фракции (N12,13) наблюдается угнетение этого вклю

- - 700

- -400

-100 фракций

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

N фракции

030 сочетаний, 30 минут О30 сочетаний, 7 часов В120 сочетаний, 24 часа

Рис. и. А Диск-электрофорез водорастворимых белков ЦНС Helix (7.5% ПАА-геле) столбики - профили радиоактивности

Процент включения меченого предшественника на 1 мг белка обученных животных по отношению к контролю. # - р<о.(Ю1., # - р<0.05

I \

15 сочетаний, через 30 минут Е130 сочетаний, через 30 минут

60 сочетаний, через 30 минут

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

N фракций

Рис. 12. Изменение включения меченого предшественника на 1 мг белка обученных животных в % по отношению к контролю спустя разное время после обучения. н 30 сочетаний через 7 часов - р<0.001 Ш120 сочетаний, через 7 часов - р<0.05 □ 20 сочетаний, через 24 часа чения в другие (N4). Следовые процессы, выраженные как в увеличении, так и в уменьшении скорости включения, сохраняются спустя 7 и даже 24 ч после обучения. Отмечается также ряд различий в интенсивности включения метки в ряд фракций в зависимости от стадии обучения (рис. 11, рис. 12).

Наиболее сильные изменения в процессе формирования оборонительного условного рефлекса наблюдались в белках фракции N10 (Rf0,58), 12, 13. Причем исключительный интерес представляет тот факт, что сильный количественный рост белка Rf0,58 не сопровождается интенсификацией его синтеза. Таким образом, резкий рост количества белка в цитоплазме не может быть объяснен увеличением синтеза de novo. Среди возможных причин этого феномена можно предположить выход белка из мембранных или иных клеточных структур, увеличение процес-синга медленно обновляющегося предшественника, распад на субъединицы крупного структурного белка и некоторые другие посттрансляционные изменения.

Таким образом, формирование оборонительного условного рефлекса у виноградной улитки можно разделить на три стадии.

Первая стадия, начальная, характеризуется генерализованной реакцией всей нервной системы, увеличивается возбудимость основной массы нейронов. В результате структурных модификаций нейрональной мембраны или цитоскелета происходит транслокация белка Rf0,58 в цитоплазму. Подобный механизм описан для каталитической субъединицы протеинкиназы А и а-субъединицы G-белка (Kandel, Schwartz, 1982; Kandel et al., 1983).

137

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На современном этапе развития нейробиологии одной из важных проблем является проблема молекулярно-генетических механизмов обучения и памяти. Результаты проведенных нами комплексных исследований с применением биохимических и молекулярно-генетических методов анализа позволили углубить и расширить существующие представления о механизмах вовлечения генома в формирование долговременной памяти и установить некоторые закономерности регуляции экспрессии генов при выработке ассоциативных и неассоциативных форм обучения. Наше внимание было сосредоточено на выяснении следующих аспектов этой проблеммы: активируется ли белковый синтез в ЦНС виноградной улитки при обучении, какие внутриклеточные сигнальные системы включены в этот процесс, какие транскрипционные факторы участвуют в регуляции экспрессии генов при формировании долговременных следов памяти и каков механизм их активации.

На первом этапе работы было обнаружено, что в процессе обучения в ЦНС виноградной улитки происходят значительные изменения метаболизма белков, связанные как с посттранскрипционной модификацией, так и с их синтезом. В этой связи формирование оборонительного условного рефлекса у виноградной улитки можно разделить на три стадии.

Первая стадия, начальная, характеризуется генерализованной реакцией всей нервной системы, увеличением возбудимости значительной популяции нейронов. В результате структурных модификаций нейрональной мембраны или цитоскелета происходит транслокация белка Rf0,58 в цитозоль нейрона. Ассоциативное обучение отличается от неассоциативного только количественной величиной эффекта как на мембранном (Kandel, Schwartz, 1982; Kandel et al., 1983), так и на изученном нами цитоплазматическом уровне. Таким образом, вероятнее всего в обоих механизмах на этой стадии доминируют сенситизацион-ные процессы, выражающиеся в повышенном уровне возбудимости нейронов на предъявление тестирующего стимула. Высокий уровень возбудимости и повышенное содержание белка с Rf 0,58, вероятно, необходимы для оптимизации условий замыкания условной связи. Для осуществления этого неспецифического процесса нет необходимости в повышении синтеза белка, однако, в это же время увеличивается синтез кислых нейроспецифи-ческих белков, необходимый, очевидно, для формирования долговременной памяти.

На третьей стадии (120-240 сочетаний) выработка обучения стабилизируется на максимально высоком уровне. Достоверные изменения в уровне белков наблюдаются только в командных нейронах оборонительного рефлекса, коррелируя со степенью нагрузки их рецепторных зон. Это кислые мозгоспецифические белки (МСБ), движущиеся вблизи анодного фронта. Корреляции обучения с увеличением, либо синтезом кислых МСБ у высших позвоночных животных установлена в работах Хидена с соавторами (Hyden et al.,1977). Однако следует отметить, что количественные эффекты, получаемые при обучении моллюсков, выражены гораздо сильнее.

Таким образом, нами обнаружено два класса белков, наиболее сильно изменяющихся в процессе обучения. Это, во-первых, белок с Rf 0,58, количественное перераспределение которого происходит между мембраной и цитозолем на ранних стадиях обучения, и, во-вторых, вновь синтезированные наиболее кислые нейроспецифические белки.

Процесс активации белка Rf 0,58 оказалось возможным имитировать серотонином - медиатором, играющим значительную роль в организации оборонительных форм пластичности у моллюсков (Балабан, Захаров, 1992; Малышев и др., 1997; Шевелкин и др., 1997). Инкубация подглоточного комплекса ЦНС Helix в физиологическом растворе, содержащем 10"4 М 5-НТ, вызывает значительное увеличение белка Rf 0,58 в водорастворимой фракции спустя 1-2 ч после отмывания серотонина. Сигнальное действие серотонина, по-видимому, передается через систему ГТФ-связывающих белков, так как инкубирование ЦНС в растворе, содержащем активатор ГТФ-связывающих белков фторид натрия, вызывает увеличение белка Rf0,58 в водорастворимой фракции, сравнимое с обучением и инкубацией с серотонином. На факт участия G-белков в механизмах формирования пластичности оборонительного поведения указывают также полученные нами данные по усилению ГТФ-азной активности у обученных животных по сравнению с контрольными.

Следовательно, начальные стадии формирования условного оборонительного рефлекса у Helix являются серотонин -индуци-бильными. Активация серотонином внутриклеточной цепи регуляции происходит через систему G-белков, что сопровождается транслокацией белка Rf 0,58. Подтверждением важной роли белка Rf0,58 в обучении являются наши эксперименты по исследованию белковых спектров ЦНС ювенильных улиток, неспособных к формированию сенситизации и долговременных форм условных оборонительных рефлексов (Балабан, Захаров, 1992). У этих улиток электрофоретическими методами анализа не обнаруживается даже следовых количеств белка Rf 0,58. Белок не появляется также при инкубации с серотонином и фторидом натрия . Данные эксперименты показали, что у ювенильных улиток наряду с недостаточной зрелостью системы серотонинэр-гических нейронов (Zacharov, Balaban, 1987), незрелым является также постсинаптическое звено. Подведение экзогенного серо-тонина не вызывает появления белка Rf 0,58.

Таким образом, формирование пластичности оборонительного поведения Helix сопровождается длительным изменением как мембранных характеристик нейронов ЦНС (Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992), так и изменением белкового метаболизма. Процесс запускается серотонином и опосредуется системой ГТФ-связывающих белков. Известно, что Gs -белки могут запускать каскад регуляторных реакций как цАМФ-зависимых, так и опосредуемых протеинкиназой. Более того, и ПКА, и ПКС могут принимать участие в регуляции механизмов пластичности (Abrains et al., 1991; Bacskai et al., 1993; Cooper et al., 1995). Анализ степени участия этих киназ в механизмах пластичности Helix показал увеличение активности ПКА как в мембранной, так и цитозольной фракциях, тогда как уровень ПКС был значительно ниже и не изменялся при обучении.

Для понимания молекулярных основ долговременных пластических перестроек с вовлечением генома необходимо было провести изучение экспрессии генов при обучении, в частности, проанализировать механизмы активации экспрессии генов посредством внутриклеточных регуляторных систем. В этой области в настоящее время разворачивается широкий фронт работ, однако ввиду сложности и многокаскадности регуляторных систем, вовлеченных в индукцию экспрессии генов, полученные данные носят еще фрагментарный характер.

Проведенные нами комплексные исследования по изучению активности транскрипционных факторов нескольких семейств позволили проанализировать возможные регуляторные пути, вовлекаемые в обучение Helix. Нами выявлена каскадная регуляция активности серотонин-индуцируемых цАМФ-зависимых транскрипционных факторов семейств CRE и С/ЕВР, а также транскрипционных факторов семейства АР-1 при формировании условного оборонительного рефлекса Helix. Полученные данные свидетельствуют не только о том, что в процессе обучения происходит экспрессия генов отдельных компонентов этих факторов, но и осуществляется необходимое для их активации фосфо-рилирование. цАМФ-индуцируемая активация транскрипционных факторов семейств С/ЕВР и АР-1 может быть значительно усилена повышением уровня внутриклеточного кальция. Учитывая, что у виноградной улитки при обучении наблюдается активация цАМФ и кальций-зависимых регуляторных систем, опосредующих действие условных и безусловных стимулов, можно предположить, что изучаемые нами транскрипционные факторы обеспечивают механизмы конвергенции этих стимулов, что, в свою очередь, может определить индукцию экспрессии определенных «поздних» генов пластичности, определяющих функционирование каналов цАМФ-зависимого тока (Щербатко, 1988) или формирование новых синаптических связей (Martin, Kandel, 1 996) и другие внутриклеточные процессы, лежащие в основе ассоциативного обучения.

Экстраклеточные сигналы, опосредующие действие безусловных стимулов (у моллюсков-серотонин) через Gs белки могут ак-тивировать цАМФ зависимый регуляторный каскад, вызывая транслокацию каталитической субъединицы ПКА в ядро. Фос-форилирование ПКА транскрипционного фактора CREBI (семейства CRE) активирует последний, вызывая индукцию экспрессии «немедленных ранних генов», в частности, c/ebp и c-fos. Эффективность экспрессии зависит от присутствия ингибиторных факторов CRE- семейства CREB II и CREM, активность которых модулируется иными протеикиназами, например MAP. Показана возможность индукции последней цАМФ-зависимым путем (Martin, Kandel, 1996). Свой вклад в регуляцию экспрессии c-fos также могут вносить другие цАМФ-зависимые транскрипционные факторы, например С/ЕВР, действуя через свои регулятор-ные сайты.

Так, увеличение активности фактора С/ЕВР зависит не только от экспрессии, регулируемой цАМФ зависимым путем, но и

5-НТ

Nucleus ис. 52. Схема регуляции экспрессии генов при нормировании долговременных форм пластичности

Возможные активационные пути;

Возможные ингибиторные пути;

Модуляторные пути;

• СаМК - кальмодулин-зависимая протеинкиназа;

• MAP - митоген-активируемая протеинкиназа;

• РКС, РКА - протеинкиназа С, А;

• СК-2 - казеинкиназа 2; CREB, CREB2, С/ЕВР, CREM, Elk-1, SRF, c-Fos, c-Jun, Jun-D, Fos-B - транскрипционные факторы;

• СВР - CREB-связывающий белок;

• CRE, SRE, AP-1, ERE - сайты регуляции;

• Rf 0.58 - белок. от его фосфорилирования калыдий-завиеимыми протеинкиназа-ми. В свою очередь, индукция экспрессии c-fos может быть усилена через элемент SRE, активация которого зависит от формирования тройного комплекса (2xSRF+ELK-l). При этом фосфорилирование SRF может осуществляться посредством ПКС, а фактора ELK-1 протеинкиназой RSK, индуцируемой МАР-киназой. Таким образом, процесс регуляции активности генов обусловливается взаимодействием нескольких протеинки-наз: ПКА, ПКС, СаМК, MAP, опосредующих эффекты нескольких сигнальных систем, отражающих влияние мотивационных, arousal, сенсорных и иных функционально-значимых стимулов, вовлекаемых в формирование ассоциативных форм обучения. Таким образом, различные сигнальные пути могут конвергировать, значительно усиливая (либо модулируя) экспрессию «ранних генов».

Второй уровень регуляции обеспечивается на уровне транскрипционных факторов семейства АР-1 (димеры белков семейства Fos и Jim). Транскрипционная активность этих комплексов зависит как от их состава (наиболее активен c-Fos + c-Jun), так и от фосфорилирования (МАР-киназой и СК2 для c-Jun).

Нами показана значительная активация транскрипционных факторов семейства АР-1 при обучении виноградной улитки. Так как АР-1 факторы представляют собой димеры белков c-Fos и с-Jun, то активация транскрипционных факторов семейства АР-1 может достигаться как через увеличение экспрессии гена c-fos, так и фосфорилирование c-jun. Проведенные эксперименты показали увеличение экспрессии гена c-fos в процессе формирования данного вида пластичности. CRE- индуцированная безусловным стимулом экспрессия гена c-fos может быть усилена как через С/ЕВР-связывающие регуляторные элементы, так и через сайты SRE путем кальций-зависимой активации протеинкиназ MAP и ПКС и фосфорилирование ими факторов SRF и Elk-1. В свою очередь, СаМК может участвовать в фосфорилировании CREB связывающего белка СВР, сопрягающего транскрипционные факторы с РНК-полимеразным комплексом.

Проведенные нами эксперименты с блокированием Са/кальмодулин-зависимых и митогенактивируемых протеинкиназ в условиях взаимодействия цАМФ-индуцируемых и кальций-зависимых регуляторных путей показали значительное уменьшение активности факторов АР-1 при их применении. При блокаде СаМК и особенно МАР-киназ наблюдается также значительное снижение активности транскрипционных факторов С/ЕВР.

Следует отметить, что наряду с ПКА, значительное место в активации факторов транскрипции принадлежит MAP- киназе. Ее возможная роль в механизмах пластичности в настоящее время интенсивно исследуется.

Кроме фосфорилирования транскрипционных факторов CREBII и С/ЕВР (Martin et al., 1997)), эта киназа играет исключительно важную роль в механизмах формирования новых си-наптических контактов. Введение антител против MAP- киназы или ее блокаторов предотвращает интернализацию мембранно-ассоциированной формы молекулы клеточной адгезии (САМ) у Aplysia. Предполагается, что интернализация мембранно-ассоциированной формы САМ нарушает аксон-аксональные адгезивные контакты, что приводит к формированию новых синаптических связей (Bailey et al., 1997). Следует отметить, что этот процесс также зависит от РНК-белкового синтеза и связан с цАМФ-зависимой индукцией синтеза гидролазы, фермента разрушающего интернализованную САМ (Hegde et al. 1997) и легкой цепи клатрина (необходим для формирования покрытых впадин и везикул, с помощью которых идет процесс интернали-зации (Ни et al. 1993).

Данные, свидетельствующие о важности АР-1 факторов в формировании долговременных оборонительных условных рефлексов, получены нами также в онтогенетических исследованиях.

Известно, что созревание механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов у Helix происходит в постна-тальном онтогенезе. В возрасте до 4,5-х мес у виноградных улиток затруднена выработка этих форм поведения, что связывают с недостаточной зрелостью системы серотонинэргических нейронов. Как показано нами, у этих улиток нарушенным является также метаболизм белков, принимающих участие в обучении. Наши эксперименты с применением "gel shift" анализа показали, что уровень ДНК-связывающей активности факторов CRE и С/ЕВР у ювенильных животных сравним со взрослыми. Однако у ювенильных животных наблюдается значительное нарушение формирования факторов АР-1 (нашими методами анализа у ювенильных улиток не выявляются активированные транскрипционные факторы АР-1 семейства, активирующиеся при обучении в ЦНС взрослых улиток). Не наблюдается также появления этих изоформ факторов АР-1 при инкубации ЦНС с серотонином, форсколином, кальциевым ионофором.

Таким образом, у ювенильных улиток отсутствие способности к формированию сенситизации и условных оборонительных рефлексов сопровождается нарушением формирования и/или активации транскрипционных факторов семейства АР-1. Отсутствие этих факторов у ювенильных улиток может быть обусловлено как повышенной репрессией отдельных генов этого семейства, так и незрелостью путей активации, обеспечивающих фосфорилирование белков этих генов. Учитывая, что при обучении Helix увеличивается экспрессия гена c-fos, представлялось вероятным, что нарушения в формировании факторов АР-1 у ювенильных Helix могут быть связаны с нарушением экспрессии c-fos, предположительно обусловленной элементами SRE, так как нарушения транскрипционных комплексов CRE и С/ЕВР у этих улиток нами не обнаружено. Сравнительные онтогенетические эксперименты по изучению формирования комплексов SRE показали наличие дополнительной полосы задержки этих факторов при электрофорезе у ювенильных животных по сравнению со взрослыми. Наличие этих полос отражает присутствие дополнительных форм транскрипционных факторов, возможно ингиби-торных, взаимодействующих с элементом SRE у ювенильных улиток.

Таким образом, наряду с недостаточной зрелостью формирования серотонинэргической системы нейронов (Балабан, Захаров, 1992), у ювенильных улиток наблюдаются различия в формировании транскрипционных факторов семейства АР-1, что, в свою очередь, вероятно является причиной нарушения сигнальной трансдукции серотонина.

Полученные нами данные вносят вклад в понимание механизмов экспрессии генов, вовлекаемых в процесс приобретения новых навыков. Как нам представляется, перспективными в дальнейшем исследованиями в этом направлении являются: определение композиционного состава транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, участвующих в формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения, а также изучение вклада различных внутриклеточных регулятор-ных систем в активацию транскрипционных факторов в отдельных функционально различных нейронах.

Дальнейшее изучение путей активации транскрипционных факторов, их композиционного состава, изучение механизмов конвергенции внутриклеточных сигнальных систем в различных компартментах клетки будут способствовать углублению наших знаний в области молекулярных и генетических механизмов памяти и обучения.

1.Выработка ассоциативных и неассоциативных форм оборонительного поведения виноградной улитки вызывает существенные изменения метаболизма кислых мозгоспецифических белков, заключающиеся как в модификации и перераспределении предсуществующих белков (ранние стадии обучения), так и синтезе новых (ранние и поздние стадии обучения), что свидетельствует о вовлечении генома в процесс формирования долговременных форм обучения. Анализ водорастворимых белков идентифицированных нейронов показал, что наиболее длительные изменения содержания кислых нейроспецифических белков, движущихся с анодным фронтом, наблюдаются в командных нейронах оборонительного поведения, вовлекаемых в формирование условного оборонительного рефлекса.

2. Моделирование действия безусловного стимула серотони-ном вызывает однонаправленное с обучением влияние на динамику белка Rf 0.58, что подтверждает важную роль серотонина в обучении Helix. Эффекты серотонина на внутриклеточные процессы опосредуются ГТФ-связывающими белками, о чем свидетельствуют наши данные о сходном влиянии серотонина и активатора G-белков фторида натрия на индукцию белка Rf 0,58, а также полученные сведения об активации G-белков при обучении Helix.

3. В формировании условного оборонительного рефлекса пищевого избегания Helix принимает участие цАМФ -зависимая регуляторная система. Активация ПКА может осуществлятся безусловным стимулом посредством серотониновой индукции Gбелков. В пользу этого предположения свидетельствуют как литературные сведения об имитации серотонином эффектов ноцицептивных стимулов и повышение уровня цАМФ в нейронах под действием серотонина, так и наши данные об индукции серотонином белка Rf 0,58 активируемого при обучении.

4. Выработка условного оборонительного рефлекса пищевого избегания Helix приводит к увеличению ДНК-связывающей активности цАМФ-регулируемых транскрипционных факторов семейств CRE, С/ЕВР и АР-1, при этом наблюдается последовательная активация этих факторов. Данные об увеличении ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов свидетельствуют о том, что в процессе обучения происходит не только активация экспрессии "ранних генов", продукты которых являются компонентами транскрипционных факторов, но и осуществляется их фосфорилирование, необходимое для формирования активных димеров.

5. Однонаправленные с обучением эффекты на формирование активных транскрипционных факторов АР-1 и С/ЕВР в условиях изолированной ЦНС вызывает серотонин-индуцируемый, цАМФ-зависимый регуляторный путь. При этом значительное усиление серотониновой активации данных транскрипционных факторов достигается посредством увеличения концентрации внутриклеточного кальция. Кооперативная активация транскрипционных факторов цАМФ и кальций -зависимыми регуляторными системами очевидно лежит в основе одного из механизмов конвергенции путей условного и безусловного стимулов.

6. Важная роль в опосредовании кальциевых сигналов принадлежит митогенактивируемым и Са/кальмодулинзависимым протеинкиназам. Нами показано, что ингибирование митогенактивируемых и Са/кальмодулин- зависимых протеинкиназ (блокаторами РД 98059 и KN62- соответственно) снимает эффекты кальций- зависимого потенциирования серотонин-индуцируемой активации транскрипционных факторов семейств С/ЕВР и АР-1.

7. Незрелость рецепторного звена серотонин-обусловленной модуляции оборонительного поведения Helix, а также нарушения в формировании транскрипционных факторов АР-1 может явиться причиной неспособности ювенильных улиток к выработке сенситизации и условных оборонительных рефлексов. Нарушения формирования транскрипционных комплексов АР-1 у ювенильных улиток возможно связаны с наличием у них ингибиторных форм транскрипционных факторов, взаимодействующих с элементом SRE.

8. Транскрипционные факторы участвуют в обеспечении механизмов конвергенции стимулов различной модальности, взаимодействующих при выработке обучения. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о потенциации цАМФ-зависимой активации транскрипционных факторов семейств С/ЕВР и АР-1 кальций-индуцируемыми регуляторными системами.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гринкевич, Лариса Николаевна, Санкт-Петербург

1. Гринкевич J1.Н., Штарк М.Б., Гайнутдинов X.JI. К микрохимическому исследованию белкового спектра идентифицированных нейронов виноградной улитки Helix pomatia. Докл. АН СССР. 230(5): 1254-1256. 1976.

3. Shtark М.В., Grinkevich L.N., Deriy B.N., Zapara Т.A., Tretyakov V.P. On the plastisity of a Simple Nervous System. In: Neuronal plasticity and memory formation (Eds. A.Marsan,H.Matties). Raven Press, N.-Y.: 271-283. 1982.

4. Гринкевич JI.H., Сафронова О.Г, Штарк М.Б. Водорастворимые белки подголоточного комплекса ганглиев виноградной улитки на ранних стадиях обучения. Бюлл. эксперим биологии и медицины. (10): 429-432. 1984.

5. Гринкевич JI.H. Изучение обмена мозгоспецифических белков виноградной улитки при обучении. Всес.конф.:"Простые нервные системы и их значение для теории и практики". КГУ. Казань. 50-51. 1985.

6. L.N. Grinkevich, O.G. Safronova, М.В.Shtark. Water soluble proteins of Snail subesophageal Ganglia at early stages of learning. Advances in the Biosciences, Pergamon Press ed.H.Matties Oxford-NewYork. 59: 209-212. 1986.

7. Гринкевич Л.H., Лисачев П.Д., Штарк М.Б. Влияние аце-тилхолина на синтез белка в идентифицированных нейронах виноградной улитки. Нейрохимия. 7(2): 251-254. 1988.

8. Гринкевич Л.Н. Молекулярные основы формирования оборонительного поведения моллюсков. В сб.: Простые нервные системы, ред. Д.А.Сахаров. Наука. Л. 74-78. 1988.

9. Гринкевич Л.Н. Динамика включения (3Н)-лейцина в белки ЦНС виноградной улитки при обучении. Нейрохимия. 8(1): 56-63. 1989.

10. Гринкевич Л.Н., Береговой Н.А, Гайнутдинов Х.Л., За-пара Т.А., Лисачев П.Д., Ратушняк A.C. Исследование нейро-нальной пластичности. Биологические мембраны. 8(11): 1163. 1991.

11. Grinkevich, L.N. Bérégovoy N.A, Gainudinov Kh.L, Zapara T.A., Ratushnvak A.S, Lisachov P.D. Study of a neuronal plasticity. Biological membranes. 5(11): 1736. 1992.

12. Гринкевич Л.Н. Метаболизм белков в формировании оборонительного рефлекса моллюсков. Журн. высш. нервн. дея-тел. имени И.П. Павлова. 42(6): 1221-1229. 1992.

13. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Штарк М.Б. Нейрохимические корреляты пластичности. Журн. высш. нервн. деятел. имени И.П. Павлова. 43(5): 963-968. 1993.

14. Grinkevich L.N., Lisachov P.D, Nagibneva I.N. The studyof the learning-related proteins in Helix. Simple nervous systems. ISIN. P.13.1994.

15. Grinkevich L.N. Protein metabolism during formation of aversive conditioning in molluscans. Neuroscience and behavioral physiology, N.-Y. 24:1105-1110. 1994.

16. Гринкевич Л.H., Нагибнева И.H., Лисачев П.Д. Условный оборонительный рефлекс у виноградной улитки (молеку-лярно-генетические аспекты). Физиологичекий журнал им. И.М.Сеченова. 81(8):24-28. 1995.

17. Grinkevich L.N., Lisachov P.D., Nagibneva I.N., Toporkova L.B. Intracellular regulation of plasticity in Helix. Acta Biologica Hungarica. 46(2-4):263-266. 1995.

18. Гринкевич Л.H., Топоркова Л.H, Лисачев П.Д, Изварина Н.Л. Роль G-белков и систем вторичных посредников в пластичности оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Журнал высш. нервн. деят. имени И.П. Павлова 46(5): 886-891. 1996.

19. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Изварина Н.Л. Изучение роли G-белков в формировании условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Нейрохимия. 13(3):222. 1996.

20. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д. Десенситизация ответа на серотонин в мозге виноградной улитки при обучении. 3-й Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока, с.48. 1997.

21. Grinkevich L.N., Lisachev P.D, Nagibneva I.N., Conditioned defensive reflex in the edible snail (molecular-genetic aspects). Neuroscience and Behavioral Physiology. 27(3): 216-220. 1997.

22. Grinkevich L.N., Toporkova L.B., Lisachev P.D., Nagibneva I.N. Pathways of regulation of c-fos expression duringlearning in Helix. Simple nervous systems, The 5th east European Congress. P.23. 1997.

23. Гринкевич JI.H., Меркулова Т.И., Лисачев П.Д. Активация транскрипционных факторов CRE и API семейств коррелирует с развитием пластичности у Helix. Журн. высш. нерв. деят. имени И.П. Павлова 48(6): 1037-1042. 1998.

24. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д. Роль транскрипционных факторов и пути регуляции их активности в механизмах пластичности Helix. В сб.: "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино. С.141-144. 1998.

25. Grinkevich L.N., Merculova Т.I.CRE and API families of DNA transcription factors and Helix memory. J.of Neurochem. 71(1):61. 1998.

26. Grinkevich L.N., Toporkova L.B., Lisachev P.D., Izvarina N.L. Role of G-proteins and second messanger systems in the plasticity of the avoidence reflex in Helix. Neurosci. and Behav. Physiol. 28(2): 101-106. 1998.

27. Лисачев П.Д., Гринкевич Л.Н. Изменение характера нейромодулярных эффектов серотонина при обучении виноградной улитки. 17й Всероссийский съезд физиологов, Ростов-на-Дону. С.29. 1998.

28. Гринкевич Л.Н., Васильев Г.В., Возможные молекуляр-но-клеточные механизмы регуляции экспрессии генов при обу1. БЛАГОДАРНОСТЬ:

29. Данная работа была выполнена благодаря тесному сотрудничеству с коллективами лабораторий институтов Санкт-Петербурга, Новосибирска и Москвы.

30. Выражаю свою признательность Лисачёву П.Д., с которым мы бок о бок проработали многие годы, а также Сенькову О.В., Глущенко Т.С. и Романовскому Д.Ю. за помощь в техническом оформлении диссертации.

31. Выражаю искреннюю благодарность всем коллегам, работающим на нервной системе моллюсков, результаты работ которых, явились толчком для проводимых мной исследований.

32. Я искренне признательна Самойлову М.О., взявшего на себя тяжёлую ношу научного консультанта.

33. Выражаю признательность своему деду, Пащенко Григорию Николаевичу, который в далёком киргизском селе создал культ

34. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

35. Анохин К.В. Молекулярные сценарии консолидации долговременной памяти. Журн. Высш. Нерв. Деят. 47(2): 261279. 1997.

36. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и развитие общая основа двух явлений. Наука. М. 1992.

37. Балабан П.М., Литвинов Е.Г. Командные нейроны в дуге безусловного рефлекса виноградной улитки. Ж. высш. нерв, деят. 27: 3538-3543. 1977.

38. Береговой H.A., Гайнутдинов Х.Л., Сафронова О.Г., Штарк М.Б. Электрофизиологическое и нейрохимическое исследование долговременной сенситизации у виноградной улитки. Бюл.эксперим. биологии и медицины. 106 (9): 259-261. 1988.

39. Березин В.А., Белик Я.В. Специфические белки нервной ткани. Киев. Наук, думка. 1990.

40. Богданов Ю.Д., Овчинников Д.А., Балабан П.М., Белявский A.B. HCSl-новый ген, специфичный для гигантских интернейронов плевральных и париетальных ганглиев нервной системы виноградной улитки Helix lucorim. Доклады Академии наук. 335 (2): 246-250. 1994.

41. Воронин Л.Г. Физиология высшей нервной деятельности. М., 253 е., 1979.

42. Вингендер Э. Классификация транскрипционных факторов эукариот. Молекулярная биология. 31 (4): 584-600. 1997.

43. Гелетюк В.И. Электрические и морфологические характеристики нейронов изолированного мозга в условиях культуры ткани. Диссерт. канд. биол. наук. Пущино. 1973.

44. Греченко Т.Н. Нейрофизиологические механизмы памяти. М., "Наука", 1979.

45. Гринкевич JI.H. Микрохимические исследования белковых спектров командных нейронов условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Докл. АН СССР. 259 (1): 248-250. 1980.

46. Дьяконова Т.Л., Ш.-Рожа К. Действие ЕМКБамида на электрические и пластические свойства идентифицированных нейронов виноградной улитки. Журн. Высш. Нервн. Деят. 36(4) : 751-759. 1986.

47. Дятлов В.А. Роль ионов кальция в процессах модуляции серотонином ответов нейронов виноградной улитки на аппликацию ацетилхолина. Нейрофизиология. 20(5): 666-671. 1988.

48. Дятлов В.А., Платошин A.B. Влияние ионов кальция на ацетилхолин-индуцируемый ток в нейронах моллюска. Нейрофизиология. 22(4): 553-556. 1990.

49. Емельянов H.A., Самойлов М.О. Молекулярно-клеточные механизмы долговременной потенциации. Успехи Физиол. Наук. 27(3): 29-33. 1996.

50. Захаров И.С., Балабан П.М. Изменение оборонительной реакции виноградной улитки в онтогенезе. Журн. Высш. Нерв. Деят. 30: 1074-1078. 1980.

51. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Балабан П.М. Сравнение серотонин- и дофаминергической нейронных систем у половозрелых и ювенильных наземных моллюсков Helix и Eobania. Журн. высш. нервн. деят. 46 (3): 563-575. 1997.

52. Кононенко Н.И., Осипенко О.Н. Участие циклазной системы клетки в опосредовании эффектов некоторых нейропеп-тидов на электрические свойства нейронов виноградной улитки.

53. В кн.; Внутриклеточная сигнализация. Наука., Москва: 55-63. 1988.

54. Кругликов Р.И. Нейрохимические механизмы обучения и памяти. Наука. Москва. 1981.

55. Кузнецова J1.A. Успехи в изучении серотониновых рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой в тканях позвоночных и беспозвоночных животных. 34(2): 256-266. 1998.

56. Кузьмин В.В., Матвеев В.В., Пресман Е.К., Сандахчиев Л.С. Простая процедура количественного хроматографического анализа в ультра- микрошкале. Биохимия. 34 (4): 706-711. 1969.

57. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. Мир. М. 1980.

58. Лакин Г.Ф. Биометрия. Высшая школа. М. 1973.

59. Литвинов Е.Г., Логунов Д.Б. Изменения возбудимости нейрона в начальный период формирования условного рефлекса у виноградной улитки. Журн. В.Н.Д. 29(2): 284-293. 1979.

60. Литвинов Е.Г., Стронгин А.Н., Максимова O.A. Элек-трофоретическое изучение белков центральной нервной системы улитки Helix pomatia при выработке условной реакции. Ж. эвол.биохим. и физиол. 15(2): 162-165. 1976.

61. Литвинов Е.Г., Максимова O.A., Балабан П.М., Маси-новский Б.П. Условная оборонительная реакция виноградной улитки. Журнал высш.нерв.деят. 26(1): 203-206. 1976.

62. Лопатина Н.Г., Пономаренко В.В. Исследование генетических основ высшей нервной деятельности. Стр. 9-59. «Физиология поведения. Нейробиологические закономерности». Л., «Наука», 1987 г.

63. Максимова O.A. Выработанные реакции у виноградных улиток. Диссертация, канд.биол.наук. М. 1980.

64. Максимова O.A., Балабан П.М. Нейронные механизмы пластичности поведения. Наука. М.126 с. 1983.

65. Малышев А.Ю., Браваренко Н.И., Пивоваров A.C., Балабан П.М. Влияние уровня серотонина на постсинаптически индуцированную потенциацию ответов нейронов улитки. Журн. высш. нервн. деят. 47 (3): 553-562. 1997.

66. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Методы генетической инженерии. Мир. Москва. 1984.

67. Мартынюк А.Е. Предотвращение с помощью цАМФ спада кальциевого входящего тока в мембране внутриклеточно перфузируемых нейронов виноградной улитки, Сборн. "Внутриклеточная сигнализация". Наука: 44-48. 1988.

68. Морозова Т.М., Левашова З.Б., Нагибнева И.Н., Pay В.А., Сидоркина О.М. Участие трансмембранных систем посредников в действии стероидных гормонов на клетки-мишени. Физиологический журнал СССР им. И.М.Сеченова. 76 (9): 11791186. 1990.

69. Никитин В.П., Козырев С.А., Самойлов М.О. Нейрофизиологические изменения и динамика связанного кальция при выработке ассоциативного обучения у виноградной улитки. Нейрофизиология. 24 (6): 691-701. 1992.

70. Никитин В.П., Козырев С.А., Самойлов М.О. Обусловливание и сенситизация у виноградной улитки: нейрофизиологические и метаболические особенности. Журн. высш. нервн. деят. 42 (6): 1260-1270. 1992.

71. Никитин В.П., Сам ой л ов М. О., Козырев С.A. Me хан из-мы выработки сенситизации у виноградной улитки: участиекальция и кальмодулина. Журн. высш. нервн. деят. 42 (6): 12501259. 1992.

72. Никитин В.П., Козырев С.А. Действие блокаторов синтеза белка на нейрональные механизмы сенситизации виноградной улитки. Нейрофизиология. 25 (2): 478-481. 1993.

73. Никитин В.П., Судаков К.В. Механизмы интегративной деятельности нейронов. Успехи физиол. Наук. 28(1): 27-46. 1997.

74. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Наука.М.: 4-45.1983.

75. Палладии A.B., Белик Я.В., Полякова Е. М. Белки головного мозга и их обмен. Киев. Наукова думка. 1972.

76. Певзнер J1.3. Функциональная биохимия нейроглии. JL, Наука. 1972.

77. Перцева М.И., Кузнецова JI.A. Проблема полиморфизма субъединиц GTP-связывающих белков и ее эволюционные аспекты. Укр. биохим. журн. 62 (3): 3-16. 1990.

78. Пивень Н.В., Штарк М.Б. Иммунохимические исследо-ваниябелка S-100 в нейронах и глии виноградной улитки (Helix pomatia). Бюлл. экспер. биол. мед. 82 (12): 1501-1503. 1976.

79. Савватеева Е.В. Генетический контроль систем вторичных посредников и их роль в обучении. Усп. совр. генетики АН СССР. 17: 33-99. 1991.

80. Самойлов М.О. Базисные молекулярно-клеточные механизмы адаптивных реакций мозга. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 81 (8): 3-11. 1995.

81. Самойлов М.О. Мозг и адаптация: молекулярно-клеточные механизмы. -СПб.: Ин-т физиологии им. И.П.Павлова РАН.: 272 с. 1999.

82. Сафронова О.Г. Исследование водорастворимых и мембранных белков центральной нервной системы виноградной улитки на разных стадиях долговременной сенситизации. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 103 (3): 266-268. 1987.

83. Сахаров Д. А. Множественность нейротрансмиттеров. Журн. Эволюц. Биохимии и физиологии. 26 (5): 733-741. 1990.

84. Сахаров Д.А. Генеалогия нейрона. "Наука". М. 1974.

85. Соколов E.H. Детектор, командный нейрон и пластическая конвергенция. Журн. высш. нервн. деят. 27 (4): 691-697. 1977.

86. Соколов E.H. Нейронные механизмы обучения. Изд-во МГУ. М. 101с. 1970.

87. Соколов E.H. Нейронные механизмы памяти и обучения. Наука. М. 1981.

88. Соколов E.H. Архитектура рефлекторной дуги. Журн. высш. нервн. деят. 42 (6): 1064-1074. 1992.

89. Степанов И.И., Лохов М.И., Специфичность облегчения выработки условного рефлекса у виноградной улитки гемолимфой обученного животного. Докл. Акад. Наук СССР. 18(2): 465469. 1985.

90. Ткачук В.А. Роль и место циклических нуклеотидов в нейроэндокринной регуляции клеток. Биол. Науки. 6: 5-17. 1987.

91. Тр етьяков В.П., Дерий Б.И. Моделирование условной реакции командных нейронов на изолированной ЦНС виноградной улитки. ДАН СССР. 246 (2): 750-752. 1979.

92. Турпаев Т.М., Юрченко О.П., Рожа К.Ш. Два типа взаимодействия серотоиина и ацетилхолииа на идентифицированных нейронах мозга виноградной улитки. ДАН СССР, 270(6): 1505-1508. 1983.

93. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М. Медицина. 295 с. 1975.

94. Шевелкин А.В., Никитин В.П., Козырев С.А. Серотонин имитирует некоторые нейрональные эффекты ноцицептивной сенситизации виноградной улитки. Журн. Высш. нервн. деят. 47 (3): 532-542. 1997.

95. Штарк М.Б. Мозгоспецифические белки (антигены) и функции нейрона. М.: Медицина. 1985.

96. Щербатко А.Д. Изменения проницаемости нейрональ-ной мембраны, индуцированные повышением внутриклеточного уровня цАМФ. В кн.; Внутриклеточная сигнализация. Наука., Москва: 63-70. 1988.

97. Элкон Д.Л. Память и нейронные системы. В мире науки. 9: 16-25. 1989.

98. Abel T.Y., Kandel Е. Positive and negative regulatory mechanisms that mediate long-term memory storage. Brain Res. Rev. 26 (1): 360-378. 1998.

99. Abel Т., Martin K.C., Bartsch D., Kandel E.D. Memory suppressor genes: inhibitory constraints on the storage of long-term memory. Science. 279: 338-341. 1998.

100. Abel Т., Nguyen P.V., Barad M, Deuel TAS, Kandel ER, Bourtchouladze R. Genetic demonstration of a role for PKA in the late phase of LTP and in hippocampus-based long-term memory. Cell. 88: 615-26. 1997.

101. Abrams T.W., Kevin A.K., Kandel E.R. Biochemical studies of stimulus convergence during classical conditioning in Aplysia: dual regulation of adenylate cyclase by Ca2+/calmodulin and transmitter. J.Neurosci. 11(9): 2655-2665. 1991.

102. Agranoff B. W. Biochemical events mediating the formation of short-term and long-term memory. Neurobiological basis of learning and memory. Ed.Y.Tsukada, B.W.Agranoff. New York: Wiley. 1980.

103. Akers R.F., Lovinger D.M., Colley P.A. Translocation of protein kinase C activity may mediate hippocampal long-term potentiation. Sciense. 231: 587-589. 1986.

104. Albert K.A., Helmer-Martijek N.F., Nair A.C., Muller T.H., Haycock J.W., Greene L.A. Calcium phospholipid-dependent protein kinase (protein kinase C) phosphorylates and activates tyrosine hydroxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 7713-7717. 1984.

105. Alberini C.M., Ghirardi M., Metz R., Kandel E.R. C/EBP is an immediate-early gene re-quired for the consolidation of long-term facilitation in Aplysia. Cell. 76: 1099-1114. 1994.

106. Alkon D.L., Naito S., Kubota M., Chen C., Banc B., Smallwood J., Gallant P., Rasmussen H. Regulation of hermissenda K+ channels by cytoplasmic and membrane-associated C-kinese. J. Neurochem. 51(3): 903-917. 1988.

107. Angel P., Karin M. The role of Jun, Fos and AP-1 complex in cell- proliferation and transformation. Biochem. Biophys. Acta. 1072 (1): 129-157. 1991.

108. Anokhin K.V., Rose S.P.R. Learning-induced increase of immediate early gene messenger PHK in the chick forebrain. Europ. J. Neurosci. 3: 162-167. 1991.

109. Antoni F.A., Palkovits M., Simpson J., Smith S.M., Leitch A.L., Rose R., Fink G., Paterson J.M. Ca2+/calmodulin-inhibited adenylyl cyclase hoghly abundant in forebrain regions is impotant for learning and memory. J. Neurosci. 18 (23): 9650-9661. 1998.

110. Appleman M.M., Ariano M.A., Takemoto D.J., Whitson L.H. Cyclic phosphodiesterase, in handbook of experimental pharmacology. Berlin. Heidelberg. 58 (2): 261-301. 1982.

111. Armstrong R.C., Montminy M.R. Transsynaptic control of gene expression. Ann. Rev. Neurosci. 16 (1): 17-29. 1993.

112. Atkins C.M., Selcher J.C., Petraitis J.J., Trzaskos J.M., Sweatt J.D. The MARK caskade is required for mammalian associative learning. Nature neurosci. 1 (7): 602-609. 1998.

113. Bacskai B.J., Hochner B., Mahaut-Smith M., Adams R.,Kaang B-K., Kandel E.R., Tsien R.Y. Spatialy resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260 (1): 222-226. 1993.

114. Bading H., Ginty D.D., Greenberg M.E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct signaling pathwaes. Science. 260: 181-186. 1993.

115. Bading H., Greenberg M.E. Stimulation of protein tyrosine phosphorylation by NMDA receptor activation. Science. 253: 912914. 1991.

116. Bailey C.N., Chen M., Keller F., Kandel E.R. Serotonin-mediated endocytosis of ap CAM: an early step of learning-related synaptic growth in Aplysia. Science. 256: 645-649. 1992.

117. Bailey C.H., Kaang B.K., Chen M. Mutation in the phosphorylation sites of MAP kinase brocks learning-related internalization of CAM in Aplysia sensory Neurons. Neuron. 18 (6): 913-924. 1997.

118. Bailey C.H., Kandel E.R. Structural changes underlying long term memory storage in Aplysia: a molecular perspective. Neurosci. 6: 35-44. 1994.

119. Balaban P.M., Zakharov I.S. Serotonin and aversive conditioning in adult and juvenile snails .In: Cellular mechanisms of conditioning and behavioral plasticity. Plenum Press.N.Y.London. 1988.

120. Barnes C.A. Involvement of LTP in memory: Are we searching under the street light? Neuron. 15: 751-754. 1995.

121. Barria A., Muller D., Derkach V., Griffith L.C., Soderling T.R. Regulatory phosphorylation of AMPA-type glutamate receptors by CaM-KII during long-term potentiation. Science. 276: 20422045. 1997.

122. Bartsh D., Ghirardi M., Skehal P.A. Aplysia CREB 2 represses long-term facilitation relies of repression converts transient facilitation into long-term funcitional and structural change. Cell. 83(2): 979-992. 1995.

123. Barzilai A., Kennedy T.E., Sweatt J.D., Kandel E.R. 5-HT modulates protein synthesis and the expression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysia sensory neurons. Neuron. 2: 1577-1586. 1989.

124. Beavo J., Beehtel J., Krebs E. Preparation of homogenous cAMP-dependent protein kinases and its subunits from rabbit skeletabl muskle. Methods Enzymol. 38: 299-308. 1994.

125. Bito H., Deisseroth K., Tsien R.W. CREB phosphorylation and dephosphorylation: Ca2+ and stimulus duration-dependent switch for hippocampal gene expression. Cell. 87: 1203-1214. 1996

126. Blanquet P.R. Neurotrophin-induced activation of casein kinase II in rat hippocampal slices. Neuroscie. 86: 739-749. 1998.

127. Blendy J.A., Kaestner K.H., Schmid W., Gass P., Schutz G. Targeting of the CREB gene leads to up regulation of a novel CREB mRNA isoform. EMBO J. 15: 1098-1106. 1996.

128. Blin N., Stafford D.W. Izolation of high molecular weight DNA. Nuclear asid res. Sep;3(9):2303-2308. 1976.

129. Bockaert, Homburgen V., Rouot B. GTP-binding protein: a key role in cellular communication. Biochem. 69: 329-338. 1994.

130. Bogdanov Yu. D., Balaban P. M., Zakharov I. S., Poter-yaev D. A., Belyavsky A. V. Identification of two novel genes specifically expressed in the D-group neurons of the terrestrial snail CNS. Invert. Neurosci. 2(1): 61-69. 1996.

131. Bohnert J.Z., Malencik D.A., Anderson S.R., Teller D., Fisher E.H. Reconstitution of types 1 and 2 cAMP-dependent protein kinases. Biochem. 2: 5563-5570. 1982.

132. Bourtchuladze R., Frenquelli B., Blendy J., Cioffi D., Schutz G., Silva A. J. Deficient long-term memory in mice writh a targeted mutation of the cAMP-responsive element-binding protein. Cell. 79 (1): 59-68. 1994.

133. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal. Biochem. 72(1,2): 248-254. 1976.

134. Braun A.P., Schulman H. The multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase, from form to function. Annu. Rev. Physiol. 57: 417-445. 1995.

135. Bray P., Carter A., Simons S. Human cDNA clones for four species of Ga signal transduction protein. Proc. Natl. Acad. USA. 83 (23): 8893-8897. 1986

136. Byrne J.H. Cellular analysis of associative learning. Physiol. Reviews. 67 (2): 329-439. 1987.

137. Cambi F., Fung B. Chikazaishi D.M. 5'-flanking sequence direct cell-specific expression of rat tyrosine hydrozylase. J. Neurochem. 53: 1656-1659. 1989.

138. Carew T.J., Hawkins R.D., Kandel E.R. Differential classical conditioning of a defensive withdrawal reflex in Aplysia californica. Science. 219 (4583): 397-400. 1983.

139. Castagna M., Takai Y., Kaibushi K., Sano K., Kikkawa Y., Nishizuka Y. Direck activation of calcium-activated, phospholipid-dependent, prorein kinase by tumor-promoting phorbol ester. J. Biol. Chem. 257 (24): 7847-7851. 1982.

140. Cavigelli M., Dolfi F.E., Karin M. Induction of c-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. EMBO J. 14: 5957-5964. 1995.

141. Cerione R.A, Staniszewski C, Caron M.G., Lefkowitz R.J., Codina J., Birnbaumer L. A role for Ni in the hormonal stimulation of adenylate cyclase. Nature 318(6043):293-295. 1985.

142. Chakravarti D., La Monte V.J., Nelson M.C., Nakajima T., Shulman I. G., Juguilon H., Montminy M., Evans R.M. Role of CBP/p300 in nuclear receptor signaling. Nature. 383: 99-103. 1996.

143. Cheung W.Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207(4426): 19-27. 1980.

144. Christy B.A., Lau L.F., Nathans D. A gene activated in mouse 3T3 cells by serum growth factors encodes a protein with «zink finger» sequences. Proc.Natl.Acad. USA. 85(6): 7857-7861. 1988.

145. Chrivia J.C., Kwok R.P.S. Lamb N., Hagivara M., Montmini M.R., Goodman M.R. Phosphorylated CREB binds spesificaly to the nuclear protein CBP. Nature. 365: 855-859. 1993.

146. Cooper D.M.F., Mons N., Karpen J.W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signaling. Nature. 374: 421-424. 1995.

147. Costa M., Gerner E.W., Russell D.H. Cell-cyclespecific activity of Type 1 and Type 2 cAMP-dependent protein kinases in chines humser ovary cells. J. Biol. Chem. 251 (11): 3313-3319. 1976.

148. Crow T., Xue-Bian J.J., Siddiqi V., Kang T., Neary J. Phosphorylation of mitogene-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18: 3480-3487. 1998.

149. Cupello A., Hyden A. Alteration of the pattern of hippocampal nerve cell RNA labelling during training in rats.Brain Res. 114(3):453-60. 1976.

150. Curran T., Franza B.R. Fos and Jun: the AP-1 connection. Cell. 55: 395-397. 1988.

151. Dale N, Kandel E, Schacher S. Serotonin produces long-term changes in the excitabil-ity of Aplysia sensory neurons in culture that depend on newprotein synthesis. J. Neurosci. 7: 223238. 1987.

152. Daniel P., Walker W., Habener J.H. Cyclik AMP signaling and gene regulation.Annual Rev. Nutr. 18: 353-383. 1998.

153. Dash P.K., Hochner B., Kandel E.R. Injection of cAMP-responsive element into the nucleus of Aplysia sensory neurons blocks long-term facilitation. Nature. 345: 718-721. 1990.

154. Dash P.K., Karl K.A., Colicos M.A., Prywes R., Kandel E.R. cAMP response element-binding protein is activated by Ca2+/calmodulins well as cAMP-dependent protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (6): 5061-5065. 1991.

155. Dauwalder B., Davis R.L. Conditional rescue of the dunce learning, memory and famal fertility defects with Drosophila or rat transgenes. J. Neurosci. 15(5): 3490-3499. 1995.

156. Davis B.J. Disc Electrophoresis II. Method and application ' to human serum proteins. Annuals of New York Acad. Sci. 121(11): 404-427. 1964.

157. Davis G.W., Schuster C.M., Goodman C.S. Genetic dissection of structural and functional components of synaptic plasticity III CREB is necessary for presynaptic functional plasticity. Neuron. 17 (4): 669-679. 1996.

158. Deisseroth K., Bito H., Tsien R.W. Signaling from synapse to nucleus: postsynaptic CREB phosphorylation during multiple forms of hippocampal synaptic plasticity. Neuron. 16: 89-101. 1996.

159. Deisseroth K., Heist E.K., Tsien R.W. Translocation of calmodulin to the nucleus supports CREB phosphorylation in hippocampal neurons. Nature. 392: 198-202. 1998.

160. Demmer I., Dragunow M., Lawlor P.A., Mason S.E, Leah J.D, Abraham W.C, Tate W.P. Differential expression of immediate early genes after hippocampal long-term potentiation in awake rats. Mol. Brain. Res. 17(3-4): 279-286. 1993.

161. Doroshenko P.A., Kostyuk P.G., Martynyuk A.E. Intracellular metabolism of adenosine 3',5'-cyclic monophosphate and calcium inward current in perfused neurones of Helix pomatia. Neuroscience. 1982. 7(9): 2125-2134

162. Drain P., Folkers E., Quinn W.G. cAMP-dependent protein kinase and the disruption of learning in transgenic flies. Neuron. 6: 71-82. 1991.

163. Drust D.S., Martin T.E.I. Protein kinase C translocates from cytosol to membrane upon hormone activation: effects of thy rotropin-releasing hormone in GH3 cells. Biophys. Res. Communs. 128: 531-537. 1985

164. Duai Y. Neurogenetic dissectionof learning and short-term memory in Drosophila. Annu. Rev. Neurosci. 11:537-563. 1988.

165. Dyakonova V., Elofsson R., Calberg M. Immediate early gene product can reveal neurons active in behavioural programs ofmolluscs. ISIN. 8 Symp osium on invertebrate neurobiology. Ti-hani, Hungary. Abstracts: 22. 1995.

166. Elekes K., Nassel D.L. Distribution FMRFamide-like im-munoreactive neurons in the central nervous system of snail Helix pomatia. Cell and tissue res. 262 (1): 177-190. 1990.

167. Emson P., Walker R.J., Kerkut G.A. Chemical changes in a molluscan ganglion associated with learhing. Comp. Biochem. and Physiol. 40(1): 233-239. 1971.

168. English J.D., Sweat J.D. Activation of p42 mitogen-activated protein kinase in hippocampal long-term potentiation. J. Biol. Chem. 271: 24329-24332. 1996.

169. English J.D., Sweat J.D. A requirement for the mitogen-activated protein kinase cascade in hippocampal long-term potentiation. J. Biol. Chem. 272: 18103-19106. 1997.

170. Eskin A., Garcia K.E., Byrne J. Information storage in the nervous system of Aplysia: Specific proteins affected by serotonin and cAMP. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 2458-2462. 1989.

171. Etcheberrigaray E., Gibson G.E., Alkon D.L. Molecular mechanisms of memory and the pathophysology of Alzheimer's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 747: 245-255. 1994.

172. Fabro D., Jungmann R., Eppenberger U.Subcellular distribution of proteinkibase C of GH 3 cells: quantitation and characterization by polyacrilamid gel electrophoresis. Archives of bioch. and biophis. 239 (1): 102-111. 1985.

173. Fedulova S.A., Kostyuk P.G., Veselovsky N.S. Calcium channels in the somatic membrane of the rat dorsal root ganglion neurons, effect of cAMP. Brain Res. 214: 210-214. 1981.

174. Figurov A.L., Pozzo-Miller L.D., Olafsson P., Wang T., Lu B. Regulation of synaptic responses to high-frequency stimulation and LTP by neurotrophins in the hippocampus. Nature.381:706-709,1996.

175. Finkbeiner S., Greenberg M.E. Ca2+ dependent routes to Ras: Mechanisms for neuronal survival, differentiation and plasticity? Neuron. 16: 233-236. 1996.

176. Fiore R.S., Murphy T.H., Sanghera J.S., Pelech S.L., Baraban J.M. Activation of mitogen-activated protein kinase by glutamate receptor stimulation in rat primary cortical cultures. J.Neurochem. 61(5): 1626-1633. 1993.

177. Foulkes N.S., Borrelli E., Sassone-Corsi P. CREM gene: Use of alternative DNA binding domains generates multiple antagonists of cAMP-induced transcription. Cell. 64: 739-49. 1991.

178. Frank D.A., Greenberg M.E. CREB: a mediator of long-term memory from mollusks to mammals. Cell. 79: 5-8. 1994.

179. Frey U., Huang Y.Y., Kandel E.R. Effects of cAMP stimulats a Rate stage of LTP in hippocampal CA1 neurons. Science. 260: 1661-1664. 1993.

180. Fukunaga K., Stoppini L., Miyamoto E., Muller D. Long-term potentiation is associated with increased activity of

181. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem. 268: 7863-7867. 1993.

182. Gainer H. Patterns of protein synthesis in individual identified molluscan neurons. Brain Res. 39 (2): 369-385. 1972(6).

183. Gainer H., Barker J.Z. Selective modulation and turnover of proteins in identified neurons of Aplysia. Comp. Biochem. Physiol. 51 ( 2): 221-227. 1975.

184. Ghosh A., Greenberg M.E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequence. Science. 286: 237247. 1995.

185. Giese K.P., Fedorov N.B., Filipkowski R.K., Silva A.J. Autophosphorylation at Thr268 of the a-calcium/calmodulin kinase II in LTP and learning. Science 279: 870-873. 1998.

186. Gille H., Kortenjann M., Thoma O., Moomaw C, Slaughter C, Cobb M.H, Shaw P.E. ERK phosphorylation potentiates Elk-1 mediated ternary complex formation and transactivation. EMBO J. 14 (5): 951-962. 1995.

187. Gilman A.G. A protein binding assay for adenosine 3',5'-cyclic monophosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 67: 305-312. 1970.

188. Ginty D.D., Kornhauser J.M., Thompson M.A., Bading H., Mayo K.E. Regulation of CREB phosphorylation in the suprachiasmatic nucleus by light and a circadian clock. Science. 260: 23841.1993.

189. Gispen W.H., Nielander H.B., Degraan P.N.E., Oestreicher A.B., Schrama L.H., Shotman P. Role of the gtowth-associated protein B-50/GAP43 in neuronal plasticity. Mol.Neurobiol. 5(2-4): 61-85. 1991.

190. Giuditta A., Moore B.W., Prozzo N. A brain-specific protein from Octopus vulgaris. Lam. J. Neurochem. 29(2):235-244. 1977.

191. Glanzman D.L., Kandel E.R., Schacher S. Target-dependent structural changes accompanyng long-term synaptic fasilitation in Aplysia neurons. Sciense. 249:799-802. 1990.

192. Glassman E. The biochemistry of learning: an evaluation of the role of RNA and protein. Annual Review of Biochem. 21:157161. 1969.

193. Gold S.J., Ni Y.G., Dohlman H.G., Nestler E.J. Regulators of G-protein signaling (RGS) proteins: region-specific expression of nine subtypes in rat brain. J. Neurosci. 17(20): 8024-8037. 1997.

194. Goldsmith B.A., Abrams T.W. c-AMP modulates multiple K+ currents, increasing spike duration and exitabillity in Aplisia sensory neurons. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89 (23): 11481-11485. 1992.

195. Golet P., Castelluci V.F., Schacher S., Kandel E.R. The long and short of long term memory a molecular framework. Nature. 322: 419-422. 1986.

196. Gonzalez G.A., Montminy M.R. Cyclic AMP stimulates somatostatin gene transcription by phosphorylation of CREB at serine 133. Cell. 59: 675 680. 1989.

197. Gonzalez G.A., Yamamoto K.K., Fischer W.H., Karr D., Menzel P., Biggs W., Vale W.W., Montminy M.R. A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMP-regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence. Nature. 337 (6209): 749-752. 1989.

198. Goodnight G., Mischak H., Mushinski F. Selective involvement of protein kinase C isoformes in differentiation and neoplastic transformation. Advancwes in cancer research. 64: 159163. 1994.

199. E.B. Mutation of the c-fos gene dyad symmetry element inhibits serum inducibility of transcription in vivo and the nuclear regulatory factor binding in vitro. Moll. Cell Biol. 7: 1217-1225. 1987.

200. Greenberg S.M., Castellucci V.F., Bayley H., Schwartz J.H. A molecular mechanisms for long-term sensitisation in Aplysia. Nature. 329(6134): 62-65. 1987.

201. Griffith L.C., Verselis L.M., Aitken K.M., Kyriacou C.P., Danko W., Greenspan R.J. Inhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinase in Drosophila disrupts behavioral plasticity. Neuron. 10: 501-509. 1993.

202. Guo Z., Du X., Iacovitti H. Regulation of tyrosine hydroxylase gene expression during transdifferentiation of striatal neurons: Changes in transcription of factors binding the AP-1 site. J. Neurosci. 18 (20): 8163-8174. 1998.

203. Gupta A., Kanungo M.S. Modulation of vitellogenin II gene by estradiol and progesterone in the Japanese quail. Biochem. Biophys. Res. Commun. 222 (1): 181-185. 1996.

204. Gustafson B., Wigstrom H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. TINS. 114: 156-162. 1988.

205. Guzowski J.F., Mc.Gaugh J.L. Antisense oligodeoxynu-cleotide-mediated disruption of hippocampal CREB protein levels impairs memory of a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2693-98. 1997.

206. Hagiwara M., Alberts A., Brindle P., Meinkoth J., Feramisco J, et al. Transcriptional attenuation following cAMPinduction requires PP-1-mediated dephosphorylation of CREB. Cell. 70: 105-113. 1992.

207. Han P-L., Levin L.R., Reed R.R., Davis R.L. Preferential expression of the Drosophila rutabaga gene in mushroom bodies neural centers for learning in insects. Neuron. 9: 619-627. 1992.

208. Handschin J.C., Eppenberger U. Altered cellular satio of Type 1 and Type 2 cAMP-dependent protein kinases in human mammary tu- mars. FEBS Letters. 106 (2): 301-304. 1979.

209. Hanson P.I., Meyer T., Stryer L., Schulman H. Dual role of calmodulin in autophosphorylation of multifunctional CaM kinase may underlie decording of calcium signals. Neuron. 12: 943956. 1994.

210. Hanson P.I., Schulman H. Neuronal Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. Annu. Rev. Biochem. 61: 559-601. 1994.

211. Hardingham G.E., Chawla S., Johnson C.M., Bading H. Distinct functions of nuclear and cytoplasmic calcium in the control of gene expression. Nature. 385: 260-265. 1997.

212. Hawkins R.D., Abrams T.V., Carew T.J., Kandel E.R. A cellular mechanism of classical conditioning in Aplysia: activiti -dependent amplification of presinaptic fasilitation. Science. 219(4583): 400-405. 1983.

213. Hawkins R.D., Lalevic N., Clark G.A., Kandel E.R. Classical conditioning of the Aplysia siphon- withdrawal reflex exhibit response specificiti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 76207624. 1989.

214. Hawkins R.D., Kandel E.R., Siegelbaum S.A. Learning to modulate transmitter release: themes and variations in synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 16: 625-665. 1993.

215. Hayashi T., Umemori H., Mishina M., Yamamoto T. The AMPA receptor interacts with and signals through the protein tyrosine kinase Lyn. Nature. 397(7): 72-76. 1999.

216. Haycock J.W., Ahu N.G., Cobb M.H., Krebs E.G. ERK1 and ERK2, two microtubule-associated protein kinases, mediate the phosphorylation of tyrosine hydroxylase at serine 31 in situ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 2365-2369. 1992.

217. Hegde A.N., Goldberg A.L., Schwartz J. Regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinases are degraded after conjugation to ubiquitin: a molecular mechanism underlying long-term synaptic plasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7436-7440. 1993.

218. Hegde A.N., Inokuchi K., Pei W., Casadio A. Ubiquitin c-terminal hydrolase is an immediate-early gene essential for long-term facilitation in Aplysia Cell. 89 (4): 115-126. 1997.

219. Hepler J.R., Gilman A.G. G protein. TIBS. 17: 383-387. 1992.

220. Herbegen T., Claret F.X., Kallunki T., Martin-Villalba A., Winter C., Hunter T., Karin M. Lasting n-terminal phosphorylation of c-jun n-terminal kinases after neuronal injuri. J. Neurosci. 18 (4): 5124-5135. 1998

221. Hochner B., Kandel E.R. Modulation of a transient K+ current in the pleural sensory neurons of Aplysia by serotonin and cAMP-implications for spike broadening. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89 (23): 11476-11480. 1992.

222. Hofmann F., Beavo J., Bechtel J., Krebs E. Comparison of cAMP-dependent protein kinases from rabbit sceletal muscle and bovine heart muscle. J Biol. Chem. 250: 7795-7800. 1975.

223. Hu GY, Hvalby O, Walaas SI, Albert KA, Skjeflo P, Andersen P, Greengard P. Protein kinase C injection into hippocampal pyramidal cells elicits features of long-term potentiation. Nature. 328 (6129): 426-429. 1987.

224. Hu Y., Barzilai , Chen M., Bailey C.H., Kandel E.R. 5-HT and cAMP induce the formation of coated pits and vesicles and increase the expression of clatrin light chain in sensory neurons of Aplysia. Neuron. 10: 921-929. 1993.

225. Huand Z., Villar-Palasi C,, Kochevar Z., Charlton J., King Z.-S. Autophospharylation of the regulatory subunit of type 1 cAMP-dependent protein kinase. Fedx proceed. 42(7): 2256-2263. 1983.

226. Huang Y.Y., Colley P.A., Routtenberg A. Postsynaptic then presynaptic protein kinase C activity may be necessary for long-term potentiation. Neurosci. 49 (4): 819-827. 1992.

227. Huang Y.Y., Li X.-Ch., Kandel E.R. cAMP contribures to Mossy Fiber LTP by initiating both a covalently mediated earlyphase and macromolecular synthesis- dependent late phase. Cell. 79 (1): 69-79. 1994.

228. Hug H., Sarre T.F. Protein kinase C isoenzymes: divergense in signal transduction. Biochem. J. 291: 329-343. 1993.

229. Hvalby O., Reymann K., Andersen P. Inracellular analysis of potentiation of CA1 hippocampal synaptic transmission by phorbol ester application. Exp. Brain Res. 71 (3): 588-596. 1988.

230. Hyden H., Lange P.W. Protein changes in different brain areas as a function of intermittent training. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 69(7): 1980-1984. 1972.

231. Hyden H., Lange P.W., Perrin G.L. Protein pattern alterations in hippocampal and cortical cells as a function of training in rats. Bram Res. 119 (3): 821-830. 1977.

232. Impey S., Smith D., Obrietan K., Donahue R., Wade Ch., Storm D. Stimulation of cAMP response element (CRE)-mediated transcription during contextual learning. Nature neuroscienee. 1 (7): 595-597. 1998.

233. Ito E., Oka K., Collin C., Alkon D.L. Intracellular calcium signals are enhanced for days after pavlovian conditioning. J.Neurochem. 4 (62): 1337-1344. 1994.

234. Iuengar R. Molecular and functional diversity of mammalian Gs-stimulated adenylyl cyclases. FASEB J. 7: 768-775. 1993.

235. Izvarina N., Glushchenko T., Tokarev A., Emelyanov N. G-proteins and long-term potentiation in rat olfactory cortex slices. J. Neurochem. 63(S1): 69. 1994.

236. Janknecht R., Hunter T. A growing coactivator network. Nature. 383(6595):22-23. 1996.

237. Janknecht R., Nordheim A. Regulation of the c-fos promoter by the ternary complex factor Sap-la and its coactivator CBP. Oncogene. 12: 1961-1969. 1996.

238. Johns E. Studies of histones: preparative methods for histon fractions from calf thymus. Biochem. J. 92 (1): 55-59. 1964.

239. Jonat G., Kahmsdorf H.I., Park K-K., Cato A.C.B., Gebel S., Ponta H., Herrlich P. Antitumor promotion and antiinflammation: Down- Modulation of API (Fos/Jun) activity by Glucocortical hormone. Cell. 62: 1189-1195. 1990.

240. Kaang B.K., Kandel E.R., Grant S.G.N. Activation of cAMP-responsive genes by stimuli that produce long-term facilitation in Aplysia sensory neurons. Neuron. 10: 427-435. 1993.

241. Kaczmarek L., Chandhuri A. Sensory regulation of immediate early gene expression in mammalion visual cortex : implications for functional Mapping and neural plasticity. Brain research reviews. 23: 237-256. 1997.

242. Kageyama R., Sasai Y., Nakanishi S. Molecular characterization of transcription factors that bind to the cAMP-responsive region of the substance P precursor gene. J. Biol. Chem. 266: 15525-15531. 1991.

243. Kamei Y., Xu L, Heinzel T., Torchia J., Kurokawa R., Gloss B., Lin S.C., Heyman R.A., Rose D.W., Glass C.K., Rosenfeld M.G. A CBP integrator complex mediates transcripttional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors. Cell .85:403-414. 1996.

244. Kandel E.R., Schwartz J.N. Molecular biology of learning: Modulation of transmitter release by cyclic AMP. Science. 218: 433-443. 1982.

245. Kandel E.R., Abrams T., Bernier L. Carew T.J, Hawkins R.D, Schwartz J.H. Classical conditioning and sensitization shareaspects of the molecule cascade in Aplysia . Mol. Neurobiol. 48 (3) 821-830. 1983.

246. Kang H, Schuman E.M. A requirement for local protein synthesis in neurotrophin-induced hippocampal synaptic plasticity. Science. 273: 1402-1406. 1996.

247. Kapoor C.L., Grantham F., Cho-Chung Y-S. Appearance of 50000 and 52000 dalton cAMP receptor protein in the nucleoli of regressing MCF-7 human breast cancer upon estrojen withdrawal. Cell Biol. Int. Reports .7 (11): 937-946. 1983.

248. Karin M., Smeal T. Control of transcription factors by signal transduction pathways: the beginning of the end. TIBS. 17(10): 418-422. 1992.

249. Karin M., Hunter T. Transcriptional control by protein phosphorulation: signal transmission from the cell surface to the nucleus. Curr. Biol. 5: 747-757. 1995.

250. Karin M., Liu Zh., Zandi E. AP-1 functuin and regulation. Current Opinion in Cell Biol. 9: 240-246. 1997.

251. Katada T., Kusukule A., Oinumu M., Ui M. A novel mechanism for inhibition of adenylate cyclase via inhibitory GTP-binding protein. J. Biol. Chem. 262 (25): 11897-11900. 1987.

252. Kelly P.T., McGuinness T.L., Greengard P. Evidence that the major postsynaptic density protein is a component of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 5326-5330. 1984.

253. Kennedy M.B., Bennett M.K., Erondu N.E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density proteins" is a subunit of calmodulin-dependent protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 7357-7361. 1983.

254. Kennedy M.B. Regulation of neuronal function by calcium. Trends Neurosci. 12 (11): 417-420. 1989.

255. Kikkawa U., Takai Y., Tanaka Y., Miyaka K., Nishizuka Y. Protein kinase C as a possible receptor protein of tumor-promoting phorbol esters. J. Biol. Chem. 258 (19): 11442-11445. 1983.

256. Kikkawa U., Nishizuka Y. The role of protein kinase C in transmembrane signaling. Ann. Rev. of cell biology. 2: 149-160. 1986.

257. Kikkawa U., Kishimoto A., Nishizuka Y. The protein kinase C family: heterogeneity and its impications. Ann. Rev. Biochem. 58: 31-44. 1989.

258. Kim K.S., Lee M.G., Carroll J., Joh T.J. Both basal and inducible trascription of the tyrosine hydroxylase gene are dependent upon a cAMP response element. J. Biol. Chem. 268: 15689-15695. 1993.

259. Kim K.S., Tinti C., Song B., Cubells J.F., Joh T.J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates basal and cyclic AMP-stimulated but not phorbol ester-stimulated trascription of the tyrosine hydroxylase gene. J. Neurochem. 63: 834-842. 1994.

260. Kim C.S., Han Y.E., Etcheberrigaray R., Nelson T.Y., Yoshioka T., Alkon D.L. Alzheimer and beta-amyloid-treated fibroblasts demonstrate a decrease in a memory-associated GTP-binding protein, Cp20. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 92: 3060-3064. 1995.

261. Klein M., Kandel E.R. Presynaptic modulation of voltage-de- pendent Ca2+ current: Mechanism for behavioral sensitization in Aplysia californica. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75: 3512-3516. 1978.

262. Koch C., Zador A. The function of dendritic: devices subserving biochemical rather than electrical compartmentalization. J. Neurosci. 14 (2): 413-422. 1993.

263. Kogan JH, Frankland PW, Blendy JA, Coblentz J, Marowitz Z, Schutz G, Silva AJ Spaced training induces normal long-term memory in CREB mutant mice. Curr. Biol. 7:1-11. 1997.

264. Kononenko N.N., Kostyuk P.G., Shcherbatko A.D. Properties of cAMP-induced transmembrane current in mollusc neurons. Brain Res. 376 (2): 239-245. 1986.

265. Kormhauser J.M., Greenberg M.E. A kinase to remember: Dual roles for MAP kinase in long-term memory. Neuron. 18(6): 839-842. 1997.

266. Kraft A.S., Andersson W.B. Phorbol ester increase the amount of Ca2+, phospholipid-dependent protein kinase associated wits plasma membrane. Nature. 301: 621-623. 1983.

267. Kuhl D., Kennedy T.E., Barzilai A., Kandel E.R. Long-term sensitization traning in Aplysia leads to an increase in the expression of Bip, the major protein chaperon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 119: 1069-1076. 1992.

268. Kurino M., Fukunaga K., Ushio Y., Miyamoto E. Activation of mitogen-activated kinase in cultured rat hippocampal neurons by stimulation of glutamate receptors. J.Neurochem. 65: 1282-1289. 1995.

269. Landschulz W.H., Jonson P.F., McKnight S.L. The DNA binding domain of the rat liver nuclear protein C/EBP is bipartite. Science. 243: 1681-1688. 1989.

270. Landschulz W.H., Jonson P.F., Adashi E.Y., Braves B.J., Mc Knught S.L. Isolation of a recombinant copy of the gene encoding C/EBP. Genes Dev. 2: 786-800. 1988.

271. Laoide B.M., Foulkes N.S., Schlotter F., Sassone-Corsi P. The functional versatility of CREM is determined by its modular structure. EMBO J. 12: 1179-1191. 1993.

272. Larson J., Lynch G. Induction of synaptic potentiation in hippocampus by patterned stimulation involves two events.Science. 232: 985-988. 1986.

273. Lemaire P., Vesque C., Schmitt J., Stunnenberg H., Frank R., Charnay P. The serum-inducible mouse gene K20x-24 encodes a sequence- specific transcriptional activator. Mol. cell biol. 10: 3456-3467. 1990.

274. Lehtola L, Sistonen L, Koskinen P, Lehvaslaiho H, Di Renzo MF, Comoglio PM, Alitalo K Constitutively activated neu oncoprotein thyrosine kinase interferes with growth factor-induced signals fos gene activation. J.Cell. Biochem. 45(1): 69-81. 1991.

275. Levitan J.B. Adenylate cyclase in isilated Helix and Aplysia neuronal cell bodies: stimulation and peptidecontaining extract. Brain Res. 154(2): 404-408. 1978.

276. Liberman D.N., Mody I. Casein kinase-II regulates NMDA channel function in hippocampal neurons. Nature neuroscience. 2 (2): 125-132. 1999.

277. Liu F.C., Graybiel A.M. Spatiotemporal dynamics of CREB phosphorylation: transient versus sustained phosphorylation in the de-veloping striatum. Neuron 17: 1133-44. 1996.

278. Lovinger D.V., Wong K.L., Hurakami K., Routtenberg A. Protein kinase C inhibitors eliminate hippocampal long-term potentiation. Brain Res. 436(1): 177-183. 1987.

279. Ma L., Zablow L., Kandel E.R., Siegelbaum S.A. Cyclic AMP induced functional presynaptic boutons in hippocampal CA3-CA1 neuronal cultures. Nature Neurosci. 2 (1): 24-30. 1999.

280. Malenka RC. Synaptic plasticity in the hippocampus: LTP and LTD. Cell 78:535-38. 1994.

281. Malinow R., Schulman H., Tsien R.W. Inhibition of postsynaptic RKC or CaMKII blocks induction but not expression of LTP. Science. 245: 862-866. 1989.

282. Malviya A.N., Rogue P.J. "Tell me where is calcium bred: Clarifying the roles of nuclear calcium". Cell. 92(1): 17-19. 1998.

283. Mandel R.J., Gage F.H., Thai L.J. Enhanced detection of nucleus basalis magnocellularis lesion-induced spatial learning deficit in rats by modification of training regimen. Behav. Brain Res. 31: 221-229. 1989.

284. Mansuy I.M., Mayford M., Jacob B., Kandel E.R. Bach M.E. Restricted and regulated overexpression reveals calcineurin as a component in the transition from short-term to long-term memory. Cell. 92: 39-49. 1998.

285. Maren S, Baudry M. Properties and mechanisms of long-term synaptic plasticity in the mammalian brain: relationships to learning and memory. Neurobiol. Learn. Mem. 63: 1-18. 1995.

286. Martin K.C., Kandel E.R. Cell adhesion mole cules, CREB and the formation of new synaptic connections during development and learning. Neuron. 17: 567-570. 1996.

287. Martin K.C., Michael D., Rose J.C., Darad M., Casadio A., Zhu Y., Kandel E.R. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18(6): 899-912. 1997.

288. Massicotte G., Baudry M. Triggers and subrates of hippocampal synaptic plasticity. Neurosci. Biobehav. Rev. 15 (3): 415-423. 1991.

289. Matthies H. In search of cellular mechanisms of memory. Prog Neurobiol. 32(4):277-349. 1989.

290. Mauelshagen J., Parker G.R., Carew T.J. Dynamics of induction and expression of long-term synaptic facilitation in Aplysia. J. Neurosci. 16: 7099-7108. 1996.

291. Mayford M., Abel T., Kandel E.R. Transgenic approaches to cognition. Curr. Opin. Neurobiol. 5: 141-148. 1995.

292. Mayford M., Bach M.E., Huang Y.Y., Wang L., Hawkins R.D., Kandel E.R. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274: 1678-1683. 1996.

293. McDonald J., Walsch M. Unhibition of the Ca2+ phospholipid-dependent protein kinase by a novel M 170000 Ca -binding protein. Biochem. and biophis res. commun. 129 (2): 603610. 1985.

294. Mednieks M.J., Jungmann R.A., DeWys W.D. cAMP-dependent protein kinases phosphorylation and the control of grouth of leukemia L 1210 cell grouth. Cancer. Res. 42: 2742-2747.1982.

295. Mellstrom B., Naranjo J.R., Folkes N.S., Latarga M., Sassone-Corsi P. Transckriptional response to cAMP in brain: specific distribution and induction of CREM antagonists. Neuron. 10: 655-665. 1993.

296. Mercer A.R, Emptage N.J, Carew T.J. Pharmacological dissociation of modulatory effects of serotonin in Aplysia sensory neu-rons. Science 254:1811-1813. 1991.

297. Metz R., Ziff E. The Helix-loop-Heliz protein rel2 and the C/EBP-related factor rNFIL-6 bind to neighboring sites within the c-fos serum response element. Oncogene. 6: 2165-2178. 1991(a).

298. Metz R., Ziff E. cAMP stimulates the C/EBP-related transcription factor rNFIL-6 to translocate to the nucleus and induce c-fos transcription. Genes dev. 5: 1754-1766. 1991(6).

299. Miller S.G., Kennedi M.B. Regulation of brain tipe II Ca/calmodulin-dependent protein kinase by autopchosphorylattion: A Ca2+ triggered molecular switch. Cell. 44: 861-870. 1986.

300. Miyamoto E., Yano S., Fukunaga K. Role Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in astrocytes. J. Neurochem. 71: 61. 1998.

301. Molina C.A, Foulkes N.S, Lali E, Sassone-Corsi P. Inducibility and negative autoregu-lation of CREM: an alternative promoter directs the expression of ICER, an early re-sponse repressor. Cell. 75: 875-86. 1993.

302. Montarolo P.G., Goelet P., Castellucci V.F., Morgan J., Kandel E.R., Schacher S. A critical period for maeromolecularsynthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234(4781): 1249-1254. 1986.

303. Montminy M.R., Bilezikjian L.M. Binding of a nuclear protein to the cyclic AMP response element of the somatostatin gene. Nature. 328 (6126): 175-178. 1987.

304. Morgan J.I., Curran T. Stimulus transcription coupling in the nervous system: involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun. Ann. Rev. Neurosci. 14: 421-451. 1991.

305. Moore B.W., McGregor D. Chromotographic and electrophoretic fractination of soluble proteins of brain and lever, j. Biol. Chem. 240 (4): 1642-1653. 1965.

306. Munijppa K., Leibach F., Mendicino J. Characterization and comparison of the soluble and membrane lound cAMP-dependent PK from swine kigney. Mol. Cell. Biochem. 50: 157-171. 1983.

307. Murray A.W., Fournier A., Hardy S.J. Proteolitic activation of protein kinase C: a physiological reaction? TIBS.7: 53-54. 1987.

308. Musgrave M.A., Balyk B.A., Coh J.W. Coactivation of metabotropic and NMDA receptors is requared for ^n induction. Neuroreport. 4 (2): 171-174. 1993.

309. Musti A.M., Treier M., Bohmann D. Reduced ubiquitin-dependent degradation of c-Jun after phosphorylation by MAP-kinases. Science. 275: 400-402. 1997.

310. Neer E.J., Ciapham D.E. Roles of G protein subunits in transmembrane signalling. Nature. 333: 129-134. 1988.

311. Neer E.J., Wolf L.G., Gill D M. The stimulatory guanine nucleotide regulatory unit of adenylate cyclase ftom bovine cerebral cortex. ADP-ribosylation and purification. Biochem. J. 241 (2): 325-336. 1987.

312. Nelson T.J., Alkon D.L. Prolonged RNA changes in the Hermisenda eye induced by classical conditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7800-7804. 1988.

313. Nelson T.J., Collin C.C., Alkon D.L. Isolation of a G-protein that is modified by learning and reduces pottassium currents in Hermisenda. Science. 247: 1479-1483. 1990.

314. Nelson I.J., Alkon D.L. Phosphorylation of the conditioning-associated GTP-binding protein cp20 by protein kinase C. J. Neurochem. 65 (5): 2350-2357. 1995.

315. Nelson I.J., Alkon D.L. Calexcitin: a signaling protein that binds calcium and GTP, inhibits potassium channels and enhances membrane excitability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 1380813813. 1996.

316. Nesterova M.V., Glukhov A.J., Aeverin E.E. Effect of the regulatory subunit of cAMP-dependent PK on the genetic activation of eukaryotic cells. Mol. Cell. Biochem. 49 (1): 53-61. 1982.

317. Nestler E.J., Hope B.T., Widnell K.L. Drug addiction: a model for the molecular review basis of neural plasticity. Neuron. 11: 995-1006. 1993.

318. Neuhoff V. The application of micromethods to neurochemistry. Cent, nervous syst. stud, metabolic regulat. and funct., Berlin e.a., 1974.

319. Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface singnal transduction and tumor promotion. Nature. 308: 693-698. 1984.

320. Nolen T.G., Carew T.J. The cellular analog of sensitization of Aplysia emerges at the same time in development as behavioral sencitization. J. Neurosci. 8: 212-222. 1988.

321. Norman C., Runswick M., Pollack R.M., Treisman R. Isolation and characterization of cDNA clones encoding SRF, a transcription factor that binds the c-fos serum response element. Cell. 55: 989-1003. 1988.

322. Ofir R., Dwarki V.I., Rashid D. Phosphorylation of the c-terminus of Fos protein is required for transcriptional transrepression of the c-fos promoter. Nature. 348 (6296): 80-84. 1990.

323. Oshima H., Srapary D., Simons S.S. The factor binding to the glucocorticoid modulatory element of the tyrosine aminotransferase gene is a novel and ubiquitous heteromeric complex. Biol. Chem. 270 (37): 21893-21907. 1995.

324. Patia M., Stenzel K.H., Novogradsky A., Differential effect of tumor promoters on c AMP production:inhibition of receptor-mediated and potentiation of cholera toxin-mediated stimulation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 133: 904-910. 1985.

325. Piascik M.T., Wisler P., Jonson C., Pobler J. Ca2+-dependent regulation of guenea pig brain adenilate cyclase. J. Biol. Chem. 255: 4176-4181. 1980.

326. Pieroni J.P., Byrne J.H. Differential effects of serotonin, FMRFamine and smal cardioactive peptide on multiple, distributed processes modulating sensorimotor synaptic transmission in Aplysia. J. Neurosci. 12 (7): 2633-2647. 1992.

327. Prushad N., Cuttler R.G. Persent satellite DNA as a function of tissue and age of mise. BBA. 418 (1): 1-23. 1976.

328. Qian Z., Gilbert M., Kandel E.R. Temporal and spatial regulation of the expression of BAD2, a MAP kinase phosphatase during seizure, kindling and long-term potentiation. Learning Mem. 1: 180-188. 1994.

329. Rankin C.H., Carew T.J. Dishabituation and sensitization emerge as separate processes during development in Aplysia. J. Neurosci. 8: 197-211. 1988.

330. Rasmussen C.D., Means A.R. Calmodulin, cell growth and gene expression. TINS. 12 (11): 433-438. 1989.

331. Reymann K.G., Brodemann R., Kase H. Mathies H. Inhibitors of calmodulin and protein kinase C block different phases of hippocampal long-term potentiation. Brain Res. 461 (2): 388-392. 1988.

332. Rivera V.M., Miranti R.P., Misra R.P, Ginty D.D, Chen R.H, Blenis J, Greenberg M.E. A growth factor-induced kinasephosphorylates the serum response factor at a site that regulates its DNA binding activity. Mol. Cell. Biol. 13 (10): 6260-6273. 1993.

333. Robinson C.E. The molecule-group scheme of memory storage. J. Theor. Biol. 91 (1): 231-232. 1991.

334. Rodbell M. The role of hormone receptors and GTP-regulatory proteins in membrane transduction. Nature. 284 (5751): 17-22. 1980.

335. Rosen L.B., Ginty D.D., Weber M.J., Greenberg M.E. Membrane depolarization and calcium influx stimulate MEK and MAP kinase via activation of ras. Neuron 12: 1207-1221. 1994.

336. Sacktor T.C., Osten P., Valsamis H., Jiang X., Naik M.U., Sublette E. Persistent activation of the isoform of protein kinase C in the maintenance of long-term potentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (18): 8342-8346. 1993.

337. Sakakibara M., Alkon D.L., Kouchi T., Inoue H., Yoshioka T. Induction of photoresponse by the hydrolysis of polyphosphoinositides in the Hermissenda type B photoreceptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1): 299-306. 1994.

338. Sakharov D.A. Integrative function of serotonin common to distantly related invertebrate animals. The early brain Ed. M. Gustaffson, M.Reuter, Akad. Press. 73-88. 1990.

339. Schacher S, Castelluci VF, Kandel ER. cAMP evokes long-term facilitation in Aplysia sensory neurons that requires new protein synthesis. Science. 240: 1667-1669. 1978.

340. Schramm M., Selinger L. Message transmission receptor controled adenylate cyclase system. 225 (4668): 1350-1356. 1984.

341. Schuster C.M., Davis G.W., Fetter R.D., Goodman C.S. Genetic dissection of structural and functional components ofsynaptic plasticity II. Fasciclin II controls presynaptic structural plasticity. Neuron. 17: 655-667. 1996.

342. Schwoch G. Differential activation of type-I and type-II adenosine 3':5'-cyclic monophosphate-dependent protein kinases in liver of glucagon-treated rats. Biochem. J. 170: 469-477. 1978.

343. Scott J.D., Fitcher E.H., DamailleJ.G., Krebs E.G. Identification of an inhibitory region of the heat-stable protein inhibitor of the cAMP-dependent protein kinase. Pros. Nat. Acad. Sci. USA. 81 (3): 4379-4383. 1985.

344. Segal R.A., Greenberg M.E. Signal transduction by neu-rotrophiks. Ann. Rev. Neuroscience. 19: 463-489. 1996.

345. Sgambato V., Pages C., Rogard M., Besson M., Caboche J. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) controls immediat early gene induction on corticostriatal stimulation. J. Neurosci. 18 (21): 8814-8825. 1998(a).

346. Shashoua V.E. Identification of specific changes in the pattern of brain protein synthesis after training. Science. 193 (4259): 1264-1266. 1976.

347. Sheller R.H., Jackson G.F., McAlister L.B., Rothman B.S. A single gene encodes multiple neuroactive peptides mediating a stereotyped behavior. Cell. 35 (1): 7-22. 1983.

348. Shi eh P.B., Hu S-C., Bobb K., Timmusk T., Ghosh A. Identification of a signaling pathway involved in calcium regulation of BDNF expression. Neuron. 20 (4): 727-740. 1998.

349. Shinohara C. Differential actions of forbol esrers and diacylglycerol on inhibition of granulosa cell maturation. Biochem. andbiophis. Res. Comm. 133 (20): 468-474. 1985.

350. Silva A.J., Paylor R., Wehner J.M., Tonegawa S.T. Impaired spatial learning in a-calcium/calmodulin kinase II mutant mice. Science. (257): 206-211. 1992(a).

351. Silva A.J., Stevens C.F., Tonegawa S., Wang Y. Deficient hippocampal long-term potentiation in a-calcium/calmodulin kinase II mutant mice. Science. 257: 201-206. 1992(6).

352. Skoulakis E.M., Kalderon D., Davis R.L. Preferential expression in mushroom bodies of the catalytic subunit of protein kinase A and its role in learning and memory. Neuron. 11(2): 197208. 1993.

353. Sossien W.S., Sactor T.C., Schwartz J.H. Persistem activation of protein kinase C during the development of long-term facilitation in Aplysia. Learning memory. 1: 189-202. 1994.

354. Sugita S, Baxter D.A., Byrne J.H. Mogulation of a cAMP/protein kinase A cascade by protein kinase C in sensory neurons of Aplysia. The J. Neurosci. 17 (19): 7237-7244. 1997.

355. Sun P., Enslen H., Myung P.S., Maurer R.A. Differential activation of CREB by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase type IV involves phosphorylation of a site that negatively regulates activity. Genes Dev. 8: 2527-2535. 1994.

356. Sutherland S.S., Ral T.W., Menon T. Adenyl cyclase. J. Biol. Chem. 237 (4): 1220-1243. 1962.

357. Sutherland E.W., Robinson G.A., Butcher R.W. Some aspects of the biological role of adenosine 3'5'-monophosphate. Circulation. 37(2): 279-306. 1968.

358. Sweatt A.J., Kandel E. Persistent and transcriptionaly dependent increase in protein phosphorylation in long-term facilitation of Aplysia sensory neurons. Nature. 339: 51-54. 1989.

359. Tao M. Preparations and properties of cAMP-dependent PK from rabbit red blood cells. Meth. Enzym. 28: 315. 1969.

360. Tao X., Finkebeiner S., Arnold D.B., Shaywitz A.J., Greenberg M.E. Ca2+ influx regulates BDNF transcription factor-dependent mechanisms. Neuron. 20(4): 709-726. 1998

361. Thomas K.L., Laroche S., Errington M.L., Bliss T.V.P., Hunt S.P. Spatial and temporal changes in signal transduction pathways during LTP. Neuron. 13: 737-745. 1994.

362. Thompson T.N. Classical conditioning in snail. J. Comp. and Physiol. Psychol. 37: 467-473. 1936.

363. Toledo-Aral J.J., Brehm P., Halegoua S, Mandel G. A . A single pulse of nerve growth factor triggers long-term neuronal excitability through sodium channel gene induction. Neuron. 14: 607-611. 1995.

364. Treisman R. The serum response element. Trends Biochem Sci. 17: 423-426. 1992.

365. Treisman R. Regulation of transcription by MAP kinase cascades. Current opinion in cell biology. 8(2): 205-215. 1996.

366. Treisman R. Journey to the surface of the cell: fos regulation and the SRE. EMBO J. 14: 4905-4913. 1995

367. Tsukada T., Fink J.S., Mandel G., Goodman R.H. Identification of a region in the human vasoactive intestinal polypeptide gene responsible for regulation by cyclic AMP. J. Biol. Chem. 262: 8743-8747. 1987.

368. Tuazon P.T., Traugh J.A. Casein kinase-I and II-multipotential serine protein kinases:structure, function and regulation. Adv. second Messenger Phosphoprotein Res. 23: 123164. 1991.

369. Vaughan Ch. Second wind for second-messenger research. Bioscience. 37(9): 642-646. 1987.

370. Veber J.R., Skene J.H.P. The activity of a highly promiscuous AP-1 element can be confined to neurons by a tissue-selective repressive element. J. Neurosci. 18(14): 5264-5274. 1998.

371. Vinson C., Sigler P., McKnight S.L. A scissor-grip model for DNA recognition by a family of leucine zipper proteins. Science. 246: 911-916. 1989.

372. Vogel S.S., Chin G.J., Mumby S.M., Schonberg M., Schwartz J.H. G-proteins in Aplysia: biochemical characterization and regional and subcellular distribution. Brain Res. 478: 281-292. 1989.

373. Vossler M.R., Yao H., York R.D., Pan M.G., Rim C.S., Stork P.J.S. cAMP activates MAP kinase and Elk-1 through a B-Raf-and-RapI-dependent pathway. Cell. 89: 73-82. 1997.

374. Vulliet PR., Langan T.A., Weiner N. Tyrosine hydroxylase: a substate of cyclic AMP-dependent proteinkinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 92-96. 1980.

375. Walsh D.A., Ashby C.D., Gonzales C. Purification of a protein onhibitor of adenosine 3'5'-monophosphate-dependent protein kinase. J. Biochem. 246(7): 1977-1985. 1971.

376. Wen W., Harootunian A.T., Adams SR., Feramisso J., Isien R.Y. et al. Heat-stable inhibitors of cAMP-dependent protein kinase carry a nuclear export signal. J. Biol. Chem. 268: 3221432220. 1994.

377. Winder D.G., Mansuy I.M., Ostan M., Moalem T.M., Kandel E.R. Genetic and pharmacological evidence for a novel intermediate phase of long-term potentiation suppressed by culcinerin. Cell. 92: 25-37. 1998.

378. Wru F, Friedman L., Schacher S. Transient versus persistent functional and structural changes assosiated with facilitation of Aplysia sensorimotor synapses are second messenger dependent. J. Neurosci. 15: 7517-7527. 1995.

379. Xing J., Ginty D.D., Greenberg M.E. Coupling of the RAS-MAPK pathway to gene activation by RSK2, a growth factor-regulated CREB kinase. Science. 273: 959-963. 1996.

380. Xu X., Tao M., Finkbeiner S., Arnold D.B., Shaywitz A.J., Greenberg M.E. Ca2+ influx regilates BDNF transcription by a CREB family transcription factor-dependent mechanism. Neuron. 20(4): 709-726. 1998.

381. Xu X., Raber J., Yang D., Su B., Muske L. Dynamic regulation of c-iun N-terminal kinase activity in mouse brain by environmental stimuli. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 94: 1265512660. 1997.3oe

382. Yamamoto K.K., Gonzalez G.A., Menzel P., Rivier J., Montminy M.R. Characterization of a bipartite activator domain in transcription factor CREB. Cell. 60: 611-617. 1990.

383. Yano S., Fukunaga K., Takiguchi M., Ushio Y., Mori M., Miyamoto E. Regulation of CCAAT/enhancer-binding protein family members by stimulation of glutamate receptors in cultured rat cortical astrocytes. J. Biol. Chem. 271: 23520-23527. 1996.

384. Yin J.C.P., Walach I.S., Del Vecchio M., Wilder E.L., Zhou H., Quinn W.G., Tully T. Induction of a dominant negative CREB transgene specifically blocks long-term memory in Drosophila. Cell. 79(10): 49-58. 1994.

385. Yin J.C.P., Del Vecchio M., Zhou H., Tully T. CREB as a memory modulator: Induced expression of a dCREB2 activator isoform enhances long-term memory in Drosophila. Cell. 81: 107— 115. 1995.

386. Young A.B., Sakurai S.Y., Albin R.I., Makoveic R., Penney J.B. Excitatori amino acid reseptor distribution: quantitative autoradiographic studies. In :Exsitatory amino acids and sinaptic trasmission". Acad. Press limited, London: 19-31. 1991

387. Yovell Y., Kandel E.R., Dudai Y., Abrams T.W. A quantitative study of the Ca 2+/ calmodulin sensitivity of adenylyl cyclase in Aplysia, Drosophila and rat. J. Neurochem. 59(50): 17361744. 1992.

388. Zakharov I.S., Balaban P.M. Neuronal mechanisms of age-dependent chandes in avoidance behaviour of the snail Helix lucorum . Neu- roscience, 23: 721-729. 1987.

389. Zhang F., Endo S., Cleary L.J., Eskin A., Byrne J.H. Role of transforming growth factor-b in long term facilitation in Aplysia. Science. 275: 1318-1320. 1997.

Информация о работе

Гринкевич, Лариса Николаевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.13

Диссертация

Молекулярно-генетические механизмы обучения у виноградной улитки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно