Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов"

На правах рукописи

МАШКОВ ОЛЕГ ИГОРЕВИЧ

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ОКТ 2012

Уфа - 2012

005053731

005053731

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Вахитова Юлия Венеровна

Зимин Андрей Антонович

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Доктор биологических наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Заведующая лабораторией

Кандидат биологических наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Пущинского научного центра РАН,

старший научный сотрудник

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

2012г. в« »часов

Защита диссертации состоится «_»_

на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «_

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Рекомбинационный процесс является основой непостоянства генома, это источник новых комбинаций существующих единиц наследственности [Holliday, 1964, 1974]. Четырёх-нитевой перекрест или так называемая структура Холлидея образуется в результате взаимодействия двух молекул ДНК в том месте, где их последовательности отличаются высокой степенью подобия. Точка перекреста (обмена нитями между двумя молекулами) способна самопроизвольно мигрировать в пределах участка высокой гомологии между молекулами [Hsieh, Panyutin, 1995]. Однако, миграция точки перекреста на протяжённом участке невозможна без соответствующего ферментативного аппарата. В силу спиральной формы молекул, при продвижении в любую сторону точки перекреста, неизбежно будут возникать отрицательные или положительные сверхвитки на обеих взаимодействующих сторонах. Данное обстоятельство накладывает существенные ограничения как на скорость миграции перекреста, так и на конечное расстояние, которое способен пройти этот комплекс. В разрешении возникающей ситуации принимают участие перекрест-расщепляющие ферменты (junction resolving enzymes) или резолвазы [Lilley, White, 2001]. Протяжённость участка, на котором взаимодействующие молекулы способны произвести обмен цепями, зависит от ориентации относительно перекреста точки разрешения.

Способность резолваз различать спаренные и неспаренные основания в молекулах ДНК находит применение для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма, составляющего значительную долю вариабельности человеческих геномов [Lishanski, 2000; Lishanski et al., 2000; Yang et al., 2003; Pule et al., 2008]. Причем, несмотря на то, что методов выявления однонуклетидных замен предложено довольно много, ряд из них характеризуются невысокой специфичностью, тогда как считается, что разрешение образующихся четырех-нитевых структур Холлидея крайне

чувствительно к спариванию / неспариванию азотистых оснований. Одним из таких важных ферментов является эндонуклеаза бактериофага Т7, производимая единственной фирмой New Englands Biolabs, Inc. (США) и характеризующаяся высокой стоимостью. В этой связи представляет интерес клонирование гена данной эндонуклеазы, создание на его основе штамма-суперпродуцента, обеспечивающего наработку функционально активного белка.

Цель работы - создание бактериального (Escherichia coli) штамма-суперпродуцента эндонуклеазы I бактериофага Т7 и использование рекомбинантного фермента для разрешения структур типа Холлидея и изучения однонуклеотидных замен.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена бактериофага Т7, кодирующего эндонуклеазу I.

2. Создание генно-инженерных конструкций на основе экспрессирующих векторных молекул, несущих ген Пе1 в различных штаммах E.coli.

3. Получение штаммов-продуцентов эндонуклеазы Т7Е1 на основе культуры клеток E.coli.

4. Создание штамма-суперпродуцента эндонуклеазы Т7Е1 на основе вектора рЕТ22-ЬТ7.

5. Оптимизация условий очистки целевого белкового продукта.

6. Оценка специфической ферментативной активности очищенного белкового экстракта, включая разрешение структур типа Холлидея и детекцию однонуклеотидных замен по конечной точке и в режиме реального времени.

Научная новизна. Показано, что рекомбинантная Т7Е1 эндонуклеаза способна разрешать четырех-нитевые перекресты или структуры Холлидея, а также различать спаренные и неспаренные азотистые основания, в том числе, в режиме реального времени, что позволяет рекомендовать данный фермент для выявления однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека.

Научно-практическая значимость работы. Создан штамм-суперпродуцент фермента Т7Е1, находящего новое применение в анализе

полиморфизма ДНК. Оптимизация отдельных стадий технологии получения и очистки рекомбинантной Т7 эндонуклеазы I из штаммов E.coli обеспечивает наработку функционально активного фермента в количестве до 50 мг/л жидкой культуры.

Конкурсная поддержка работы. Данная работа проводилась в рамках государственного контракта №02.740.11.0290 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на П школе-конференции молодых учёных «ЭкоБиотех-2011» (Уфа, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 155 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования в данной работе служил ген эндонуклеазы I бактериофага Т7 (t7el), а также синтетическая ДНК и ДНК человека.

В экспериментах использовали рекомбинантные плазмидные вектора pKRXT7-El, рЕТ-ЗаТ7, рЕТ-22ЬТ7, pQE-30T7, PinPointXA-2T7, несущие ген t7el. В качестве штаммов-продуцентов целевого белка для различных векторных систем использовали соответствующие бактериальные культуры: для фагмидного вектора pKRX использовался бактериальный штамм E.coli XLl-BIue; для рекомбинантных экспрессирующих векторов на основе серии рЕТ - штамм E.coli BL21(DE3)pLysS; для работы с рекомбинантным вектором на основе pQE-30 - штамм E.coli BL21(DE3); для рекомбинантного вектора на основе PinPoint - штамм E.coli JM109.

Методы исследования Выделение высокомолекулярной ДНК проводили фенольно-детергентным методом [Graham, 1978]. Выделение плазмидной ДНК проводили методом мягкого лизиса [Clewell, Helinski, 1969]. Специфическая амплификация целевой нуклеотидной последовательности осуществлялась по стандартной методике ПНР, с некоторыми модификациями температурно-временного режима, либо с использованием различных технологий «горячего старта», в том числе с использованием HS Taq ДНК-полимеразы и наноразмерных коллоидных частиц золота. Определение пуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей выполнялся с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). Выделение белкового продукта осуществляли либо разрушением бактериальной клеточной стенки и нуклеиновых кислот последовательным добавлением лизоцима и ДНКазы, либо непродолжительным воздействием на клеточную массу ультразвука при помощи ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (СССР). Белковый экстракт анализировался в 15% полиакриламидном геле, содержащем SDS [Sambrook et al., 1989]. Аффинную хроматографию клеточного лизата проводили как с растворимой, так и с нерастворимой в воде фракциями. Целевой белковый продукт выделяли с помощью элюирующего буферного раствора, содержащего высокую концентрацию имидазола. Количественную оценку выхода белкового продукта в полученных фракциях осуществляли с помощью детекции спектра поглощения OD254 на высокоэффективном жидкостном хроматографе BioLogic Duo Flow фирмы «BioRad» (США). При визуальном контроле наличия целевого продукта в исследуемых фракциях проводили сравнительный SDS-ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. По итогам анализа спектра поглощения OD254 и SDS-ПААГ-электрофореза отбирали фракции с наибольшим количеством целевого продукта. Отобранные фракции проверяли на присутствие специфической ферментативной активности с использованием в качестве субстрата четырёхнитевого ДНК-перекреста. Наличие эндонуклеазной активности по конечной точке определяли при сравнительном ПААГ-

электрофорезе в денатурирующих условиях. Разрешение структур типа Холлидея при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК проводили в изотермических условиях в ДНК-термоциклере с оптическим модулем модели iQ5 фирмы Bio-Rad Laboratories (США) в реальном времени путем регистрации FRET-эффекта с использованием в качестве донора флуоресценции красителя FAM и в качестве акцептора - флуорохрома ROX на предложенной ранее платформе «УФА» [Чемерис и др., 2005].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение экспрессирующихрекомбинантных векторных молекул

В качестве стартового материала использовали тотальную геномную ДНК, выделенную из исходной культуры бактериофага Т7. Для получения полноразмерной последовательности гена t7el были подобраны праймеры, отжигающиеся по краям данного гена. Для удобства клонирования экстрапоследовательность праймеров несла сайт узнавания для рестриктазы ВатШ. Для специфичной амплификации целевого продукта использовали различные способы проведения ПЦР-амплификации: понижение температуры отжига праймеров, изменение рабочей концентрации праймеров, изменение концентрации ионов Mg2+ в буферном растворе ПЦР, применение «горячего старта». Применение методики «горячего старта» объяснялось наличием у прямого и обратного праймеров участков взаимной гомологии, что было вызвано особенностями нуклеотидных последовательностей концов гена t7el. Для исключения образования праймерных димеров в ходе ПЦР использовали различные подходы в виде простого предварительного нагрева реакционной смеси и добавления Taq ДНК полимеразы, использования специфически связанной с моноклональными антителами ДНК-иолимеразы HS Taq ДНК-полимеразы, а также применения наноразмерных (диаметром около 13 нм) частиц коллоидного золота, по-видимому, также при низкой температуре связывающегося с серосодержащими аминокислотами Taq полимеразы и исключающей последнюю из реакции. Дополнительным важным моментом

использования частиц коллоидного золота служит ускоренная теплопередача

7

внутри самой реакционной смеси. При использовании технологии такого отложенного старта удалось наработать целевую последовательность без появления в реакционной смеси неспецифических продуктов амплификации.

Клонирование гена Т7 эндонуклеазы 1 в плазмидную векторную конструкцию pKRX

В результате высокоспецифичной амплификации геномной ДНК бактериофага Т7 был получен фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым и составил 474 п.н. При помощи рестрикгазно-лигазного метода клонирования с использованием вектора pKRX был получен ряд рекомбинантных плазмид, содержащих ген эндонуклеазы I бактериофага Т7. Векторные молекулы со вставкой t7el проверяли на сохранение рамки считывания целевого фрагмента, а также на наличие и правильное расположение других структурных и регуляторных элементов.

Для наработки достаточного количества рекомбинантной ДНК, несущей ген t7el in vivo использовали векторную молекулу pKRXT7-El, которой был трансформирован штамм E.coli XLl-Blue (рис. 1).

Рис. 1. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов

рекомбинантной векторной молекулы pKRXT7-El. Т7 promoter - промотор Т7-РНК-полимеразы; MC S - сайт множественного клонирования (Multiple Cloning Site), полилинкерная последовательность с сайтами узнавания ферментов рестрикции; ATG-codon - инициирующий кодон; t7el - ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; lac promoter - промотор лактозного оперона; lacZ - ген ß-галактозидазы E.coli.

После выделения и очистки плазмидная ДНК рККХТ7-Е1 была амплифицирована с праймерами к гену г7е1: Т7Е1-и и Т7Е1-Ь (рис. 2а). Далее был проведён рестрикционный анализ продукта ПНР, полученного при амплификации плазмидной ДНК клонов рКЮС, содержащих вставку, с праймерами Т7Е1-11 и Т7Е1-Ь (рис. 26). Рестрикционый анализ показал наличие фрагментов, соответствующих по размеру ожидаемым. Следовательно, в вектор р!ЖХ был встроен ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, который впоследствии был специфически амплифицирован и расщеплён соответствующими рестриктазами.

■ ГкМ

ИК

а*

1Ж£Ж1Е51

: : 'ШШ

ШШм щт

а) 4 4 » * * 8 ? б) У '

Рис. 2. Электрофоретический анализ рекомбинантной вставки, амплифицированной с праймерами к гену /7еУ.

а) продукты ПЦР ДНК клонов со вставкой гена /7е7 в векторе рКК Х.

1 - маркер (рВ1изс1^ II §К:НраЩ\ 2-9 - продукты ПЦР ДНК клонов, полученных после трансформации.

б) рестрикционный анализ фрагмента плазмиды рКЫХТ7-Е1, гомологичного гену Пе1. 1 - маркер (рВ1и5Спрг П БКгЯрдП); 2 - амплифицированный фрагмент плазмиды рКЮСТ7-Е1 с праймерами к гену t7el\ 3 - результат рестрикции амплификата Сзр61; 4 - результат рестрикции амплификата НаеIII.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в ) кспресс иру юшу ю векторную молекулу рЕТ-За Идентифицированный при помощи рестрикционного анализа и специфической амплификации плазмидной ДНК ген /7е/ был переклонирован в экспрессирующий вектор рЕТ-За по сайту рестрикции ВатШ. В результате был

9

получен клон рЕТ-ЗаТ7. При амплификации плазмидной ДНК данного клона с праймерами к гену /7е/ нарабатывался ПДР-продукт ожидаемого размера (470 п.н.). При рестрикции ВатШ плазмиды рЕТ-ЗаТ7 также было показано наличие соответствующего фрагмента (рис. За). Направление вставки гена 17е1 в экспрессирующем векторе рЕТ-За определяли при помощи амплификации с использованием Т7-праймера и праймерами к гену 17е1. С целью подтверждения полученных сведений в ПЦР использовали также другие наборы праймеров (рис. 36). Полученные результаты в виде наработки ПЦР-продуктов в ожидаемых вариантах (рис. Зв) подтвердили правильность генно-инженерной конструкции.

Рис. 3. Электрофоретический анализ штамма рЕТ-ЗаТ7.

а) гшазмидный профиль рЕТ-ЗаТ7. 1 - маркер (рВ1и5спр1 П $К:Нра\\): 2 -плазмида рЕТ-За; 3 - плазмида рЕТ-ЗаТ7; 4 - плазмида рЕТ-ЗаТ7:_баотШ.

б) схема расположения внутренних и внешних праймеров при определении направления вставки гена /7е7. Серым цветом показаны внутренние праймеры к гену *7е/ (Т7П и Т7Ш), чёрным - внешние (Т7Е1-и и Т7Е1-Ь).

в) проверка ориентации вставки гена Пе1 в конструкции рЕТ-ЗаТ7.

1 - маркер (рВкюспр! П ЧК:Нра\\): 2-7 - продукты ПЦР: 2 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7 и Т7Е1-Е; 3 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7 и Т7Е1-и; 4 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7 и Т7Н; 5 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7 и Т7Ю; 6 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7Ю и Т7Е1; 7 - рЕТ-ЗаТ7 с праймерами Т7Е1-и и Т7ЕI -Ь.

Окончательная проверка нуклеотидной последовательности и ориентации вставки осуществлялась с помощью автоматического секвенирования.

Клонированная последовательность гена t7el содержит собственный ATG-кодон, что способствовало эффективной экспрессии эндонуклеазы I в клетках E.coli. Помимо Т7-промотора векторная молекула рЕТ-За содержит RBS (ribosome binding site) - сайт связывания рибосом (рис. 4).

Рис. 4. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии в генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7el, составленная на основе данных автоматического секвенирования векторной молекулы pET-3aT7. Т7 promoter - промотор Т7-РНК-полимеразы; Т7 transcription start - точка начала транскрипции для Т7-РНК-полимеразы; RBS -сайт связывания рибосом; ATG-codon - инициирующий кодон; T7-Tag coding sequence - последовательность, кодирующая иммунно-аффинную пептидную метку из первых 11 -ти аминокислот основного продукта 10-го гена бактериофага Т7; t7el - ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; Т7 terminator -терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы.

Секвенирование также показало, что при рестрикции рЕТ-За рестриктазой ВатШ и последующего лигирования с геном (7е1. рамка считывания была восстановлена. Таким образом, сделан вывод, что конструкция рЕТ-ЗаТ7 способна к экспрессии фермента эндонуклеазы I бактериофага Т7.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в экспрессирующие векторные молекулы р()Е-30 и РтРоШХА-2 Помимо вышеуказанного вектора рЕТ-За для создания экспрессирующей конструкции, содержащей ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, были использованы векторные молекулы рЕТ-15, рЕТ-22, рЕТ-26, рЕТ-44, рС)Е-30, Р1пРоиИХА-2. Наиболее удачными (с точки зрения сохранения направления рамки считывания, наличия полной последовательности гена 17е1 при условии отсутствия мутаций, изменяющих аминокислотную последовательность) оказались лишь некоторые клоны. Среди них можно выделить рЕТ-22ЬТ7(с17), р(ЗЕ-30Т7(с122) и РтРошгХЛ-2Т7(с114).

В случае р(ЗЕ-30Т7(с122) и РтРош1ХА-2Т7(с114) применялся рестршсгазно-лигазный метод направленного клонирования с использованием двух эндонуклеаз рестрикции - ВатШ и НМШ (для клонирования в вектор р(5Е-30) или Ше1 (для клонирования в вектор РшРош1ХА-2). Для этого при амплификации гена 1?е1 использовали праймеры Т7Е2-11 и Л-НМШ-К или Т7-Ше1. Каждый из праймеров в своей экстра-последовательности содержит сайт рестрикции. Для Т7Е2-и таковым является сайт рестрикции ВатШ, для Т7-#ш<ШТ-Я - сайт рестрикции НтШ, а для Т7-Ше1 - сайт рестрикции АУе1. После обработки векторной молекулы и амплифицированного гена Ле! соответствующими рестриктазами образуются фрагменты с идентичными комплементарными липкими концами. В случае смешения в растворе гена 17е1 и плазмидной ДНК происходит реассоциация гидролизованных одинаковыми рестриктазами фрагментов разных молекул нуклеиновых кислот.

Анализ с помощью секвенирования вставки гена /7е/ и прилегающих районов в рекомбинантных конструкциях рС^Е-30Т7(с122) и Р1пРот1ХА-2Т7(с114) показал полное сохранение всех структурных и регуляторных элементов экспрессии целевого белка (рис. 5).

Однако дальнейшее практическое использование р<ЗЕ-30Т7(с122) и Р1пРонПХА-2Т7(с114) показало крайне слабую наработку целевого белка и даже отсутствие таковой в бактериальной культуре. Изменение условий

12

культивирования, индукции, выделения или анализа клеточного лизата не принесло положительных результатов при детекции какого-либо полипептида на специфическом субстрате (табл. 1).

ATG-codon

1T-E2-U

Т MCS

Factor Xa Protease recognition site

0Т7

Lambda to transcriptional termination region

"5-iranscription start

biotin purification taci-ce АТб-роЗогс

[¡region 450_

I MCS T7-E2-U Factor Xa Protease recognition site

PinPointX A-2T 7 3,663 т.п.н.

Рис. 5. Схемы расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии в генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7el, составленные на основе данных автоматического секвенирования векторных молекул pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4) соответственно. Т5 transcription start - точка начала транскрипции для Т5-РНК-полимеразы; biotin purification tag-coding region - последовательность, кодирующая аффинную пептидную биотиновую метку; Factor Xa Protease recognition site -последовательность, кодирующая сайт узнавания для фактора Ха-протеазы; ATG-codon - инициирующий кодон; MCS - сайт множественного клонирования; t7el - ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-HindIII-R (в случае pQE-30Т7) или T7-Ndel (в случае PinPointXa-2T7); 6xHis-tag - последовательность, кодирующая аффинную пептидную метку из шести гистидинов.

Поскольку при анализе белкового продукта индуцированных бактериальных культур, содержащих конструкции pET-3aT7, pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4), не обнаружено полипептидной цепи с молекулярной массой и ферментативной активностью соответствующей Т7Е1, было осуществлено клонирование целевого фрагмента в вектор рЕТ-22.

Таблица 1

Параметры выделения целевого белка из экспрессирующих векторных молекул pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4)

Стадия Изменяемые параметры

Культивирование до индукции температурный режим: от 20 до 37°С; OD6ooперед индукцией от 0,3 до 0,8.

Индукция бактериальной культуры конечная концентрация IPTG в бактериальной культуре: от 0,05 до 0,3 мМ; время наращивания индуцированной культуры: от 2 до 6 часов; температурный режим культивирования: от 20 до 37°С.

Выделение белкового продукта УЗ-дезинтегрирование клеточной культуры, либо выделение белкового продукта последовательным воздействием лизоцимом и ДНКазой.

Анализ клеточного лизата Сравнительный анализ результатов электрофоретического разделения полипептидов, выделенных из подвергшихся индукции и контрольных культур, либо аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной культуры и последующий электрофоретический анализ.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в эксирессирующую векторную молекулу рЕТ-22 Рекомбинантная векторная молекула рЕТ-22ЬТ7(с17) создана с использованием аналогичных процедур молекулярного клонирования, применяемых в случае образования рЕТ-ЗаТ7 (клонирование и последующее лигирование по уникальному сайту рестрикции ВатШ). Анализ с помощью секвенирования последовательности вставки гена 17е1 и прилегающих районов рЕТ-22ЬТ7(с17) не выявил критических изменений, способных влиять на экспрессию целевого белка - рамка считывания сохранена, инициирующий и терминирующий кодоны на соответствующих местах, в плазмиде не утрачены сайты транскрипции и трансляции (рис. 6).

ATG-codon ATG-eqdon £

TT promoter

TT-E2-U Multiple Cloning Site

Г-'Ы-i. 7 Multiple Cloning Site

pET-22bT7 5,951 т.п.н.

RBS

™ Lac-operator

TT primer TT transcnption start

T7 terminator

Рис. 6. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7el, составленная на основе данных автоматического секвенирования векторной молекулы рЕТ-22ЬТ7(с17). Т7 promoter - промотор Т7-РНК-полимеразы; Т7 transcription start - точка начала транскрипции для Т7-РНК-полимеразы; Lac-operator - оператор лактозного оперона; RBS - сайт связывания рибосом; ATG-codon - инициирующий кодон; Multiple Cloning Site - сайт множественного клонирования; t7el - ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; His-tag -последовательность, кодирующая аффинную пептидную метку из шести гистидинов; Т7 terminator - терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы.

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Т7Е1, клонированного в векторную молекулу рЕТ-22ЬТ7(с17) Экспрессия рекомбинантной векторной молекулы рЕТ-22ЬТ7(с17)

Бактериальный штамм E.coli BL21(DE3)pLysS был трансформирован

вектором рЕТ-22ЬТ7(с17). Данный штамм позволяет осуществлять строгий

контроль экспрессии белков, находящихся под контролем Т7-РНК-

полимеразного промотора, благодаря наличию pLys-плазмиды, которая

кодирует Т7-лизоцим - естественный ингибитор Т7-РНК-полимеразы. При

экспрессии целевого белка лизоцим не влияет на рост клеточной культуры. В

целях недопущения так называемого «подтекания» промотора (явления, при

котором возможна незначительная экспрессия гена, находящегося под

контролем промотора, без добавления индуктора) наращивание бактериальной

культуры перед индукцией (а также контрольного образца без индукции)

проводили на питательной среде, содержащей 2%-ю химически чистую

глюкозу (репрессор промотора Т7-РНК-полимеразы). После УЗ-

дезинтегрирования проводили сравнительный SDS-PAAG-электрофорез

индуцированных и контрольных образцов (рис. 7). В отличие от

15

рекомбинантных молекул РЕТ-ЗаТ7, РдЕ-30Т7(с122) и РшРотГХА-2Т7(с114), в образцах рЕТ-22ЬТ7(с17), подвергавшихся индукции, уверенно обнаруживался дополнительный полипептидный продукт.

М [2345678

Рис. 7. Электрофореграмма клеточного лизата штамма рЕТ-22ЬТ7(с17). М - белковый маркер (Ша). 1 - без ГРТС; супернатант. 2 - без 1Р'Ш; осадок, разведённый в 0.5 М мочевине. 3 - без ГРТС; осадок, разведённый в 1 М мочевине. 4 - без ГРТС; осадок, разведённый в 2 М мочевине. 5 - 0.5 мМ ГРТС; супернатант. 6 - 0.5 мМ ГРТС; осадок, разведённый в 0.5 М мочевине. 7 - 0.5 мМ ГРТС; осадок, разведённый в 1 М мочевине. 8 - 0.5 мМ ГРТС; осадок, разведённый в 2 М мочевине.

Примечание: овалом выделена область с дополнительным полипептидным продуктом.

Необходимо учитывать, что после вставки в векторную молекулу рЕТ-22Ь гена Пе1 экспрессируемый участок включает не только последовательность самого гена, но и отрезок между полилинкерной последовательностью и инициирующим кодоном с одной стороны и полилинкером и Т7-терминатором с другой (рис. 6). При этом расчётная молекулярная масса целевого полипептида увеличивается с 17,2 до 25,3 кДа. Электрофоретическое разделение клеточного лизата штамма рЕТ-22ЬТ7(с17) служит подтверждением данного факта (рис. 7).

На основании представленных данных сделано заключение, что при выбранных условиях культивирования и выделения белкового экстракта в

штамме рЕТ-22ЬТ7(с17) происходит наработка рекомбинантного белка Т7Е1.

16

Аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной культуры, содержащей рекомбинантную молекулу рЕТ-22ЬТ7(с17) Для специфичной очистки рекомбинантного белка Т7Е1, была проведена аффинная хроматография с помощью M2+-NTA-субстрата. В случае экспрессии рекомбинантного гена t.7el на С-конце полипептидной цепи имеется аффинная метка - полигистидиновый домен, состоящий из шести последовательно расположенных остатков гистидина. Анализ выхода белкового продукта осуществлялся на высокоэффективном жидкостном хроматографе модели BioLogic Duo Flow фирмы «BioRad» (США). Так, нами был зафиксирован выход основной белковой массы (рис. 8.16) при добавлении в отмывочный буфер небольшого количества имидазола (конечная концентрация в растворе -20 мМ - рис. 8.1а). Однако, при увеличении концентрации элюирующего агента до 200 мМ (рис. 8.2а) наблюдался выход дополнительной белковой фракции (рис. 8.26). Это можно объяснить наличием в клеточном лизате рекомбинантного белка Т7Е1 с присоединённой к его N-концу полигистидиновой аффинной меткой, с помощью которой фермент и удерживался на Л72+-]МТА-субстрате.

Fncfanc

22ЬТ7(с17). 1а — повышение концентрации имидазола до 20 мМ в отмывочном буфере. 16 - начало выхода основной части белкового продукта штамма рЕТ-22ЬТ7(с17). 2а - повышение концентрации имидазола до 200 мМ в отмывочном буфере. 26 - начало выхода белкового продукта, связавшегося с Лт ^ -МТА-субстратом.

Фракции, в которых детектировался максимальный выход полипептида с аффинной меткой, подвергали диализу в течение 2 часов при 4°С против градиента 20 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 1 мМ дитиотрейтола, 0.1 мМ EDTA, 50% глицерина, 0.15% Triton Х-100 (рН 7.5 при 25 °С). Данный этап необходим для сохранения ферментативной активности рекомбинантного белка. После этого для анализа чистоты белкового продукта проводили денатурирующий электрофорез в 15% SDS-полиакриламидном геле (рис. 9).

М - 11 2 3 4 5 6

Рис. 9. Электрофореграмма результатов аффинной хроматографии на M*+-NTA-субстрате клеточного лизата штамма pET-22bT7(cl7). М - белковый маркер (ГОа). «-» - Без IPTG, супернант. I - 0.5 мМ IPGT, супернатант. 1 - 6 -последовательные фракции, полученные при проведении аффинной хроматографии на №2+-ЫТА-субстрате клеточного лизата рЕТ-22ЬТ7(с17).

По результатам электрофоретического разделения и последующего окрашивания белкового препарата проводили относительную оценку количества очищенного полипептидного продукта с помощью программы TotalLab 2.01. Разработанная схема выделения и очистки рекомбинантного белка позволяет нарабатывать его в количестве до 50 мг/л жидкой культуры E.coli.

С теми фракциями, где по итогам электрофоретического анализа обнаруживалась наибольшая концентрация одиночного продукта массой 25 кДа

(на рис. 9 это четвёртая фракция), осуществляли эксперимент на наличие специфической ферментативной активности, характерной для Т7Е].

Исследование ферментативной активности очищенного рекомбинантного

белкового продукта Т7Е1 Белковый продукт Т7Е1 обладает специфической ферментативной активностью, которая выражается в расщеплении четырёх-нитевых перекрестов. Для проверки наличия ферментативной активности, характерной для Т7Е1, была создана олигонуклеотидная структура, моделирующая четырёх-нитевой перекрест. В её состав входят четыре одноцепочечных олигонуклеотида. Каждый из них частично комплементарен двум другим (рис. 10). В итоге, при отжиге в одной пробирке эквимолярных количеств всех олигонуклеотидов образуется ДНК-перекрест, являющийся природным субстратом для Т7Е1.

Ь-цепь

(54 я.)

Ь-цепь (28 к.)

разрешение 1|\

разрешение

х-цгпь

<80 н.)

разрешение I

-1 Г "АвСЧ^С И'А !А -С »Т-У "'- Г 15А ~ Щ- "С

Щ. 'т ^разрешение (I

■А «Т

-о *"0 ?-!С !<С-3'

\

г-цепь

(54 я.)

Рис. 10. Схема ДНК-перекреста и его разрешение Т7 эндонуклеазой I. Ь-цепь, длиною 54 нуклеотида, с 1-го по 40-й комплементарна х-цепи, с 41-го по 54-й - Ь-цепи; Ь-цепь, длиною 28 нуклеотидов, с 1-го по 14-й комплементарна Ь-цепи, с 15-го по 28-й - г-цепи; г-цепь, длиною 54 нуклеотида, с 1-го по 14-й комплементарна Ь-цепи, с 15-го по 54-й - х-цепи; х-цепь, длиною 80 нуклеотидов, с 1-го по 40-й комплементарна г-цепи, с 41-го по 80-й - Ь-цепи.

Полученный ДНК-перекрест в эквимолярном количестве отбирали для анализа ферментативной активности выделенных фракций или коммерчески доступного фермента Т7Е1 (New England Biolabs, США). Далее проводили инкубирование растворов в течение двух часов при 37°С. По результатам электрофоретического разделения продуктов ферментативной реакции можно заключить, что при добавлении элюирующего буферного раствора с высоким содержанием имидазола удавалось добиться единовременного выхода белковой фракции, обладающей специфической ферментативной активностью Т7Е1 (рис.

И).

1 2 3 4 5 6

. .•:••-.•-•:- ййм-у'

80 54 40

?х ж Ш ж Ш 14

Рис. 11. Электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях (7 М мочевина) результатов ферментативной активности Т7Е1 и полученных фракций клеточного лизата штамма рЕТ-22ЬТ7(с17) после очистки на №2+-NTA-субстрате. 1 - ДНК-перекрест без обработки ферментативным препаратом. 2 -ДНК-перекрест после обработки коммерческим ферментом Т7Е1 (New England Biolabs, США). 3-6 ДНК-перекрест после обработки полипептидным продуктом 4-7 фракций, соответственно, полученными при хроматографии на №2+-NTA-cy6cTpaTe.

Из рис. 11 видно, что электрофореграмма ДНК-перекреста при денатурирующих условиях не имеет одной выраженной полосы. Вместо этого образец разделяется на три отличающихся по массе фрагмента. Подобное распределение объясняется тем, что два олигонуклеотида из четырёх (Ь- и г-цепь) имеют одинаковую длину - 54 нуклеотида. Однако, после обработки

коммерческим ферментом Т7 эндонуклеазой I характер распределения конформомеров ДНК-перекреста изменяется. Появляются дополнительные фрагменты, обусловленные расщеплением в точке разветвления двух из четырёх нитей ДНК-перекреста. По литературным данным известно, что эндонуклеаза I способна разрезать четырёх-нитевую ДНК двумя способами. Однако в любом случае разрешение структуры Холлидея происходит при одновременном введении одноцепочечных разрывов фосфодиэфирных связей с противоположных 5'-концов цепей ДНК, относительно центра перекреста. Как показано на рисунке 10, Т7 эндонуклеаза I способна разрезать нити ДНК либо со стороны Ь- и г-цепей, либо со стороны х- и Ь-цепей. Поскольку в электрофоретической дорожке, соответствующей коммерческому ферменту Т7Е1 (рис. 11, дорожка 2), происходит разделение ДНК-перекреста на фрагменты 54, 40 и 14 нуклеотидов, можно с уверенностью сказать, что в данном случае преобладает разрешение структуры Холлидея со стороны Ь- и х-цепей. Аналогичная картина наблюдается для ДНК-перекреста, обработанного ферментативным препаратом из четвёртой фракции клеточного лизата. При этом, данная фракция соответствует повышению концентрации имидазола в элюирующем буфере с 20 мМ до 200 мМ. Последующие пятая и шестая фракции (на рис. 11 - дорожки 4 и 5, соответственно), собранные при 200 мМ концентрации имидазола, таковой ферментативной активности не проявляют. Из чего можно заключить, что в них не содержится достаточного количества рекомбинантного белкового продукта. Последняя дорожка элекгрофореграммы соответствует этапу промывки колонки деионизированной водой. В ней, принимая во внимание наличие нерасщеплённого ДНК-перекреста, также не содержится активной формы Т7 эндонуклеазы I.

В качестве одного из методов выявления однонуклеотидных замен служит ферментативное расщепление гетеродуплексов в местах неспаривания нуклеотидов или мисматчей, образующихся в результате отжига цепей ДНК, одна из которых несет мутацию.

600 • • —.......... ' ' •.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 150 500 550 600 650

ÍC» A»p»<l«tion w Cytk: Dwa J0-Ms.05 T^terbv »er remp лап лор иилрЛ

Рис. 12. Кривые флуоресценции олигонуклеотидных структур с полным (1) и неполным (2) спариванием, обрабатываемых рекомбинантной эндонуклеазой Т7Е1.

На рис. 12 можно видеть изменения регистрируемых в режиме реального времени в ДНК-термоциклере с оптическим модулем в условиях изотермической реакции уровней флуоресценции для разрешаемой с помощью рекомбинантной эндонуклеазы T7EI структур Холлидея с полным (1) и неполным (2) спариванием соответственно. Резкое падение под действием Т7Е1 эндонуклеазы уровня флуоресценции (переноса резонансной энергии флуоресценции) соответствует прохождению цепей места неспаривания и отдалением красителя-акцептора от красителя-донора.

ВЫВОДЫ

1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген бактериофага Т7, кодирующий эндонуклеазу I.

2. Проведенное сравнение различных созданных генно-инженерных конструкций, оптимизированных для экспрессии в различных штаммах E.coli, позволило установить, что в отношении уровня экспрессии и эффективности очистки оптимальна конструкция, находящаяся под контролем промотора и терминатора РНК полимеразы Т7 и содержащая на N-конце рекомбинантного гена ti el полигистидиновый домен в штамме E.coli, несущем дополнительную pLys-плазмиду, кодирующую Т7-лизоцим, являющийся естественным ингибитором Т7-РНК-полимеразы, для исключения «подтекания» промотора.

3. Создан штамм-супер продуцент E.coli BL21(DE3)pLysE / рЕТ-22ЬТ7(с17) для наработки эндонуклеазы I бактериофага Т7, в котором целевой фермент

экспрессируется в составе слитного белка, содержащего на N-конце домен из шести последовательно расположенных остатков гистидина.

4. Разработан метод очистки, позволяющий получить до 50 мг фермента Т7 эндонуклеазы I из 1 литра культуры клеток E.coli BL21(DE3)pLysE / рЕТ-22ЬТ7(с17).

5. Показано, что синтезированный белковый препарат Т7Е1 обладает ферментативной эндонуклеазной активностью по отношению к олигомерным ДНК-перекрестам и способен в виде неспаренных участков выявлять однонуклеотидные замены.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Машков О.И., Чубукова О.В. Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, № 5(3). С. 259-262.

2. Бикбулатова С.М., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Машков О.И., Гарафутдинов P.P., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Способы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17, № 1. С. 59-67.

3. Чемерис Д.А., Магданов Э.Г., Машков О.И., Гарафутдинов P.P., Чемерис A.B. ПЦР с отложенным (горячим или задержанным) стартом // Биомика. 2011. Т. 2, №1. С. 1-8.

4. Машков О.И. Структура Холлидея и перекрест-расщепляющие ферменты как основные агенты гомологичной генетической рекомбинации // Биомика. 2011. Т. 2, № 1. С. 9-23.

5. Машков О.И., Чубукова О.В. Детекция de novo однонуклеотидного полиморфизма ДНК с помощью изменённой эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика — наука XXI века». Уфа. 2007. С. 93-95.

6. Машков О.И., Чубукова О.В. Высокочувствительная детекция однонуклеотидных замен при помощи изменённой эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Материалы IV российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань. 2009. С. 305.

7. Машков О.И., Узянбаева А.Х., Гарафутдинов P.P., Сахабутдинова А.Р., Чемерис A.B. Особенности протекания ПЦР в присутствии наночастиц золота // Материалы П-ой Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. Биомика 2011. Т.1, № 2. С. 77-78.

Подписано в печать 02.10.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсегпая. Печать рнзографическая. Тираж 50 экз. Заказ 802. Гарнитура «ТппебЬ'еи'Котап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 2 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Машков, Олег Игоревич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение четырёх-нитевого перекреста (структуры Холлидея). 10 1.1.1. Особенности строения структуры Холлидея.

1.2. Молекулярные основы генетической рекомбинации.

1.3. Обзор структуры ферментов, ответственных за разрешение структуры Холлидея.

1.3.1. Глобальная молекулярная структура резолваз.

1.3.2. Молекулярная организация активного центра резолваз.

1.3.3. Молекулярная структура комплекса ДНК-перекрест-резолваза.

1.3.3.1. Кинетика ассоциации Т4 эндонуклеазы VII со структурой Холлидея.

1.3.3.2. Кинетика ассоциации Т7 эндонуклеазы I со структурой Холлидея.

1.4. Характеристика эндонуклеазы I бактериофага Т7.

1.4.1. Молекулярная структура эндонуклеазы I бактериофага Т7.

1.4.2. Связывание Т7Е1 со специфическим субстатом.

1.4.3. Активный центр Т7 эндонуклеазы 1.

1.5. Гетерологичные системы экспрессии в бактерии Е.соїі.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Выделение и очистка ДНК бактериофага Т7.

2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.4. Выделение и очистка нуклеиновых кислот.

2.5. Микровыделение плазмидной ДНК.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.7. Электрофоретическое фракционирование ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот.

2.8. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.9. Создание ДНК-перекреста.

2.10. Расщепление ДНК-перекреста эндонуклеазой I бактериофага

2.11. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом.

2.12. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.13. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.14. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.15. Экспрессия Т7 эндонуклеазы 1.

2.16. Выделение Т7 эндонуклеазы 1.

2.17. Аффинная хроматография белкового экстракта.

2.18. Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях.

2.19. Основные реактивы, использованные в работе.

2.20. Составы использованных стандартных водных растворов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Амплификация гена эндонуклазы I бактериофага Т7.

3.2. Клонирование гена Т7 эндонуклеазы I в плазмидную векторную конструкцию pKRX.

3.3. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в экспрессирующую векторную молекулу рЕТ-За.

3.4. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в экспрессирующие векторные молекулы pQE-ЗО и

PinPointXA-2.

3.5. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в экспрессирующую векторную молекулу рЕТ-22.

3.6. Экспрессия рекомбинантной векторной молекулы рЕТ

22ЬТ7(с17).

3.7. Аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной культуры, содержащей рекомбинантную молекулу рЕТ

22ЬТ7(с17).

3.8. Исследование ферментативной активности очищенного белкового продукта из клеточного лизата рЕТ-22ЬТ7(с17).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов"

Актуальность работы. Рекомбинационный процесс является основой непостоянства генома, это источник новых комбинаций существующих единиц наследственности (Holliday, 1964, 1974). Четырёх-нитевой перекрест или так называемая структура Холлидея образуется в результате взаимодействия двух молекул ДНК в том месте, где их последовательности отличаются высокой степенью подобия. Точка перекреста (обмена нитями между двумя молекулами) способна самопроизвольно мигрировать в пределах участка высокой гомологии между молекулами (Hsieh, Panyutin, 1995). Однако, миграция точки перекреста на протяжённом участке невозможна без соответствующего ферментативного аппарата. В силу спиральной формы молекул, при продвижении в любую сторону точки перекреста, неизбежно будут возникать отрицательные или положительные сверхвитки на обеих взаимодействующих сторонах. Данное обстоятельство накладывает существенные ограничения как на скорость миграции перекреста, так и на конечное расстояние, которое способен пройти этот комплекс. В разрешении возникающей ситуации принимают участие перекрест-расщепляющие ферменты (junction resolving enzymes) или резолвазы (Lilley, White, 2001). Протяжённость участка, на котором взаимодействующие молекулы способны произвести обмен цепями, зависит от ориентации относительно перекреста точки разрешения.

Способность резолваз различать спаренные и неспаренные основания в молекулах ДНК находит применение для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма, составляющего значительную долю вариабельности человеческих геномов (Lishanski, 2000; Lishanski et al., 2000; Yang et al., 2003; Pule et al., 2008). Причем, несмотря на то, что методов выявления однонуклетидных замен предложено довольно много, ряд из них характеризуются невысокой специфичностью, тогда как считается, что разрешение образующихся четырех-нитевых структур Холлидея крайне чувствительно к спариванию / неспариванию азотистых оснований. Одним из таких важных ферментов является эндонуклеаза бактериофага Т7, производимая единственной фирмой New Englands Biolabs, Inc. (США) и характеризующаяся высокой стоимостью. В этой связи представляет интерес клонирование гена данной эндонуклеазы, создание на его основе штамма-суперпродуцента, обеспечивающего наработку функционально активного белка.

Цель работы - создание бактериального (Escherichia coli) штамма-суперпродуцента эндонуклеазы I бактериофага Т7 и использование рекомбинантного фермента для разрешения структур типа Холлидея и изучения однонуклеотидных замен.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена бактериофага Т7, кодирующего эндонуклеазу I.

2. Создание генно-инженерных конструкций на основе экспрессирующих векторных молекул, несущих ген t7el в различных штаммах E.coli.

3. Получение штаммов-продуцентов эндонуклеазы Т7Е1 на основе культуры клеток E.coli.

4. Создание штамма-суперпродуцента эндонуклеазы Т7Е1 на основе вектора рЕТ22-ЬТ7.

5. Оптимизация условий очистки целевого белкового продукта.

6. Оценка специфической ферментативной активности очищенного белкового экстракта, включая разрешение структур типа Холлидея и детекцию однонуклеотидных замен по конечной точке и в режиме реального времени.

Научная новизна. Показано, что рекомбинантная Т7Е1 эндонуклеаза способна разрешать четырех-нитевые перекресты или структуры Холлидея, а также различать спаренные и неспаренные азотистые основания, в том числе, в режиме реального времени, что позволяет рекомендовать данный фермент для выявления однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека.

Научно-практическая значимость работы. Создан штамм-суперпродуцент фермента Т7Е1, находящего новое применение в анализе полиморфизма ДНК. Оптимизация отдельных стадий технологии получения и очистки рекомбинантной Т7 эндонуклеазы I из штаммов E.coli обеспечивает наработку функционально активного фермента в количестве до 50 мг/л жидкой культуры.

Конкурсная поддержка работы. Данная работа проводилась в рамках государственного контракта № 02.740.11.0290 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на II школе-конференции молодых учёных «ЭкоБиотех-2011» (Уфа, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 155 работ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Машков, Олег Игоревич

выводы

1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген бактериофага Т7, кодирующий эндонуклеазу I.

2. Проведенное сравнение различных созданных генно-инженерных конструкций, оптимизированных для экспрессии в различных штаммах E.coli, позволило установить, что в отношении уровня экспрессии и эффективности очистки оптимальна конструкция, находящаяся под контролем промотора и терминатора РНК полимеразы Т7 и содержащая на N-конце рекомбинантного гена t7el полигистидиновый домен в штамме E.coli, несущем дополнительную pLys-плазмиду, кодирующую Т7-лизоцим, являющийся естественным ингибитором Т7-РНК-полимеразы, для исключения «подтекания» промотора.

3. Создан штамм-суперпродуцент E.coli BL21(DE3)pLysE / рЕТ-22ЬТ7(с17) для наработки эндонуклеазы I бактериофага Т7, в котором целевой фермент экспрессируется в составе слитного белка, содержащего на N-конце домен из шести последовательно расположенных остатков гистидина.

4. Разработан метод очистки, позволяющий получить до 50 мг фермента Т7 эндонуклеазы I из 1 литра культуры клеток E.coli BL21(DE3)pLysE / рЕТ-22ЬТ7(с17).

5. Показано, что синтезированный белковый препарат Т7Е1 обладает ферментативной эндонуклеазной активностью по отношению к олигомерным ДНК-перекрестам и способен в виде неспаренных участков выявлять однонуклеотидные замены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рекомбинационный процесс - одна из причин непостоянства генома, результатом которого является возникновение новых комбинаций единиц наследственности. Структура Холлидея образуется в ходе рекомбинации между двумя молекулами ДНК на участке с высокой гомологией. Ферментами, обслуживающими данный процесс, являются различные резолвазы, призванные устранять положительные и отрицательные сверхвитки при миграции точки обмена цепями.

Повышенная гибкость резолваз в выборе субстрата ферментативной активности вместе со строгой специфичностью к разветвлённым и неспаренным участкам агрегатов нуклеиновых кислот позволяет рассматривать эти ферменты в качестве инструмента выявления однонуклеотидного полиморфизма, а также как составную часть диагностической системы ДНК-типирования личности (Lishanski, 2000;

Lishanski et al., 2000; Yang et al., 2003; Pule et al., 2008). Межмолекулярные взаимодействия резолваз со своими биологическими субстратами до настоящего времени недостаточно изучены. Так, для шести ферментов определён активный центр, ответственный за гидролиз фосфодиэфирных связей (Rafferty et al., 2003; Raaijmakers et al., 1999; Hadden et al., 2001), получена кристаллическая структура комплекса ДНК-фермент для нескольких резолваз бактериального типа (Giraud-Panis, Lilley, 1998; Chan et al., 1998; Biertümpfel et al., 2007; Hadden et al., 2007). Однако знания по кинетике разрешения структуры Холлидея (Hadden et al., 2007), механизма специфического связывания с широким кругом субстратов остаются на уровне предположений (Bennett, West, 1995; Duckett et al., 1995; Póhler et al.,

1996; White, Lilley, 1997b, 1998; Giraud-Panis, Lilley, 1998; Decíais, Lilley,

82

2000; Fogg et al., 2001). Наиболее перспективным направлением решения поставленных вопросов нам видится использование в экспериментах не природных, нативных четырёх-нитевых перекрестов, а модельных синтетических субстратов, молекулярное строение которых в высокой степени подобно структуре Холлидея. Изучение взаимодействия резолваз с промежуточными продуктами рекомбинации и применение полученных данных в методике детекции однонуклеотидного полиморфизма осложнено также и тем обстоятельством, что коммерчески доступен только один фермент этого класса - эндонуклеаза I бактериофага Т7, производимая фирмой New Englands Biolabs, Inc. (США). В этой связи представляет интерес клонирование гена данной эндонуклеазы, а также создание на его основе штамма-суперпродуцента, обеспечивающего наработку функционально активного белка.

В целях получения штамма-суперпродуцента Т7 эндонулеазы I ген t7el, кодирующий данную полипептидную последовательность, был клонирован в ряд плазмидных векторов. Первой была получена рекомбинантная молекула pKRXT7-El, созданная на основе клонирующего вектора pKRX. Данная плазмидная молекула была проверена на предмет вставки гена t7el при помощи рестрикционного анализа и специфической амплификацией с праймерами к данному гену. Все последующие рекомбинантные экспрессирующие плазмиды, упомянутые в работе, содержат копию гена t7el амплифицированную из pKRXT7-El. Так, для создания экспрессирующей плазмидной конструкции, содержащей ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, в работе на разных этапах были использованы такие векторные молекулы как рЕТ-3, рЕТ-15, рЕТ-22, рЕТ-26, рЕТ-44, pQE-30, PinPointXA-2. Наиболее удачными (с точки зрения сохранения направления рамки считывания гена t7el, наличия полной

83 последовательности целевого гена при условии отсутствия мутаций, изменяющих аминокислотную последовательность) оказались лишь некоторые клоны. Среди них можно выделить рЕТ-22ЬТ7(с17), pQE

30Т7(с122) и PinPointXA-2T7(cll4). В случае pQE-30T7(cl22) и PinPointXA

2Т7(с114) применялся рестриктазно-лигазный метод направленного клонирования. Анализ с помощью секвенирования вставки гена t7el и прилегающих районов в рекомбинантных конструкциях pQE-30T7(cl22) и

PinPointXA-2T7(cll4) показал полное сохранение всех структурных и регуляторных элементов экспрессии целевого белка. Однако дальнейшее использование pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4) показало крайне слабую наработку целевого белка и даже отсутствие таковой в бактериальной культуре. Поскольку при анализе белкового продукта индуцированных бактериальных культур, содержащих конструкции pET-3aT7, pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4), не обнаружено полипептидной цепи с молекулярной массой и ферментативной активностью соответствующей Т7Е1, было осуществлено клонирование целевого фрагмента в вектор рЕТ-22. Анализ с помощью секвенирования последовательности вставки гена t7el и прилегающих районов рЕТ-22ЬТ7(с17) не выявил критических изменений, способных влиять на экспрессию целевого белка. В отличие от рекомбинантных молекул pET-3aT7, pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cll4), в образцах рЕТ-22ЬТ7(с17), подвергавшихся индукции, уверенно обнаруживался дополнительный полипептидный продукт. Выделенный и очищенный экстракт Т7Е1 показал специфическую по отношению к модельному ДНК-перекресту активность, сопоставимую с активностью коммерчески доступного аналогичного фермента (New England Biolabs,

США). Последнее утверждение было подтверждено в ходе анализа динамики уровней флуоресценции в ходе совместной инкубации Т7Е1 и ДНК

84 перекреста, а также по результатам последующего сравнительного гель-электрофореза продуктов ферментативной активности коммерческого фермента и синтезированного препарата Т7Е1.

Показано (в том числе и в режиме реального времени), что рекомбинантная эндонуклеаза Т7Е1 способна разрешать четырех-нитевые перекресты или структуры Холлидея, а также различать спаренные и неспаренные азотистые основания. Данное обстоятельство позволяет рекомендовать полученный фермент в качестве детектирующего агента однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Машков, Олег Игоревич, Уфа

1. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Чемерис А.В. Сайт-направленный мутагенез углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений с использованием инвертированной ПЦР // Молекулярная биология. 2007а. Т. 41. №5. С. 940-942.

2. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Куликова О.Л., Чемерис А.В. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым // Микробиология. 2007b. Т. 76. №1. С. 129-131.

3. Кантор Ч.Р., Шиммел П.Р. Биофизическая химия: в 3-х т. М.: Мир. 1984. Т. 1.336 с.

4. Ariyoshi М., Vassylyev D.G., Iwasaki Н., Nakamura Н., Shinagawa Н.,

5. Morikawa К. Atomic structure of the RuvC resolvase: a Holliday junction-specifc endonuclease from E.coli II Cell. 1994. V. 78. P. 1063-1072.

6. Ban C., Yang W. Structural basis for MutH activation in E.coli mismatch repair and relationship of MutH to restriction endonucleases // EMBO J. V. 17. P. 1526-1534.

7. Bennett R.J., West S.C. Structural analysis of the RuvC-Holliday junction complex reveals an unfolded junction // J. Mol. Biol. 1995. V. 252. P. 213— 226.

8. Biertumpfel C., Yang W., Suck D. Crystal structure of T4 endonuclease VII resolving a Holliday junction //Nature. 2007. V. 449(4). P. 616-621.

9. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucl. Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513-1523.

10. Bolt E.L., Sharpies G.J., Lloyd R.G. Identification of three aspartic acid residues essential for catalysis by the RusA Holliday junction resolvase // J. Mol. Biol. 1999. V. 286. P. 403-415.

11. Bond C.S., Kvaratskhelia M., Richard D., White M.F., Hunter W.N. Structure of Hjc a Holliday junction resolvase from Sulfolobus solfataricus II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 5509-5514.

12. Bowater R.P., Wells R.D. The intrinsically unstable life of DNA triplet repeats associated with human hereditary disorders // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. V. 66. P. 159-202.

13. Carlstrom G., Chazin W.J. Sequence dependence and direct measurement of crossover isomer distribution in model Holliday junctions using NMR spectroscopy // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 3534-3544.

14. Center M.S., Richardson C.C. An endonuclease induced after infection of Escherichia coli with bacteriophage T7. I. Purification properties of the enzyme // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. P. 6285-6291.

15. Ceschini S., Keeley A., McAlister M.S.B., Oram M., Phelan J., Pearl L.H., Tsaneva I.R., Barrett T.E. Crystal structure of the fission yeast mitochondrial Holliday junction resolvase Ydc2 // EMBO J. 2001. V. 20. 6601-6611.

16. Chan S.N., Vincent S.D., Lloyd R.G. Recognition and manipulation of branched DNA by the RusA Holliday junction resolvase of Escherichia coli II Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1560-1566.

17. Chao Y.P., Law W., Chen P.T. et al. High production of heterologous proteins in Escherichia coli using the thermo-regulated T7 expression system // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 446-453.

18. Cheatham T.E., Kollman P.A. Molecular dynamics simulation of nucleic acids//Annu. Rev. Phys. Chem. 2000. V. 51. P. 435-471.

19. Churchill M.E., Tullius T.D., Hallenbach N.R., Seeman N.C. A Holliday recombination intermediate is twofold symmetric // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1988. V. 85. P. 4653-4656.

20. Clegg R.M., Murchie A.I.H., Diekmann S., von Kitzing E., Kemper B., Lilley D.M.J. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis // Biophys. J. 1994. V. 66. P. 99-109.

21. Clegg R.M., Murchie A.I.H., Zechel A., Carlberg C., Diekmann S., Lilley,D.M.J. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 4846D4856.

22. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia colt purification and induced conversion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1969. V. 62. P. 1159-1166.

23. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria Genetic transformation of E.coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1972. V. 69. P. 2110-2114.

24. Connolly B., Parsons C.A., Benson F.E., Dunderdale H.J., Sharpies G.J., Lloyd R.G., West S.C. Resolution of Holliday junctions in vitro requires the Escherichia coli ruvC gene product // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 6063-6067.

25. Constantinou A., Davies A.A., West S.C. Branch migration and Holliday junction resolution catalyzed by activities from mammalian cells // Cell.2001. V. 104. P. 259-268.

26. Cooper J.P., Hagerman P.J. Gel electrophoretic analysis of the geometry of a DNA four-way junction//J. Mol. Biol. 1987. V. 198. P. 711D719.

27. Cooper J.P., Hagerman P.J. Geometry of a branched DNA structure in solution // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 7336-7340.

28. Cox M.M. Recombinational DNA repair of damaged replication forks in Escherichia coli: questions // Annu. Rev. Genet. 2001. V. 35. P. 53-82.

29. Cox M.M., Goodman M.F., Kreuzer K.N., Sherratt D.J., Sandler S.J., Marians K.J. The importance of repairing stalled replication forks // Nature. 2000. V. 404. P. 37-41.

30. Day R., Bennion B.J., Ham S., Daggett V. Increasing temperature accelerates protein unfolding without changing the pathway of unfolding // J. Mol. Biol.2002. V. 322. P. 189-203.

31. Declais A.-C., Lilley D.M.J. Extensive central disruption of a four-way junction on binding CCE1 resolving enzyme // J. Mol. Biol. 2000. V. 296. P. 421-433.

32. Declais A.-C., Lilley D.M. New insight into the recognition of branched DNA structure by junction-resolving enzymes // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. P. 86-95.

33. Declais A.-C., Fogg J.M., Freman A.D.J., Coste F., Hadden J.M., Philips S.E.V., Lilley D.M.J. The complex between a four-way junction DNA and T7 endonuclease I // EMBO J. 2003. V. 22. P. 1398-1409.

34. Dickman M.J., Ingleston S.M., Sedelnikova S.E., Rafferty J.B., Lloyd R.G., Grasby J.A., Hornby D.P. The RuvABC resolvasome // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 5492-5501.

35. Duckett D.R., Murchie A.I.H., Diekmann S., von Kitzing E., Kemper B., Lilley D.M.J. The structure of the Holliday junction and its resolution // Cell. 1988. V. 55. P. 79-89.

36. Duckett D.R., Panis M.E.G., Lilley D.M.J. Binding of the junction-resolving enzyme bacteriophage T7 endonuclease I to DNA: separation of binding and catalysis by mutation // J. Mol. Biol. 1995. V. 246. P. 95-107.

37. Eichman B.F., Ortiz-Lombardia M., Aymami J., Coll M., Ho P.S. The inherent properties of DNA four-way junctions: comparing the crystal structures of Holliday junctions // J. Mol. Biol. 2002. V. 320. P. 1037-1051.

38. Eichman B.F., Vargason J.M., Mooers B.H.M., Ho P.S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 3971-3976.

39. Elborough K.M., West S.C. Resolution of synthetic Holliday junctions in DNA by an endonuclease from calf thymus // EMBO J. 1990 V. 9. P. 29312936.

40. Flores-Rozas H., Kolodner R.D. Links between replication recombination and genome instability in eukaryotes // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 292. P. 196-200.

41. Fogg J.M., Kvaratskhelia M., White M.F., Lilley D.M.J. Distortion of DNA junctions imposed by the binding of resolving enzymes: a fluorescence study // J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P. 751-764.

42. Garcia A.D., Aravind L., Koonin E., Moss B. (2000). Bacterial-type DNA Holliday junction resolvases in eukaryotic viruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 8926-8931.

43. Giraud-Panis M.-J.E., Lilley D.M.J. T4 endonuclease VII: importance of a histidine-aspartate cluster within the zinc-binding domain // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33148-33155.

44. Giraud-Panis M.-J.E., Lilley D.M.J. Structural recognition distortion by the DNA junction-resolving enzyme RusA // J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 117133.

45. Grady W.M. Genomic instability and colon cancer // Cancer Metastasis Rev. 2004. V. 23(1-2). P. 11-27.

46. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. V. 85. P.609-613.

47. Hadden J.M., Convery M.A., Declais A.-C., Lilley D.M.J., Phillips S.E.V. Crystal structure of the Holliday junction-resolving enzyme T7 endonuclease I at 2.1 A resolution//Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 62-67.

48. Hadden J.M., Declais A.C., Carr S.B., Lilley D.M.J., Phillips S.E.V. The structural basis of Holliday junction resolution by T7 endonuclease I // Nature. 2007. V. 449(4). P. 621-625.

49. Hadden J.M., Declais A.C., Phillips S.E.V., Lilley D.M.J. Metal ions bound at the active site of the junction-resolving enzyme T7 endonuclease I // EMBO J. 2002. V. 21(13) P. 3505-3515.

50. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. V. 166(4). P. 557-580.

51. Hannig G., Makrides S.C. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli // Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 54-60.

52. Hays F.A., Vargason J.M., Ho P.S. Effect of sequence on the conformation of DNA Holliday junctions // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 9586-9597.

53. Hays F.A., Watson J., Ho P.S. Caution! DNA crossing: crystal structures of Holliday junctions // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 49663-49666.

54. Hickman A.B., Li Y., Mathew S.V., May E.W., Craig N.L., Dyda F. Unexpected structural diversity in DNA recombination: the restriction endonuclease connection //Mol. Cell. V. 5. P. 1025-1034.

55. Ho P.S., Eichman B.F. The crystal structures of DNA Holliday junctions // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 302-308.

56. Holliday R. A mechanism for gene conversion in fungi // Genet. Res. 1964. V. 5. P. 282-304.

57. Holliday R. Molecular aspects of genetic exchange and gene conversion // Genetics. 1974. V. 78. P. 273-287.

58. Hsieh P., Panyutin I.G. DNA branch migration. In Eckstein F., Lilley D.M.J // Nucleic Acids and Molecular Biology. 1995. V. 9. P. 42-65.

59. Huang J., Villemain J., Padilla R., Sousa R. Mechanisms by which T7 lysozyme specifically regulates T7 RNA polymerase during different phases of transcription // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P. 457-475.

60. Hyde H., Davies A.A., Benson F.E., West S.C. Resolution of recombination intermediates by a mammalian activity functionally analogous to Escherichia coli RuvC resolvase // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 5202-5209.

61. Inouye M., Arnheim N., Sternglanz R. Bacteriophage T7 lysozyme is an N-acetylmuramyl-L-alanine amidase // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 7247-7252.

62. Iwasaki H., Takahagi M., Shiba T., Nakata A., Shinagawa H. Escherichia coli RuvC protein is an endonuclease that resolves the Holliday structure // EMBO J. 1991. V. 10. P. 4381^389.

63. Jana S., Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteinsin Escherichia coli II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67. P. 289-298.94

64. Joo C., McKinney S.A., Lilley D.M.J., Ha T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy // J. Mol. Biol. 2004. V. 341. P. 739-751.

65. Kelly S.J., Li J., Setlow P., Jedrzejas M.J. Structure flexibility and mechanism of the Bacillus stearothermophilus RecU Holliday junction resolvase // Proteins. 2007. V. 68. P. 961-971.

66. Kemper B., Garabett M. Studies on T4 head maturation. Purification and characterisation of gene-49-controlled endonuclease // Eur. J. Biochem. 1981. V. 115. P. 123-131.

67. Kerr C., Sadowski P. D. The involvement of genes 3 4 5 and 6 in genetic recombination in bacteriophage T7 // Virology. 1975. V. 65. P. 281-285.

68. Kreuzer K.N. Interplay between DNA replication and recombination in prokaryotes // Annu. Rev. Microbiol. 2004. V. 59. P. 43-67.

69. Kovall R.A., Matthews B.W. Structural functional and evolutionary relationships between }i-exonuclease and the type II restriction endonucleases //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95(14). P. 7893-7897.

70. Kvaratskhelia M., White M.F. Two Holliday junction resolving enzymes in Sulfolobus solfataricus //J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 923-932.

71. Kwan K.Y., Moens P.B., Wang J.C. Infertility and aneuploidy in mice lacking a type IA DNA topoisomerase III beta // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100(5). P. 2526-2531.

72. Lilley D.M.J. Structures of helical junctions in nucleic acids // Quart. Rev. Biophys. 2000. V. 33. P.109-159.

73. Lilley D.M.J., White M.F. Resolving the relationships of resolving enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 9351-9353.

74. Lilley D.M.J., White M.F. The junction-resolving enzymes // Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2001. V. 2. P. 433-443.

75. Lishanski A. Screening for single-nucleotide polymorphisms using branch migration inhibition in PCR-amplified DNA // Clin. Chem. 2000. V. 46(9). P. 1464-1470.

76. Lishanski A., Kurn N., Ullman E.F. Branch migration inhibition in PCR-amplified DNA: homogeneous mutation detection // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28(9). P. 42.

77. Liu J., Declais A.-C., Lilley D.M.J. Electrostatic interactions and the folding of the four-way DNA junction: analysis by selective methyl phosphonate substitution // J. Mol. Biol. 2004. V. 343. P. 851-864.

78. Liu J., Declais A.-C., Lilley D.M.J. Mechanistic aspects of the DNA junction-resolving enzyme T7 endonuclease I // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 393— 442.

79. Liu J., Declais A.-C., McKinney S.A., Ha T., Norman D.G., Lilley D.M.J. Stereospecific effects determine the structure of a four-way DNA junction // Chem. Biol. 2005. V. 12. P. 217-228.

80. Lombard D.B., Chua K.F., Mostoslavsky R., Franco S., Gostissa M., Alt F.W. DNA repair genome stability and aging // Cell. 2005. V. 120(4). P. 497-512.

81. MacDonald M., Hassold T., Harvey J., Wang L.H., Morton N.E., Jacobs P. The origin of 47 XXY and 47 XXX aneuploidy: heterogeneous mechanisms and role of aberrant recombination // Hum. Mol. Genet. 1994. V. 3(8). P. 1365-1371.

82. MacMaster R., Sedelnikova S., Baker P.J., Bolt E.L., Lloyd R.G., Rafferty J.B. RusA Holliday junction resolvase: DNA complex structure — insights into selectivity and specificity // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 55775584.

83. Makarova K.S., Aravind L., Koonin E.V. Holliday junction resolvases and related nucleases: identifcation of new families phyletic distribution and evolutionary trajectories //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3417-3432.

84. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 512-538.

85. Mao C., Sun W., Seeman N.C. Designed two-dimensional DNA Holliday junction arrays visualized by atomic force microscopy // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 5437D5443.

86. Mashal R.D., Koontz J., Sklar J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 177-183.

87. McKee B.D. Homologous pairing and chromosome dynamics in meiosis mitosis // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1677(1-3). P. 165-180.

88. McKim K.S., Jang J.K., Manheim E.A. Meiotic recombination and chromosome segregation in Drosophila females // Annu. Rev. Genet. 2002. V. 36. P. 205-232.

89. McKinney S.A., Declais A.-C., Lilley D.M.J., Ha T. Structural dynamics of individual Holliday junctions //Nat. Struct. Biol. 2003. V. 10. P. 93-97.

90. Middleton C.L., Parker J.L., Richard D.J., White M.F., Bond C.S. Substrate recognition and catalysis by the Holliday junction resolving enzyme Hje // Nucl. Acids. Res. 2004. V. 32. P. 5442-5451.

91. Mizuguchi H., Nakatsuji M., Fujiwara S., Takagi M., Imanaka T. Characterization and application to hot start PCR of neutralizing monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase // J. Biochem. 1999. V.126. P.762-768.

92. Moffatt B.A., Studier F.W. T7 lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase // Cell. 1987. V. 49. P. 221-227.

93. Morrison C., Vagnarelli P., Sonoda E., Takeda S., Earnshaw W.C. Sister chromatid cohesion genome stability in vertebrate cells // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31(1). P. 263-265.

94. Murchie A.I.H., Clegg R.M., von Kitzing E., Duckett D.R., Diekmann S., Lilley D.M.J. Fluorescence energy transfer shows that the fourway DNAjunction is a right-handed cross of antiparallel molecules // Nature. 1989. V. 341. P. 763-766.

95. Newman M., Lunnen K., Wilson G., Greci J., Schildkraut I., Phillips S.E.V. Crystal structure of restriction endonuclease Bgll bound to its interrupted DNA recognition sequence // EMBO J. 1998. V. 17. P. 5466-5476.

96. Ni Y, Chen R. Extracellular recombinant protein production from Escherichia coli // Biotechnol. Lett. 2009. V. 31. P. 1661-1670.

97. Nishino T., Komori K., Tsuchiya D., Ishino Y., Morikawa K. Crystal structure of the archaeal Holliday junction resolvase Hjc and implications for DNA recognition // Structure. 2001. V. 9. P. 197-204.

98. Oram M., Keeley A., Tsaneva I. Holliday junction resolvase in Schizosaccharomyces pombe has identical endonuclease activity to the CCE1 homologue YDC2 //Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 594-601.

99. Ortiz-Lombardía M., González A., Erijta R., Aymamí J., Azorin F., Coll M. Crystal structure of a DNA Holliday junction // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 913-917.

100. Overmars F.J.J., Altona C. NMR study of the exchange rate between two stacked conformers of a model Holliday junction // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 519-524.

101. Panyutin I.G., Hsieh P. The kinetics of spontaneous DNA branch migration // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 2021-2025.

102. Parkinson M.J., Lilley D.M.J. The junction-resolving enzyme T7 endonuclease I: quaternary structure and interaction with DNA // J. Mol. Biol. 1997. V. 270. P. 169-178.

103. Parkinson M.J., Pohler J.R.G., Lilley D.M.J. Catalytic and binding mutants of the junction-resolving enzyme endonuclease I of bacteriophage T7: role of acidic residues //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 682-689.

104. Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3705-3727.

105. Plank J.L., Hsieh T.S. A novel, topologically constrained DNA molecule containing a double Holliday junction: design, synthesis, and initial biochemical characterization // J. Biol. Chem. 2006. V. 281(25). P. 17510-17516.

106. Powling A., Knippers R. Recombination of bacteriophage T7 in vivo // Mol. Gen. Genet. 1976. V. 149. P. 63-71.

107. Pohler J.R.C Giraud-Panis M.-J.E. & Lilley D.M.J. T4 endonuclease VII selects and alters the structure of the four-way DNA junction; binding of a resolution-defective mutant enzyme // J. Mol. Biol. 1996. V. 260. P. 678-696.

108. Raaijmakers H., Toro I., Birkenbihl R., Kemper B., Suck D. Conformational flexibility in T4 endonuclease VII revealed by crystallography: implications for substrate binding and cleavage//J. Mol. Biol. 2001. V. 308. P. 311-323.

109. Raaijmakers H., Vix O., Toro I., Golz S., Kemper B., Suck D. X-ray structure of T4 endonuclease VII: a DNA junction resolvase with a novel fold unusual domain-swapped dimer architecture // EMBO J. 1999. V. 18. P. 1447-1458.

110. Rodier F., Kim S.H., Nijjar T., Yaswen P., Campisi J. Cancer and aging: the importance of telomeres in genome maintenance // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2005. V. 37(5). P. 977-990.

111. Sadowski P. D. Bacteriophage T7 endonuclease. I. Properties of the enzyme purified from T7 phage-infected Escherichia coli B // J. Biol. Chem. 1971. V. 246. P. 209-216.

112. Saito A., Iwasaki H., Ariyoshi M., Morikawa K., Shinagawa H. Identification of four acidic amino acids that constitute the catalytic centre of the RuvC Holliday junction resolvase // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7470-7474.

113. Sawers G., Jarsch M. Alternative regulation principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 46. P. 1-9.

114. Sha R., Liu F., Seeman N. C. Atomic force microscopic measurement of the interdomain angle in symmetric Holliday junctions // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 5950-5955.

115. Sherratt D.J., Soballe B., Barre F.X., Filipe S., Lau I., Massey T., Yates J. Recombination and chromosome segregation // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2004. V. 359(1441). P. 61-69.

116. Smith K.C. Recombinational DNA repair: the ignored repair systems // Bioessays. 2004. V. 26(12). P. 1322-1326.

117. Sorensen H.P., Mortensen K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli II Microb. Cell Fact. 2005. V. 4. P. 1.

118. Srinivasan A.R., Olson W.K. Computer models of DNA four-way junctions // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9329-9404.

119. Stuart D., Ellison K., Graham K., McFadden G. In vitro resolution of poxvirus replicative intermediates into linear minichromosomes with hairpin termini by a virally induced Holliday junction endonuclease // J. Virol. 1992. V. 66. P. 1551-1563.

120. Studier F.W. The genetics physiology of bacteriophage T7 // J. Virol. 1969. V. 39. P. 562-574.

121. Studier F.W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system // J. Mol. Biol. 1991. V. 219. P. 37-44.

122. Subramaniam S., Tewari A.K., Nunes-Duby S.E., Foster M.P. Dynamics and DNA substrate recognition by the catalytic domain of lambda integrase // J. Mol. Biol. 2003. V. 329(3). P. 423-439.

123. Symington L., Kolodner R. Partial purification of an endonuclease from Saccharomyces cerevisiae that cleaves Holliday junctions 11 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1985. V. 82. P. 7247-7251.

124. Tajkhorshid E., Aksimentiev A., Balabin I., Gao M., Isralewitz B., Phillips J.C., Zhu F., Schulten K. Large scale simulation of protein mechanics and function // Adv. Protein Chem. 2003. V. 66. P. 195-247.

125. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. P. 523-533.

126. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 211-222.

127. Thorpe J.H., Gale B.C., Teixeira S.C., Cardin C.J. Conformational and hydration effects of site-selective sodium calcium and strontium ion binding to the DNA Holliday junction structure d(TCGGTACCGA)4 // J. Mol. Biol. 2003. V. 327. P. 97-109.

128. Thorpe J.H., Teixeira S.C., Gale B.C., Cardin,C.J. Structural characterization of a new crystal form of the four-way Holliday junction formed by the DNA sequence d(CCGGTACCGG)2: sequence versus lattice? // Acta Crystallogr. D. 2002. V. 58. P. 567-569.

129. Tsujimoto Y., Ogawa H. Intermediates in genetic recombination of bacteriophage T7 DNA. Biological activity and the roles of gene 3 gene 5 // J. Mol. Biol. 1978. V. 125. P. 255-273.

130. Voth A.R., Hays F.A., Ho P.S. Directing macromolecular conformation through halogen bonds // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 61886193.

131. Wardleworth B.N., Kvaratskhelia M., White M.F. Sitedirected mutagenesis of the yeast resolving enzyme Ccel reveals catalytic residues and relationship with the intron-splicing factor Mrsl // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 2372523728.

132. Watson J., Hays F.A., Ho P.S. Definitions and analysis of DNA Holliday junction geometry // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 3017-3027.

133. West S.C., Korner A. Cleavage of cruciform DNA structures by an activity from Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 6445-6449.

134. Whitby M.C., Dixon J. A new Holliday junction resolving enzyme from Schizosaccharomyces pombe that is homologous to CCE1 from Saccharomyces cerevisiae II J. Mol. Biol. 1997. V. 272. P. 509-522.

135. White M.F., Lilley D.M.J. Characterization of a Holliday junction resolving enzyme from Schizosaccharomyces pombe II Mol. Cell. Biol. 1997a. V. 17. P. 6465-6471.

136. White M.F., Lilley D.M.J. Interaction of the resolving enzyme YDC2 with the four-way DNA junction // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5609-5616.

137. White M.F., Lilley D.M.J. The resolving enzyme CCE1 of yeast opens the structure of the four-way DNA junction // J. Mol. Biol. 1997b. V. 266. P. 122-134.

138. White M.F., Lilley D.M.J. The structure-selectivity and sequence-preference of the junction-resolving enzyme CCE1 of Saccharomyces cerevisiae // J. Mol. Biol. 1996. V. 257. P. 330-341.

139. White M.F., Giraud-Panis M.-J.E., Pohler J.R.G., Lilley D.M.J. Recognition and manipulation of branched DNA structure by junction-resolving enzymes // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 647-664.

140. Yang Q., Lishanski A., Yang W., Hatcher S., Seet H., Gregg J.P. Allele-specific Holliday junction formation: a new mechanism of allelic discrimination for SNP scoring // Genome Res. 2003. V. 13(7). P. 1754-1764.

141. Zerbs S., Frank A.M., Collart F.R. Bacterial systems for production of heterologous proteins // Methods Enzymol. 2009. V. 463. P. 149-168.

142. Zhang, X., Studier, F.W. Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNA polymerase by T7 lysozyme // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 10-27.