Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование диагностической ДНК-зонда из генома гриба Fusarium oxysporum

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование диагностической ДНК-зонда из генома гриба Fusarium oxysporum"

РГ6 о

2 3 MAP 1994

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

ИРИСБАЕВ Бобир Кабулович

УДК 577.21

КЛОНИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ДНК-ЗОНДА ИЗ ГЕНОМА ГРИБА FUSARIUM OXYSPORUM

Специальность: 03.00.26 — молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ - 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии растений Инженерного Центра «Биоинженерия» РАН (г. Москва) и в лаборатории генной инженерии Института Генетики АН Республики Узбекистан.

Н а у ч н ы е руководители:

доктор биологических наук, профессор А. А. АБДУКАРИМ013 кандидат химических наук Р. С. МУХЛМЕДОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент АН РУз

А. П. ИБРАГИМОВ кандидат биологических наук, с. н. с. Ш. С. БУРИХАНОВ

Ведущая организация: Институт Биохимии АН РУз.

Защита диссертации состоится1994 г. в « часов на заседании специализированного совета Д. 015.70. 21 по присуждению ученых степеней при Институте Генетики АН РУз (700000, Ташкент, Главпочтамт, аб/я. 97).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Генетики АН РУз.

Автореферат разослан »СM.¿pCUfJ? 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Ш. С. ЮНУСХАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалъноить_проОлеш. Одной из современных проблем заг^гга растений, и в частности хлопчатника, от патогенных грибов является проблема борьбы с пилтом. Внлт, или трахеомикозное увядакпе, наносит огромный увдеDO урожаи хлопчатника. Вилт растений вызиаак/г грибы, отностше к родам Verticillium и Fusarium,- Сшяггош вилта, вызываемого Verticillijun а Fusarium, чрезвычайно схожи, причем, оба гриба могут одновременно зараиать одну культуру, и даже одновременно один и тот же экземпляр растения.

В последнее время значительное развитие получил метод диагностики на основе специфических участков' ДНК. Метод ДНК-дкагностики позволяет увеличить чувствительность и надежность идентификации фитопатох'енов. В Связи с эти» разработка теорети-- • ческих и рисперимеатальных основ ДНК-диагностики заражеш^стя фн-топатогениыми грибами почв или' растеши*, является весьма актуальной, так как данный метод позволяет однозначно определить фитопа-тогенн из растеши) и почки в реакции гибридизации нуклеиновых. кислот по крайней пере род гриба по принципу "да-нет".

■ Данная работа является часть» проекта " Разработка метода диагностики зараженности почин и посевного материала грибами-фитопзразитами, использующего. ДНК/РНК - зонды". Названный проект осуществлялся п Центре "Бноиняенерия" РАН, в Институте оиооргаш!-ческой химии АН РУз и в Институте Генетики АН РУз, а в IS90-1992 гг. - финансировался ГНТП по ррограше "Новейшие методы бионике- . нерни".

Поль и задачи исследова ни я* Целью настоящей работы являло ь.. создание диагностического ДНК-зонда на основе межгенного спейсера геномной ДНК Fusarium oxysporum для экспресс-диагностики гриба-фитопатогена F.oxysporum па растениях и в почве. В связи с этим в задачи настоящей работы входило:

1. Клонирование риоосошшх генов гриба Fusarium oxysporum с использованием в качестве зонда рДНК дроикей.

2. Локализация секиенироиянием и субкдощфованиен спейсьрннх областей геномной ДНК гриба Fusarium oxysporum.

3. Выявление фрагментов геномной ДНК гриба Fusarium oxyspo- • rum в растеши! хлопчатника па основе созданных меченных зондов.

4. Выявление чувствительности полимеразной цепной реакции -при амплификации внутреннего транскрибируемого спейсера риОоссм-:юго оперона гриба Fusarium oxysporum.

5. .Идентификация нуклео'твднцх 'последовательностей между ге-наш! 1вБ и 5,85 р РШС рибосоикого оцерона• гриба Р.охузрогит для получения зондов.

Научная новизна. Впервые на основе рестрикционного анализа геномной' ДНК грибов Усг^ИсППит баЬИае и РизагШт охузрогит иденткфицироваш растрнкционные фрашенти, принадлекащне генаи рибосомных РНК.

С помощью полииаразной цепной реакции ввделен фрагмент генома гриба аг1ил охуврогшп, происходящий из внутреннего транскрибируемого спейсера (ВТС-1) генов рибосоыаой РНК.

Спейсерный участок нейду генами 18Б и 5,8Б рРНК гриба Риза-Г1ит охуврогш проклонирован в бактериофаг М13 1фЮ и определена его первичная структура состоящая из 219 пар оснований.

Показано, что клонированный фрагмент ВТС-1 участка рибоссыно--го оперона комно использовать в качестве зонда для обнаружения специфических фрагментов гриба РизаПшп охузрогит, в препарате ДИК из зараженных растений.

Сравнение первичной структуры ВТС-1 участка рибосомного спи-рона грибов УегПсНПгш) йгЛИае и Ризаг1ш охуерогш показало, ■что последовательности ыекгенного спейсера ВТС-1 участка отличается как по нуклеотпдному•составу, -так и по степени гомолошн.

■ . Синтезирован специфический олнгонуклеотид ВТС-1 участка рн-босомного опорона для грибов рода РиваПш.,. Метод полшеразпоД цепной реакции также показал" высокую чувствительность при.виделе-. ши ДНК из инфицировании?. листьев и почвы ' даже и следовых количествах (1нг ДНК), необходимых для проведения реакции.

Практическая ценность, Полученный на основе спейсерных последовательностей ДНК-зонд можно успешно использовать для идентификации гриба Р.охуерогит в условиях лабораторииИспользованный подход к решению проблема ' диагностики иошю распостршрлть на другие фитопатогены и вирусы,

Все положения, изложенные" в подразделах" "Научная новизна и "Практическая ценность'!, выносятся на официальную защиту. •

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на V- иезду-народноы симпозиуме по ве'ртициллиуиу (Ленинград 1950г;; на второй Всвсо)>знои совещании "Генетика развития" (Ташкент 1990г. );на 3-ем Мёаалпироднои симпозиума по молекулярной биологии растений (США, 1951}г на первой сьезде физиологов растений Узбекистана (Тшкент 1931.). Диссертация обсуздена и одобрена на расширенном научном

сешшарэ Института Генетики АН Респуолтш Узбекистан (проток.'I ' 6 от 20 октября 1593г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Обьем и структура диссертации. Диссертация . изложена на 90 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследовании, результатов исследования, их обсуждения и выводов.

Работа иллюстрирована 17 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы включает 134 наименования отечественных и зарубежных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования выбран вирулентный штамм Fusarium оху-sporum 235, полученный из отдела вйлта Узбекского НИИ защиты растений УзСХА. Рекомбинантная плазмида PSC4, содержащая центральную часть рибосомного оперона пекарских дрожжей Saccharomyces се-revisiae предоставлена к.б.н. Краевым A.C. (Центр "Биоиюкенерия" РАН, г.Москва).

Выделение. препаратов ..геномной_ДНК_гриба F.oxyspomm про-

водиаи по методу ïelton M.M. et al., 1984.

Полимер_азную_ цепную____Р_еа1шшс1______(ВДР}. проводили согласно

рекомендациям научно-производственного центра "Биопол" г.Москва. Сшг/етк'к'ские дезоксинуклеотиды для ПЦР синтезированы на приборе £yn*>e*.?.t D. чмрш Biötrcnik (США") и послу снятия заытшх групп ис-пол*. vo&aHH для полимераэной цепной реакции.

ч.1'1робиологические процедуры проводили согласно методике К; п-ев?< A.C. (1988). В работе использовали штамм XL-1 E.coli. Вы* >.-щиршаю бактериальных культур проводил! при температуре 37'-'С в среде YT (8г/л бактотриптонаДОг/л дрожжевого экстракта, 5г/л IJaCi) с добавлением тетрациклина- 12,5 мкг/мл

Молекулярное_зонирование проводили по методике Краева A.C. (199Я), подбирая различные соотношения вектор/фрашент, как правило, о увеличением концентрации последнего. В качестве вектора ш.подь'.ч>в->ли ДНК фага MI3 (фирмы "Amershara" pic.), расщепленного no Siг:г, I сайту.

Т^ансф.'рмуцкю бактериальных клеток проводил! по ранее описание- , 1983) методу.

,ннч, продуктов ЩР - но методу Краева A.C. (1998)

Секвешфование клонов для определения вставок в MI3 проводили по модифицированной методике '(Sanger et ai.,J977). Основные изменения реакции секвенировашш состояли в применении для выраедша-ния реконоинантных фагов полипропиленовых пробирок разового использования, проведении полимеразной реакции в микрокамерах для титрования, а также в использовании "квазиконцевой"_ метки с. помощью изотопа ÜNIP в полииеразной реакции. Получешше последовательности были обработали с помощью пакета программ StadenPlus ("Amersham")

Радпоактивше пробы для гибридизации получали методом случайных гексамероа (Feiberg and Pogelstein, 1983).

Фрагмент ПНР элшровали с 2%-ного геля по методу Кроева A.C. (1988) .

Подготовку фильтра и гибридизации проводили на нитроцедяплоз-ных фильтрах фирмы "Schleiher und Schuell" (ФРГ)' диаметром пор

0.20 «км и 0,45 ыкм. Фильтр экспонировал^ ночь, использовав для этого рентгеновскую пленку Ш-В Шосткинского химкомбината и экран ЭУ-В2.

Инокуляцию хлопчатника грибом Р.охувротп в условиях фитотрона проводили следующим образом:

1. Семена хлопчатника G.barbadenge сорта 6037 после стерилизации и предварительного прора^шания ь сосудах (12х12сИ с грунтом . (песок:торфяная смесь 1:1), помещали в фитотрон. Растения поливали через каждые 40 часов с ежедневной подкормкой 0,2%-шн растворо» питательной среди, содержащей 10:8:6 (Н:Р:Н).

2. Температура в фитотроне в течет:! веехч> периода культнии-ровакип растиний составляла '25-30'JC, с относительной влажность» воздуха не менее 70% и соотвитстёугадш фотопориодом 16:0 (день: ночь).

3. Па стадии образования двух настоящих листьев в подсеия-дольное колено вносили суспензии гриба F.oxysporum шташ 235.

^lii'Syi^.ffi^-ÜS-yöiiiÜL^MäMyi-iyilb^y проводили согласно Scott O.e.t al. (ISS8)

РЕЗУЛЬТАТЫ и обсувдшш.

1. Стратегия получения ДНК-зонда.

Метод хморидизации нуклеином«; кислот позволяет идентифицировать лиООН организм по гиир1;днзации препарата его ДНК с иечешдш специфический}! последовательное;! или нуклеотидов (зондами). В цвстоад-jß работе била применена обузл стодол огня, разработанная

на основе выявления Фрагментов повторящихся последовательностей ДНК различных организмов, -и в частности, рДНК гриба F.oxysporan.

Рибосомше гены могут быть как в составе генома, так и в виде > 'экстрахромосомных копий. Транскрипционные единицы, расположенные в геноме в виде блока из многих повторов, обычно соединена по схеме "голова-хвост". В настоящее время приняты следующие обозка-чения различных областей повторяющейся единицы' рибосомных генов. Область ДНК, не подвергающаяся транскрипции и разделяющая транскрипционные единицы, ооозиачается как Н'ГС (нетранскрибируемый спейсер), а в состав транскрибирующей области, кроме генов 18S 5,8S л 28S рРНК, входят фрагменты ТС, обозначаемые как ВнТС •.(Внешний транскрибируемый спейсер)'и соответственно В'ГС (Внутренний транскрибируемый спейсер). •

Первичная структура генов рРНК консервативна для большинства микроорганизмов, что создает возможность для относите ль», j простого клонирования этих генов из произвольно взятого организма.Вместе с тем, структура спейсеров специфична по крайней мере для данного рода. Использование клонированных последовательностей в качестве зондов в сочетании с полимеразной ценной реакцией для амплификации количества ДНК-мкаени в образце семян или почвы ' и • составило основу выбранного подхода, использованного в данной работе. ,

2. Стратегия получения ДНК-зондов для гриба Fusarium oxysporum методом ПЦР.

Гены рибосомных РНК могут. слухздть универсальным источником родосг.ецифических зондов, поскольку внутри повторяющейся единицы рнбосомного оперона гриба F. охуврогап имеются области, изменявши-, "ся в ходе эволюцщ! с различной скорость». Клонирование ' рДНК и генома грибов легко осуществимо по той причине,, что эти последовательности можно выделить в сильно 'обогащенном виде путем гель-электрофореза. Однако, являясь по сути достаточно простым путем выделения родоспецифических зондов , он, в- то не время является и трудоемким,для осуществления которого необходимы определенные количества ДНК. В связи с тем, что поиторяывдаеся единицы рибосомнох'о оперона состоят из эволюционно . консервативных

структурных генов и вариабельных спейсеров, то такую структурную особенность рцбосонного оперона мо:мо использовать для выделена я родсспецифическпх фрагментов генома с позгяьв метода полииеразной цепной реакция (ПЦ?).

Метод полииеразной цепкой реакции позволяет амплифицировать фрагмента меаду двумя участками ДНК с иоисчыи пари кокваргентшх олигонуклеотидных прайыеров. Приложимость метода, таким образом, ограничена тем случаем, когда a priori имеется минимальная информация о последовательностях ДНК.флашшрумцлх исследушу;и область.

3. ПЦР-клоинрование BTC-I участка рибосомного оперона гриба Fusarim oxysporum

Для получения ДНК-зонда бил выбран фрагмент внутреннего транскрибируемого спайсера иеаду I8S и 5,8S рРНК гриба F.oxyspo-гш, состоящего примерно из 200 нуклеотидов. Амплификацию внутреннего транскрибируемого спеЯоера иотю осуществить используя "универсальные" праймеры комплементарные консервативный концевгм участкам генов 18S рРНК и 5.8S рРНК. В качестве такого праймера, комплементарного концу I8S рРНК, била выбрана последовательность 5' - ÏTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG, гомологичная всем I8S РНК, имевшимся в Европейском банке- пук-лэстиднах последовательностей микроорганизмов (EMBL, выпуск II).

В качестве ке второго праймера первоначально . был выбран олигснуклеотид 5- GAACCAAGAGATCCGTTGTÏCAAAG, комплементарный консервативной части гена 5,8S РНК у всех известных гриоов. Места посада! этих праймеров на последовательности соответствующих генов отстоят на 10-15 нуклеоткдов от их концов, что позволяет проверять продукты амплификацик рДНК гриба F.oxysporum.

Синтетические дезоксинуклаотиды синтезировали на приборе Synostat D фирмы Biotronik и после снятия защитных групп использовали для полииеразной реакции. В полимеразной цепной реакции варьировали условия отжига затравок, ^ такае количество полимера-зп для получения максимального выхода продукта, иитичмьяые условия амплификации зависели от источника и партии иолими а также от типа термоциклера, в котором проводилась реакция. Так, максимальный выход фрагмента получается при концентрации ДНК 100 mj /мл и при разбавлении полимеразы из ïhenaus aqualicui- в 4 paia (исходная активность 8 ед./мкл).

Результаты исследований по использованию этих праймероь для

амплификации клошфованной и геномной ДНК гриба V. dahlias, и геномной ДНК гриба F. oxysporum v. vasinfectum представлены на рис.1. Геномные ДНК гриоов рода Vertlclllium dahllae и Fusa-г1ш oxysporun дают амплифицированные фрагменты несколько разной длины. ПЦР- Фрагмент ДНК гриба F. oxysporum очищали электрофорезом в 2% -ноч агарозном геле, злектроэлшровали на ДЕАЕ-мембрану и использовали для кюнирования.

Трансформацию вектора созданного для работы с фагом MI3 и "усовершенствованный" по целому ряду признаков (Messing,1988), проводили используя штамм, бактерий XL-I E.coll blub" фирмы "Stratogene" (США). Указанный штамм содержит мутации в системе рекомбинации, дефектную эндонуклеазу',; "дефектную, систему рестрикции с сохранением метилазной функции и ' ряд мутаций ауксо-трофности. Нэмаловаинш преимуществом штамма является -наличие транспозона Тп 10 в эписоме, придающей бактерии E.coll тетрацик-линовую устойчивость.

м л а з

564 -п.о.

РИС;1,

Гель-электрофорез продуктов- амплификации- при полиме-разной цепной реакции ДНК грибок У.сЗаЬНае и Р. он у -врогиш. .

- I. Клонированная ДНК гриба V.Дат 1ае из пл'азкиды Р71Г-4. 2. Генрмная ДНК гриба Р-охузропки 3-4. Генбшше ДНК гриба У.йаЬИае-

М-маркер длины; ДНК фага '--с 1857,' обработанная Н1т1 ГЦ.

Известно, что небольпой Фрагмент ДНК (гю.',::лпнкер), встроенный в ''алнюконцевуу" часть гена f?- галактозидазы фага MI3, содержит используемые для клонирования едшшчше сайтн для нескольких рес-трпктаз. Эта вставка не ышяет на способность обргзукяцегося фрагмента р- галактозидазе! кошлемекткровать с мутанткой в- галак-тозидазой клетки. Однако ¡зстраиванпе в эту область дополнительного фрагмента нарушает коншшментацаю.На среде с 1РТС,содергащий (3- галактозидазу, такие фаги способны образовывать белые колонии.

Так, в результате трансформации в контрольной чашке обнаружены только бактерии содеркащие вектор MI3. В опытных же чашках соотношение белых и синих клонов соответствовало соотношению вектор: фрагмент в лигазных смесях. Из опытных чааок отбирались 20' белых клонов для выращивания культур в ÏT- среде. После выращивания клонов в течении 8 часов на вращающемся барабане качество препарата полученной ДНК оценивали в 1%-яои агарозном геле.

При первичном отборе рекомбинантов клонированных.в вектор MI3, обычно используют подвижность однонитевой ДНК при электрофорезе в агарозном геле . Этот тест, однако, дает незначительную информацию о качестве самого препарата ДНК. В связи с этим все фаговые ДНК были проанализированы параллельно методом Т-скрининга (скрининг клонов с помощью одной секвенирушщей реакции). Проведение секвенируицей реакции с помощью одной ddNTP создает возможность для предварительнол оценки матрицы MI3 на наличие вставки. Такую реакцию также удобно проводить, при подготовке клонированного зонда, нуклеотидная последовательность которого заведома известна. Картина полос Т-терминации позволяет, таким образом, идентифицировать конец клонированного фрагмента, прилегающего к участку гибридизации универсальной затравки (рис.2). Электрофорез проводили в 5% -ном секвенирущем геле длиной 18см. Анализ данных 'Г-скрининга позволил отобрать 4 клона, из 20 выбранных для секвени-рования, по четырем нуклеотидам, по методу терминаторов (Сзн-гер,1977). В результате проведенного нами секвенирования впервые была определена первичная структура внутреннего транскрибируемого спейсера генома гриба F.oxyspoiuin, состоящая из 219 пар оснований (рис. 3.).

Рис.2. Т- тренинг клонов по одной секьенируюцей реакции.

Стрелкой указан клон Г1 14, содержащий вставку ДНК гриба Р.охуврогит. Все остальные клош содержат последовательности вектора М13.

АГСТ

;: в"

Рис.3. Секвещрувдий гель продукта амплификации спейсера рДНК Е.охуврогиш,клонированного в МГЗгарЮ. Точками отмечены полосы терминации, соответствующие нуклеотидаой последовательности одного из праймеров, использованного для амплификации.

Л:22."13 полH£.\~i последовательностей показывает (Рнс.4), что на концах клонированного фрагмента имеется области, гомологичные концам генов 1&S FHK и 5.8S РНК. Эти области длиннее по колнчестзу пуклеотидов, чем использованные праймеры, и всегда пр-лсутствуш на концах амплифицированного фрагмента. Таким образом, использованные праймеры позволяет специфично а«плифицироват> последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК гриба F.oxysporum.

Анализ и сравнение с помощь» компьютерной программы "Siaden Plus" нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера (ВГС-1) гриба ?.oxysporum и гриба V.dahliae показывает, что они отличаются по нуклеотидноыу составу (Рис.5).

5,8S

5/ - GAACCAAG AGATCCGTTG T2GAAAGTTT GAACCAAGAG ATCCGTTGTT

CTTGGTTG TCTAGGCAAC ААСТТТСААА «»»»»»а» »»«»*«»_

GAAAGKTTA ATTTATTTGO TTGTTTACTC AGAAGAAAGA TTATAGAAAG AGAGTTAGGG GGT-CTCTGG CGGGGGGCCC TGTTACGGGG CCGTCTGTTC CCGCCG-AGG GCAACGTTTT AGGTATGTTC ACAGGGTTCA TGAGTTGTAT AACTCGGTAA TGATCCTTCC GCAGGTTCA- CTACC-GAA4

ATCCTTCCGC AGGTTCACCT ACGGAAACCT tGGAAGGCG TCCAAGTGGA TGCCTTT- 3/

■Рис.4. Нухлзотиднаэ последовательности гриба F. oxysporum мевду генами 18S и 5,8S рРКК.Звездочками обозначены участки наибольшей гомологии, встречающиеся у всех грибов (по данным EMBL-банка) Стрелкой обозначены участки, использованные для синтеза праймеров.

Причем у гриба F.oxysporum обнаруживается уникальный сайт рестрикции - Snta I (CCCGGG), которой делает его одним из дополнительных паркеров для проверки зонда.

Сравнение внутрехшего транскрнбируепого спейсера геног-лдлх ДНК грибов V.dahliae и Р.oxysporun ыезду I8S u 5,8S рРКК показывает характерное различие их последовательностей в этой области..

Для того, чтобы кетодок Slot-blot гибридизации показать специфичность метода, били синтезированы два новых прайиера с последовательностью 5^-ATTTATTTGCTTGITTACTC и 5/- AGTAATGGC TCAATATGTTGAGT. Синтезировашый праймер на основе полученных нами последовательностей не фланкирует консервативную часть генов 18S и 5,83 рРНК и амнли1*н£фует лишь внутреннш> область BTC-I участка ркбосоьшого оперона геномной ДНК гриба F.oxysporum. Такая специфическая амплификация для тотальной ДНК гриба F.oxysporui:., выделенного из инфицированных листьев хлопчатника сорта 6037 G.Lar-badense, представлен на рис,6.

Гибридизация ДНК-зовда с ПЦР фрагментом геномной ДНК гриба F. oxysporum, выделанной из инфицированных растений хлопчатника показала, что аншифицированный фрагмент является специфический, поскольку, гибридизуясь с геномной ДНК F. oxysporum, не связывается с геномной ДНК V. dahliae (ркс.7).

Б.^рРНК

FUS1 VER

FUS1 VER

PUS1 VER

FUS1 VER

FUS1 YER

GAACCAAGAG ATCCGTTGCT GAAAGTEtTA ATTTATTTGC TTGITTACTC GAACCAAGAG ATCCGTIGTT AAAAGTTTTA ATAGTTCGCT AAGAACACTC

fc********* я*«*«:***** *****С*** ** * * KitV

AGAAGAAACA TTATAGAAAC AGAGTTAGGG GGT-CTCIGG CGGGGGGC-C

AGAAGTATCG TTGGTATATA AACAGAC-AGA CTGATGGACG CAGAACGAGC ***** * * ** * * • *

TGTTACGGGG CCGTCTG1TC CCGCCG-AGG GCAACGTTTT AGGTATGTTC CGCCGAAGCA ACAATATGGT TCACAAAGGG * * * * * «* 18S pPHK

ACAGGGTTGA TGAGTTGTAT AACTCGGTAA TGATCCTTCC GCAGGTTGAC

CCTTCC GCAGGTTCAC ****** **********

CTACGGAAA

CTACGGAAA ********

Рис. 5.

Сравнение BTC грибов Fusarium oxysporum и Verticillium dahliae. Звездочками отмечены области топологии.

Далее эта npsiuepu были проЕереш ил спг;7н£1чпсс-п. олнготгу::-леотид'гих. прз&эрсз к различит вида;; грчбсп года Pussrlta л Vor-ticilli.vra,- таклх к эк P.solani, ? moniforso, ?. lucopersici, nolonsor.?., P. sibfcosra, Р. oxysponra 235, 7. osysporm

2.T£MU 25Э, ?. oXisporua ktsuh 380, V.dahli"- i: V.albo-atrra np" по^шсрггноЗ цеп;:о:1 реакции. Анализ про^тятсз скплЕЗзхсгтт шжазагает, что все види рода Fusariir.i содержат одинаковые полосы зз 2~-пс:л голь-олектрофорезе, а ДНК грибов V.dahlias ;i V.al-bo-atriin E8 епиш^ицируется, что связано с i:c специфичностью прзй-ыера для этих грибов (Рис.8).

Определение специфичности зонда путем дот-гибридизации с тотальной ДНК грибов F.oxysporum, V.dahlias выделенных из почвы, а такзе с геномной ДНК хлопчатника сорта С-6037 G.fcarbadense показывает, что ДНК-зонд, специфично гибридизуясь с тотальной ДНК

М 1 2 3

Рис.6. ПЦР фрагменты тотальной ДНК грибов F.oxysponmi и V.dahllae, выделенных из инфицированных листьев. I - ПЦР фрагмент F.oxysporum. 2-3-ПЦР фрагменты V.dahllae М- маркер Hind III

гриба Р.охуврогш, не связывается с геномной ДНК У.ЦайИае и хлопчатника.(Рис.9).

Таким образом, предложенный ка>.а; подход для выделения и идентификации фрагментов генома грибов, специфичшх для конкретного фитопатогена предпологает лишь использования не более одной пары универсальных праймеров. Другим немаловажным обстоятельством является и то , что предлагаемый нами подход значительно менее трудоемок, в отличие от методов, включающих поиск спейсерных областей в клонированных рДНК, и достаточно дешев для, например, массового скрининга коллекций природных изолятов в условиях лаборатории.

1 fi ' @

iffiS» «К

Рис.7. Slot-blot анализ ПЦР-фрапгеиюз ДКК rpzOa F.oxysporura (выделенной из листьев) с клопш К сэдергацим внутренний транскрибируемый cnef.cep ыеаду I8S и 5,8S рРНК. * I. Разведение ПЦР-фрагаектг гриба F.oxysporuin от 1мкг/мл до 0,001 кг/i-п.

2. Гибридизация ПЦР-фрггиентсз геномных ДНК грибов F.oxyspomn и V.datilJ.ae ' .

3. Гибридизация ПЦР-фрЕ.^.'.ентс Р. oxyspom-i с геномной ДНК F.oxysporuin, вц,ч?.".еннсЛ*из листьев..

3.

¡3 11

Рис.8. ПЦР-реакция на специфичность праймеров 'дач геномных ДНК рода Риза'Пит и Уег1;1с1111ит. 1; 11 - У.с1а1й1ае и У.а1Ьо-а1;гит, 2-9 - фрагменты ДНК гркбов Р.по1ап1, Р'поп11огте, Р. Гисорег-з1с2., Р. тэ -1ог^егл, Р. зИэЬозш, Р. охузрогит штамм 235, Р. оху-срогиш ета>1! 259, Р. схусропгп штата 380.

1 и

" л

3 сЯ

Рис.9. Дот-гибридизация ПЦР фрагмента с ДНК гриба из почвы.

1. Разведение ПЦР фрагмента гриба Р.охуяроп

2. Гибридизация ПЦР фрагмента Р.охувропип с У.ааЫ1ае

3. Гибридизация ПЦР фрагмента Р.охуарогигл с ДНК Р.охуБрога'п выделенных из поч!/1,'.

4. Гибридизация ПЦР фрагмента Р.охуерогип -хлопчатника сорта С-6037 0.; ;ьо

• (Разведение от I ихг/т ;.■•> 0. ...; ■:■/;<.'

1Г:1

грп'

геь

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные указывают на то, что при создании ДНК-дшагностикуыов вахно проведение ряда последовательных экспериментов, а именно выявление тех участков ДНК гриба F,oxysporum, специфичных только для данного фитопатогена. Такими 'специфическими участками являются гены рДНК. Проведенный анализ ПДРФ геномных ДНК грибов V.dahliae и F.oxysporurn позволил идентифицировать рес-трикт1ше фрагменты, принадлежащие генам рибосомных РНК. Дпя выделения спейсерных фрагментов между генами I8S и 5,8 S рРНК рибо-сомного оперона гриба F.oxysporum был использован метод полиме-разной цепной реакции (ПЦР>. Два олигонуклеотидных праймера ис-пользова1шых для ПЦР специфически амплифицировали BTC-I участок генома гриба F.oxysporum. Показано, что амллифицированные фрагменты геномных ДНК грибов V.dahliae и F.oxysporum характеризуются разной длиной при гель-электрофорезе. ПЦР-фрагмент гриба F.oxysporum был клонирован в вектор MI3 мр 10 расщепленного по Srna I-сайту. Такхе показано существенное преимущества ПЦР-клонирования по сравнению с классическим клонированием.

Секвенированием было установлено, что последовательность ВТС-I участка, состоящая из 219 пар оснований, отличается от аноло-гичного BTC-I участка V.dahliae. Сравга1тельный анализ BTC-I спей-серов V.dahliae и F.'oxysporujn показал их низкую гомологию как в последовательности нуклеотидов, так в их длине. При их сравнении был установлен уникальшЛ сайт рестрикции 'Snia-1 (CCCGGG) для BTC-I' участка риоосомного оперона гриба F.oxysporurn, позволяющий использовать его в качестве маркера для проверки зонда..

Slot-blot гибридизация фрагмента ПЦР показала специфичность его связывания только с препаратами тотальной ДНК F.oxysporurn, выделенными из инфицированных листьев, что является логическим подтверждением существования различий в первичной структуры BTC-I участка грибов V.dahliae и F.oxysporurn. Испытание этих праймеров для полимеразной реакции с тотальной ДНК других видов рода Fusa-rium показало, что такая специфичность характерна лишь для грибов рода Fusarium. Дополнительным подтверждением сказанному, могут служить проведение эксперименты по дот-гибридизации с ДНК грибов V.dahliae и F.oxysporurn, выделенных из почвы.

Таким образом, возможность использования в каче'стве диагнос-■ тического зонда ДНК спейсерных участков рибосс-шюго опероиа гриба F.oxysporurn получила полное экспериментальное подтверждение. Эти

уникальные свойства рибосомного оперона, состоящего из перенес »,■ щахся консервативных и вариабельных участков, делан/г его уд ионии источником для клонирования диагностических ДНК.

Все вышеизложенное открывает новые переспективи по создашш ДНК-даагностнкумов, идентнфицирумцих Фитоиатогены. Такие свойства, как высокая специфичность, чувствительность предлагаемого метода позволяет рекомендовать разработанный нами метод, на примере гриба F.oxysporum для . jccohux скршшнгов по определению фитопатогенов, как в почве так и в растениях.

ВЫВОДЫ

1. Рестрикциош&ш анализом геномной ДНК грибов Vertieillium и Fusarium идентифицированы рестрнктше Фрагменты, принадле.тащю генам рибосомшх РНК.

2. Синтезированы олигонуклеотидные праймеры дпл нолимеразнсЛ цепной реакции (IB1P), комплементарные концевым консервативней участкам структурных генов рибосомного оперона I8S и 5,ÖS рГПК грибов V.dahliae, и F.oxysporum.

3. Проведано клонирование ПЦР фрагмента гриба F.oxysporum внутреннего транскрибируемого спенсера (М'С I) мекду IöS и 5,öS рРНК и определена его нумеотвдная последовательность, состоящая из 219 ib-O. ' •

1. Показано, различно но размеру и по последовательности нук-леогндов Фрагмента ДНК ВТС- I мекду х'енами IB5 и 5,05 pPIiK x-piiöa F.oxysporum ii известной последовательности V.dahliae.

5. Показано, что олигонуклеотидные праймеры специфично амплн-ф;'циру|л' BTC-I участок геномной ДНК грибов рода Fusarium.

6. Показана возможность использования получешюго ДНК-зонда, для иде*1тифики.цш .гриоа F.oxyr,purum в ночье и и растительных материалах с чувствительностью I акг ДНК гриба и I г исследуемой пробы. Использованный подход к peuaimw проблемы диагностики мокнс распостраннть на другие фитоиатогены и вирусы.

Список работ, опубликованных по материалам исследований.

1.M/хсмодов P.C., Ирясбяеа Б.К., Ханазьрова Д.К. Полиморфизм ялнны рестрнкциотшх'фрагментов грибов рода Vei tlciJ.l 1ьип dahliae Sieb.// V- международный симпозиум по вертнциллиуму (Ленинград, • [990г).Тезисы докладов,стр,64.

2.Ирисбаев Е.К., Мухсывдов P.C., Краев A.C., Абдукэримов i.A. .Структура гена I8S рРНК i-риба Verticillla-a dahlia:.7/STopoe

всесоюзное совещание ."Генетика развития", (Ташкент, 1990г.) Тезисы докладов,стр.114. -

3.B.K.Irisbaev., A.S.Kraev..A.A.Abdukarimov;, K.G.Skryabin. Cloning ol genus specific DtiA fragment from iungus Fusarium oxysporum.//The international society for plant molecular biology. Third International congress Tucson, 'Arizona, USA6-11 October 1991. " .

4. Ирисбаев Б.К., Мухамедов P.C., Абдукаримов A.A..Структурная организация снейсеров 5.8S рРНК гриба Fusorium oxysporum Первый съезд физиологов растений Узбекистана, 1991, Ташкент Тезисы докладов, стр. 28.

5.Ирисбаев Б.К., Краев А.С, Позмогова Г.Е., Абдукаримов А., Скрябин К.Г. Клонирование родоспецифического ДНК-зонда из гриба Fusarium oxysporum.■ Молекулярная биология т.25, вып.6 1991, стр.1667-1670.;

УЗ'бЕКИСТОН ФАНЛАР АКАДЕШЯСИ ГЕНЕТИКА ИНСТИТУТ« ИРИСБОЕВ БОБИР КОВУЛОВйЧ Биология фанлари номзоди нлмий унвонини олшп учун F.oxysporum замбуруш геномидан диагностик ДНК зондини ажратиш АВТОРЕФЕРАТ ИШНИНГ УМУМИИ МАЗМУНИ

Г?за вилт касаллигини кузгатувчи Verticillium ва Fusarium замбуруглари ДНКси рестрикция тш натинасида рибосома РНКсига таьлукли б?лган фрагментлар ани^ланди. F.oxysporum замбуругимшг генетик иняэнерия й?ли билан эволюцион консерватив кисиларпга праймерлар синтез vjimmö, полимераза заннир реакцияси ёрдагэда 5,8S ва 18S генлар оралигидаги .ички транскрипцион спейсерларя фрагмента ани^ланди. Бу фрагмент векторга утказилиб бирламчи структураси 219 асослар кетма-кетлишдан иборатлиги ани^ланда. Бу асослзр кетма-кетлигшш V.dahliae закбуруги 5,8S ва 18S оралигидаги асослар билан солиштирилди ва бпр- биридан уларнинг сони ва ухшашшги билан тубдан фар:-; килшпи анщлавди. Ички транс-крипцион спейсерлар учун синтез ^илинган праймерлар, полииераза реакциясида специфик тарзда фа^ат Fusarium замбуруглари турларшт амплификация цилиш к?рсатилда. F.oxysporuiTi узига хос аиосларнинг касалланган г?за ва тупрсвдан акратиб олинган замбуруг ДНКси билан гибридизацияси бу асоснинг фадат узига хос асос билан бирика олива: курсатилди.

INSTITUTE OF GENETIC ACADSJY 01' SCIEiiCE OP UZBKK REPUBLIC. ' TASlCCEiiT, UZBEKISTAN

IRTSBAEV BOBIR KABULOVICH Cloning o 1 diagnostic DHA-probe from the genome ot Prsarlum oxysporum SUMMARY

rRWA gene restrlctic fragments were identified by resrtiction analysis of Verticllllurn and Fusarium fungus genomic DHA. Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction (PCK), complemented to terminal parts of 18S and 5,8S rRI.'A operon structural genes of fungi V.dahliae and F.oxycporum, were pyntezied. PGR ircyv.cfit cloning the P.oxysporum Internal transcribed spacer (ITS 1) between 18S and 5,8S rDJIA were carried out and its nucleotide eoqucnce consisting of 2)9 b.p. were determined; By comparing oi ITS 1 nucleotide sequence between ¡OS and 5,BS rBiJA of F.oxyspo-ruin tliose sequence of V.dahliao it wan shown, that obtained synthetic primers allowed to carry out the amplification by PCR from fungus DHA of Pusariwa'gC'ims, while it had not been happened the ar.iplificatlca from fungus DHA of Vertlcilliuin genus fungus DNA. Possibility to use the obtained DMA probe for fungus P.oxyeporuin identification in soil and plant material ivitli sensibility 1 pg of fungus DHA- in 1 g of analysed sample was shown.

Полинса!.^ и r.u'ian. -- $ k OsL.j J t Формат бумаги 60х81'/|в Бума1а тишлрафская -Va 1 Пачагь «РОТЛПР1ЩТ». Oil,ем ^ Тщыи: м.

•57;Г

Тшаграфил ш«тЧ1Ш»л «Фан» ЛИ Pm-ajС.пп.и. ¡'«бошеш 7G0171). Тшженг, пр. М Го|Пкош, 79