Клонирование генов вне клетки

Саматов, Тимур Рустэмович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование генов вне клетки
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов вне клетки"

На правах

САМАТОВ ТИМУР РУСТЭМОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ВНЕ КЛЕТКИ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук

Четверин Александр Борисович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Лукьянов Сергей Анатольевич

доктор биологических наук, профессор

Степанов Александр Семенович

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики

РАН

Защита состоится « I » 2006 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 501 001 76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « ¿9 » 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук ¿^¿г^е^у/ырл'

Н.О. Калинина

¿of>6b

^177

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний момент все большее применение находят и большее значение приобретают методы in vitro. По сравнению с подходами in vivo, они имеют существенные преимущества: позволяют исследователю в большей степени менять и контролировать условия эксперимента, они быстрее и их проще автоматизировать, они позволяют избежать ограничений, накладываемых живыми клетками и векторами, соответственно, здесь меньше выражен естественный отбор и, наконец, они позволяют работать с ббльшим разнообразием последовательностей нуклеиновых кислот и белков.

Однако среди всего многообразия подходов in vitro нет метода, который позволил бы провести экспрессию наборов РНК и ДНК, их скрининг по свойствам синтезированного продукта и в результате получить индивидуальные последовательности (то есть выделить клоны).

Истинные молекулярные клоны можно получить in vitro с помощью метода молекулярных колоний, экспоненциально размножая нуклеиновые кислоты в пластинке геля. В результате потомство каждой исходной молекулы концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, образуя колонию. Такая колония по сути и является молекулярным клоном. Ранее в Лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН при помощи размножения QP репликазой в пластинке агарозного геля были получены молекулярные клоны реплицирующихся РНК в виде колоний и показана точность и количественность этого метода, названного «методом молекулярных колоний». Использование ПЦР в качестве системы размножения позволило бы получать клоны на уровне ДНК, при этом специфичность размножения была бы ограничена лишь используемыми олигонуклеотидными праймерами.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является создание бесклеточного метода клонирования генов, позволяющего проводить скрининг клонов по свойствам кодируемых продуктов. В связи с этим были поставлены следующие задачи: разработать ПЦР-версию метода молекулярных колоний и

исследовать ее возможности на примере иплммрпрянио гоня г ир.пппьягшянмрм

[рос НАЦИОНАЛЬНАЯ I

биологическои ткани в качестве стартового материад^дгодэвд^и экспрессию

1 i. ¿

(транскрипцию и трансляцию) генов в молекулярных колониях и детектировать синтезированный in situ белок по его функциональной активности.

Научная новизна и практическая значимость. Разработана ПЦР-версия метода молекулярных колоний Найдены условия для размножения полноразмерных генов в виде колоний ДНК, содержащих до 100 миллионов копий исходной матрицы. На примере кДНК гена люциферазы светляка Lucióla mmgrelica впервые осуществлено истинно молекулярное клонирование и последующее размножение in vitro индивидуальных последовательностей из библиотеки кДНК. Показано, что клонирование может быть осуществлено с использованием генетического материала, эквивалентного содержанию всего одной клетки.

Разработана методика транскрипции и транскрипции-трансляции генов в молекулярных колониях. Продемонстрировано, что синтезированный в молекулярных колониях белок является функционально активным. Разработанный метод может быть использован для скрининга генов по функции продуктов экспрессии, то есть для прямой селекции РНК и белков с заданными свойствами. Таким образом, создан первый бесклеточный генетический дисплей, который позволяет получить истинные молекулярные клоны; при этом связь ДНК с соответствующими РНК и белками осуществляется за счет того, что они находятся в составе одной и той же молекулярной колонии.

Апробация работы и научные публикации. Работа прошла апробацию на открытом семинаре Лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Результаты работы опубликованы в 2 статьях в международных научных журналах и доложены на 6 международных научных конференциях, а также на 2 ежегодных научных конференциях Института белка РАН.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного генетическим дисплеям, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ИЬ страницах машинописного текста и содержит 18 рисунков. Библиография включает i {У названий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний Выбор иммобилизованной среды. Полимеразная цепная реакция включает в себя многократный нагрев образца до высокой температуры, поэтому в качестве иммобилизованной среды для проведения реакции нами был выбран термоустойчивый полиакриламидный гель После серии предварительных экспериментов была разработана следующая схема выращивания и детекции колоний ДНК (рис. 1).

Молекулярные колонии формируются за счет того, что полиакриламидный гель препятствует диффузии продуктов реакции. Однако при этом он также затрудняет подвижность компонентов реакционной смеси, в особенности высокомолекулярных (например, ДНК-полимеразы или такой огромной молекулы, как рибосомы, имея в виду дальнейшую экспрессию клонов in situ). Для того, чтобы в конечном счете стала возможной детекция продуктов экспрессии единичных колоний, необходимо было добиться максимальной эффективности

МИКРОСКОПНОЕ ПРЕДМЕТНОЕ СТЕКЛО С ЛУНКАМИ

ЛУНКА С ВЫСУШЕННЫМ ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ

ПРОПИТЫВАНИЕ ГЕЛЯ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСЬЮ ОЛЯ ПЦР

ПРОВЕДЕНИЕ 40 ЦИКЛОВ ПЦР

ПЕРЕНОС ДНК ИЗ ГЕЛЯ НА НЕЙЛОНОВУЮ МЕМБРАНУ

ГИБРИДИЗАЦИЯ МЕМБРАНЫ С МЕЧЕНЫМ ЗОНДОМ И ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАВТОГРАФА

Рис. 1. Выращивание и детекция колоний ДНК.

всех проводимых в геле реакций.

Первым шагом в данном направлении стало сравнение гелей с разными концентрациями акриламида и сшивающего агента (рис. 2). Нас интересовал наименее

концентрированный гель, колонии в котором оставались бы компактными. Мы остановились на 5% геле с

| 6 5 5 5

§" Концентрация акриламида, %

Рис. 2. Зависимость размера колоний от концентрации полиакриламидного геля В каждый гель внесли по 30 молекул гена вРР

Тац

Taq+Pwo

соотношением акриламид:метиленбисакриламид 1001 Несмотря на низкую концентрацию, этот гель обладал приемлемой механической прочностью и был способен выдержать без поврездений манипуляции, проводимые в процессе эксперимента В то же время, колонии в нем были яркими, что отражало содержание продукта ПЦР

Смесь термостабильных ДНК-полимераз. Для более точного и эффективного размножения целых генов при помощи ПЦР используют смесь -эрмостабильных ДНК-полимераз из ТИегтиз ациаНсив и экстремального термофильного организма, например, Ругососсив У1/ое8е1 Нами была исследована зависимость эффект::: 'ее:- г с."т гона СРР п гзле от концентрации Ршэ-полимеразы, добавленной к Тад-полимеразе. На рисунке 3 представлено сравнение выбранной оптимальной концентрации Рмэ-полимеразы (0,02 нг/мкл) с исходной смесью для ПЦР Как можно видеть, использование смеси термостабильных ДНК-полимераз действительно привело к заметному увеличению яркости колоний Эффективность переноса ДНК из геля на мембрану. Схема проведения ПЦР в геле включает в себя стадию переноса новосинтезированной ДНК из геля на мембрану с целью дальнейшей гибридизации и выявления колоний (рис 1) Для количественной оценки эффективности ПЦР в геле необходимо знать, какая при этом доля ДНК оказывается на мембране Эффективность переноса ДНК из геля на мембрану позволил выяснить следующий эксперимент (рис 4). Плазмиду с геном вРР

Рис. з. Ршо днк-полимераза увеличивает эффективность ПЦР в геле Сравнение геля с исходной смесью для ПЦР («Гас?») и геля с добавленной Рмо-полимеразой до 0,02 нг/мкл («7"ас)+Рл<о»). В каждый гель внесли по 30 молекул гена вРР.

Перенесено из геля на мембрану

- - „о ¿X 1и

ю9

10а ЗхЮ7

Нанесено Рис- 4. Эффективность переноса ДНК из геля на прямо нейлоновую мембрану Левая панель указанные

на мембрану количества молекул плазмиды, из которой путем обработки рестриктазой РучИ был вырезан фрагмент, сллтратгтйую!иий продукту ПЦР с геном СРР нанесли на сухой гель, затем гель пропитали буфером до полного восстановления его объема и ДНК перенесли

и? »яймЯпаи*/ Ппоряо паиет** ш?19иимо гопмиаггоа

такой же ДНК нанесли непосредственно на мембрану Далее обе мембраны гибридизовапи с радиоактивным зондом и получили их радиоавтографы

10й ш7

106

обработали рестриктазой Pvull и получили фрагмент, соответствующий продукту ПЦР Указанные на рисунке 4 количества молекул этого фрагмента нанесли на сухой гель, затем добились полного восстановления объема геля, пропитав его буфером Далее провели перенос ДНК из геля на мембрану Эту мембрану вместе с другой, на которую указанные количества той же ДНК нанесли непосредственно, гибридизовали с зондом и получали радиоавтограф Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в результате переноса на мембране оказывается не более 10% от всей ДНК, находящейся в геле.

Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний. В геле с выбранной концентрацией акриламида и с использованием смеси Taq- и Ри/о-полимераз мы размножали гены обелина и GFP (рис. 5). В качестве матрицы были использованы линеаризованные плазмиды В случае гена обелина длина размножаемого продукта составляла 756 п о и он включал в себя Т7 промотор и кДНК фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima вместе с природной 5'-нетранслируемой областью, которая усиливает синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы При размножении гена GFP продукт длиной 1570 по включал в себя под контролем Т7 промотора ген GFP, окруженный 5'-нетранслируемой областью мРНК обелина и З'-нетранслируемой областью сателлитного вируса некроза табака, также усиливающей синтез белка в

Ген обелина (756 п.о.)

Ген GFP -

(1570 п.о.) 4*

0 30 100

# ю9

в ю8

ю7

# ю8

* ю7

106

Число копий

Число молекул матрицы в геле продукта

Рис. 5. Размножение генов при помощи ПЦР в геле Гены обелина и ОРР размножили в 5% полиакриламидном геле (соотношение акриламид метиленбисакриламид 1001) колонии ДНК перенесли на мембрану и выявили гибридизацией с радиоактивным зондом Число молекул продукта ПЦР в колонии можно определить, сопоставляя с известным числом плазмидных матриц, непосредственно нанесенным на мембрану и принимая во внимание эффективность переноса ДНК из геля на мембрану (около 10%)

бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы. В гели вносили указанные на рисунке 5 количества молекул матрицы.

Как можно видеть, число колоний пропорционально и близко к числу добавленных молекул матрицы. Иными словами, в виде колонии выявляется почти каждая исходная молекула гена. В то же время, при клонировании in vivo с использованием векторов и трансформации клеток, выход клонов обычно составляет от 0,0001% до 0,01%. Таким образом, разработанный нами подход позволяет исследователю избежать значительных потерь содержимого генной библиотеки. Кроме того, при клонировании in vitro изучаемые последовательности в меньшей степени подвержены естественному отбору, обусловленному живыми клетками.

По сопоставлению с известными количествами плазмидных матриц, непосредственно нанесенными на мембрану, мы определили содержание продукта ПЦР в колонии. С учетом эффективности переноса ДНК из геля на мембрану (около 10%) можно сделать вывод о том, что колонии с геном обелина содержат порядка 109 копий продукта ПЦР (то есть около 1 нг), а с геном GFP - 108 (около 0,2 нг). Это количество легко детектируется при помощи гибридизации с меченым зондом и, как было нами показано в дальнейшем, вполне пригодно для дальнейшей работы, например, для экспрессии in situ При этом молекулярные колонии представляют собой чистые препараты генов, свободные от примесей клеточных ДНК и РНК. В традиционном же подходе in vivo интересующие гены размножают в составе вирусов или клеток, поэтому необходимо выделять и очищать ДНК полученных клонов для анализа и дальнейших манипуляций.

Клонирование in vitro кДНК люциферазы

Получение и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле.

С целью демонстрации возможностей разработанного метода мы клонировали кДНК гена люциферазы Lucióla mingreiica. В этом случае в качестве исходного материала для клонирования использовали не очищенный препарат плазмидной ДНК, как для генов обелина и GFP, а «фонарики» светляка. Из них выделили суммарную РНК и с олиго(6Т)12.18 в качестве праймера для обратной

Рис. 6. Клонирование гена люциферазы

Числами указаны количества суммарной РНК в пикограммах, взятой в образец (А) Препарат суммарной РНК светляка Lucióla mingrehca 1% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием (Б) Продукты размножения кДНК полученной путем обратной транскрипции суммарной РНК светляка с использованием олиго(с1Т)12,8 ПЦР проводили в жидкой среде с праймерами, специфичными к гену люциферазы В качестве маркера использовали продукт размножения кДНК люциферазы клонированной в составе плазмиды 1% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием (В) Продукты размножения суммарной кДНК при помощи ПЦР в геле с праймерами, специфичными к гену люциферазы (Г) Контрольная ПЦР в геле, где для размножения брали суммарную РНК после стадии обратной транскрипции, проведенной в присутствии одного лишь dTTP.

транскрипции создали библиотеку кДНК, которую использовали для дальнейшего размножения с геноспецифичными праймерами. Длина размноженной с помощью ПЦР кДНК люциферазы составляла 1702 п.о.

На рисунке 6Б представлены продукты размножения кДНК при помощи ПЦР в жидкой среде. Как видно из рисунка, полоса, соответствующая размножаемому гену, появляется, когда в смеси для ПЦР присутствует 100 пг суммарной РНК, и уверенно видна при 1000 пг. В то же время, при размножении суммарной кДНК в геле (рис 6В) существенное число колоний образовалось уже при использовании 10 пг РНК О том, что эти колонии специфичны и действительно являются клонами кДНК люциферазы, говорит их отсутствие на рисунке 6Г На нем представлен результат ПЦР в геле, когда для размножения брали суммарную РНК после стадии обратной транскрипции, проведенной в присутствии одного лишь сГГТР вместо всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов.

Следует отметить, что 10 пг РНК приблизительно соответствует содержанию животной клетки Это означает, что предлагаемый нами метод может быть использован для клонирования генетического материала из

В юо ю Г юоо

«Л

4гЛ

единичных клеток напрямую, то есть без предварительного размножения Более того, становится возможным осуществлять отбор материала из разных частей одной клетки (ядра, различных участков цитоплазмы) и анализировать матричные или иные РНК на разных стадиях созревания Кроме того, открывается перспектива с высокой точностью анализировать уровень экспрессии определенных генов на разных стадиях клеточного цикла или в ответ на какое-либо внешнее воздействие на клетку.

Отбор молекулярных клонов из геля. Клонирование подразумевает получение отдельных клонов и возможность их использования в дальнейшей работе Мы попытались их выделить из геля следующим образом-наконечником, содержащим реакционную смесь для ПЦР, прикасались к месту геля, соответствующему молекулярной колонии. Далее проводили ПЦР в жидкой среде и анализировали продукты при помощи Саузерн-блот анализа (рис 7) При этом в качестве контрольного варианта проводили такую же процедуру, но с местом геля, где нет колонии Рисунок 7 демонстрирует, что продукт размножения извлеченного из колоний материала по электрофоретической подвижности соответствует кДНК люциферазы Более того, он гибридизуется с радиоактивно меченным зондом, которым является антисмысловая мРНК люциферазы В то же время, такой продукт отсутствует в контрольном варианте. Это свидетельствует в пользу того, что индивидуальные клоны, полученные в виде молекулярных колоний, можно выделить из геля в чистом виде и размножить при помощи ПЦР в жидкой среде, что позволит проводить с ними дальнейшие манипуляции

Рис. 7. Результат эксперимента по извлечению ДНК — + + Л М из колоний гена люциферазы Саузерн-блот анализ

Jr ''продуктов размножения при помощи ПЦР в жидкой *'ЩШЛ^НаЩ^^^^Л 1929 П среде со специфичными к гену люциферазы - У'ВН^Н .„71 праймерами В качестве матрицы использовали ДНК, ' ~ 1 о/1 П извлеченную из мест геля, соответствующих двум

/ ... разным молекулярным колониям (дорожки «+»), и из

пустого места (дорожка «-»). На дорожке «Л» представлен продукт размножения кДНК люциферазы (1702 по) В качестве маркера (дорожка «М») использовали ДНК фага А, обработанную рестриктазой BstEII Левая часть рисунка - радиоавтограф, правая часть - 1% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием.

Транскрипция в молекулярных колониях

Первой стадией экспрессии генов является их транскрипция, то есть синтез мРНК Мы проводили транскрипцию in situ по следующей схеме Сначала кДНК люциферазы под 17 промотором размножали в виде колоний ДНК, затем гель высушивали. Далее гель пропитывали реакционной смесью для транскрипции, содержащей РНК-полимеразу фага Т7 После набухания геля (1 час при 4°С) и транскрипции (2 часа при 37°С) проводили анализ на наличие колоний РНК На рисунке 8 представлен результат этого эксперимента Видно, что в результате транскрипции in situ существенно увеличился сигнал после гибридизации с зондом. Это усиление говорит о том, что синтез РНК действительно произошел, и по крайней мере 10 молекул транскрипта длиной около 1700 нуклеотидов синтезировалось с одной молекулы матричной ДНК При этом колонии остались четкими и компактными, сохранив высокую разрешающую способность метода молекулярных колоний

Полученный результат говорит о том, что с использованием данного метода можно проводить прямую селекцию молекул РНК с заданными свойствами, таких как рибозимы или аптамеры. Преимуществом предлагаемого нами подхода является то обстоятельство, что молекулярная колония, содержащая интересующую нас РНК, уже содержит соответствующий клон ДНК. Это

позволяет избежать необходимости осуществления обратной транскрипции отобранной РНК и клонирования полученной кДНК т vivo. Кроме того, значительное усиление

гибридизационного сигнала в результате проведения транскрипции in situ можно использовать для повышения чувствительности

обнаружения в геле молекулярных колоний.

Транскрипция

Рис. 8. Усиление сигнала за счет транскрипции в молекулярных колониях Радиоактивно меченную антисмысловую мРНК люциферазы гибридизовали с молекулярными колониями после ПЦР в геле (левая часть рисунка) и после ПЦР с последующей транскрипцией (правая часть) Время экспонирования при авторадиографии было оптимальным для просмотра варианта с транскрипцией

Синтез белка в молекулярных колониях Выбор системы транскрипции-трансляции. Прежде чем приступать к синтезу белка в молекулярных колониях, необходимо было выбрать подходящую бесклеточную систему транскрипции-трансляции. Дело в том, что экспрессия генов в молекулярных колониях имеет ряд особенностей. В частности, в колонии в качестве матрицы будет выступать продукт ПЦР, количество которого существенно меньше, чем обычно используют для бесклеточной экспрессии в жидкой среде. Кроме того, после синтеза белка и его детекции in situ предполагается извлечь из геля целостную ДНК искомого клона. Таким образом, бесклеточная система транскрипции-трансляции должна быть высокоэффективной и содержать как можно меньше нуклеазных примесей. Мы сравнили две распространенные системы - на основе S30 экстракта E.coli и экстракта зародышей пшеницы (рис. 9).

В случае бактериальной системы мы использовали в качестве матрицы генетическую конструкцию, содержащую ген GFP в окружении эффективных для E.coli нетранслируемых усилителей синтеза белка. Эта конструкция присутствовала в трех вариантах: в виде продукта ПЦР, а также ввиде линеаризованной и кольцевой плазмиды. Во всех случаях в реакционную смесь вносили эквимолярные количества ДНК. Необходимо отметить, что в бесклеточной системе на основе S30 экстракта E.coli в качестве матричной ДНК обычно используют кольцевую плазмиду. Как видно из рисунка 9А,

Рис. 9. Сравнение

д . - , м «- ion продуктивности бескпеточных

л 1 i Л и ° 1 1 м систем транскрипции-

трансляции на основе S30 экстракта E.coli и экстракта зародышей пшеницы.

Результаты синтеза GFP (молекулярный вес около 27 кДа) в присутствии [,4С]-лейцина 30 кДа с использованием бесклеточной системы транскрипции-

трансляции на основе (A) S30 экстракта Ecoli и (Б) экстракта зародышей пшеницы В качестве матрицы использовали

эквимолярные количества продукта ПЦР (дорожки «1»), линеаризованной плазмиды (дорожки «2») и кольцевой плазмиды (дорожка «3»). Дорожка «М» содержит маркер -карбоангидразу (молекулярный вес 30 кДа), позиция которой отмечена [ С]-чернилами. Радиоавтограф градиентного 8-22% полиакриламидного геля.

именно этот вариант и обеспечил максимальный выход GFP (приблизительно 4 молекулы белка на 1 молекулу ДНК-матрицы). С линеаризованной плазмидой синтез заметно хуже, а при использовании продукта ПЦР полоса, соответствующая GFP, вообще практически отсутствует. Другая ситуация наблюдается, когда эксперимент проводили с системой на основе экстракта зародышей пшеницы (рис. 9Б). Матрицами служили линеаризованная плазмида и продукт ПЦР с геном GFP в окружении соответствующих усилителей трансляции (рис. 5). Выход белка в обоих случаях практически одинаков и составляет порядка 10 молекул GFP на 1 молекулу ДНК-матрицы. Полученные данные согласуются с тем, что эта бесклеточная система характеризуется небольшим уровнем нуклеазных активностей. Поэтому дальнейшие усилия по разработке метода экспрессии генов в молекулярных колониях следовало сосредоточить на бесклеточной системе транскрипции-трансляции с экстрактом зародышей пшеницы.

Транскрипция-трансляция в геле. Успех экспрессии генов в молекулярных колониях зависел от того, будет ли происходить синтез белка в полиакриламидном геле и будет ли синтезированный белок функционально

активен.

Рис. 10. Эффективность транскрипции-трансляции в геле. С указанными количествами матричной ДНК провели транскрипцию-трансляцию в присутствии ["С]-лейцина в жидкой среде и в геле, на который перед пропитыванием реакционной смесью нанесли разведения ДНК Включение меченой аминокислоты анализировали на нитроцеллюлозных мембранах с нанесенными из пробирки аликвотами или перенесенными из геля продуктами трансляции (автограф последней мембраны показан на вставке).

Ответ на первый вопрос нам дал следующий эксперимент. На сухой гель мы нанесли ряд аликвот с разведениями матричной ДНК (линеаризованной плазмиды с геном обелина), имитируя таким образом молекулярные колонии. Далее гель пропитали бесклеточной системой транскрипции-трансляции с экстрактом зародышей пшеницы, содержащей [14С]-лейцин, и инкубировали в

Молекул ДНК в образце

течение 1 часа при 25°С После этого белки перенесли из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond™ С, освободились от невключенной метки кипячением в 5% ТХУ и анализировали оставшуюся на мембране радиоактивность при помощи фосфоимиджера Cyclone™ На рисунке 10 представлены результаты этого эксперимента Как можно видеть, эффективность синтеза белка в геле всего лишь втрое ниже, чем контрольного синтеза в жидкой среде Следует принять во внимание тот факт, что только часть продуктов трансляции переносится из геля на мембрану (например, как мы знаем, эффективность переноса ДНК составляет около 10%) С учетом этого можно сделать вывод, что бесклеточная система транскрипции-трансляции практически столь же продуктивна в геле, как и в жидкой среде.

Эффективность синтеза функционально активного белка в геле мы исследовали на примере GFP (рис 11) По аналогии с предыдущим экспериментом мы имитировали молекулярные колонии ДНК нанесением на

гель ряда аликвот

0 15 30 60 120

с разведениями линеаризованной плазмиды с геном GFP.

20 40 60 80 100 120

Время транскрипции-трансляции, минуты

3»10°

i08j2}108 3*108 3*107 Молекул ДНК в точке

2 3 4 5 6 Время транскрипции-трансляции часы

Рис. 11. Синтез вРР в бесклеточной системе транскрипции-трансляции (А) Синтез вРР в жидкой среде в присутствии [14С]-лейцина Алик-воты реакционной смеси (по 5 мкл) отобранные в указанные моменты времени, подвергали электрофорезу вместе с маркером подвижности (дорожка «М» см подпись к рис 9), затем гель высушивали и

радиоавтографирова-ли (левая часть рисунка) На правой части рисунка представлена зависи-мость количества белка в полосе вРР от времени транс-крипции-трансляции (Б) Флуоресценция вРР, синтезированного в геле На гель нанесли указанные количества матричной ДНК (В) Флуоресценция указанных количеств синтезированного ранее зрелого йРР

10"

Ю9 107 Молекул GFP в точке

Далее гель пропитали бесклеточной системой транскрипции-трансляции с экстрактом зародышей пшеницы и инкубировали при 25°С В указанные на рисунке 11Б моменты времени флуоресценцию GFP в геле регистрировали при помощи конфокального сканера микрочипов ScanArray Express. Приведенные данные демонстрируют, что флуоресцентный сигнал в геле достигает своего максимума после 2 часов транскрипции-трансляции. При этом из рисунка 11А следует, что большая часть белка синтезируется уже к первому часу. В то же время, для созревания этого варианта GFP требуется также около часа Таким образом, можно заключить, что матрикс геля практически не сказывается на скоростях транскрипции, трансляции и формирования функционально активного белка.

Сопоставив интенсивность флуоресцентного сигнала в образце со

свечением известных количеств полученного ранее зрелого GFP (рис. 11В),

можно определить, что в геле синтезировалось порядка 10 молекул GFP на 1

молекулу ДНК-матрицы. Это совпадает с выходом белка в жидкой среде,

рассчитанным по включению [14С]-лейцина (рис. 11 А). Стоит отметить, что в

процессе инкубации происходит диффузия GFP в геле (рис 11 Б) Однако она

становится существенной только после 3 часов инкубации, когда уже завершен

не только синтез белка, но и реакция формирования флуорофора GFP

Поэтому мы ожидали, что

молекулярные колонии белка будут

компактными и сохранится высокая

разрешающая способность метода

Проблема несовместимости

условий ПЦР и транскрипции-

трансляции и ее решение. Первые

эксперименты по синтезу белка в

молекулярных колониях мы

проводили по той же схеме, что и

~ + + транскрипцию in situ - после

Рис. 12. Ингибирование транскрипции- проведения ПЦР гель высушивали, а трансляции компонентами ПЦР

Совмещенная транскрипция-трансляция в затем пропитывали реакционной

жидкой среде в присутствии компонентов смесью для экспрессии 0днако все

100-as 80"

СО

Iю:

I40:

£ 20г со

HQ.

£=г

И О.

~ Я < i2 га й

¡2 i5> со ^ ® Z ^^ Ш х

§ с

о с 2

TJ +1 +

2 rr-f- л а а Ооо ол

8 ¿а^к

I Р si fi =

§ s

со

X §

с +

они были неудачны, и синтеза белка в молекулярных колониях детектировать не удавалось Зная, что транскрипция-трансляция идет в полиакриламидном геле почти столь же эффективно, как и в жидкой среде, мы предположили, что после ПЦР в геле может оставаться ингибитор синтеза белка. Для проверки этого предположения компоненты ПЦР добавили в жидкую систему транскрипции-трансляции (рис 12), в которой в качестве матрицы присутствовала линеаризованная плазмида с геном обелина. Выяснилось, что каждый из компонентов ПЦР в той или иной степени ингибирует синтез белка, но самым сильным ингибитором является буфер (50 мМ Трис-НС1, рН 8,7).

Мы сравнили рН-зависимости транскрипции-трансляции и ПЦР (рис 13). Оказалось, что при оптимальном для синтеза белка значении рН 7,6 сильно подавлена ПЦР. В свою очередь, использование при транскрипции-трансляции буфера для ПЦР со значением рН 8,7 понижает выход белка практически до нуля Как видно из рисунка 13, в принципе возможен компромисс между этими двумя крайностями" при рН 7,9 и синтез белка на относительно высоком уровне, и продукт ПЦР еще удается обнаружить. Однако этот компромисс нас не устраивал Такое уменьшение количества ДНК в геле привело бы к столь низкому содержанию продукта экспрессии в колонии, что мы не смогли бы его детектировать.

Транскрипция-трансляция

*100-(В

I 801

и во«-| 40-

| 20

£ о-

ПЦР в жидкой среде

ПЦР в геле

I I

7.6 7.9 Значение

8.7

Рис. 13. Оптимальные условия ПЦР и транскрипции-трансляции несовместимы Влияние значения рН используемого буфера на эффективность совмещенной транскрипции-трансляции в жидкой среде и на ПЦР в жидкой среде (приведены участки окрашенного

бромистым этидием 1 % агарозного геля, включающие полосу продукта ПЦР) и в геле (приведены радиоавтографы мембран, гибридизованных с зондом) В качестве матрицы использовали плазмиду с геном обелина

рН

Нами было найдено простое и эффективное решение этой проблемы (рис. 14). Если гель, содержащий компоненты ПЦР, промыть спиртово-солевым раствором и далее 50% этанолом, то ингибирующий эффект компонентов ПЦР полностью снимается. При этом ДНК остается в геле в виде столь же компактных точек, как и без всякой обработки (рис. 14).

Молекул ДНК в точке

6x10

""бх ю9

* \

Гель без смеси Гели пропитаны смесью для ПЦР для ПЦР не обработан Обработан

6х10/

6x10а

Рис. 14. Замена в геле буфера для ПЦР на буфер для транскрипции-трансляции Радиоавтографы мембран с продуктами транскрипции-трансляции в геле На гели нанесли указанные количества плазмиды с геном обелина Два геля пропитали смесью для ПЦР, один из них затем промыли спиртово-солевым раствором и 50% этанолом и высушили Далее провели транскрипцию-трансляцию в присутствии [14С]-лейцина

Таким образом, нам удалось полностью поменять реакционную среду без потери генетического материала Данный способ можно использовать для того, чтобы в одном и том же геле последовательно проводить несколько реакций, оптимальные условия которых сильно различаются. Например, после размножения ДНК в виде молекулярных колоний становится возможным проводить in situ различные ферментативные реакции - лигирование, модификации ДНК и т.д.

Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях. Завершением создания

бесклеточного метода клонирования генов стал синтез белка в молекулярных

колониях (рис. 15). Мы размножили ген GFP при помощи ПЦР в геле. Далее

гели промыли спиртово-солевым раствором, высушили и пропитали

бесклеточной системой транскрипции-трансляции на основе пшеничного

экстракта. В процессе инкубации детектировали флуоресценцию GFP (рис

15А). После синтеза белка ДНК из геля перенесли на нейлоновую мембрану,

гибридизовали с радиоактивным зондом и таким образом выявили колонии

ДНК с геном GFP (рис. 15Б). Содержание белка в колонии оценили, сравнив

интенсивность флуоресцентного сигнала со свечением известных количеств

синтезированного ранее зрелого GFP (рис 11 В). Оказалось, колония содержит

в среднем 10® молекул GFP. Это соответствует 40 пг/мм2 белка в геле и

говорит о том, что на одну молекулу матричной ДНК образовалось 10 копий белка (это согласуется с результатами предварительных экспериментов, см рис 11) Обращает на себя внимание тот факт, что число флуоресцентных пятен близко к числу молекул матрицы, добавленных в гель перед ПЦР Более того, изображения гелей, полученные при детекции флуоресценции и при выявлении колоний ДНК с помощью гибридизации, практически совпадают Это означает, что флуоресцируют молекулярные колонии, содержащие ген GFP, то есть экспрессия in situ привела к образованию функционально активного белка.

Разработанный метод позволяет осуществлять быстрый скрининг большого числа клонов одновременно. Благодаря отсутствию клеточных стенок, мембран капель водно-масляной эмульсии и тд имеется прямой доступ к новосинтезированным белкам, что облегчает и ускоряет тестирование их функции Кроме того, исследователь имеет возможность вводить в гель после экспрессии различные реагенты и, таким образом, тестировать специфическую активность клонов в условиях, отличных от условий транскрипции-трансляции.

Полученные результаты позволяют рассматривать разработанный метод как новую разновидность генетического дисплея, обладающую рядом существенных преимуществ перед используемыми в настоящее время подходами В частности, физическая связь фенотипа и генотипа осуществляется за счет того, что ген и соответствующий ему белковый продукт находятся в одной и той же молекулярной колонии Это позволяет

Рис. 15. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях После ПЦР в геле с указанным числом молекул плазмиды, содержащей ген GFP, гели промыли спиртово-солевым раствором и 50% этанолом и высушили Затем в гелях провели транскрипцию-трансляцию и в указанные моменты времени регистрировали флуоресценцию GFP (А) Флуоресценция GFP, синтезированного в

молекулярных колониях

(Б) Колонии гена GFP в тех же гелях Радиоавтографы

мембран, гибридизованных с меченым зондом.

Время транскрипции-трансляции, часы

А 1 2 Б

избежать необходимости в модификациях белка, обеспечивающих ковалентную связь с собственной матрицей либо образование нековалентного с ней комплекса (как, например, тройственного комплекса мРНК, рибосомы и пептидил-тРНК в случае рибосомного дисплея). Таким образом, нативная структура белкового продукта клонов не будет нарушена.

Известно, что бесклеточные системы синтеза белка транслируют только каждую десятую молекулу мРНК, внесенную в реакционную смесь Это означает, что в результате экспрессии библиотеки, где последовательности могут быть представлены всего в одном экземпляре, часть клонов неизбежно останется вне поля зрения исследователя В то же время, предлагаемый нами подход обеспечивает размножение каждой исходной молекулы библиотеки в виде молекулярной колонии, которая содержит многие миллионы копий родителя Следовательно, даже при столь малоэффективном вовлечении матриц в трансляцию проэкспрессирован будет каждый клон Более того, в результате экспрессии в молекулярной колонии оказывается до 109 молекул белкового продукта данного клона. Таким образом, белок имеет возможность формировать олиго- или даже мультимерные комплексы, если этого требует проявление его функциональной активности.

Хотелось бы еще раз подчеркнуть то преимущество разработанного нами метода клонирования, что исследователь имеет возможность сразу извлечь ген в виде ДНК из молекулярной колонии, содержащей искомый белок В отличие от большинства традиционных методов селекции in vitro, результатом которых являются последовательности мРНК (например, в случае рибосомного или мРНК-дисплея), в нашем случае нет необходимости в последующей стадии обратной транскрипции, которая малоэффективна и в процессе которой РНК-зависимой ДНК-полимеразой могут быть внесены мутации в отобранный клон.

выводы

1. Разработана ПЦР-версия метода молекулярных колоний. Найдены условия для размножения полноразмерных генов (свыше 1500 пар оснований) в виде колоний ДНК, содержащих до 100 миллионов копий исходной матрицы. Таким образом, впервые осуществлено истинно молекулярное клонирование генов.

2. На примере «ДНК гена люциферазы светляка Lucióla mingrelica продемонстрирована возможность бескпеточного клонирования и последующего размножения in vitro индивидуальных последовательностей из библиотеки кДНК. Показано, что клонирование может быть осуществлено с использованием генетического материала, эквивалентного содержанию всего одной клетки.

3. Осуществлена транскрипция генов в молекулярных колониях с выходом не менее 10 РНК-копий длиной 1700 нуклеотидов на молекулу ДНК. Разработанный метод может быть использован для прямой селекции РНК с заданными свойствами, таких как рибозимы и аптамеры.

4. Осуществлена экспрессия (транскрипция и трансляция) генов в молекулярных колониях с выходом около 10 копий белка на молекулу ДНК. На примере гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) продемонстрировано, что синтезированный в молекулярных колониях белок является функционально активным Разработанный метод может быть использован для скрининга генов по функции кодируемого белка. Также, поскольку синтезированный белок находится в той же колонии, что и кодирующий его ген, метод может быть использован в качестве альтернативы фаговому и иным формам генетического дисплея.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах Статьи в научных журналах:

1. Chetverina, Н V., Samatov, T.R., Ugarov, V!. and Chetverin, A.B. (2002) Molecular colony diagnostics: detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR. BioTechniques 33 pp 150-157.

2. Samatov, T.R., Chetverina, HV. and Chetverin, A.B. (2005) Expressible molecular colonies. Nucleic Acids Res, 33, e145

Тезисы международных конференций:

1. Samatov, T.R., Chetverina, H.V., Ugarov, V.I., and Chetverin, A.B. (2000) PCR molecular colony technique: the ultrasensitive quantitative diagnostics. Student Meeting of the Medical Academy of Latvia, Riga, Latvia, May 18, pp 28-29.

2. Chetverin, A.B., Samatov, T.R., Chetverina, H.V., and Ugarov, V.I. (2000) DNA colonies: prospects for cell-free gene cloning and diagnostics. Meeting of International Research Scholars, Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, Maryland, USA, June 20-23, p. 65.

3. Chetverina, H.V., Samatov, T.R., Ugarov, V.I. and Chetverin, A.B. (2001) Virus assay with the molecular colony technique. Meeting of International Research Scholars, Howard Hughes Medical Institute, Vancouver, Canada, June 20-23, p. 48.

4. Samatov, T.R., Chetverina, H.V., Ugarov, V.I., and Chetverin, A.B. (2003) PCR molecular colony technique: the powerful tool for quantitative assays. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Kyiv, Ukraine, September 25-27, p. 204.

к исполнению 13/04/2006 Исполнено 17/04/2006

Заказ № 268 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

-7911

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Саматов, Тимур Рустэмович

Использованные сокращения.- б

• ВВЕДЕНИЕ.

1. Обзор литературы.

1.1. Подходы in vivo (методы, использующие клетки).

1.1.1. Фаговый дисплей.

1.1.2. Дисплей на поверхности клеток.

Ф 1.1.3. «Пептиды на плазмидах».

1.1.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vivo.

1.2. Подходы in vitro (бесклеточные методы).

1.2.1. Дисплеи, где белок связан с РНК.

1.2.1.1. Нековалентная связь мРНК с белком.

1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком.

1.2.2. Дисплеи, где белок связан с ДНК.

1.2.3. In vitro компартментализация.

1.2.3.1. Простая эмульсия.

1.2.3.2. Двойная эмульсия.

1.2.3.3. Особенности метода in vitro компартментализации.

1.2.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vitro.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы E.coli и плазмиды.

2.1.1. Штаммы E.coli.

2.1.2. Плазмиды.

2.2. Микробиологические среды.ь 2.3. Трансформация клеток E.coli.

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.4.1. Грубое выделение плазмидной ДНК.

2.4.2. Очистка плазмидной ДНК при помощи кипячения в присутствии

Мд2+ и Трис-HCI (рН 9,0).

2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК.

2.5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica.

2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот и белков.

2.6.1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях.ф 2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях.

2.6.2.1. В денатурирующих условиях.

2.6.2.2. В неденатурирующих условиях.

2.6.3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия.

2.7. Саузерн-блот анализ.

2.7.1. Перенос ДНК из геля на мембрану.

2.7.2. Гибридизация с меченым зондом.

2.8. Определение концентрации белка.

2.9. Выделение и очистка термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз.

2.9.1. Получение препарата (Н1з)б-Риго-полимеразы.

2.9.2. Получение препарата (Ыэ^-Гад-полимеразы.

2.10. Ферментативные реакции.

2.10.1. Рестрикция.

2.10.2. Обратная транскрипция (синтез кДНК).

2.10.3. Транскрипция.

2.10.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.11. Получение экстракта зародышей пшеницы.

2.11.1. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением.

2.11.2. Разрушение зародышей пшеницы.

2.11.3. Гель-фильтрация экстракта зародышей пшеницы.

2.12. Совмещенная транскрипция-трансляция in vitro.

2.12.1. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта S30 E.coli.

2.12.2. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы.

2.13. Метод молекулярных колоний.

2.13.1. Подготовка полиакриламидных гелей.

2.13.2. Полимеразная цепная реакция в геле.

2.13.3. Транскрипция в геле.

2.13.4. Совмещенная транскрипция-трансляция в геле.

2.13.5. Обнаружение колоний ДНК и РНК.

2.13.5.1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану.

2.13.5.2. Гибридизация с меченым зондом.

2.13.6. Детекция белков, синтезированных в геле.

2.13.6.1. Детекция по включению радиоактивной метки.

2.13.6.2. Детекция флуоресценции GFP.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Цели и экспериментальные задачи.

3.2. Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний.

3.2.1. Выбор иммобилизованной среды.

3.2.2. Смесь термостабильных ДНК-полимераз.

3.2.3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану.

3.2.4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний

3.3. Клонирование in vitro «ДНК люциферазы.

3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле

3.3.2. Отбор и размножение молекулярных клонов.

3.4. Транскрипция в молекулярных колониях.

3.5. Синтез белка в молекулярных колониях.

3.5.1. Выбор системы транскрипции-трансляции.

3.5.2. Транскрипция-трансляция в геле.

3.5.3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции и ее решение.

3.5.4. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Истинно молекулярное клонирование генов.

4.1.1. Преимущества бесклеточного клонирования.

4.1.2. Ген люциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов.

4.2. Экспрессия генов в молекулярных колониях.

4.2.1. Новая разновидность генетического дисплея.

4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле.

4.3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки.

4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний.

4.3.2. Изотермические системы размножения генов.

4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов.

ВЫВОДЫ.

Цитированная литература.

Использованные сокращения бисакриламид - N.N'-метиленбисакриламид БСА - бычий сывороточный альбумин

Да - дальтон - единица молекулярной массы, равная массе атома водорода

ДНК - 2-дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК- ДНК-копия РНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

Трис- трис(оксиметил)аминометан

ТХУ - трихлоруксусная кислота

А - аденин или остаток адениловой кислоты

С - цитозин или остаток цитидиловой кислоты

DTT - дитиотрейтол dNTP - дезоксирибонуклеозид-5-трифосфаты (N = А, С, G, Т)

EDTA - этилендиамин-Ы.М.Ы'.М'-тетрауксусная кислота

G - гуанин или остаток гуаниловой кислоты

GFP - зеленый флуоресцирующий белок

HEPES - М-2-оксиэтилпиперазин-1\Г-2-этансульфоновая кислота

IPTG - изопропилтиогалактопиранозид

NTP - рибонуклеозид-5-трифосфаты

PMSF - параметилсульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

Т-тимин или остаток тимидиловой кислоты

TEMED - М.М^'.М'-тетраметилэтилендиамин

U -урацил или остаток уридиловой кислоты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование генов вне клетки"

На сегодняшний момент все большее применение находят и большее значение приобретают методы in vitro. По сравнению с подходами in vivo, они имеют существенные преимущества: позволяют исследователю в большей степени менять и контролировать условия эксперимента, они быстрее и их проще автоматизировать, они позволяют избежать ограничений, накладываемых живыми клетками и векторами, соответственно, здесь меньше выражен естественный отбор и, наконец, они позволяют работать с большим разнообразием последовательностей нуклеиновых кислот и белков.

Необходимо отметить, что к настоящему моменту все же описан ряд экспериментальных бесклеточных подходов, с использованием которых в принципе возможно получить индивидуальные клоны. Эти подходы основаны на той идее, что если сильно разводить экспериментальный образец, то рано или поздно в одном сортировочном компартменте (это может быть, например, реакционная ячейка, элемент микрочипа, микрошарик или капля водно-масляной эмульсии) окажется единичная молекула исследуемой библиотеки. Однако это вовсе не означает, что результатом такой селекции всегда будет истинный молекулярный клон, и сами разработчики этих методов вынуждены в каждом случае проверять чистоту полученных клонов при помощи обычного клонирования с использованием векторов и живых клеток.

Истинные молекулярные клоны можно получить in vitro с помощью метода молекулярных колоний (Четверин и Четверина, 1998), экспоненциально размножая нуклеиновые кислоты в пластинке геля. В результате потомство каждой исходной молекулы концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, образуя колонию. Такая колония по сути и является молекулярным клоном. Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована возможность клонировать таким образом молекулы РНК, размножая их с помощью QP репликазы (Chetverina & Chetverin, 1993).

Целью данной работы было создание версии метода молекулярных колоний, позволяющей клонировать молекулы ДНК, в том числе целые гены, а также разработка метода экспрессии генов в молекулярных колониях.

Данная работа была выполнена в Лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Автор искренне благодарит сотрудников Лаборатории Е.В. Четверину, В.И. Угарова, М.В. Фалалееву, З.В. Валину, Е.А. Узлову и технический персонал за помощь в планировании и проведении экспериментов, обучение и критическое обсуждение результатов.

Автор благодарен Е.С. Высоцкому (Институт биофизики, Красноярск), В.Н. Ксензенко (Институт белка РАН), С. Дабровски и Й. Куру (Технический университет Гданьска, Польша), а также Н.Н. Угаровой (Московский Государственный Университет) за предоставление генетического материала, использованного в работе.

Автор признателен Л.А. Шалойко (филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино), В.А. Яшину (Институт биофизики клетки РАН, Пущино), а также сотрудникам Института белка РАН А.А. Минину и В.А. Широкову за помощь в проведении некоторых предварительных экспериментов.

Особую признательность автор выражает своему научному руководителю А.Б. Четверину за искренний интерес, постоянное внимание и прекрасную школу научной работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДИСПЛЕИ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Саматов, Тимур Рустэмович

- 101 -выводы

2. На примере кДНК гена люциферазы светляка Luciola mingrelica продемонстрирована возможность бесклеточного клонирования и последующего размножения in vitro индивидуальных последовательностей из библиотеки кДНК. Показано, что клонирование может быть осуществлено с использованием генетического материала, эквивалентного содержанию всего одной клетки.

4. Осуществлена экспрессия (транскрипция и трансляция) генов в молекулярных колониях с выходом около 10 копий белка на молекулу ДНК. На примере гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) продемонстрировано, что синтезированный в молекулярных колониях белок является функционально активным. Разработанный метод может быть использован для скрининга генов по функции кодируемого белка. Также, поскольку синтезированный белок находится в той же колонии, что и кодирующий его ген, метод может быть использован в качестве альтернативы фаговому и иным формам генетического дисплея.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саматов, Тимур Рустэмович, Москва

1. Верхуша В.В., Аковбян Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Вржещ

2. П.В. (2001) Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. Биохимия, т.66 (12), с.1656-1667.

3. Четверин А.Б., Четверина Е.В. (1998) Способ клонирования нуклеиновыхкислот. Патент РФ № 2 114 175.

4. Agterberg, М., Adriaanse, Н., van Bruggen, A., Karperien, М. and Tommassen, J.1990) Outer-membrane PhoE protein of Escherichia coli K-12 as an exposure vector: possibilities and limitations. Gene 88:37-45.

5. Alberts, В., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D. (1994)

6. Molecular Biology of the Cell. 3rd edn. Garland Publishing, NY

7. Alimov, A.P., Khmelnitsky, A.Yu., Simonenko, P.N., Spirin, A.S. and Chetverin,

8. A.B. (2000) Cell-free synthesis and affinity isolation of proteins on a nanomole scale. BioTechniques 28:338-344.

9. Amstutz, P., Pelletier, J.N., Guggisberg, A., Jermutus, L., Cesaro-Tadic, S.,

10. Zahnd, C. and Pluckthun, A. (2002) In vitro selection for catalytic activity with ribosome display. J. Am. Chem. Soc. 124:9396-9403.

11. Aruffo, A. and Seed, B. (1987) Molecular cloning of a CD28 cDNA by a highefficiency COS cell expression system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:85738577.

12. Bernath, K., Hai, M., Mastrobattista, E., Griffiths, A.D., Magdassi, S. and Tawfik,

13. Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure forscreening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.

14. Boder, E.T. and Wittrup, K.D. (1997) Yeast surface display for screeningcombinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15:553-557.

15. Brunet, E., Chauvin, C., Choumet, V. and Jestin, J.-L. (2002) A novel strategy forthe functional cloning of enzymes using filamentous phage display: the case of nucleotidyl transferases. Nucleic Acids Res. 30:E40.

16. Chen, L., MacMillan, A.M., Chang, W., Ezaz-Nikpay, K., Lane, W.S. and

17. Verdine, G.L. (1991) Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methyltransferase. Biochemistry 30:11018-11025.

18. Chen, W. and Georgiou, G. (2002) Cell-surface display of heterologous proteins:from high-throughput screening to environmental applications. Biotechnol. Bioeng. 79:496-503.

19. Chen, Y. (2003) Novel approach to generate human monoclonal antibodies by

20. PROfusion™ Technology. Cambridge Healthtech Institute 4th Annual Conference on Recombinant Antibodies, Cambridge, MA, USA.

21. Chetverina, H.V. and Chetverin, A.B. (1993) Cloning of RNA molecules in vitro.

22. Nucleic Acids Res. 21:2349-2053.

23. Chetverina, H.V., Samatov, T.R., Ugarov, V.I. and Chetverin, A.B. (2002)

24. Molecular colony diagnostics: detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR. BioTechniques 33: 150-157.

25. Cohen, H.M., Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (2004) Altering the sequencespecificity of Haelll methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng. Des. Sel. 17:3-11.

26. Compton, J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 350:9192.

27. Cormack, B.P., Valdivia, R.H. and Falkow, S. (1996) FACS-optimized mutants ofthe green fluorescent protein (GFP). Gene 173:33-38.

28. Cull, M.G., Miller, J.F. and Schatz, P.J. (1992) Screening for receptor ligandsusing large libraries of peptides linked to the С terminus of the lac repressor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:1865-1869.

29. Dabrowski, S. and Kur, J. (1998) Cloning and expression in Escherichia coli ofthe recombinant His-tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei. Protein Expr. Purif. 14:131-138.

30. Doi, N., Kumadaki, S., Oishi, Y., Matsumura, N. and Yanagawa, H. (2004) Invitro selection of restriction endonucleases by in vitro compartmentalization. Nucleic Acids Res. 32:E95.

31. Ernst, W., Grabherr, RM Wegner, D., Borth, N. Grassauer, A. and Katinger, H.1998) Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library. Nucleic Acids Res. 26:1718-1723.

32. De Figueiredo, P., Roberts, R.L. and Nester, E.W. (2004) DARTs: A DNA-basedin vitro polypeptide display technology. Proteomics 4:3128-3140.

33. Fletcher, G., Mason, S., Terrett, J. and Soloviev, M. (2003) Self-assembly ofproteins and their nucleic acids. J. Nanobiotechnology 1:1.

34. Francisco, J.A., Earhart, C.F. and Georgiou, G. (1992) Transport and anchoringof (3-lactamase to the external surface of Escherichia coii. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:2713-2717.

35. Fraser, Т.Н. and Rich, A. (1973) Synthesis and aminoacylation of 3'-amino-3'deoxy transfer RNA and its activity in ribosomal protein synthesis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 70:2671-2675.

36. Gates, C.M., Stemmer, W.P.C., Kaptein, R. and Schatz, P.J. (1996) Affnityselective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor "headpiece dimer". J. Mol. Biol. 255:373-386.

37. Georgiou, G. (2000). Analysis of large libraries of protein mutants using flowcytometry. Adv. Protein Chem. 55, 293-315.

38. Georgiou, G., Stathopoulos, C., Daugherty, P.S., Nayak, A.R., Iverson, B.L. and

39. Curtiss III, R. (1997) Display of heterologous proteins on the surface ofmicroorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15:29-34.

40. Ghadessy, F.J., Ong, J.L. and Holliger, P. (2001) Directed evolution ofpolymerase function by compartmentalized self-replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98:4552-4557.

41. Ghadessy, F.J., Ramsay, N. Boudsocq, F., Loakes, D., Brown, A., Iwai, S.,

42. Vaisman, A., Woodgate, R. and Holliger, P. (2004) Generic expansion of the substrate spectrum of a DNA polymerase by directed evolution. Nat. Biotechnol. 22:755-759.

43. Griffiths, A.D. and Tawfik, D.S. (2003) Directed evolution of an extremely fastphosphotriesterase by in vitro compartmentalization. EMBO J. 22:24-35.

44. Guatelli, J.C., Whitfield, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richman, D.D. and

45. Gingeras, T.R. (1990) Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:1874-1878.

46. Gunneriusson, E., Samuelson, P., Ringdahl, J., Gronlund, H., Nygren, P.-A. and

47. Stahl, S. (1999) Staphylococcal surface display of immunoglobulin A (IgA)-and IgE-specific in w'fro-selected binding proteins (affibodies) based on Staphylococcus aureus Protein A. Appl. Environ. Microbiol. 65:4134-4140.

48. Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M. and Kreider, B.L. (2001) Invitro selection and characterization of Bcl-X(L)-binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276:20898-20906.

49. Hoogenboom, H.R. (2005) Selecting and screening recombinant antibodylibraries. Nat. Biotechnol. 23:1105-1116.

50. Huang, W., Petrosino, J. and Palzkill, T. (1998) Display of functional |3-lactamaseinhibitory protein on the surface of M13 bacteriophage. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42:2893-2897.

51. Igloi, G.L. (1983) A silver stain for the detection of nanogram amounts of tRNAfollowing two-dimensional electrophoresis. Anal. Biochem. 134:184-188.

52. Illarionov, B.A., Bondar, V.S., lllarionova, V.A. and Vysotski, E.S. (1995)

53. Sequence of the cDNA encoding the Ca2+-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene 153:273-274.

54. Illarionov, B.A., Frank, L.A., lllarionova, V.A., Bondar, V.S., Vysotski, E.S. and

55. Blinks, J.R. (2000) Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator. Methods Enzymol. 305:223-249.

56. Isticato, R., Cangiano, G., Tran, H.T., Ciabattini, A., Medaglini, D., Oggioni, M.R.,

57. De Felice, M., Pozzi, G. and Ricca, E. (2001) Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. J. Bacteriol. 183:6294-6301.

58. Jung, H.C., Lebeault, J.M. and Pan, J.G. (1998) Surface display of Zymomonasmobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein of Pseudomonas syringae. Nat. Biotechnol. 16:576-580.

59. Kim, D.M., Kigawa, Т., Choi, C.Y. and Yokoyama, S. (1996) A highly efficientcell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239:881-886.

60. Laemmli, D.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of Bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

61. Leemhuis, H., Stein, V., Griffiths, A.D. and Hollfelder, F. (2005) New genotypephenotype linkages for directed evolution of functional proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 15:472-478.

62. Lindner, P., Guth, В., WQIfing, C., Krebber, C., Steipe, В., Muller, F. and

63. Plukthun, A. (1992) Purification of native proteins from the cytoplasm and periplasm of E.coli using IMAC and histidine tails: a comparison of proteins and protocols. Methods 4:41-56.

64. Liu, R., Barrick, J.E., Szostak, J.W. and Roberts, R.W. (2000) Optimizedsynthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection. Methods Enzymol. 318:268-293.

65. Lizardi, P.M., Huang, X., Zhu, Z., Bray-Ward, P., Thomas, D.C. and Ward, D.C.1998) Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat. Genet. 19:225-232.

66. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951) Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

67. Madin, K., Sawasaki, Т., Ogasawara, T. and Endo, Y. (2000) A highly efficientand robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos:

68. Plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:559-564.

69. Maruyama, I.N., Maruyama, H.I. and Brenner, S. (1994) Afoo: А Л phage vectorfor the expression of foreign proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:82738277.

70. Masai, H. and Arai, K. (1988) RepA protein- and oriR-dependent initiation of R1plasmid replication: identification of a rho-dependent transcription terminator required for cis-action of repA protein. Nucleic Acids Res. 16:6493-6514.

71. Mastrobattista, E., Taly, V., Chanudet, E., Treacy, P., Kelly, B.T. and Griffiths,

72. A.D. (2005) High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a (3-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem. Biol. 12:1291-1300.

73. Mattheakis, L.C., Bhatt, R.R. and Dower, W.J. (1994) An in vitro polysomedisplay system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:9022-9026.

74. Merryman, C., Weinstein, E., Wnuk, S.F. and Bartel, D.P. (2002) A bifunctionaltRNA for in vitro selection. Chem. Biol. 9:741-746.

75. Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W. and Uhlenbeck, O.C. (1987)

76. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15:8783-8798.

77. Monro, R.E. and Vazquez, D. (1967) Ribosome-catalysed peptidyl transfer:effects of some inhibitors of protein synthesis. J. Mol. Biol. 28:161-165.

78. Notomi, Т., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, Т., Watanabe, K., Amino,

79. N. and Hase, T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28:E63.

80. Odegrip, R., Coomber, D., Eldridge, В., Hederer, R„ Kuhlman.'P.A., Ullman, C.,

81. FitzGerald, K. and McGregor, D. (2004) CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:2806-2810.

82. Pavlov, M.Y. and Ehrenberg, M. (1996) Rate of translation of natural mRNAs inan optimized in vitro system. Arch. Biochem. Biophys. 328:9-16.

83. Patnaik, R. and Swartz, J.R. (1998) E.coli-based in vitro transcription/translation:in wVo-specific synthesis rates and high yields in a batch system. BioTechniques 24:862-868.

84. Pedersen, H., Holder, S., Sutherlin, D.P., Schwitter, U., King, D.S. and Schultz,

85. P.G. (1998) A method for directed evolution and functional cloning of enzymes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:10523-10528.

86. Pratt, J.M. (1984) in: Hemes, B.D. and Higgins, S.J., Eds, 179-209, IRL Press,1. Oxford.

87. Reiersen, H., Lobersli, I., Loset, G.A., Hvattum, E., Simonsen, В., Stacy, J.E.,

88. McGregor, D., FitzGerald, K., Welschof, M., Brekke, O.H. and Marvik, O.J. (2005) Covalent antibody display-an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Res. 33:E10.

89. Ren, Z.J., Lewis, G.K., Wingfield, P.T., Locke, E.G., Steven, A.C. and Black,

90. W. (1996) Phage display of intact domains at high copy number: a systembased on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4. Protein Sci. 5:1833-1843.

91. Robert, A., Samuelson, P., Andreoni, C., Bachi, Т., Uhlen, M., Binz, H., Nguyen,

92. T.N. and Stahl, S. (1996) Surface display on staphylococci: a comparative study. FEBS Lett. 390:327-333.

93. Roberts, R.W. and Ja, W.W. (1999) In vitro selection of nucleic acids andproteins: What are we learning? Curr. Opin. Struct. Biol. 9:521-529.

94. Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitroselection of peptides and proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:1229712302.

95. Rosenberg, A., Griffin, K., Studier, F.W., McCormick, M., Berg, J., Novy, R. and

96. Mierendorf, R. (1996) T select phage display system: a powerful new protein display system based on the bacteriophage T7. Innovations 6:1-6.

97. Ryabova, L.A., Desplancq, D., Spirin, A.S. and Pliickthun, A. (1997) Functionalantibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat. Biotechnol. 15:79-84.

98. Ryabova, L.A., Vinokurov, L.M., Shekhovtsova, E.A., Alakhov, Yu.B. and Spirin,

99. A.S. (1995) Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal. Biochem. 226:184-186.

100. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T.,

101. Mullis, K.B. and Erlich, H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.

102. Samatov, T.R., Chetverina, H.V. and Chetverin A.B. Real-time monitoring of

103. DNA colonies growing in a polyacrylamide gel. Anal. Biochem. in press.

104. Sawata, S.Y. and Taira, K. (2003) Modified peptide selection in vitro byintroduction of a protein-RNA interaction. Protein Eng. 16:1115-1124.

105. Schaffitzel, C., Hanes, J., Jermutus, L. and Pluckthun, A. (1999) Ribosomedisplay: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J. Immunol. Methods 231:119-135.

106. Schaffitzel, C. and Pluckthun, A. (2001) Protein-fold evolution in the test tube.

107. Trends Biochem. Sci. 26:577-579.

108. Seed, B. and Aruffo, A. (1987) Molecular cloning of the CD2 antigen, the T-cellerythrocyte receptor, by a rapid immunoselection procedure. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3365-3369.

109. Sepp, A., Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (2002) Microbead display by in vitrocompartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett. 532:455-458.

110. Shaloiko, L.A., Granovsky, I.E., Ivashina, T.V., Ksenzenko, V.N., Shirokov, V.A.and Spirin, A.S. (2004) Effective non-viral leader for cap-independent translation in a eukaryotic cell-free system. Biotechnol. Bioeng. 88:730-739.

111. Shimizu, Y., Inoue, A., Tomari, Y., Suzuki, Т., Yokogawa, Т., Nishikawa, K. and

112. Ueda, T. (2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19:751-755.

113. Smith, G.P. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317.

114. Southern, E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

115. Speight, R.E., Hart, D.J., Sutherland, J.D. and Blackburn, J.M. (2001) A newplasmid display technology for the in vitro selection of functional phenotype-genotype linked proteins. Chem. Biol. 8:951-965.

116. Steiner, G., Liihrmann, R. and Kuechler, E. (1984) Crosslinking transfer RNAand messenger RNA at the ribosomal decoding region: identification of the site of reaction on the messenger RNA. Nucleic Acids Res. 12:8181-8191.

117. Sternberg, N. and Hoess, R.H. (1995) Display of peptides and proteins on thesurface of bacteriophage Л. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:1609-1613.

118. Takahashi, F., Funabashi, H., Mie, M., Endo, Y., Sawasaki, Т., Aizawa, M. and

119. Kobatake, E. (2005) Activity-based in vitro selection of T4 DNA ligase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 336:987-993.

120. Tateyama, S., Horisawa, K., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Doi, N. and

121. Yanagawa, H. (2006) Affinity selection of DNA-binding protein complexes using mRNA display. Nucleic Acids Res. 34:E27.

122. Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (1998) Man-made cell-like compartments formolecular evolution. Nat. Biotechnol. 16:652-656.

123. Turner, R.B. (1977) Analytical Biochemistry of Insects. 3:85-130 Elsevier,1. Amsterdam, Oxford, NY.

124. Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996) Molecular beacons probes that fluoresceupon hybridization. Nat. Biotechnol. 14:303-308.-114108. Ugarov, V.I., Samatov, T.R., Chetverina, H.V., and Chetverin, A.B. (1999)

125. Plasmid purification using hot Mg2+ treatment and no RNase. BioTechniques26:194-198.

126. Urban, J.H., Schneider, R.M., Compte, M., Finger, C., Cichutek, K., Alvarez

127. Vallina, L. and Buchholz, C.J. (2005) Selection of functional human antibodies from retroviral display libraries. Nucleic Acids Res. 33:E35.

128. Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. and Shank, D.D. (1992) Isothermal invitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:392-396.

129. Westerlund-Wikstrom, B. (2000) Peptide display on bacterial flagella: principlesand applications. Int. J. Med. Microbiol. 290:223-230.

130. Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E. and Hoogenboom, H.R. (1994)

131. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12:433-455.

132. Wittwer, C.T., Herrmann, M.G., Moss, A.A. and Rasmussen, R.P. (1997)

133. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. BioTechniques 22:130-138.

134. Xu, L., Aha, P., Gu, K., Kuimelis, R.G., Kurz, M., Lam, Т., Lim, A.C., Liu, H.,1.hse, P.A., Sun, L., Weng, S., Wagner, R.W. and Lipovsek, D. (2002) Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display. Chem. Biol. 9:933-942.

135. Yonezawa, M., Doi, N., Kawahashi, Y., Higashinakagawa, T. and Yanagawa,

136. H. (2003) DNA display for in vitro selection of diverse peptide libraries. Nucleic Acids Res. 31:E118.

Информация о работе

Саматов, Тимур Рустэмович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Клонирование генов вне клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы