Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические механизмы специализации возбудителей "гельминтоспориозных" пятнистостей зерновых культур

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы специализации возбудителей "гельминтоспориозных" пятнистостей зерновых культур"

На правах рукописи

МИРОНЕНКО Нина Васильевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СПЕЦИАЛИЗАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ «ГЕЛЬМИНТОСПОРИОЗНЫХ» ПЯТНИСТОСТЕЙ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

Специальность: 03.00.24 - Микология;

03.00.15 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте

защиты растений

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор

Дьяков Юрий Таричанович доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич доктор биологических наук Дмитриев Андрей Петрович

Ведущее учреждение: Ботанический институт им. Комарова ВЛ. Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 1 декабря 2005 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д.З.

Факс (812) 470-51-10; e-mail: vizrspb@mail333.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан « X/)

»

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.А. Наседкина

221 ОНО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Фундаментальные знания о механизмах взаимоотношений паразита и хозяина и о направлениях микроэволюционных процессов у фитопатоген-ных грибов могут служить теоретической базой для создания сортов с длительной устойчивостью. Изучение механизмов специализации паразитов представляет особый интерес для прогнозирования появления новых форм и видов фитопатогенных грибов.

К числу наиболее вредоносных заболеваний ряда злаковых культур относятся «гельминтоспориозные» пятнистости листьев, вызываемые гемибиотрофными грибами родов Pyrenophora и Cochliobolus, анаморфы которых (Drechslern и Bipolaris) ранее относили к роду Helminthosporium В последние годы наблюдается тенденция в усилении вредоносности и распространения этих патогенов на зерновых культурах. В ряде регионов РФ потери урожая ячменя от сетчатой пятнистости, вызываемой грибом P. teres Drechs., могут достигать 20-60%, от темно-бурой пятнистости, вызываемой С. sativus (Ito & Kuribayashi) Drechs. ex Dastur, недобор урожая достигает 30-40% при значительном снижении качества зерна (Кашемирова, 1995). Темно-бурая пятнистость пшеницы широко распространена в Приморском крае и на Дальнем Востоке. В Казахстане потери урожая пшеницы от С. sativus доходили до 43.8% (Здражевская, Шугуров, 1991), в странах Азии, Африки и Южной Америки - до 87 % (Hetzler et al., 1991). В настоящее время отмечается нарастающее распространение и вредоносность желтой пятнистости пшеницы, вызываемой грибом Р tritici-repentis (Died.) Shoemaker. Потери зерна от этого заболевания в условиях эпифитотии достигают 65% (Hirrell et al., 1990). Также наблюдается тенденция в усилении вредоносности красно-бурой пятнистости овса, вызываемой Р. avenae Ito et Kuribay., которая может выражаться в потере урожая до 50 % и ухудшении качества зерна (Obst, Huber, 1988).

Род Helminthosporium исторически включал различные роды грибов, объединенные по формальным признакам - морфологии конидиального аппарата и симптомам заболеваний. На протяжении ряда лет происходило уточнение и изменение таксономического статуса видов, входящих в этот род грибов (Drechsler, 1923; Ito, 1930; Хохряков, 1953; Shoemaker, 1959; Sivanesan, 1987). Однако морфологический подход не мог обеспечить решения многих проблем идентификации и филогении видов грибов в связи с их изменчивостью, обусловленной как нестабильностью генома, так и биологическими особенностями, связанными с типами размножения и адаптацией к новым растениям-хозяевам. Специализация является одним из путей симпатрического видообразования фитопатогенных грибов (Хохряков, 1953; Дьяков, 1981). Механизмы специализации гемибиотрофных паразитов и, в частности, возбудителей «гельминтоспо-риозных» пятнистостей злаков остаются практически не изученными. Одна из причин такого положения, видимо, связана с таксономическими проблемами, возникающими в результате внутривидовой изменчивости и освоения паразитами новых видов растений-хозяев. Поэтому существует объективная необходимость в разработке новых методов идентификации видов грибов, основанных на использовании молекулярных критериев видового разнообразия - структурных особенностей ДНК, что могло бы служить инструментом, позволяющим определять видовой или внутривидовой (форма, раса) статус паразита, освоившего новый вид растения, и его филогенетическое положение по отношению к предполагаемой предковой форме.

Виды паразитов, имеющие широкий спектр растений-хозяев (например, С. sativus, поражающий все виды злаков), обладают потенциальной возможностью эволюционировать в направлении специализации к «ндр

I БИБЛИОТЕКА I 3

I. .'."тда?

Виды паразитов, поражающие преимущественно конкретные виды растений хозяев (Pyrenophora teres - ячмень, Р tritici-repentis - пшеницу, Р avenae - овес), по-видимому, уже прошли в своем эволюционном развитии этап специализации. Однако внутривидовая дивергенция этих видов продолжается. Особый интерес представляет уникальный пример внутривидовой дивергенции Р teres, связанной со специализацией паразита по симптомам заболевания (f. sp. teres Smedeg. вызывает сетчатую, f. sp. macúlala Smedeg.- округлую и f. sp. gramínea Smedeg - полосатую пятнистости ячменя).

Скорость и направленность микроэволюционных процессов, ведущих к специализации фитопатогенных грибов, определяются их эволюционным потенциалом, который может быть вскрыт путем изучения структуры популяций и генетической детерминации признаков патогенности и вирулентности у паразитов.

Анализ структуры популяций паразитов по комплексу признаков позволяет выявить роль генотипа сорта и вида растения-хозяина в формировании их генофонда. Наиболее изучена популяционная изменчивость по вирулентности у грибов Р teres и С. sativus. Однако исследования генетической структуры популяций и генетики вирулентности этих паразитов находятся на начальной стадии. Совершенно отсутствуют сведения о генетической структуре популяций возбудителей Р tritici-repentis и Р avenae.

Изучение механизмов расообразования и адаптации патогенов к новым видам растений-хозяев особенно актуально в современных условиях загрязнения окружающей среды и глобального потепления климата, которые могут индуцировать генетические изменения микроорганизмов.

Цель работы - выявить молекулярно-генетические механизмы специализации к видам и сортам растений-хозяев возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистосгей злаков.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд задач:

1. Разработать экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов.

2. Сравнить внутривидовое разнообразие узко- и широкоспециализированных гемибиотрофных паразитов злаков.

3. Определить влияние генотипа растения-хозяина на генетическую структуру популяций узко- и широкоспециализированных видов фитопатогенных грибов (Р. teres, Р tritici-repentis, P. avenae в сравнении с С. sativus) по локусам, выявляемым методами молекулярного ДНК фингерпринтинга.

4. Изучить особенности полового процесса внутривидовых форм P. teres - f. sp. teres и f. sp. maculata и филогенетические отношения между ними.

5. Изучить особенности полового процесса С. sativus и изучить филогенетические отношения между С sativus и рядом узкоспециализированных видов рода Cochliobo-lus.

6. Изучить наследование признака вирулентности Р teres f. sp. teres к ячменю и С sativus к ячменю и пшенице

7. Выявить генетические факторы, влияющие на процесс адаптации С sativus к различным видам растений-хозяев.

Научная новизна.

1. Предложен оригинальный метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, который заключается в сравнении спектров ДНК, выявляемых методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

Использование этого метода расширило возможности идентификации видов и внутривидовых форм гемибиотрофных паразитов, адаптирующихся к новым растениям-хозяевам.

2. Впервые проведено сравнительное изучение структуры популяций 4-х видов гемибиотрофных патогенов злаков {Pyrenophora teres, Р tritici-repentis, Р, avenae и Cochliobolus sativus), различающихся по уровню специализации к растениям-хозяевам, с использованием ДНК-маркеров и выявлены различия между ними по доле клональной фракции и уровню среднего генного разнообразия на локус.

Популяции узкоспециализированных паразитов P. teres f. sp. teres, P. tritici-repentis и P. avenae характеризуются меньшей клональной фракцией (0-60 %) и большим значением среднего генного разнообразия на локус (Н=0.11 -0.30), чем популяции широко специализированного вида С sativus (клональная фракция составляет 75-90 % и Н=0.061-0.192).

Выявлена специализация популяций С. sativus к пшенице, культурному и дикорастущему ячменю, которая на данном этапе микроэволюции проявляется в виде повышенной агрессивности к "своим" хозяевам, различиях в генетической структуре популяций, а именно в преобладании клонов с определенными генотипами, а также в нарушениях мейоза у «межпопуляционных» гибридов.

3. Снижение фертильности гибридов между разными формами P. teres (f. sp. teres и f.sp maculata), и снижение жизнеспособности их мейотического потомства является следствием внутривидовой дивергенции в результате специализации форм гриба. На основании изучения внутривидовой изменчивости грибов P. teres на уровне ДНК выведены филогенетические отношения между формами - f. sp. teres, f. sp. maculata и f. sp. gramínea, и доказана их дивергенция на уровне геномов.

4. На основании выведенных филогенетических отношений между С. sativus и близкородственными узкоспециализированными видами грибов р. Cochliobolus показана роль С sativus в качестве предкового вида в эволюции грибов рода Cochliobolus.

5. Впервые изучено распределение типов спаривания в популяциях Р teres и С. sativus, обитающих на разных видах злаков. В популяциях обоих видов выявлено соотношение типов спаривания 1:1, что свидетельствует о прохождении половой стадии этих грибов в природе.

6. Впервые изучено наследование вирулентности у P. teres к 9 генотипам ячменя и С. sativus к 11 генотипам ячменя и 8 генотипам пшеницы. Показано, что взаимодействие генов авирулентности и устойчивости в патосистеме Н vulgare - Р teres f. sp teres осуществляется по типу ген-на-ген, согласно теории Флора (Flor, 1947). Кроме того, у Р teres f. sp. teres выявлены как специфические, так и неспецифические гены-супрессоры по отношению к генам авирулентности. Показан более высокий полиморфизм генов устойчивости и генов авирулентности в патосистеме Н. vulgare - Р teres f. sp. teres по сравнению с патосистемами Н vulgare - С. sativus и Т. aestivum - С. sativus.

Практическая значимость результатов исследований

1. Разработан экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК, выявляемых методом УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот- гибридизации.

2. Созданы коллекции аскоспоровых изолятов P. teres и С. sativus, которые могут быть использованы для оценки разнообразия генов устойчивости у доноров устойчивости ячменя к обоим патогенам и пшеницы к С sativus и создания конвергентных

5

сортов с большим числом генов устойчивости.

3. На основании результатов генетического анализа вирулентности созданы пулы ДНК изолятов Р teres, различающихся по вирулентности к сортам с различными генами устойчивости для проведения молекулярной идентификации и картирования генов авирулентности.

4. Разработан метод определения идентичности генов устойчивости с использованием пар генетически охарактеризованных штаммов патогена и их мейотического потомства для патосистем Н vulgare - Р teres f. sp. teres, H vulgare - С sativus и T aestivum - С. sativus

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных конференциях "Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)" (1983, Пущино); "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (1989, Пущино); VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (1990, Пущино); 12-ой Международной конференции по микологии и лихенологии (1993, Вильнюс); VI Совещании "Вид и его продуктивность в ареале" (1993, С-Петербург); 2-м рабочем совещании по филогенетической систематике (1994, Аарус, Дания); 13-м совещании общества Willi Hennig (1994, Копенгаген, Дания); I Всероссийском съезде по защите растений (1995, С-Петербург); XIY Съезде Эукарпия "Адаптация в селекции" (1995, Дживаскила, Финляндия); Международном симпозиуме «Современные проблемы в устойчивости злаков к болезням» (2002, С-Петербург); Первом съезде микологов России (2002, Москва); 11-ом Международном съезде по взаимоотношениям растений и микроорганизмов (2003, С-Петербург); 9-ом Международном симпозиуме по генетике ячменя (2004, Брно, Чехия); Международной научно-практической конференции (2004, Краснодар); III съезде ВОГИС (2004, Москва).

Работа была поддержана грантом ГНТП «Перспективные направления генетики» 1995-1997 гг., грантом RSS (Group Research Support Scheme Grant) 1367/1997, а также программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований ВИЗР «Фи-тосанитарная устойчивость агроэкосистем», международным проектом «Фитосани-тарная стабилизация» министерства науки и образования РФ, грантами РФФИ № 0004-49406 и № 03-04-49082, грантом Санкт-Петербурга 2003 г.

Положения, выносимые на защиту.

1. Молекулярно-генетические механизмы процесса специализации широкоспециализированного вида С sativus заключаются в дивергенции геномов изолятов, адаптированных к виду растения-хозяина, ведущей к образованию хозяин-специфичной молекулярло-генетической структуры популяции патогена. Процесс специализации обусловлен наличием в популяциях паразита набора специфических аллелей генов вирулентности к разным видам растений-хозяев, а также нарушениями мейоза в скрещиваниях между изолятами различного происхождения по растению-хозяину.

2. Молекулярно-генетические механизмы специализации Р teres заключаются в дивергенции геномов изолятов, вызывающих различные симптомы, которая сохраняется благодаря наличию репродуктивной изоляции. Возникновение новых вирулентных рас у Р teres при скрещивании авирулентных изолятов происходит в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих как гены авирулентности, так и гены-6

супрессоры, влияющие на их экспрессию.

3. Патосистемы, включающие широкоспециализированный патоген С salivus, характеризуются меньшим разнообразием генотипов устойчивости растений-хозяев и вирулентности по сравнению с патосистемами, включающими узкоспециализированные патогены

4. Метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых в УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 114 работ, в том числе по теме диссертации - 86, из них 42 - в рецензируемых печатных изданиях, 2 методических указаний, 1 патент и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения; содержит 354 страницы машинописного текста, 94 таблицы (из них 20 даны в Приложении) и 61 рисунок. Список использованной литературы включает 419 источников, из них 61 на русском языке.

Место проведения работы. Исследования проводились в 1978-2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по программам ГНТП и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН, а также согласно договорам о сотрудничестве в ПИЯФ РАН, институте фитопатологии (Ашерслебен, Германия), Центре сельскохозяйственных исследований (Йокиойнен, Финляндия).

Некоторые разделы работы были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунитета растений к болезням (ВИЗР) Афанасенко О.С., Михайловой J1.A., Тимофеевой E.H., Сердюк A.A., Филатовой O.A., Петровой A.C., а также Булатом С.А. (ПИЯФ, РАН), О. Маннинен и М. Серениус (МТТ, Финляндия), Д. Копаньке и И. Крамер (ИФ, Германия) и Б. Стеффенсоном (Университет Минессота, США).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Генетическая структура и механизмы изменчивости популяций узко- и широкоспециализированных возбудителей «гельминтоспориозных»

пятнистостей злаков

В главе представлен обзор литературы по проблемам идентификации видов фи-топатогенных грибов, решаемым с помощью молекулярно-генетических методов, а также современные представления о генетической структуре популяций фитопатоген-ных грибов, достижения в генетике вирулентности и механизмы образования рас фи-топатогенных грибов.

Глава 2. Материалы и методы

Материалом исследований служили коллекционные изоляты и природные популяции 4-х видов патогенов, выделенные из пораженных листьев различных видов злаков, собранных в разных регионах России и зарубежных странах (табл. 1).

Оценку вирулентности патогенов к растениям-хозяевам проводили по известным методикам: Р teres f. sp. teres к ячменю (Афанасенко и др., 1976); P. tritici-repentis к пшенице (Михайлова и др., 2002); P. avenae к овсу (Петрова, 2004); С. sativus к ячменю и пшенице (Михайлова и др., 2002).

Для анализа популяций патогенов использовали ДНК маркеры, полученные с помощью различных методов ДНК фингерпринтинга: УП-ПЦР (Булат, Мироненко, 1990), RAPD (Williams et al., 1990) и AFLP (Vos et al., 1995). ДНК выделяли из генети-

7

чески однородных культур грибов, полученных из отдельных конидий или аскоспор. Выделение геномной ДНК грибов проводили по оригинальной методике (Булат, Ми-роненко, 1990; ВиЬНеСа!., 1998).

Таблица 1. Фитопатогенные грибы, использованные в работе

Растение хозяин Популяция (изоляты) Число изолят0в Сорт Географическое происхождение

Pyrenophora teres f sp teres

Hordeum vulgare к 22 Криничный п. Рождесгвено, Лен. обл , 1991

p 42 Зазерский 85 г. Пинск, Белоруссия, 1991

В 45 Белогорский д. Зайцево, Лен обл., 1991

R 60 Инари п. Рождесгвено, Лен обл , 2002

J 36 -«- г Йокиойнен, Финляндия, 2002

Y3 52 Арве

Pyrenophora tritici-repentis

Triicum aestivum A-2002 7 Неизвестный сорт Ашерслебен, Германия, 2002

G 5 -«- Штутгарт, Германия, 2002

Kr 15 -«- Краснодарский край, 2002

Cz-2002 7 Чехословакия, 2002

B-2002 7 Башкирия, 2002

D 10 -«- Дагестан, 2003

Ar 4 Северная Осетия, 2003

A -2003 14 Ашерслебен, Германия, 2003

B-2003 20 -«- Башкирия, 2003

c7-2003 20 -«- Чехословакия, 2003

Pyrenophora avenue

Avena sativa Rb 35 Боррус Ленинградская обл., 2001

Rbui 30 -«-, 2002

Raw 30 Астор -«-, 2002

LaUJ 30 Аргамак г Луга, 2002

Cochliobolus sativus

Hordeum vulgare Bar-1 28 Красноуфимский 95 Челябинская обл, 1990

Bar-2 24 Паллидум 107 Ленинградская обл, 1990

Bar-3 24 Криничный -«-, 1990

Lb 30 Лебедь -«-, 2000

Ad 30 Адур -«-, 2000

PH 44 Паллидум 107 -«-, 1992

KH 18 Криничный -«-, 1992

Hkr 21 Неизвестный Краснодарский край, 1992

408H 17 Кедр Казахстан, 1992

Hordeum leporinum HW 24 сорняк Краснодарский край, 1991

3HW 38 -«- -«-, 2001

Triticum aestivum Wh-1 19 Тангуэнь Вьетнам, 1992

Wh-3 19 Саратовская 29 -«-

Lk 30 Ленинградка* Ленинградская обл, 2000

7T 41 Саратовская 29 Казахстан, 1992

IT 13 Тангуэн Вьетнам, 1992

Triticum durum Wh-2 16 Безенчукская 139 Казахстан, 1992

4T 13 -«-

Для идентификации локусов типов спаривания (МАТ 1 и МАТ 2) у гриба Р teres использовали праймеры, специфичные для этих локусов, любезно предоставлен-

ные О. Manninen (МТТ, Финляндия).

Тип спаривания изолятов С sativas определяли по наличию сумок с аскоспора-ми в псевдотециях, образовавшихся после скрещивания изолятов с коллекционными штаммами-тестерами 7Т-33 (-) и 7Т-48 (+), выделенными нами из листьев пшеницы. Статистическая обработка результатов. Для анализа генетической структуры популяции каждый ДНК-маркер у изучаемых изолятов учитывался в двух состояниях: присутствие «1» или его отсутствие «О», соответствующих двум аллельным состояниям одного локуса. Учет мономорфных и полиморфных продуктов амплификации был использован для построения бинарных матриц признаков, используемых для статистической обработки. Для расчета генетических расстояний между изолятами и кластерного анализа использовали программу Neigbour-Joining филогенетического пакета программ Phyllip v. 3.6 (Felsenstein, 1993). Стандартные индексы разнообразия - число генных копий, число гаплотипов, общее число локусов и число полиморфных локусов в популяции и молекулярные индексы разнообразия - среднее число попарных различий и среднее генное разнообразие на локус - рассчитывали с помощью компьютерной программы AMO VA (analysis of molecular variance) (Excofïier et al., 1992) пакета Arlequin v. 2.0.1.1 (Schneider et al., 1997).

Клональную фракцию (CF) популяции рассчитывали по формуле (Zhan et al., 2003):

CF = 1- (a/b);

a - число уникальных генотипов, b - общее число изолятов.

Коэффициент генетической дивергенции FST рассчитывали с помощью пакета Arlequin v. 2.0.1.1 (Schneider et al., 1997). Значения индекса Fst, большее чем 0.25, считались значимыми для оценки генетической дифференциации (Hartl & Clarke, 1997).

Достоверность соответствия наблюдаемого расщепления к теоретически ожидаемому рассчитывали по методу X2 (Рокицкий, 1974).

Скрещивания изолятов P. teres проводили по известной методике (McDonald, 1967). Для скрещивания изолятов С sativus модифицировали известные методы (Tinline, 1951).

Выявление идентичных генов авирулентности. Расщепление в аскоспоровом потомстве по фенотипам вирулентности к паре заражаемых сортов (образцов) (а/а - ави-рулентный к обоим сортам, а/в - авирулентный к первому и вирулентный ко второму сорту, в/а - вирулентный к первому и авирулентный ко второму и в/в - вирулентный к обоим сортам) дает информацию о наличии и количестве генов в родительских изоля-тах патогена, ответственных за вирулентность к обоим сортам и, соответственно, наличии в данной паре сортов тождественных генов устойчивости, комплементарных гену (генам) авирулентности у родительских изолятов гриба. Очевидно, что использование этого подхода правомочно только при условии взаимодействия генов устойчивости и авирулентности в патосистеме по типу ген-на-ген (Flor, 1955).

Глава 3. Изучение таксономии и филогении фитопатогенных грибов с помощью молекулярно-генетическИх методов

Для изучения специализации гемибиотрофных фитопатогенных грибов необходимо знать видовую принадлежность и степень генетического родства изолятов, обитающих на разных видах растений-хозяев. Для полиморфных вариантов грибов, выявляемых в процессе изучения структуры популяций, также требуется уточнение их видового или внутривидового (форма, раса) статуса. В связи « этим в данной главе при-

ведены экспериментальные данные, демонстрирующие применимость различных молекулярных методов и ДНК маркеров к фитопатогенным грибам для идентификации видов и рас, а также для изучения их филогении на примере грибов родов РугепорИога и СосЫюЬо1ш.

Идентификация видов грибов с использованием вцдоспецифичных ДНК фрагментов на примере СосЫюЪоЫа ьШмю

Совместно с лаб. генетики эукариот ПИЯФ РАН (Булатом С.А.) нами был разработан способ выявления и клонирования видоспецифичной повторяющейся ДНК грибов (Булат, Мироненко, 1989). Выявляемая при этом видоспецифичная ДНК представлена не уникальными генами, которые консервативны у многих организмов, а вы-сокоповторяющейся ДНК не рибосомного происхождения, что следовало из опытов по перекрестной гибридизации с тотальной ДНК.

Были клонированы два видоспецифичных ДНК фрагмента гриба С ¿яг/гмл. С5 и С61, из которых С61 оказался нестрого видоспецифичным и был связан с патогенно-стью изолятов, в которых он был обнаружен. На рис.1 представлены результаты гибридизации геномной ДНК разных видов грибов рода СосМ'юЬо1т с другой меченой пробой рС5. Видно, что проба гибридизуется только с ДНК С хаПуия.

Рис.1. Гибридизация геномной ДНК грибов, рестрици-рованной ЕсоШ (2,3), ХЬо! (4,5), Крп1 (6,7), ЕсоШ (813) с рС5 пробой. Маркерные фрагменты ДНК "лямбда", рестрицированной НшШН - боковые дорожки. Образцы 1-9 - С зШпив, 10 - Р-1445 (С. VШопае), 11 -Р1443 (С. супос1опйв), 12 - 431 (С На дорож-

ках 10-12 гибридизационный сигнал отсутствует.

Таким образом, клон рС5 оказался строго видоспецифичным. В жестких условиях гибридизации его гомологи не были обнаружены у других видов, и в то же время все проанализированные изоляты С боНум (более 60 изолятов) содержали многочисленные копии С5-элемента (рис.1). В последующем анализ С5-элемента был переведен на технику ПЦР. Согласно нуклеотидной последовательности рС5 клона Булатом С.А. (ПИЯФ) были сконструированы олигонуклеотидные праймеры, названные Св5 праймерами (30-членные с сайтом рестрикции на 5'-конце и с АТ богатыми 3'-концами), которые в ПЦР давали фрагмент ДНК ожидаемой величины (290 п.н.) лишь у изолятов С. хаНуиз (рис.2). В других видах этого рода амплификацию ДНК с этими праймерами вообще не наблюдали. Сб5 специфичные праймеры могут быть использованы для идентификации С зшмия в сложных биологических смесях и также тканях растений.

9 10 11 12

Рис.2. ПЦР-амплификация с Сэ5 праймерами выборки изолятов С ¿а/1'м и родственных видов грибов. Сбоку (дорожки 1 и 12) - маркеры молекулярных масс ("лямбда" - НтсШ1+рВ1Ш2-А1и1). 2-7 -изоляты С за/пту, 8 - С супоЛопИя; 9 - С У1с1опае; 10-С Ле/егсШгорАг«; 11-С т'1уаЬеапш.

Идентификация видов фитопатогенных грибов методом УП-ПЦР

Суть метода вндоидентификацни с помощью полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) заключается в том, что электрофоретические спектры ДНК, получаемые в результате УП-ПЦР, видоспецифичны, а внутривидовая изменчивость может проявляться в виде незначительно измененных спектров ампли-фицированной ДНК (зависит от того, имеет ли гриб половую стадию и как часто ее использует). Видоспецифичность УП-ПЦР паттернов доказана эмпирически на большом экспериментальном материале. Было показано сходство УП-ПЦР паттернов для изо-лятов, принадлежащих к одному таксономическому виду для грибов, относящихся к родам Cochliobolus, Pyrenophora, Saccharomyces, Trichoderma, Aureobasidium, Fusarium и др. (Булат, Мироненко, 1990,1992; Bulal et al., 1998; Mironenko, Bulat, 2001).

При сравнении УП-ПЦР паттернов изолятов последние можно сгруппировать по критерию сходства этих ДНК паттернов, которые отражают структуру генома изолятов гриба. Такие группы могут представлять подвиды, специализированные формы, расы и т.д.

На рис.3 представлены результаты амплификации изолятов одного вида (С sati-vus) с универсальным праймером LI5. Очевидно сходство ПЦР паттернов. Если же в анализируемой выборке присутствуют разные виды грибов, то получается достаточно пестрая картина (рис.4).

1 2 3 4 5 6 7 8

^HBHHJHHB Рис. 3. Видоспецифичный ПЦР паттерн выборки изолятов С. ^^ШШШШШШШш sativus, полученный с праймером L15.

^Я маркеры молекулярных масс - дорожка 1; 2-8 -изоляты С sativus.

| 2 3 4 5 6 7 в 9 ю 11 12 1з Рис.4. Видоспецифичные ПЦР паттерны грибов

различного таксономического положения. Маркеры молекулярных масс - дорожка 1. Образцы- 2 -С sativus; 3 - Р teres; 4 - Pyricularia oryzae, 5 -Fusarium graminearum; б - Septoria tritici, 7-Cercosporella sp.; 8 - Yarrowia lipolytica; 9 - Saccharomyces cerevisiae; 10 - Aureobasidium pullu-lans; 11- Peziza sp , 12 — Coprinus cinereus, 13 -Aspergillus awamori.

В случае если возникают затруднения в интерпретации сходства ПЦР паттернов (разные виды или выраженная внутривидовая изменчивость), необходимо проводить перекрестную блот-гибридизацию амплифицированной ДНК. В качестве меченой ДНК пробы можно использовать отдельные фрагменты ПЦР паттерна или амплифи-цированную ДНК изолята в целом.

Таким образом, разработанный нами экспресс-метод идентификации видов грибов, основанный на анализе сходства УП-ПЦР профилей и гомологии амплифицированной в УП-ПЦР ДНК, оказался незаменимым для верификации видовой принадлежности изолятов, обитающих на различных растениях-хозяевах.

Определение биологического видового статуса P. teres и Р. gramínea методом УП-ПЦР

Материалом исследования послужили штаммы грибов, выделенные из природных популяций или полученные из разных коллекций. На рис.5 и 6 представлены УП-ПЦР паттерны изолятов Р teres и Р gramínea. Из приведенных данных следует, что изоляты этих двух таксономических видов фактически не различаются по УП-ПЦР паттернам.

1 2 34 5 6 7 89 101112 13 14

Рис. 5. ПЦР-патгерны изолятов P. teres и Р. gramínea, полученные с использованием праймера L21. Маркеры молекулярных масс - 1 и 14. Изоляты Р teres: дорожки 2 -8. Изоляты Р gramínea: дорожки 9 - 13 .

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13

Рис. 6. ПЦР-патгерны изолятов Р teres и Р. graminea, полученные с использованием прай-меров 178 (2-6) и Е2 (7-12). Маркеры молекулярных масс - 1 и 13. Изоляты Р teres, дорожки 2, 3, 4 и 7, 8, 9. Изоляты Р graminea: дорожки 5, 6и 10,11, 12.

Приведенные на рис. 5 и 6 данные свидетельствуют, что грибы P. teres и Р graminea представляют один биологический вид, что согласуется с литературными данными по фертильности гибридов этих видов (Smedegaard-Petersen, 1983). На рис.7 выборочно приведены результаты амплификации ДНК грибов с использованием системы двух универсальных праймеров L21+178. Показано, что использование этой системы праймеров приводит к появлению у Р graminea мажорного фрагмента размером около 350 пар оснований (п.о.), по которому можно диагносцировать эту внутривидовую форму. Все тестированные изоляты Р graminea содержали этот фрагмент, тогда как ни один изолят P. teres не содержал его. Полученные данные позволяют придать таксономическим видам Р teres и Р graminea статус внутривидовых форм - Р teres f. sp. teres и P teres f. sp. graminea, различающихся по специализации в проявлении симптомов заболевания на одном растении-хозяине.

Рис. 7. ПЦР-паттерны Р teres и Р graminea с использованием системы двух праймеров L21+178.

Маркеры молекулярных масс - 7. Изоляты Р teres. 1-3. Изоляты Р graminea: 4-6. Стрелкой отмечен диагностический для Р graminea ДНК-фрагмент размером ~ 350 п.о.

Идентификация и анализ филогенетических отношений различных форм Р. teres (f. sp. teres, f. sp. graminea, f. sp. maculata).

В пределах вида P teres, специализированного к ячменю, различают три внутри-

видовые формы, вызывающие различные симптомы заболеваний: f. sp. teres - сетчатую, f. sp. gramínea - полосатую и f. sp. maculata - округлую пятнистости Такой тип специализации по симптомам болезни не встречается у других видов рода Ругепо-phora Нами была поставлена задача вскрыть уровень генетической дивергенции данных форм гриба. На рис.8, приведены УП-ПЦР паттерны 3-х форм P. teres и группы изолятов из Азербайджана, которые отличались от остальных по молекулярным маркерам и были названы нами f. sp. Az Принадлежность всех 4-х форм к одному виду доказана блот-гибридизацией продуктов амплификации анализируемых изолятов с продуктом амплификации изолята Р teres, использованным в качестве метки. Во всех случаях получен положительный гибридизационный сигнал (рис.9).

Отметим, что амплифицированная ДНК Р tritici-repentis также показала небольшую гомологию с УП-ПЦР продуктами Р teres, что свидетельствует о генетическом родстве этих видов.

На рис.8 показаны четкие различия между формами f. sp. teres и f. sp. maculata no одному мажорному фрагменту (обозначен стрелкой) при основном сходстве остальных фрагментов паттернов. Этот фрагмент можно считать диагностичным для P. teres f. sp. maculata и пригодным для разработки ПЦР диагностики этого патогена.

Е

S'J5 §> Рис.8. УП-ПЦР паттерны грибов вида Pyrenophora

Ой. Imac f.teres a,' f.Az teres, полученные с праймером 3-2. Молекулярные

маркеры масс - боковые дорожки - "лямбда" ДНК, расщепленная PstI ферментом. Образцы: 1 - С salí-vus; 2 - Р. tritici-repentis; 3-6 - P. teres f. sp. maculata; 7-11 - P teres f. sp. teres; 12-13 -P. teres f. sp. gramínea, 14-17 - P. teres f. sp Az.

1 2 3 4 5 67 8 91011121314151617

Рис.9. Дот-гибридизация продуктов амплифи-кации ДНК

1 2 j*?6788 10 изолятов Pyrenophora, полученных с праймером 3-2. В качестве ДНК меченой пробы использовали тотальный продукт амплификации изолята 6 Р teres. Пятно 1 - С. sativus (в качестве негативного контроля); пятно 2 - Р tritici-repentis; 3 — Р teres f. sp. maculata; 4-8 - P teres f. sp. teres; 9 — P. teres f. sp. gramínea; 10 - P teres f. sp. Az.

Для установления филогенетического родства изолятов Pyrenophora использовали филогенетически информативные ДНК фрагменты, полученные в УП-ПЦР с прай-мерами АА2, AS4 и комбинацией праймеров AS15+AS15inv. В результате компьютерной обработки матрицы различий методом парсимонии было получено приведенное на рисунке дерево для изолятов P. teres (рис.10).

Сходные результаты были получены при построении филогенетического дерева на основе данных полиморфизма рибДНК изолятов.

Оба дерева показывают, что изоляты P. teres делятся на два кластера: генетически гетерогенные изоляты Р teres f. sp. teres, группа изолятов из Азербайджана (P. teres f. sp. Az), и изоляты P. teres f. sp. maculata и P. teres f. sp. gramínea, которые представляют одну мо-нофилетическую группу, характеризуемую самым высоким значением бутстрэпа. Таким образом, нами показана внутривидовая дивергенция изолятов гриба Р teres, вызывающих различные симптомы пятнистостей ячменя, на уровне структуры их геномов.

Рис.10. Филогенетические отношения между формами Р teres, выведенные на основании УП-ПЦР полиморфизма методом пар-симонии (branch and bound, С1=0,80). Числа под каждым узлом ветвления означают количество случаев появления монофилетической группы в 100 повторностях,

Филогенетические отношения между видами рода Cochliobolus, специализированными к разным видам злаков

Специализация некоторых видов грибов рода Cochliobolus выражается в способности поражать различные виды злаков: С. nodulosus - дагуссу (Eleusin sp.), С mi-yabeanus - рис, С. heterostropus и С. carbonum - кукурузу, С. avenae - овес, С супо-dontis - свинорой. Задачей данного этапа исследования было сравнить уровень генетической дивергенции между этими специализированными видами и С. sativus, имеющим широкий спектр растений-хозяев. Материалом для исследования служили коллекционные штаммы грибов различных видов, полученные из ряда институтов России и зарубежных стран.

Для определения филогенетических отношений между видами использовали признаки, выявленные методом рестрикционною анализа рибДНК этих грибов (наличие или отсутствие фрагментов рестрикции). Матрицей для рестрикции служила рибДНК (ITS2 спейсер и часть 25S рибосомальной единицы), амплифицированная с праймерами F22 hF24 (Lübeck et al., 1998). В качестве контрольных видов для сравнения были взяты Р teres и Fusarium oxysporum. Виды Cochliobolus разделились на два кластера: С nodulosus-С. miyabeanus и остальные 6 видов (рис.11).

Рис.11. Филогенетические отношения грибов р. Cochliobolus, выведенные на основе рестрикционного рибДНК полиморфизма. Дендрограмма построена методом наибольшей парсимонии по единой матрице признаков - 14 рестриктов (Taql, Mspl, Rsal, AIul) амплифици-рованного фрагмента рибДНК (область ITS2-25S). Использовали метод парсимонии (branch and bound, CI=0,74) и процедуру бутстрэп. На рисунке даны сокращенные названия видов: Cs- С sativus, bi - D biseptata, vi - С victo-riae, ca - С. carbonum.

Для более детального анализа филогенетических отношений между близко родственными шестью видами был использован метод УП-ПЦР. Он позволяет выявлять большое число признаков, пригодных для построения филогенетических деревьев.

В результате гибридизационного анализа УП-ПЦР продуктов показано, что шесть проанализированных таксономических видов (С sativus, С carbonum, D biseptata, С victoriae, С heterostrophus и С cynodontis) проявляют гомологию на уровне геномов и, следовательно, представляют собой один комплекс видов. Эти результаты подтвердили выдвинутое еще в 1964 г. предположение, что С sativus, С victoriae и другие виды со сходной морфологией конидий, включая С carbonum, "со-

зо

100

• Р teres £ macaba

Р laps f дашаеа

Pteresf Az Р tars Itms 1

"Ж"

Plací Iteres 6 цд| I P teres f tors i

- F ozysponga

—P teres

_ С hrtocrstrophiB "111 С cyeodontis

. Csibi'vi 'ca

1(10 С шузЬеаш

ooduksus

ставляют комплекс близко родственных видов" (Luttrell, 1964). На основании УП-ПЦР полиморфизмов были выведены филогенетические отношения между шестью видами грибов внутри единого видового комплекса (рис.12.). Топология дерева, построенного по данным УП-ПЦР анализа (рис.12.), близка к таковой дерева, построенного по данным полиморфизма рибДНК (рис.11).

Таким образом, результаты филогенетического анализа группы специализированных видов Cochliobolus по рибДНК и УП-ПЦР маркерам, а также гибридизацион-ного анализа, показали, что 6 видов - С. sativus, С victoriae, С carbonum, D biseptata, С cynodontis и С heterostrophus имеют сходную структуру генома и представляют собой один комплекс видов. С sativus является наиболее дивергентным компонентом этого комплекса, что позволяет считать его предковой формой в эволюции других хозяин-специализированных видов грибов рода Cochliobolus.

Рис.12. Филогенетические отношения грибов р. Cochliobolus, выведенные на основе УП-ПЦР полиморфизма. Дендрограмма построена методом наибольшей парсимонии по единой матрице признаков (79 полиморфных продуктов амплификации), полученных с двумя универсальными праймерами L45 и L21. Использовали метод парсимонии (branch and bound, С1=0,76) и процедуру бутстрэп.

Глава 4. Влияние растения-хозяина на молекулярно-генетическую структуру популяций возбудителей пятнистостей злаков

Возможность использования ДНК маркеров наряду с признаками вирулентности позволила применять современные методы статистического анализа частот аллелей и генотипов в популяции и благодаря этому выявить факторы, влияющие на структуру популяций паразитов и сравнить популяции узко- и широкоспециализированных видов паразитов. В результате выявлено влияние генотипа сорта ячменя на структуру популяций Р teres f. sp. teres и генотипа вида растения-хозяина на структуру популяций С, sativus

4.1. Влияние генотипа сорта на структуру популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя Pyrenophora teres f. sp. teres по анонимным ДНК локусам

Материалом исследования служили две популяции Р teres f. sp. teres, выделенные из листьев сорта Инари с производственных посевов ячменя в п. Рождествено Ленинградской обл. (R) и г. Йокиойнен (Финляндия) (J), разделенных расстоянием около 600 км.

Изучили генетическое разнообразие популяций R и J по AFLP маркерам с использованием методов кластерного анализа и программы AMOVA. Изучение популяций R и J с помощью метода ДНК фингерпринтинга - AFLP, позволило не только охарактеризовать генетическое родство между изолятами двух популяций, но и изучить молекулярное разнообразие этих популяций.

Для популяций R и J были учтены 166 продуктов амплификации размером от 100 до 400 пар оснований. Процент полиморфных маркеров для популяции R составил 35.5%, для популяции J - 69.6%. Другие показатели молекулярного разнообразия также были выше для финской популяции (табл. 2)

Изменчивость по AFLP маркерам распределилась следующим образом: 35.14% внутри популяций и 64.86% между популяциями. Выявленный коэффициент генетической дифференциации (FST) между этими популяциями составил 0.649, что свиде-

I— С. cynodontis L2 С heterostrophus

- Y»

j— С. carbonum \1 С. victoriae

. D biseptata , С. sativus

тельствует о существенной генетической дивергенции между ними. На рис.13 представлена фенограмма генетического родства двух популяций по AFLP маркерам. На фенограмме изоляты обеих популяций образовали два отдаленных друг от друга кластера, что подтверждает их генетическую дифференциацию. Таким образом, по молекулярным маркерам выявлены существенные различия между двумя популяциями Р teres f. sp. teres, которые можно отнести как за счет географической отдаленности популяций, так и за счет других факторов (например, климатических различий, различий в семенном материале и др.).

Таблица 2. Характеристика молекулярного разнообразия популяций R и J Р teres f. sp. teres no AFLP маркерам

Число Число Клональная Общее генное Среднее генное

Популяция изолятов AFLP фракция разнообразие разнообразие на

генотипов (CF) (%) локус(Н)

R 60 49 18.3 0.98+0.01 0.087+0.044

J 36 36 0 1.00+0.07 0.175+0.090

Также материалом для молекулярных исследований служили изоляты P. teres, выделенные из листьев различных сортов ячменя, собранных в Ленинградской обл. (популяция К - из сорта Криничный и популяция В - из сорта Белогорский). Еще одна группа изолятов, взятая для сравнения, выделена из сорта Зазерский 85 (г. Пинск, Белоруссия) (популяция Р).

Популяции К, В и Р проанализировали с помощью одного универсального праймера L45. В популяциях Р и В был выявлен полиморфизм по УП-ПЦР паттернам. Из 25 амплифицированных ДНК фрагментов 21 оказались полиморфными. Выявленные УП-ПЦР полиморфизмы в целом оказались специфичными для каждой популяции, кроме основного, распространенного во всех трех популяциях ДНК варианта, составляющего мажорные по частоте встречаемости классы. Таким образом, каждая популяция характеризовалась своим «набором» ДНК вариантов и частотным распределением их в популяции (табл. 3.).

Таблица 3. Распределение УП-ПЦР генотипов (праймер L45) _ в популяциях «В», «Р» и «К» P. teres_

Обозначение генотипа Генотипы по 21 УП-ПЦР маркерам Число (%) генотипов в популяции

В р К

1G 111111111101111110101 31 (68.8) 21 (50 0) 23 (100.0)

2G 111111101101111111111 5(11 1) 0 0

3G 101111000101100010001 3 (6.7) 0 0

4G 111111000101100010001 2(4.4) 0 0

5G 110Ш 000000000001000 2(4 4) 0 0

6G 111111101101111111101 2(4 4) 0 0

7G 011111111101111111101 0 15 (35 7) 0

8G 111111101110101111001 0 2(4 8) 0

9G 111111111011111111101 0 1 (2.4) 0

10G 111111111111111111101 0 К2 4) 0

11G 110011101010111110101 0 1 (2.4) 0

12G 110011001011111111101 0 1 (2.4) 0

Рис. 13. Генетическое расстояние между изолятами P. teres f. sp. teres двух популяций R и J по AFLP маркерам. Изоляты популяции R обозначены n 1, п2 и т.д.; популяции J - j 1, j2 и т.д.

Популяция К оказалась гомогенной по структуре ДНК, выявляемой праймером L45. Эта же популяция была оценена в ПЦР анализе с праймерами L21 и АА2, в результате которого среди 23 исследованных изолятов не было обнаружено ни одного ПЦР варианта (данные не приведены), что подтвердило генетическую однородность популяции. Вероятно, эта в популяция представлена одним или несколькими близкородственными клонами.

В популяции В обнаружено б, а в популяции Р - 7 типов ДНК вариантов, из которых один (1G) был общим для обеих популяций (а также для популяции К) и был представлен большинством изолятов (табл. 3.). Таким образом, популяции В и Р оказались гетерогенными по исследуемым УП-ПЦР маркерам. Причем, если в популяции В выделяется один мажорный класс (68.8%) ДНК вариантов, представленный генотипом 1G, то в популяции Р мажорных класса два, представленных генотипом 1G (50.0%) и генотипом 7G (35.7%). Последний класс представляет собой ДНК варианты, уникальные для популяции Р.

Таким образом, между популяциями К, В и Р с помощью УП-ПЦР метода выявлены различия по молекулярно-генетической структуре, которые могут быть обусловлены влиянием генотипа сорта, что подтверждает выявленное нами ранее влияние генотипа восприимчивого сорта ячменя на структуру популяций Р teres по вирулентности (Левитин, Афанасенко, Мироненко, 1983).

Структура популяций P. teres f. sp. teres по типам спаривания

Одним из объяснений столь высокой генетической изменчивости в популяциях Р teres f. sp. teres может быть наличие половой стадии гриба в природе. Изучили распределение аллелей типа спаривания в популяциях Р teres R и J (табл. 4). Тип спаривания изолятов определяли с помощью оригинального метода - ПЦР со специфичными праймерами, сконструированными для обнаружения аллелей типа спаривания МАТ1/МАТ2 (рис.14).

Очевидно, что в обеих популяциях оба типа спаривания гриба представлены с одинаковой частотой. Данный факт свидетельствует о возможности прохождения по-

ловой стадии гриба в природе. В подтверждение этого можно привести наши наблюдения, а именно: обнаружение весной на остатках ячменя в поле зрелых псевдотециев с аскоспорами.

Таблица 4. Распределение частот типов спаривания (МАТ1& МАТ2) в популяциях R и J

Популяция Число изолятов Типы спаривания (%) Х2(1:1)

МАТ1 МАТ2

J 36 52.8 47.2 0.31

R 61 57.4 42.6 2.19

1234567 1234567

Рис 14 Результаты амплификации изолятов Р leres f. sp. teres популяпии R со специфичными праймерами на аллели типов спаривания. Дор. 1-7 - продукты амплификации ДНК различных изолятов с праймерами на локус МАТ2 (размер 1150 п.о.) и амплификация тех же изолятов с праймерами на локус МАТ1 (размер 1300 п.о.). М - маркеры молекулярных весов.

4.2. Внутривидовая изменчивость Pyrenophora trüici-repenäs - возбудителя желтой пятнистости пшеницы. Структура популяций по анонимным ДНК локусам.

Материалом служили группы изолятов из Германии (G - Штуптарт, А - Ашерс-лебен), Чехии (Cz) и России (Краснодар (Кг), Башкирия (В), Дагестан (D) и Северная Осетия (Ar)), выделенные из пораженных листьев районированных восприимчивых сортов пшеницы в 2002 г (40 изолятов) и в 2003 г (68 изолятов) (табл.1). Для изучения генетической изменчивости P. tritici-repentis использовали метод RAPD. Из 11, случайно взятых RAPD праймеров, для дальнейшей работы были выбраны 4 - OPA-OI, ОРА-08, ОРВ-11 и OPI-09, которые давали четкие воспроизводимые ПЦР паттерны. Генетическая изменчивость популяций P. tritici-repentis, выявленная RAPD анализом, отражена в таблице 5.

Высокие значения показателя генетической дифференциации между группой изолятов из Башкирии и другими (Fs-f=0.262-0.572) и изолятами из Дагестана и Северной Осетии и другими группами (FST=0.2462-0.572), а также кластеризация изолятов Р tritici-repentis из Башкирии (кластер 1а на рис.15), Дагестана и Северной Осетии (кластер 2 на рис.15) на фенограммах дают основание утверждать, что эти группы изолятов отличаются друг от друга и могут считаться представителями различных географических популяций.

Для других групп патогена не удалось найти корреляцию между ДНК полиморфизмом и их происхождением. Исключением можно считать группу изолятов из Чехии. Десять изолятов этой группы, выделенные в 2003 году, что составляет 50% от общего числа изолятов, попали в один кластер (кластер 16 на рис.15). Вероятно, изо-ляты из Чехии также являются самостоятельной популяцией, но на данном этапе исследований этот вопрос остается открытым.

Таблица 5. Генетическая изменчивость популяций Р. tritici-repentis, обнаруженная RAPD-PCR анализом со случайными праймерами OPA-Q1, OPA-Q8, ОРВ-11 и QPI-09

Группа изоля- Всего Кол-во ге- Клональная фрак- Всего RAPD Количество полиморф-

юв изолятов нотипов ция CF (%) локусов ных RAPD локусов

Кг-2002 15 13 13.3 38 13

Cz-2002 7 6 14.3 38 8

В-2002 7 5 28.6 38 5

А-2002 7 7 0.0 38 10

G-2002 4 2 50.0 38 5

Коллекция-2002 40 30* 25 0 38 16**

А-2003 14 3 78.6 24 4

Cz-2003 20 16 20.0 24 11

В-2003 20 12 40.0 24 10

D-2003 10 6 40.0 24 3

Аг-2003 4 3 25.0 24 4

Коллекция-2003 68 47* 30 9 24 14**

*обшее число генотипов не равно сумме генотипов всех групп изолятов, поскольку изоляты из разных групп могли иметь один и тот же генотип, **- общее количество полиморфных ИАРБ локу-сов не равняется сумме полиморфных локусов для каждой группы, поскольку часть локусов бьша общей для нескольких групп изолятов.,

Я

ID12 А31

А43

1а

16

2

Рис. 15. Генетическое родство изолятов РугепорЪога 1гИ\с\-герепИ$, выделенных в 2003 году. Обозначения изолятов даны в таблице 1.

4.3. Влияние генотипа сорта на структуру популяций возбудителя красно-бурой пятнистости овса Pyrenophora avenue по анонимным ДНК локусам

Материалом исследований служили 4 популяции патогена, выделенные из пораженных листьев овса: Rb01 и Rb - из сорта Боррус, собранного в Ленинградской обл. в 2001 и 2002 годах и La02 и Ra02 - из сортов Астор и Аргамак, собранных в г. Луге и п. Рождествено Ленинградской обл., соответственно.

После тестирования 30 случайных праймеров были отобраны 3 (ОРА-09, ОРА-10 и ОР1-Ю), способные выявлять ДНК полиморфизмы изолятов Р avenae, независимо от концентрации ДНК (в диапазоне 5-50 нг/мкл). Было обнаружено, что эти прай-меры выявляли ДНК полиморфизмы у изолятов, относящихся к популяциям Rb02, La02 и Ra02, но не у изолятов популяции Rb01, что являлось свидетельством отличия генетической структуры данной популяции от других трех популяций патогена. На рис.16 показано единообразие ДНК-спектров, полученных с использованием праймера ОРА-10, у 13, случайно отобранных из 30 изолятов популяции Rb01. Пример амплификации ДНК изолятов популяции La02 с тем же праймером представлен на рис.17. Очевидно, что данный праймер выявляет у изолятов этой популяции минимум три ДНК-полиморфизма.

Рис. 16. Спектры ДНК изолятов Р avenae (случайная выборка) популяции Rb01, полученные методом RAPD с праймером OPA-IO. У изолятов 7-10 верхние фрагменты амплифици-рованы слабее.

M I 2 3 4 5 6 7 I 1 10 II 12 и

Рис. 17. Спектры ДНК изолятов Р avenae (случайная выборка) популяции Ьа02, полученные методом RAPD с праймером ОРА-Ю. Полиморфные фрагменты ДНК обозначены стрелками

В результате проведенного RAPD анализа выявлены высокие частоты клональ-ных фракций во всех популяциях (табл. 6).

Таблица 6. Генетическая изменчивость в популяциях Р. avenae, обнаруженная RAPD-PCR анализом со случайными праймерами ОРА-09, ОРА-Ю и ОР1-Ю

Популяция Всего Количество Клональная Всего RAPD Количество полиморфных

изолятов генотипов фракция CF (%) локусов RAPD локусов

Rau/ 23 15 34.8 16 5

Rbu/ 20 12 40.0 16 10

La02 18 10 44.4 16 8

Rbul 20 1 100 20 0

Среднее генное разнообразие на локус для популяций Rb02 и Ra02 составило 0,194 и 0,302, соответственно. Коэффициент генетической дифференциации между этими популяциями был очень низким (FSr= 0,096), что свидетельствует об отсутствии влияния генотипа восприимчивого сорта овса на молекулярно-генетическую структуру популяций.

4.4. Влияние вида растения-хозяина на структуру популяций возбудителя темно-бурой пятнистости злаковых Cochliobolus sativus по анонимным ДНК локусам

Изучали генетическое разнообразие популяций С sativus, выделенных из разных сортов растений-хозяев: культурного и дикорастущего ячменя, пшеницы Triticum aestivum и Т durum с использованием методов ДНК фингерпринтинга (RAPD и УП-ПЦР).

С помощью метода УП-ПЦР были проанализированы три популяции, выделенные из пораженных листьев ячменя (bar-1, bar-2, bar-3) и три популяции, выделенные из пораженных листьев пшеницы (wh-1, wh-2, wh-З). ДНК изолятов амплифицировали с универсальным праймером LI5. В результате было получено 28 продуктов амплификации, из которых 14 были полиморфными. Среди 130 проанализированных изолятов было выявлено всего 16 генотипов (обозначенных 1G-16G). Распределение частот этих генотипов в популяциях отражено в табл. 7. Частоты различных генотипов распределились в популяциях неравномерно.

Таблица 7. Распределение УП-ПЦР генотипов (праймер LI5) в популяциях С sativus

Обозначение генотипа Генотипы по 14 УП-ПЦР маркерам Число (%) генотипов в популяции

Ваг-1 Ваг-2 Ваг-3 Wh-1 Wh-2 Wh-З

Ю 10110010101111 7(25.0) 7 (29.2) 8 (33.3) 9(47.4) 1 (6.3) 12(63.2)

2G 11110010101111 18(64.3) 11 (45.8) 8 (33.3) 0 9(56.3) 0

3G 11111010101111 0 5 (20.8) 4(8.3) 0 0 0

4G 00010011001001 0 0 0 0 2(12.5) 0

5G 10111010101111 0 1 (4.2) 1(4.2) 1 (5.3) 0 0

6G 10110010101011 0 0 0 2 (10.5) 0 1 (5.3)

7G 10010010101011 0 0 0 0 0 2 (10.5)

8G 10010010101111 0 0 3(12.5) 3 (15.8) 0 3 (15.8)

9G 10010110101111 0 0 0 2 (10.5) 0 0

10G 10011110101111 0 0 0 1 (5.3) 0 0

11G 00010010110011 0 0 0 1 (5.3) 0 0

12G 00010010101011 0 0 0 0 0 1 (5.3)

13G 10010010100011 0 0 0 0 2(12.5) 0

14G 11110010100001 2(7) 0 0 0 0 0

15G 11110010000001 1(3.6) 0 0 0 0 0

16G 11110010100011 0 0 0 0 2(12.5) 0

Всего 28 24 24 19 16 19

Чаще всего встречались генотипы 1G и 2G. Первый генотип представлен во всех популяциях с высокой частотой (25-63,2%), за исключением популяции wh-2. Отметим, что эта популяция, выделенная из Т durum, отличается от «ячменных» и двух других «пшеничных» популяций, выделенных из Т aestivum, низкой частотой генотипа 1G и наличием уникальных генотипов, не встречающихся в других популяциях -4G, 13G, 16G. Второй мажорный по частоте встречаемости генотип 2G отсутствовал в популяциях wh-1 и wh-З, выделенных из Т aestivum. Генотип 3G встречался только в двух «ячменных» популяциях. Остальные генотипы были представлены одиночными изолятами.

Для характеристики внутрипопуляционной изменчивости С чмпш оценивали их генотипическое и генное разнообразие по УП-ПЦР локусам (табл. 8), выявляемое с помощью программы АМОУА.

Таблица 8. Генетическая изменчивость популяций С sativus, обнаруженная УП-ПЦР _анализом с универсальным праймером L15._

Популяция Общее число Число гено- Клональная фрак- Среднее генное разно-

изолятов типов ция CF (%) образие на локус

Ваг-1 28 4 85 7 0 075

Ваг-2 24 4 83 3 0 061

Ваг-3 24 4 83 3 0.078

Wh-1 19 6 68 4 0 112

Wh-2 16 5 68.2 0 192

Wh-3 19 3 84.2 0 064

Данные табл. 8 демонстрируют наличие во всех популяциях значительной кло-нальной фракции и низкие показатели среднего генного разнообразия на локус, отражающие низкую степень «гетерозиготности» популяций С. яаНуш.

Также материалом исследований служили изоляты С выделенные из

различных сортов ячменя и пшеницы, из листьев дикорастущего ячменя Н ¡ероппит и собранных на одном поле остатков соломы ячменя и почвы (табл. 1 и 9).

Таблица 9. Распределение УП-ПЦР генотипов в популяциях С. выявленных _с использованием комбинации универсальных праймеров ОП^оС52__

Популяция, (растение- хозяин) УП-ПЦР генотипы (число изолятов)

А В с D Е F G H I J К L M N О

РН (44) ячмень - В* 2 С„ 39 - - F* 1 - - - - K*2 - - - -

КН (17) ячмень А* 1 - - D„ 14 - - - - - J* 2 - - - - -

408Н (21) ячмень А„ 15 В* 2 - - - F*2 - - - J* 1 K»1 - - - -

НЭ (51) почва - в,„ 38 I* 1 J 11 K*1 - - - -

НХ(16) солома ячм - СО —

Н\У (24) дик ячмень 1* 1 - K»1 L* 1 Mm 17 N3 О* 1

7Т (41) пшеница Fen 16 G„ 22 H* 2 - J* 1 - - - - -

4Т (13)** пшеница - - - - Е 4 13 G 6

1Т(13)" пшеница - - - - - G 9 - - J» 4 - - - - -

т - мажорный класс УП-ПЦР генотипов, обнаруженный более чем в 30% изолятов, * - единичные изоляты, ** - мажорный класс не был идентифицирован из-за малого количества изолятов в популяции.

В трех популяциях, выделенных из культурного ячменя (РН, КН и 408Н), было выявлено 7 типов УП-ПЦР полиморфизма, 5 из которых не встречались в «пшенич-

ных» популяциях (7Т, 4Т и 1Т), т.е. были уникальными для «ячменных» популяций (табл.9). Каждая «ячменная» популяция характеризовалась своим мажорным типом УП-ПЦР полиморфизма, что, по-видимому, связано не только с их географическим происхождением, но и генотипом сорта ячменя. На последнее заключение указывает то обстоятельство, что популяции РН и КН, выделенные из разных сортов ячменя одного сортоучастка (Ленинградская обл.) (табл.1.), характеризовались различными мажорными УП-ПЦР генотипами "А" и "В" (табл. 9), которые, к тому же, оказались генетически не родственными (рис. 18). На рис. 18 показаны отношения генетического родства изолятов, представляющих мажорные классы популяций разного происхождения по виду растения-хозяина, определенные на основе УП-ПЦР анализа. В целом, «ячменным» популяциям оказалась свойственна большая изменчивость изолятов по

Рис. 18. Филогенетические отношения популяций С. заШю. Дендрограмма построена методом наибольшей парсимонии (консенсус из 300 деревьев). Числа в узлах ветвления означают частоту появления данной группы при количестве повторений равном 300 (процедура бутстрэп). На концах ветвей обозначены вид растения-хозяина, популяция патогена и мажорный тип УП-ПЦР полимор-

-Искуственный предок (корень) фиЗМа ДЛЯ ДЭННОЙ ПОПуЛЯЦИИ (табл. 9.)

Три «пшеничные» популяции имели один общий тип полиморфизма "С, который не встречался больше ни в одной популяции даже в минорном числе. Популяция 7Т имела два мажорных типа полиморфизма "Р" и "С'. Важно отметить, что взятые для УП-ПЦР анализа «пшеничные» популяции сильно различаются между собой по географическому происхождению (Казахстан и Вьетнам), но при этом характеризуются единым мажорным типом полиморфизма. Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют о генетической специализации патогена к пшенице Т. аевНуит.

В почвенной популяции (Н8) превалировал мажорный генотип "В", выявленный также на соломе культурного ячменя, собранной на том же поле. Интересно отметить, что в данной популяции 21.5% изолятов относятся к типу полиморфизма 'Т\ которые встречаются в остальных популяциях в минорном количестве.

Наибольшей генетической изменчивостью характеризовалась популяция с дикорастущего ячменя. Из 6-ти выявленных генотипов 4 были уникальны для данной популяции, но, как и в других популяциях, один генотип был «мажорным» и также уникальным, что может свидетельствовать о генетической специализации патогена к данному растению-хозяину. Генетическое разнообразие патогена обусловлено, скорее всего, генетическим разнообразием популяции сорняка.

Другая популяция С. яаЧхт из Н крогтит (ЗН>У), использованная в данной работе, была изучена методом ЯАРО с помощью одного праймера. Полученные данные также свидетельствуют о большом внутрипопуляционном разнообразии, и позволяют предположить существование рекомбинантных генотипов.

Структура популяций С. 5айЧти по распространению аллелей типов спаривания

Для С БаНут нет четких доказательств существования полового процесса в природе. Представляло интерес изучить распространение типов спаривания этого гри-

структуре генома, чем «пшеничным».

— Пшеница (7Т+4Т+1Т) в

{

гЧ

—i 129 1

___ Пшеница 7Т Р

——— Ячмень РН С 2045

Ячмень (НЭ-НХ) В

129 1

Ячмень 408Н А

ч

Ячмень КН О Дик ячмень НМУ М

ба в природных популяциях, что могло бы косвенно свидетельствовать о существовании полового процесса. С этой целью была изучена структура 5 популяций С sativus, выделенных из листьев культурного ячменя (популяции Lb и Ad), и семян пшеницы (популяция Lk), произрастающих в Ленинградской обл., а также из листьев культурного (Кг) и дикорастущего ячменя (3HW), собранных в Краснодарском крае, по типам спаривания.

Три популяции из Ленинградской обл. отличались высокой фертильностью (8090% удачных скрещиваний). Во всех трех популяциях преобладал (+) тип спаривания. Для популяций Lk и Ad статистически достоверно соотношение (+) и (-) типов спаривания как 1: 1 (Р=0,1-0,25), так и 2:1 (Р=0,50-0,75). Расщепление типов спаривания в популяции Lb достоверно отличается от 1:1 (%2 = 8.33). и составляет 2(+):1(-) (Р=0,1-0,25) или 3(+):1(-) (Р=0,45-0,75). Популяция из культурного ячменя, собранная в Краснодарском крае, отличалась низкой фертильностью (23%) и поэтому выяснить распределение типов спаривания в этой популяции не удалось. В популяции, выделенной из дикорастущего ячменя, соотношение типов спаривания соответствует как 1(+): 2(-) (х2 = 0.02) с преобладанием типа спаривания (-), так и 1:1 (%2 = 2.13).

Обнаружение в популяциях С sativus изолятов с обоими типами спаривания в соотношении 1:1 позволяет предполагать панмиксную природу этих популяций, тогда как соотношения, отличные от 1:1 говорят в пользу клоновой структуры популяций патогена.

Глава 5. Изучение генетического потенциала изменчивости признака вирулентности, выявляемого у фитопатогенных грибов при половой рекомбинации

Скорость и направленность микроэволюционных процессов, ведущих к специализации фитопатогенных грибов, определяются их генетическим потенциалом в освоении новых пищевых субстратов, который может быть вскрыт путем изучения генетической детерминации признаков вирулентности.

Генетическую детерминацию признака вирулентности изучили у двух видов грибов, различающихся по степени специализации к растению-хозяину: узко специализированного гриба P. teres f. sp. teres к ячменю и широко специализированного С. sativus к основным его хозяевам - ячменю и пшенице.

5.1. Наследование вирулентности Pyrenophora teres f. sp. teres к ячменю

Генетику вирулентности Р teres к 9 образцам ячменя с известными генами устойчивости изучали на материале аскоспорового (гаплоидного) потомства скрещиваний D (181-6 х А-80) и F (Н-22 х 92-179/8). Суммарные результаты расщеплений по вирулентности приведены в табл.10.

В скрещивании D оба родителя, 181-6 и А-80, были авирулентны к сорту Diamond. Полученное в этом скрещивании расщепление по вирулентности 3:1 (здесь и далее дается соотношение авирулентные : вирулентные) свидетельствует о наличии различий между двумя родительскими изолятами по двум генам авирулентности, или иначе говоря, моногенной детерминации вирулентности для каждого родителя.

Результаты расщепления 3-х беккроссов по вирулентности к этому сорту не противоречат первоначальному предположению о дигенном наследовании вирулентности. Согласно типам расщепления признака здесь и далее, если не оговорено особо, мы считаем (согласно теории Флора), что ген, детерминирующий вирулентность, имеет два аллельных состояния, из которых доминантная аллель А определяет авирулент-

ность, а рецессивная аллель а - вирулентность гриба к образцу ячменя с конкретным геном устойчивости.

В потомстве от скрещивания F (вирулентный х авирулентный) получено расщепление 32:34, что соответствует отношению 1:1 и дает основание предположить моногенное наследование вирулентности для изолята 92-179/8. В двух последующих скрещиваниях - беккроссе (FBI) между авирулентным потомком и авирулентным родителем и сибкроссе (FS4) между двумя авирулентными потомками ожидали получить только авирулентное к сорту Diamond потомство, поскольку скрещивания считали гомозиготными по аллелю авирулентности. В потомстве скрещивания FBI (F-69 х 92179/8) было получено фактическое расщепление потомков 20а : 7в, от скрещивания FS4 (F-74 х F-4) - 8а : Зв. Выщепление вирулентных изолятов в потомстве от скрещивания авирулентных изолятов показывает, что родители имеют различные гены авирулентности к сорту Diamond. Фактические отношения 20:7 и 8:3 соответствуют теоретическому 3:1, что ожидается при расщеплении по двум независимым генам авирулентности у гаплоидного гриба. В таком случае можно интерпретировать расщепление в потомстве скрещивания F 32:34, как 7:9 (%2 = 0.60), соответствующее наличию четырех генов, ответственных за вирулентность.

Такое расщепление может быть либо результатом комплементарного действия двух пар генов, либо супрессии двух генов авирулентности двумя генами-супрессорами. Обе эти гипотезы не противоречат данным расщепления вирулентности в скрещиваниях FBI и FS4 между авирулентными изолятами, которое соответствует 3:1. Мы считаем более вероятным объяснением полученных результатов участие генов-супрессоров в детерминации признака вирулентности патогена. Подобные результаты - расщепление по генетическим факторам, эпистатичным признаку авирулентности, известны для возбудителя болезни риса гриба Magnaporthe grísea (Leung et al., 1988; Lau et al., 1993). Авторы считают, что каждому гену авирулентности у этого патогена соответствует ген-супрессор.

Расщепление по вирулентности к образцу к-8755 в потомстве скрещиваний D и F между авирулентными родителями было 7'1, что соответствует расщеплению по трем независимым генам авирулентности. Расщепления в беккроссах и сибкроссах скрещиваний D и F подтвердили дигенное наследование вирулентности к этому образцу у изолятов 181-6 и Н-22 и моногенное у изолятов А-80 и 92-179/8.

В скрещивании D оба родителя, 181-6 и А-80, были авирулентны к образцу к-21849. В потомстве получено 46 авирулентных и 15 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 3:1 и свидетельствует о наличии двух разных генов авирулентности - по одному в каждом родительском изоляте. В потомстве 4-х беккроссов между авирулентным родителем 181-6 и вирулентными потомками обнаружены ави-рулентные и вирулентные изоляты примерно в отношении 1:1, что подтверждает моногенное наследование авирулентности у изолята 181-6. В скрещивании F родители Н-22 и 92-179/8 были авирулентными к к-21849. Потомство скрещивания F состояло из 87 авирулентных и 2 вирулентных изолятов, что согласуется с ожидаемыми результатами расщепления по четырем независимым генам авирулентности (15:1). Результаты фактического расщепления по вирулентности (17:11) в потомстве беккросса между двумя авирулентными родителями свидетельствуют о наличии одного гена авирулентности у изолята 92-179/8. Следовательно, у второго родителя скрещивания F, изолята Н-22, можно предположить наличие трех генов авирулентности.

Таблица 10. Расщепление по вирулентности (авирулентные : вирулентные) гибридного мейотического потомства двух скрещиваний Pyrenophora teres f. sp. teres к набору сортов и образцов ячменя с известными генотипами устойчивости (табл.1)

Комбинация скрещивания Сорта ячменя

Diamond к- 8755 к-21849 CI9819 CI4922 Haibin CI9825 С15401 к-8721

D 181-6 х А-80

181-6 а а а а в в а a в

А-80 а а а а* а а а a a

ф р (а в) 20 7 647 46 15 29 22 5623 39 25 4119 49 19 16.37

тор 3 1 71 3 1 1 1 3.1 11 31 3 1 1:3

уг * 0.01 0 45 0 01 0.96 071 3.06 1 42 0.32 0.76

F Н-22 х 92-179/8

Н-22 в а а а в в а в в

92-179/8 а а а а а а а a a

ФР 32 34 78 10 87 2 82 5 40 25 20 70 87 2 18 65 40 39

то.р. 1 1 7 1 15 1 15.1 1.1 1.3 15 1 1:3 1 1

х2' 0.06 0 10 2 49 0 03 3.46 0.37 2 49 0.10 0.01

Обозначения ф р - фактическое расщепление, тор - теоретически ожидаемое расщепление, а -авирулентный, в - вирулентный, * - авирулентный фенотип обусловлен неспособностью аномальных конидий изолята А-80 проникать в ткань растения-хозяина. При значении у} меньше 3 84 разница фактического и теоретического соотношения недостоверна. (Р 20.05).

В скрещивании D оба родителя, 181-6 и А-80 были авирулентны к CI 9819. Их потомство состояло из 29 авирулентных и 22 вирулентных изолятов, что соответствует отношению 1:1 или моногенному наследованию. Однако в связи с авирулентностью обоих родителей данная гипотеза, на первый взгляд, не может быть принята. В двух беккроссах между авирулентным родителем 181-6 и вирулентными потомками получено расщепление по вирулентности в отношении 1:1. Поэтому, мы предположили, что родитель 181-6 имеет доминантную аллель гена авирулентности, и в таком случае второй родитель А-80 должен иметь рецессивную аллель этого гена и, соответственно, отличаться вирулентностью к CI 9819. Авирулентность изолята А-80, наблюдаемая к образцу CI 9819, вероятно, является результатом маскирующего влияния мутации формы конидий. Следовательно, возможно предположить, что изолят А-80 несет рецессивную аллель гена авирулентности.

В потомстве скрещивания F между двумя авирулентными к CI 9819 изолятами было 82 авирулентных и 5 вирулентных изолятов. Отношение 15:1 соответствует расщеплению по четырем независимым генам авирулентности. Отношение авирулентных к вирулентным изолятам в потомстве сибкросса между случайно выбранными авирулентными изолятами было 15:1 (фактическое 15:2), что также соответствует наличию четырех независимых генов авирулентности.

В скрещивании D между вирулентным (181-6) и авирулентным (А-80) к CI 4922 изолятами получено фактическое расщепление 56:23, что соответствует расщеплению 3:1 по двум независимым генам. Результаты расщеплений в беккроссах не противоречат этой гипотезе.

В скрещивании F между вирулентным и авирулентным к образцу CI 4922 родителями получено 40 авирулентных и 25 вирулентных потомков, что соответствует моногенному расщеплению 1:1 (табл.10).

В скрещивании D родители различались по вирулентности к сорту Harbin. Соотношение в потомстве 39 авирулентных и 25 вирулентных соответствовало расщеплению 1:1 или моногенному наследованию у изолята А-80.

В скрещивании F между вирулентным и авирулентным к сорту Harbin родителями получено 20 авирулентных и 70 вирулентных потомков, что соответствует отношению 1:3. Для объяснения этого типа расщепления следует предположить либо комплементацию двух генов авирулентности, либо существование одного гена авиру-лентности и одного гена-супрессора. Выщепление авирулентного потомства в двух сибкроссах между двумя вирулентными изолятами (фактическое 1:3 и 2:18) подтверждает обе гипотезы. Однако возможно и третье объяснение необычному расщеплению по авирулентности (13) - это наличие рецессивных генов авирулентности. В таком случае фенотип авирулентности будет проявляться у изолятов с генотипом ala2 при инокуляции растений, как с доминантным, так и рецессивным наследованием устойчивости. Для выяснения характера взаимоотношения патогена и растения хозяина необходимо проведение гибридологического анализа устойчивости растений с использованием родительских изолятов, при скрещивании которых получено расщепление 1:3.

В скрещивании D родители были авирулентны к CI 9825. Потомство состояло из 41 авирулентного и 19 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 3:1 или дигенному наследованию (по одному гену авирулентности в каждом родителе).

В скрещивании F родители также были авирулентны к. CI 9825. Потомство этого скрещивания состояло из 87 авирулентных и 2 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 15:1 или наследованию по четырем независимым генам.

В скрещивании D родители были авирулентны к CI 5401. Потомство состояло из 49 авирулентных и 19 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 3:1 или дигенному наследованию. У каждого родительского изолята предполагается наличие одного гена авирулентности.

В скрещивании F родители различались по вирулентности к образцу CI 5401. Потомство состояло из 18 авирулентных и 65 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 1:3. Данное расщепление может быть как результатом комплементации двух генов авирулентности, так и существования одного гена авирулентности и одного гена-супрессора. Выщепление авирулентных изолятов в потомстве двух вирулентных родителей одного сибкросса (14:5) подтверждает обе гипотезы.

В скрещивании D один родитель (181-6) был вирулентным, другой (А-80) - авирулентным к образцу к-8721. Потомство состояло из 16 авирулентных и 37 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 1:3. Модели наследования такие же, как к сорту Harbin и образцу CI5401.

В скрещивании F один родитель (Н-22) был вирулентным, тогда как другой (92179/8) - авирулентным к образцу к-8721. Потомство состояло из 40 авирулентных и 39 вирулентных, что соответствует расщеплению 1:1 или моногенному наследованию. В двух скрещиваниях (беккросс и сибкросс) между вирулентным и авирулентным изолятами получено вирулентное и авирулентное потомство в отношении 1:1 (фактическое расщепление 19:11 и 6:7, соответственно), что подтверждает предложенную модель наследования.

Таким образом, показано как простое (моногенное и дигенное), так и сложное (3-4 гена) наследование признака авирулентности гриба Р teres f. sp. teres к образцам ячменя.

Выявление идентичных генов авирулентности у изолятов P. teres f. sp. leres к различным сортам ячменя

Сравнение генов авирулентности к различным образцам ячменя на их идентичность позволяет также оценить генетическое разнообразие образцов по признаку устойчивости. Частично результаты (фактические расщепления по вирулентности к нескольким парам образцов ячменя в потомстве скрещиваний изолятов Р teres f. sp. teres) представлены в таблице 11.

Таблица 11 . Выявление генетического разнообразия устойчивости ячменя __с использованием аскоспорового потомства P. teres_

Сорта и генотипы устойчивости Родительские изоляты Число генов авирулентности к сорту Распределение фототипических классов по реакции сравниваемых образцов ячменя к аскоспоровым изолягам X2 Примечание

а/а а/в в/а в/в

С14922 Harbin R1 R1 8 ах x 181-6 2 1 26* 2** 0 0 12 1 11 1 0.22 Ген А1 комше-мекга-ренгену в обоих сортах

CI 9819 CI9825 R1 R1R2 181-6 x A-80 1 2 18* 2** 0 0 7 1 5 1 1.46

CI9819 к-21849 R1 R1R2 1 2 26* 2** 0 0 13 1 12 1 0.99

CI5401 CI9825 R1R2 R1R3 2 2 20* 5** 4 1 8 1 3 1 3 62 -«-

к-21849 CI9825 R1R2 R1R3 2 2 18* 5** 1 1 4 1 6 1 3.50

к-8755 Diamond R1R3R4 R1R2 3 2 14* 11** 14 3 0 1 6 1 2.05

CI5401 CI9819 R1 R1R2R3R4 H-22 x 92-179/8 1+S.2 4 17* 8** 0 0 57 22 3 2 0 72

CI5401 CI 9825 R1 R1R2R3R4 1+S,,2 4 21* 8** 0 0 58 21 3 3 0.13

Harbin CI5401 R1 R2 l+Sl.2 1+S..2 12* 1** 10 1 10 1 57 5 0 32 Общий 1ен-супрессор у родительских изолятов к 2-м разным генам авирулентности

CI5401 Diamond R1 R2R3 l+su 2+S3+S12 9* 5** 5 3 12 9 31 15 1 71

Harbin Diamond R1 R2R3 1+S,,2 2+S3+ Sl.2 И* 5** 5 3 18 9 31 15 0 27

R - ген устойчивости, А - ген авирулентности, S - ген-супрессор, S) 2 - ген-супрессор к двум генам авирулентности; *- фактические расщепления; ** - теоретически ожидаемые расщепления. Одинаковые обозначения генов не означают их тождественности и могут рассматриваться только в пределах одной пары сравниваемых образцов.

К четырем парам образцов (CI 4922 - Harbin, CI 5401 - CI 9825, CI 9819 - CI 9825 и к-8755 - Diamond), имеющих общие гены устойчивости (Rptlb, Pt2 и Pt6) (Mode, Schaller, 1958; Афанасенко, 1996), были выявлены гены авирулентности, общие к образцам, несущим один и тот же ген устойчивости. Эти результаты можно считать подтверждением комплементарности генов авирулентности и устойчивости в патосистеме Hordeum vulgare - Р teres f. sp. teres. Выявлен один общий ген авирулентности к образцам CI 9819, CI 9825, к-8755 и к-21849. Это предположение под-

твердилось «перекрестным» анализом на идентичность генов авирулентности к парам образцов CI 9819 - к-21849 и к-21849 - к-8755 (табл.11). Наряду с этим, на примерах трех пар образцов, не имеющих по литературным данным общих генов устойчивости, показано, что к ним отсутствуют общие гены авирулентности у изученных родительских изолятов патогена.

Сравнительный анализ генов авирулентности P. teres f. sp. teres, эпистатируе-мых генами-супрессорами, выявленными в потомстве F скрещивания к 3-м образцам ячменя, позволил получить интересный результат - общность одного гена-супрессора по отношению к трем различным генам авирулентности (к образцу CI 5401 и сортам Harbin и Diamond). Данный факт позволил нам выдвинуть гипотезу о существовании у Р teres как специфичных, так и неспецифичных по отношению к генам авирулентности генов-супрессоров, которые могут вносить существенный вклад в рекомбинаци-онную изменчивость признака вирулентности, а также повышать вероятность образования редких высоковирулентных рас патогена в результате мутаций генов-супрессоров. На основании предложенных генотипов патогена и проведенного анализа на идентичность генов можно предполагать существование более 30 генов авирулентности и 5 генов-супрессоров у изолятов Р teres f. sp. teres к образцам ячменя.

Комплементарность генов устойчивости и вирулентности в патосистеме Hordeum vulgare-Pyrenophora teres

Для доказательства существования взаимодействий в патосистеме ячмень - возбудитель сетчатой пятнистости по типу «ген-на-ген» был проведен генетический анализ устойчивости ячменя и вирулентности гриба Р teres с использованием одних и тех же изолятов патогена (частичные данные приведены в таблица 12).

Материалом исследования послужили новые источники устойчивости из Эфиопии - к-23874, к-19979 и Китая - к-15811 к аскоспоровым изолятам Р teres из скрещиваний Н-22 х 92-179/8 и 181-6 х А80.

Таблица12. Генетика взаимоотношений в патосистеме Р teres - Я vulgare

Наследование устойчивости к-23874 к различным изолятам P. teres Наследование вирулентности P. teres к образцу ячменя к-23874

Комбинация скрещивания Изо-лят Расщепление по устойчивости факт итеор ожид (У В) Х2 Комбинация скрещивания Образец ячменя Расщепление по вирулентности факт и теор ожид (А В) Х2

к-23874 х Пиркка d 8-3 61 29 3 1 2 40 d9-l х d9-4 с-23874 21 6 3 : 1 010

d 8-4 60 30 3 1 3 30 181-6xd8-4 15 5 3 1 000

d9- 1 60 30 3 1 3 30 181-6xd8-3 11 4 3 . 1 0.01

d9-4 73 17 3 1 1 78

181-6 75 15 3 1 3 30

Несмотря на то, что наследование устойчивости у образца ячменя к-23874 к каждому из использованных для инокуляции штаммов было моногенным, параллельное изучение наследования признака вирулентности у этих же штаммов, показало наличие, по крайне мере, двух генов устойчивости у образца к-23874. Наличие дигенного расщепления по вирулентности к этому образцу в аскоспоровом потомстве от скрещивания штамма 181-6 и штаммов d8-4 и d8-3 свидетельствует о том, что в каждом из этих штаммов авирулентность детерминирована одним геном, и, что гены авирулентности у штаммов 181-6 и d8-4, а также у 181-6 и d8-3 различны. Следовательно, и ус-

тойчивость к этим штаммам контролируется разными генами. Фактические данные расщепления по устойчивости не противоречат этому заключению: однотипное расщепление к штаммам d8-3, d8-4 и d9-l (61:29; 60:30 и 60:30, соответственно) свидетельствует об одинаковом генетическом контроле устойчивости к ним у образца к-23874. В то же время расщепление по устойчивости этих же гибридных растений к штаммам d9-4 и 181-6 (73:17 и 75:15) свидетельствует об иных генетических факторах устойчивости. Таким образом, с учетом генетической характеристики вирулентности штаммов использованных в генетическом анализе устойчивости у образца к-23874 можно констатировать наличие, по крайней мере, двух генов устойчивости.

Таким образом, параллельный гибридологический анализ устойчивости 3-х образцов ячменя и вирулентности паразита, с использованием одних и тех же штаммов гриба продемонстрировал комплементарность генетических систем устойчивости хозяина и вирулентности паразита.

5.2. Наследование вирулентности С. sativus к сортам ячменя

Материалом исследований служило аскоспоровое потомства двух скрещиваний изолятов С sativus ND90PR х URY98-Gamba 30, относящихся к патотипам 2 и 1 (Valjevec-Gratian, Steffenson, 1997) и Lb7 х 7Т-48. Оценивали вирулентность потомства к американскому сорту Bowman, линии NDB112 и 9 образцам коллекции ВИР, отобранным как новые источники устойчивости к С sativus. Результаты расщепления по вирулентности потомства скрещивания ND90PRxURY98-Gamba 30 приведены в таблица. 13.

В скрещивании ND90PRxURY98-Gamba30 родители различались по вирулентности к сорту Bowman. Потомство состояло из 45 авирулентных и 44 вирулентных изолятов, что соответствует расщеплению 1:1, или моногенному наследованию вирулентности. Обозначим ген авирулентности к этому сорту Ahvl (avirulence to Hordeum vulgare).

К образцу NDB112 оба родительских изолята были авирулентны. Фактическое расщепление по вирулентности 84а : 9в, соответствующее теоретическому расщеплению 7:1, указывает на участие 3-х генов в детерминации признака. В связи с тем, что в родословной сорта Bowman имеется линия NDB112, один из генов авирулентности к NDB112 будет Ahvl, а два других гена обозначим Ahv2 и Ahv3.

Таблица 13. Наследование вирулентности к 11 образцам ячменя в потомстве от скре-_щивания ND90PR х URY98-Gamba30 изолятов С sativus_

Родительский изолят Bowman 1 NDB112 1 к-29438 к-30453 к-29636 к-30501 к-30594 к-29830 ^ к-30597 к-27557 к-30452

1 в а а а а а а а а а а

2 а а в в а в а а а а/в в

Фр (а в) 45 44 84 9 65 28 63 36 68 20 2445 92 10 53 30 61-36 54-26 56 39

То 1:1 7:1 3:1 5:3 3:1 7:9 7:1 5:3 5:3 5:3 1:1

X2 (PS) 05) 0 01 0 67 0 29 0 05 0 12 2 26 0 67 0 067 0.01 0 88 3 04

Характер расщепления вирулентности С к 9 новым источникам устойчи-

вости был различным. Только к образцу к-30452 показано моногенное наследование вирулентности, к образцу к-30594 выявлено три гена (так же, как к сорту КОВ112). К образцам к-30453, к-29830, к-30597 и к-27557 полученное расщепление по вирулентности соответствовало отношению 5а: Зв, что можно объяснить следующей моделью наследования: два доминантных гена авирулентности и один доминантный ген-30

супрессор.

Расщепление к образцу к-30501 мы расценили как 7а:9в, что объясняется моделью 4-х генного наследования: два доминантных гена авирулентности и два доминантных гена-супрессора. Расщепление к образцу к-29636 - 68а:20в соответствует 3:1, что свидетельствует о наличии 2-х генов авирулентности - по одному в каждом родительском изоляте.

Генетический контроль вирулентности С sativus к ячменю изучали также на материале другого скрещивания - Lb-7 х 7Т48. Результаты расщепления вирулентности в потомстве скрещивания Lb-7 х 7Т-48 к сортам Bowman и NDB112 не отличаются от результатов скрещивания ND90PR х URY98-Gamba30.

Выявление идентичных генов авирулентности у изолятов С. sativus к различным сортам ячменя

Для выяснения вопроса, идентичны ли некоторые гены, контролирующие вирулентность к разным образцам ячменя, мы провели анализ расщепления по фенотипам вирулентности аскоспорового потомства от скрещивания ND90PR х URY98-Gamba30 к парам сравниваемых сортов и образцов (табл.14). При сравнении вирулентности потомства к сорту Bowman и образцу NDB112 расщепление фенотипов было 30:0:30:4 (табл.14), что соответствовало модели расщепления 4:0:3:1 или наличию одного гена авирулентности, общего к обоим образцам (Ahvl).

Анализ на сцепление генов, ответственных за вирулентность к Bowman и к-30452 показал, что полученное фактическое расщепление фенотипических классов 22:13:19:15 (табл.14) достоверно не отличается от 1:1:1:1, что объясняется наличием двух независимых генов авирулентности. Ген, ответственный за авирулентность к к-30452, не идентичен гену Ahvl, но, в то же время, он контролирует авирулентность к NDB112 (фактическое расщепление по фенотипам вирулентности к паре образцов к-30452 и NDB112 - 41:0:25:6 (табл.14) соответствует модели 4:0:3:1 - наличию одного общего гена авирулентности к обоим образцам). Предположим, что это ген Ahv2. При сравнении расщепления фенотипов потомства к образцам к-30452 и к-29438 полученное соотношение 36:0:13:20 (табл.14.) соответствует модели наследования 2:0:1:1, предполагающей наличие общего гена авирулентности (Ahv2) к обоим образцам. Второй ген авирулентности обозначим X.

Сравнение фенотипов вирулентности к образцам к-30452 и к-29636 показало отсутствие у родительских изолятов общего гена авирулентности к обоим сортам или, другими словами, отсутствие общего гена устойчивости у этих образцов. Таким образом, гены авирулентности к сорту к-29636 отличны от Ahv2 . При сравнении вирулентности к образцам к-29438 (два гена Ahv2, X) и к-29636 получено расщепление 37:5:11:10, что соответствует модели 5:1:1:1, то есть наличию общего гена авирулентности к обоим образцам. Этим геном должен быть ген X. Тогда гены, отвечающие за вирулентность к образцу к-29636 - X и Y.

Не выявлено общих генов авирулентности к сорту Bowman и образцам к-29438 и к-29636 (модель расщепления 3:1:3:1).

Сравнение фенотипов вирулентности к образцам к-29438 (гены Ahv2 и X) и NDB112 (гены AhvlAhv2Ahv3) (фактическое расщепление 41:0:13:7) показало наличие двух общих генов авирулентности к обоим образцам (модель 6:0:1:1). Один из этих генов - Ahv2, а другой Ahvl или Ahv3. Поскольку ранее показано, что ген Ahvl

не контролирует авирулентность к образцу к-29438, то ген X логично обозначить как Ahv 3. Таким образом, гены Ahv2, Ahv3 детерминируют авирулентность к образцу к-29438.

Сравнение фенотипов вирулентности к образцам к-29636 (гены X и Y) и NDB112 (гены Ahvl, Ahv2, Ahv3) (фактическое расщепление 53:3:13:1, табл.14) показало наличие одного общего гена авирулентности к обоим образцам (модель 11:1:3:1). Поскольку ген X является, как показано ранее, геном Ahv3, то именно он является общим геном авирулентности для обоих образцов. Ген авирулентности У отличен от других генов авирулентности и обозначен нами как Ahv4. Таким образом, авирулентность к образцу к-29636 контролируется генами Ahv3 и Ahv4.

Мы не сравниваем на идентичность гены, участвующие в сложных моделях наследования (5:3, 3:5, табл.13). Однако представляет интерес узнать, какие гены авирулентности специфичны к образцу к-30594, к которому показано тригенное наследование авирулентности (табл.13). Сравнение расщеплений по фенотипу вирулентности к образцам Bowman - к-30594 и к-30452 - к-30594 (табл. 14) показало, что к образцу к-30594 имеются гены авирулентности Ahvl и Ahv2, обнаруженные ранее у Bowman и к-30452, соответственно. Третий ген авирулентности остается неизвестным.

Расщепление по фенотипам вирулентности к образцам к-29438 (гены Ahv2 и Ahv3) и к-30594 подтвердило наличие общего к ним гена авирулентности Ahv2 (табл.14). Расщепление фенотипов по вирулентности к образцам к-29636 (гены авирулентности Ahv3 и Ahv4) и к-30594 также свидетельствует о наличии общего гена авирулентности. Этим геном может быть Ahv3 или Ahv4. Но, поскольку расщепление по фенотипам вирулентности к к-30594 (Ahvl, Ahv2 и X) и NDB112 (Ahvl, Ahv2, Ahv3) соответствует модели 13:1:1:1, т.е. наличию двух общих генов авирулентности, которыми, очевидно, являются гены Ahvl и Ahv2 (но не Ahv3), то третьим геном авирулентности следует считать Ahv4.

Таким образом, мы обнаружили всего 4 гена авирулентности С sativus к одному сорту и 5 образцам ячменя, к которым было показано моно-, ди- и тригенное наследование вирулентности у родительских изолятов. Предполагаемые генотипы родительских изолятов: ND90PR - ahvlAhv2Ahv3ahv4 (патотип 1) HURY98-Gamba30 -Ahvlahv2ahv3Ahv4 (патотип 2).

Выявленный нами незначительный полиморфизм генов авирулентности С sativus к ячменю, возможно, объясняет наблюдаемую другими авторами малую гетерогенность признака вирулентности к ячменю в популяциях патогена (Левитин и др., 1985) и малую изменчивость признака устойчивости ячменя к этому патогену (Steffen-son, 2000).

5.3. Наследование вирулентности С. sativus к сортам пшеницы

Изучение генетической детерминации вирулентности к пшенице проводили также на материале аскоспорового потомства 2-х скрещиваний: ND90PR х URY98-Gamba30 и Lb7 х 7Т-48. Растительным материалом служили устойчивые сорт Bohout 6 и линия 181-5, а также 6 восприимчивых коммерческих сортов, к которым родительские изоляты различались по вирулентности.

Результаты расщепления по вирулентности к сортам пшеницы в потомстве скрещивания ND90PR х URY98-Gamba30 приведены в табл. 15. К 6 сортам пшеницы расщепление по вирулентности было 1а:3в, к сорту Bohout 6 - 1а:7в и к сорту 181-5 -1а:1в. Тип расщепления 1а:3в в скрещиваниях вирулентного и авирулентного родите-

лей соответствует трем моделям наследования: (1) один доминантный ген авирулент-ности и один доминантный ген-супрессор; (2) два доминантных несцепленных гена авирулентности, взаимодействующих по типу комплементации; (3) два доминантных не сцепленных гена вирулентности или два рецессивных гена авирулентности. Фенотипы родителей по вирулентности к этим сортам пшеницы соответствуют предложенным моделям. В дальнейшем мы примем модель наличия 2-х рецессивных генов авирулентности для объяснения расщеплений по вирулентности 1:3 в потомстве С. sativus к пшенице.

Расщепление к сорту Bohout 6 (1а:7в) соответствует модели наследования с участием трех рецессивных генов авирулентности (табл.15). Расщепление 1:1 к линии 181-5 при скрещивании двух авирулентных родителей объяснить не удается. Нами предложена другая модель расщепления 5а:3в, которая будет рассмотрена ниже. Результаты расщепления по вирулентности к пшенице потомства другого скрещивания Lb7 х 7Т48 оказались сходными.

Исходя из выше изложенного мы предполагаем, что родительский изолят URY98-Gamba30 (авирулентный к 6 сортам) имеет две экспрессирующиеся рецессивные аллели atal и ata2 (ata - авирулентность на Triticum aesíivum).

Таблица 14. Выявление генетического разнообразия устойчивости сортов ячменя с

Copia и leHoraiibi устойчивости Родительские изоля-ты Общее число генов авирулентности к каждому сорту Фактическое и теоретическое распределение феноти-пических классов по реакции сравниваемых образцов ячменя к аскоспоровым изолятам X2 Примечание

а/а а/в в/а в/в

Bowman NDB112 R1 R1R2R3 ND90PR х URY98-Gamba 30 1 3 30* 4** 0 0 30 3 4 1 3 60 ГенА1 компле-мен-т^енгенуК1 в обоих сортах

к-30452 R1 «i 1 36 0 13 20 1.56 1(

к-29438 R1R2 2 2 0 1 1

к-29438 R1R2 2 37 5 11 10 5.44

к-29636 R1R3 2 5 1 1 1

к-30452 R1 1 41 0 25 6 176 ((

NDB112 R1R2R3 3 4 0 3 1

к-29636 R1R4 2 53 3 13 1 0 73 й

NDB112 R1R2R3 3 11 1 3 1

Bowman R1 tt 1 31 0 34 5 4.35 „

к-30594 R1R2R4 3 4 0 3 1

Bowman к-30452 R1 R2 1 1 22 1 13 1 19 1 15 1 2 83 Нет общих генов устойчиво-сги в обоих сортах

Гены А1 и А2

к-29438 NDB112 R1R2 R1R2R3 2 3 41 6 0 0 13 1 7 1 4 32 комплементарны генам R1 и Я2 в обоих сортах

к-30594 NDB112 R1R2R4 R1R2R3 3 3 66 13 6 1 6 1 2 1 2.22 1

Обозначения' Я - доминантная аллель гена устойчивости, А ности - фактические расщепления; **-тео] значения генов означают их тождественносп

- доминантная аллель гена авирулент-

йюПЯГОиемяетжвщвяления Одинаковые обо-

"С НАЦИОНАЛЬНАЯ ' БИБЛИОТЕКА

СПетчЯЦгрг i зз

«*т

t

-■J

К линии 181-5, имеющей 1 ген устойчивости к С гагпдо (М1кЬаНоуа ег а!., 2000), оба родителя были авирулентны. Для объяснения расщепления, полученного в потомстве этих изолятов к линии 181-5, подходит модель 5а:3в (х2=1.13): два доминантных гена авирулентности и один доминантный ген-супрессор. Однако эта модель не может быть принята, поскольку при сравнении расщеплений по вирулентности к парам 181-5 и любому из 6 восприимчивых сортов пшеницы было показано наличие 2-х генов, детерминирующих вирулентность одновременно к обоим сортам. Таким образом, в состав 3-х генов, детерминирующих вирулентность к линии 181-5, должны входить 2 рецессивных гена авирулентности (а1а1 и аЫ2). Мы предлагаем модель, объясняющую расщепление к линии 181-5 (5:3) и удовлетворяющую этим условиям: два рецессивных гена авирулентности (а1а1 и а1а2) и один доминантный ген авирулентности (А1аЗ), эпистатирующий рецессивные гены авирулентности. Известный ген устойчивости в линии пшеницы 181-5. должен быть комплементарен гипотетическому гену А1аЗ.

Таблица 15. Результаты расщепления по вирулентности (авирулентные : вирулентные = а : в) среди потомства от скрещивания Ы090РЯ х 1ЖУ98-ОатЬаЗО изолятов С м__Нун5 к сортам пшеницы_

Сорта пшеницы

Родительские изоля-ты 181-5 Срагов-1 екая 29 Lusitano Дельта Бурятская ост. Харьковская 22 Чебаркул ьская Bohout 6

ND90PR а в в в в в в в

URY98-Gamba30 а а а а а а а а

а'в 1913 8 22 10 20 8-22 721 921 623 2 22

Модель 11 1 3 1 3 1 3 1-3 1.3 1.3 1 7

у2(Р20 05) 1 13 0.04 1.11 0.13 0.0 041 0.4 0 38

Таким образом, мы обнаружили 4 гена авирулентности С sativus к пшенице, из которых 3 гена рецессивные (atal, ata2, ata4) и один ген доминантный (Ata3). Рецессивные гены авирулентности atal и ata2, видимо, видоспецифичны, a ata4 специфичен к соргу BohoutG.

Как было показано выше, вирулентность изолятов С sativus к ячменю может контролироваться одним, двумя или тремя доминантными генами авирулентности или более сложным способом с участием генов-супрессоров. Совсем иная картина расщеплений по вирулентности выявлена к 8 сортам пшеницы. В большинстве случаев было получено расщепление 1а:3в, что соответствует участию в контроле признака вирулентности двух рецессивных генов авирулентности. Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о различных механизмах генетического контроля вирулентности С sativus к двум видам растений-хозяев - ячменю и пшенице.

Глава 6. Физиологическая и молекулярно-генетическая специализация грибов

на примере С. sativus

Целью нашего исследования было изучить эволюционный потенциал гриба С sativus, т.е. возможность патогена эволюционировать в направлении образования специализированных форм. В задачи данного исследования входило (1) изучение физиологической специализации С sativus к разным видам злаков, (2) изучение репродук-

тивных барьеров между изолятами, обитающими на разных растениях-хозяевах, (3) изучение возможной роли повторяющейся ДНК в хозяин-специфичности С sativus, (4) поиск изменений в генетической структуре популяций патогена, коррелирующих с их специализацией

О физиологической специализации гриба судили по уровню вирулентности изолятов к «своим» (тем видам растений, на которых они обитали) и иным видам растений-хозяев. Для этого изучали вирулентность изолятов, выделенных из разных видов растений-хозяев (ячменя, пшеницы, овса и дикорастущего ячменя - Я Ieporinum), по отношению к другим "не своим" видам растений-хозяев (ячменю, пшенице, ржи, овсу и ближайшему родственнику культурного ячменя - Н vulgare vor spontaneum). В работе использовали моноконидиальные штаммы из популяций, обитающих на различных видах растений-хозяев (табл.1). Провели оценку вирулентности этих штаммов к 23 сортам Avena sativa, 13 сортам Я vulgare и 16 сортам и линиям Т aestivum, а также 150 автофертильным линиям S. cereale (любезно предоставленным A.B. Войло-ковым) и 22 линиям Н vulgare var spontaneum (из коллекции генбанка Гатерслебена, Германия).

Уровень вирулентности изолятов, обитающих на разных растениях-хозяевах, оценивали как долю, выраженную в процентах, сорт-изолят совместимых комбинаций между изолятами, обитающими на определенном виде растения-хозяина, («овсяными», «ячменными», «пшеничными» и из дикорастущего ячменя Я leporinum) и конкретным видом растения-хозяина, представленным набором случайно выбранных коллекционных и районированных сортов. Графическое выражение результатов оценки уровня вирулентности представлено на рис.19. Достоверность различий в уровне вирулентности на определенном растении-хозяине между изолятами различного происхождения определяли по критерию Фишера.

■ оме

□ Hteporinun

Рис.19. Число совместимых комбинаций (%) для изолятов С. sativus, обитающих на разных видах растений-хозяев (по 4 столбика слева направо: изо-ляты из овса, ячменя, дикорастущего ячменя - Я leporinum и пшеницы) к разным видам растений-хозяев (по оси "X" - овес, рожь, пшеница, ячмень и Я. vulgare var spontaneum)

Таким образом, возбудитель темно-бурой пятнистости злаков гриб С «йшм проявляет физиологическую специализацию к ячменю и пшенице, которая выражается в большей вирулентности «ячменных» изолятов к ячменю и «пшеничных» изолятов к пшенице. Имеются в виду количественные различия в степени поражения растения, так как те и другие изоляты сохраняют способность заражать обоих хозяев. Для доказательства физиологической специализации изолятов, обитающих на дикорастущем ячмене, требуются дополнительные исследования вирулентности этих изолятов на своем хозяине - Я крогтит. Однако данные по распределению типов спаривания и обнаружению в популяции из дикорастущего ячменя большего по сравнению с популяциями из культурных злаков ДНК полиморфизма свидетельствуют о ее генетиче-

ской обособленности, что в свою очередь с большой вероятностью должно сопровождаться физиологической специализацией патогена к дикорастущему ячменю.

Как уже отмечалось выше (глава 3), у С sativus были клонированы повторы ДНК, один из которых, обозначенный С61, оказался связанным с патогенностью изолятов.

Различия между популяциями, выделенными из разных видов растений-хозяев, по изменчивости УП-ПЦР паттернов коррелировали с их происхождением по хозяину (глава 4). В целом эти данные подтверждают выдвинутую нами гипотезу, что физиологическая специализация к пшенице и ячменю сопровождается изменениями в структуре генома изолятов, что в свою очередь отражается на генетической структуре популяции. Молекулярно-генетичсская специализация выявлена также для изолятов, обитающих на дикорастущем ячмене (глава 4), что дает основание предполагать существование физиологической специализации этих изолятов.

Для изучения роли ДНК повторов С sativus в специализации этого патогена была создана клонотека видоспецифичных повторов ДНК. Из них были клонированы 2 ДНК повтора, один из них (рС5) оказался строго видоспецифичным и был использован для разработки ПЦР диагностики С. sativus (глава 3.). Другой (рС61) оказался нестрого видоспецифичным и отсутствовал у 10% тестированных методом дот-гибридизации природных изолятов гриба. Нами получены предварительные данные, что ДНК элемент рС61 обладает транспозонными свойствами. На ограниченном материале (40 изолятов) было изучено распределение копий этого ДНК элемента в природных изолятах в связи с их происхождением по растению-хозяину. Показано, что изоляты, выделенные из дикорастущих злаков (дикорастущий ячмень, пырей, трясунка, овсюг), характеризуются малым числом копий С61, тогда как среди изолятов, выделенных из культурных ячменя и пшеницы, а также из почвы (ячменного и пшеничного поля) наряду с «малокопийными» по С61 элементу встречаются «многокопий-ные» изоляты. Не было обнаружено четкой зависимости между наличием С61 элемента в изолятах гриба с их вирулентностью. Возможно, ДНК повтор С61 играет какую-то роль во взаимоотношениях патогена с культурными злаками по аналогии с известным ДНК повтором MGR у Magnaporthe grisea (Hamer, 1991).

Мы предполагаем, что обнаруженный полиморфизм популяций С sativus, выделенных из разных хозяев, представляет собой результат дивергенции на молекулярном уровне. Наиболее вероятным, на наш взгляд, механизмом такой дивергенции является селективный отбор генотипом растения-хозяина определенных генотипов патогена. Мономорфность грибных популяций в агроценозах вследствие отбора наиболее приспособленных к пищевому субстрату генотипов патогена отмечалась и ранее (например, Дьяков, 1998). Считается, что популяции патогена на культурных растениях состоят из высоко адаптивных рас.

Наши данные позволяют выдвинуть гипотезу, что мы наблюдаем процесс расо-образования, т.е. специализации к новому хозяину, который выражается в генетической дифференциации (изменении структуры генома) патогена. Это можно предполагать по отношению к культурным пшенице, ячменю и дикорастущему ячменю Я leporinum. Анализ вирулентности ряда изолятов, представляющих разные типы ДНК полиморфизма из разных популяций, а также результаты изучения физиологической специализации С sativus, подтверждают эту гипотезу.

Был проведен анализ фертильности и мейотической сегрегации 35 УП-ПЦР маркеров у гибридов между родственными (два изолята из дикорастущего ячменя) и неродственными изолятами (из пшеницы, дикорастущего ячменя и проса). Два «не-36

родственных» скрещивания (1Т2хХ17) и (1T2xHW32) характеризовались более низкой фертильностью (23,3 и 42,3 %) по сравнению с «родственным» скрещиванием (HW32xHW38), у которого выживаемость аскоспор составила 66,0%.У «неродственных» гибридов были выявлены отклонения в наследовании УП-ПЦР маркеров по типу 1:1, которые можно объяснить нарушениями в сегрегации хромосом во время мейоза. Данный факт может свидетельствовать о генетической дифференциации родительских изолятов, связанной с их различным происхождением по растению-хозяину. Вероятно, мы являемся свидетелями начального этапа дивергенции внутри вида С. sativus в сторону образования специализированных рас на культурных и дикорастущих злаках.

Выводы

1. Показана возможность использования метода сравнения спектров ДНК-маркеров, выявляемых в полимеразной цепной реакции с универсальными праймера-ми (УП-ПЦР), и установления гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации для молекулярной идентификации видов и внутривидовых специализированных форм грибов.

2. Показано, что два ранее установленных таксономических вида грибов P. teres и Р gramínea представляют один биологический вид и могут рассматриваться в качестве внутривидовых форм - f.sp. teres и. f. sp. gramínea Внутривидовые формы узкоспециализированного вида P. teres - f. sp. teres, f. sp. maculata и f. sp. gramínea, вызывающие различные симптомы заболеваний на ячмене, представляют собой дивергентные формы внутри одного биологического вида, поскольку различаются по структуре геномов, выявляемой методом УП-ПЦР и рестрикционного анализа рибДНК, и сохраняют гомологичность геномов.

3. УП-ПЦР анализом и блот-гибридизацией ПЦР продуктов показано, что представители рода Cochlíobolus - С. sativus, С. carbonum, С. victoriae, С heterostrophus и С cynodontís, различающиеся по степени специализации к растениям-хозяевам, представляют собой комплекс видов со сходной структурой и гомологичностью геномов. С sativus является предковым видом в эволюции грибов рода Cochlíobolus.

4. Различия по представленности клональной фракции и среднему генному разнообразию на локус в популяциях узкоспециализированных паразитов Р teres f. sp. teres, P. tritící-repentis и P avenae и широкоспециализированного паразита С sativus связаны с типом размножения. Обнаружено влияние вида растения-хозяина на структуру популяций С sativus по ДНК маркерам, которое выражается в преобладании в популяции клонов с определенными генотипами.

5. Возникновение новых вирулентных рас P. teres f. sp. teres при скрещивании авирулентных изолятов происходит в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих как гены вирулентности, так и гены-супрессоры, влияющие на их экспрессию. Выявленное соотношение типов спаривания в популяциях Р teres, соответствующее 1:1, свидетельствует о высокой вероятности появления новых рас паразита за счет половой рекомбинации.

6. Обнаружение в популяциях С. sativus обоих типов спаривания в соотношении как 1:1 так и 2:1 позволяет предположить возможность спорадически возникающей половой стадии в жизненном цикле гриба.

7. На основании генетического анализа вирулентности к образцам ячменя с известными генами устойчивости доказано существование взаимоотношений паразита и

хозяина в патосистеме Я. vulgare - P. teres f. sp. teres по типу ген-на-ген.

8. Показана возможность использования аскоспорового потомства изолятов Р teres f. sp. teres и С sativus для выявления идентичных генов устойчивости у растений-хозяев и комплементарных им генов авирулентности. Предложены модели расщепления по вирулентности в аскоспоровом потомстве патогенов к сортам растений-хозяев при наличии (или отсутствии) у них тождественных генов устойчивости, комплементарных генам авирулентности у родительских изолятов гриба,

9. Авирулентность изолятов Р teres f. sp. teres к каждому из 11 использованных в генетическом анализе образцов ячменя контролируется от 1 до 4 доминантными генами и 1 или 2 доминантными генами-супрессорами. Показано, что авирулентность к 9 образцам ячменя контролируется более чем 30 генами. Выявлено 3 гена-супрессора, из которых один ген можно считать неспецифичным, поскольку он эпистатировал 3 различных гена авирулентности к сортам Диамонд и Харбин и образцу CI 5401, а два других - специфичными, так как они соответствовали конкретным генам авирулентности к образцу к-8721 и сорту Диамонд. Высокое разнообразие генов авирулентности обусловлено существованием большого полиморфизма генотипов устойчивости растения-хозяина.

10. Вирулентность изолятов С sativus к каждому из 11 образцов ячменя и 8 образцов пшеницы, использованных в генетическом анализе, контролируется 1-3 генами- доминантными к ячменю и в большинстве случаев рецессивными к пшенице. Анализ на идентичность генов авирулентности выявил у изолятов С sativus по 4 различных гена авирулентности к 9 образцам ячменя и 8 образцам пшеницы. Низкое разнообразие генов авирулентности у С sativus обусловлено видоспецифичностью некоторых из них и малым полиморфизмом генотипов устойчивости растений-хозяев.

Практические рекомендации

1. Для идентификации видов фитопатогенных грибов разработан экспресс-метод молекулярной диагностики, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

2. Для использования в практической селекции предлагается ускоренный метод выявления генетического разнообразия устойчивости ячменя к P. teres и С. sativus и пшеницы к С sativus, основанный на расщеплении фенотипов (авирулентный /вирулентный) в потомстве гаплоидного гриба к паре сравниваемых сортов, которое зависит от количества генов в родительских изолятах, контролирующих вирулентность к каждому сорту, взаимодействия генов патогена и наличия генов устойчивости в анализируемых сортах, комплементарных генам авирулентности.

3. Коллекция ДНК образцов генетически охарактеризованных изолятов Р teres и С sativus с альтернативными признаками вирулентности может быть использована для картирования генов авирулентности.

Список основных научных трудов по теме диссертации

1 Левитин, М.М. Естественная и индуцированная изменчивость возбудителя сетчатой пятнистости ячменя / М.М Левитин, Г.С. Коновалова, Н.В Мироненко // Труды ВИЗР. Л., 1981. - С.56-63.

2. Левитин, М.М. Конкурентноспособность рас в популяциях Drechslern teres / М.М.

Левитин, О.С. Афанасенко, Н.В. Мироненко // Изменчивость фитопатогенных микроорганизмов. М.: Колос, 1983. - С.135-144.

3. Захаров, И. А. Гетерокариоз и проблемы структуры популяций грибов / И.А.За-

харов, Н.В. Мироненко // Миколог, и фитопатол. - 1983. - Т.17, вып.5. - С.414-424.

4. Мироненко, Н.В. Новые методы в генетике фитопатогенных грибов / Н.В. Миро-

ненко // Генетика. - 1987. - Т.23. - С.5-13.

5. Мироненко, Н.В. Методы молекулярной биологии и биотехнологии в селекции

растений на болезнеустойчивость / Н.В. Мироненко, H.H. Гусева // Сельскохоз. биол. - 1987. - Т. 11, №5 - С.87-90.

6. Мироненко, Н.В. Основы молекулярно-генетического различения изолятов и

видов фитопатогенных грибов / Н.В. Мироненко, С.А. Булат // Молекуляр. и генетич. механизмы взаимодейс. микроорганизмов с растениями. - Пущино,

1989. - С.168-174.

7. Булат, С.А. ДНК-полиморфизмы фитопатогенных грибов Pyrenophora teres

Drechsler и Pyrenophora graminea Ito and Kuribayashi / С.А. Булат, H.B. Мироненко II Генетика. - 1989. - T.25, №5. - C.838-850.

8. Булат, С.А. ДНК-полиморфизмы фитопатогенного гриба Pyrenophora tritici-

repentis (Died.) Drechsler / С.А. Булат, Н.В. Мироненко // Генетика. - 1989. -Т.25, №11. - С.2059-2063.

9. Булат, С.А. Видовая идентичность фитопатогенных грибов Pyrenophora teres

Drechsler и Pyrenophora graminea Ito and Kurib. / С.А. Булат, H.B Мироненко II Миколог, и фитопатол. - 1990. - T.24, вып.5. - С.435-441.

10. Гусева, H.H. Биотехнология и проблемы селекции растений на устойчивость /

H.H. Гусева, Н.В. Мироненко, Р.И. Высоцкая [и др.] // Защита растений. - 1990. - № 8. - С. 5-9.

11. Булат, С.А. Идентификация микромицетов на основе видоспецифичной ДНК на

примере Cochliobolus sativus Drechler ex Dustur / С.А. Булат, H.B. Мироненко, O.B. Макарова II Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов: сборник статей. - Вильнюс (Литва), 1990. - С. 21-24.

12. Булат, С.А. Идентификация микромицетов на основе видоспецифичных ПЦР пат-

тернов / С.А. Булат, Н.В. Мироненко // Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов- сборник статей. - Вильнюс (Литва),

1990. - С.25-28.

13 Булат, С.А. Видоспецифичная ДНК грибов / С.А. Булат, Н.В. Мироненко, О.В. Макарова // Молекуляр. механизмы генетич. процессов. - М.: Наука, 1991. -С. 157-167.

14. Булат, С.А. Видоидентификация грибов методом полимеразной цепной реакции с универсальными олигонуклеотидами. Генотипирование таксономических видов Issatchenkia orientalis Kudriavzev и Candida krusei (Cast) Berkhout. Kudriavzev / С.А. Булат, Н.В. Мироненко, В.П. Жарова, С.С. Нагорная // Цитология и генетика. - Киев, 1992. - Т.26, № 2. - С.25-31.

15. Булат, С.А. Полиморфизм дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans (De

Baiy), выявляемый в полимеразной цепной реакции с универсальными прайме-рами: состояние дивергенции вида / С.А. Булат, Н.В. Мироненко // Генетика. -1992. - Т.28, №4. - С.19-30.

16. Булат, С.А. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для

изучения геномов / С.А. Булат, O.K. Кабоев, Н.В. Мироненко [и др.] //Генетика.

- 1992. - Т.28, № 5. - С.19-28.

17. Булат, С.А. Полиморфизм грибов: ДНК маркеры / С.А. Булат, Н.В. Мироненко //

Успехи соврем, генетики. - 1993. - Вып.18. - С.75-120.

18. Булат, С.А. Генетическая дифференциация фитопатогенного гриба Cochliobolus

sativus (Ito and Kurib.) Drechsl. ex Dastur (Bipolaris sorokiniana Shoem.), выявляемая методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР): корреляция с хозяин-специфичностью / С.А. Булат, Н.В. Мироненко //Генетика. - 1993. - Т.29, № 8. - С. 1295-1301.

19. Bulat, S.A. Phylogeny inference in fungi based on UP-PCR (RAPD like) amplified po-

lymorphic DNA and nuclear rDNA RFLPs: parsimonious tree topology congruity / S.A. Bulat, N.V. Mironenko, I.A. Alekhina // Biodiversity and phylogeny: the 13-th meeting of the Willi Hennig society. - Copenhagen, 1994. - P.31.

20. Bulat, S.A. Polymerase chain reaction with universal primers (UP-PCR) and its appli-

cation to plant genome analysis / S.A. Bulat, N.V. Mironenko, M.N. Lapteva, P.P. Strelchenko // Conservation of plant genes. II: utilization of ancient and modern DNA Missuri Botanical Garden, 1994. - Vol.48. - P.l 13-129.

21. Булат, С.А. Генетическая структура почвенной популяции гриба Fusarium ох-

ysporum Schlechtend.: Fr.: молекулярная реидентификация вида и генетическая дифференциация изолятов методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) / С А. Булат, Н.В. Мироненко, Ю.Г. Жолкевич // Генетика. - 1995. - Т. 31, №. 3. - С. 315-323.

22. Булат, С.А. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости мето-

дом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами / С.А. Булат, Н.В. Мироненко // Генетика. - 1996. - Т.32, № 2.

- С.165-183.

23 Lubeck, М. Identification and characterization of isolates of Trichoderma and Gliocla-dium by PCR-based methods / M. Lubeck, S.A. Bulat, N. Mironenko [et al.] // Monitoring Antagonistic Fungi Deliberately Released into the Environment. - Dordrecht,

1996.-P. 123-128.

24. Yli-Mattila, T. Universally primed polymerase chain reaction analysis of Fusarium

avenaceum isolated from wheat and barley in Finland / T. Yli-Mattila, N.V. Mironenko, I .A. Alekhina [et al.] // Agricul. Food Sci. Finland. - 1997. - Vol. 6. - P. 2536.

25. Мироненко, Н.В. ПЦР-диагностика патогенов картофеля: проблемы и перспекти-

вы на примере грибов / Н.В. Мироненко, С.А. Булат // Миколог, и фитопатол. -

1997. - Т.31, вып.4. — С.72-85.

26. Bulat, S.A. UP-PCR analysis and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and

Gliocladium / S.A. Bulat, M. Lubeck, N. Mironenko. [et al.] // Mycol. Res. - 1998. -Vol. 102,№8.-P. 933-943.

27. Мироненко, Н.В. Использование молекулярно-биологических методов для реше-

ния проблем иммунитета растений к болезням / Н.В. Мироненко, Н.Н. Гусева //

Сельскохоз. биол. -1998. - Т. 1. - С. 18-27.

28. Михайлова, J1.A. Методы исследования структуры популяций возбудителя бурой

ржавчины пшеницы Puccinia recóndita Rob. ex Desm. f. sp.tritici / Л.А. Михайлова, Е.И. Гультяева, H.B. Мироненко; РАСХН, ВИЗР, Иновац. Центр. - СПб, 2003. - 24 с.

29. Mironenko, N.V. Intraspecific variation in gamma-radiation resistance and genomic

structure in the filamentous fungus Alternaría alternata: A case study of strains inhabiting Chernobyl Reactor No. 4 / N.V. Mironenko, I.A. Alekhina, N.N. Zhdanova, S.A. Bulat. // Ecotoxicol. and Environ. Safety. - 2000. - Vol. 45, № 2. - P. 177-187.

30. Мироненко, H.B. Филогенетические отношения видов грибов рода Cochliobolus,

специализированных к разным хозяевам / Н.В. Мироненко // Вестник защиты растений; ВИЗР. - 2000. - №1. - С. 49-54.

31. Mironenko, N.V. Molecular variation and genetic structure in field populations of

Pyrenophora teres causing net blotch in barley / N.V. Mironenko// 5-th Mendel centenary Congress. - Brno, 2000. - P. 181.

32. Mironenko, N.V. Genetic structure of Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana)

populations isolated from different hosts as revealed by UP-PCR (RAPD-like) technique / N.V. Mironenko, S.A. Bulat // J. Rus. Phytopathol. Soc. - 2001. - Vol. 2, part 1. - P.25-30.

33. Мироненко, H.B. Распределение типов спаривания в популяциях Cochliobolus

sativus / Н.В. Мироненко, А.А, Сердюк, О.А. Филатова // Миколог, и фитопатол. -2001. -Т. 35, вып. 5. - С. 36-40.

34. Naumova, E.S. Differentiation of six sibling species in the Saccharomyces sensu stricto

complex by multilocus enzyme electrophoresis and UP-PCR analysis / E.S. Naumova, S.A. Bulat, N.V. Mironenko, G.I. Naumov// Antonie van Leeuwenhoek. - 2003. -Vol. 83.-P. 155-166.

35. Mironenko, N. Genetic control of Pyrenophora teres virulence to three barley acces-

sions / N. Mironenko, O. Filatova, O. Afanasenko // Plant Protection Sci. - 2002. -Vol. 38 (Special Issue №2). - P. 612-614.

36. Мироненко, Н.В. Видоидентификация фитопатогенных грибов методом УП-ПЦР:

метод, пособие / Н.В. Мироненко, С.А. Булат //. ВИЗР, СПб. - 2003. - 25 с.

37. Мироненко, Н.В. Современные достижения в изучении генетической структуры

популяций фитопатогенных грибов / Н.В. Мироненко // Успехи соврем, биологии. - 2004. - Т.124, №3. - С. 234-245.

38. Павлюшин, В.А. Генетика взаимоотношений в патосистеме llordeum vulgare -

Pyrenophora teres / B.A. Павлюшин, O.C. Афанасенко, Н.В. Мироненко [и др.] // Докл. РАСХН. - 2004. - № 3. - С. 62-65.

39. Петрова, О.С. Структура популяций Pyrenophora avenae в Ленинградской области

по признаку вирулентности и ДНК-маркерам / О .С. Петрова, Н.В. Мироненко, О.С. Афанасенко // Миколог, и фитопатол. - 2005. - Т. 39, вып. 1. - С. 66-75.

40. Мироненко, Н.В. Генетический анализ вирулентности возбудителя сетчатой пят-

нистости ячменя гриба Pyrenophora teres / Н.В. Мироненко, О.С. Афанасенко, О.А. Филатова, Д. Копаньке // Методические основы селекции зерновых культур и картофеля на устойчивость к болезням; РАСХН, ВИЗР. - СПб., 2005 -С.41-54.

41. Мироненко, Н.В. Физиологическая специализация гриба Cochliobolus sativus на

различных видах растений-хозяев / Н.В Мироненко, А.А. Сердюк // Методические основы селекции зерновых культур и картофеля на устойчивость к болезням; РАСХН, ВИЗР. - СПб., 2005. - С.55-59

42. Мироненко, Н.В. Специализация возбудителя темно-бурой пятнистости гриба

Cochliobolus sativus к различным видам злаков / Н.В. Мироненко, А.А. Сердюк // Культурные растения для устойчивого сельского хозяйства в XXI веке (иммунитет, селекция, интродукция). - М.: Россельхозакадемия, 2005. - С.183-210.

43. Serenius, М. Genetic variation, occurrence of mating types and different forms of

Pyrenophora teres causing net blotch of barley in Finland / M. Serenius, N. Mironenko, O. Manninen // Mycol. Res. - 2005. - Vol. 109, №7. - P. 809-817.

44. Castell-Miller, C. Genetics of virulence of Cochliobolus sativus pathotypes 1 and 2 in

barley / C. Castell-Miller, N. Mironenko, O. Afanasenko, B. Steffenson // Phytopathology. - 2005. - Vol. 95. - P. sl7.

45. Мироненко, Н.В. Генетический контроль вирулентности возбудителя сетчатой

пятнистости ячменя гриба Pyrenophora teres Drechs. / Н.В. Мироненко, О.С. Афанасенко, О.А. Филатова, Д. Копаньке // Генетика. - 2005. - Т.41, №12. - С.1-7.

Авторское свидетельство

А.с. 1700941 СССР, МКИ А1 С 12 N 15/01. Способ выделения высокомолекулярной ДНК из эукариот / С.А. Булат, Н.В. Мироненко - № 4757918/13; заявл. 17.10.89; публ. не подлежит 22.08.1991, Бюл. №47.

Пат. 1833644 СССР, МКИ А 3 С 12 Q 1/68. Способ идентификации видов организмов / С.А. Булат, Н.В. Мироненко, O.K. Кабоев [и др.]; заявитель и патентообладатель Петербургский институт ядерной физики. - № 4757254/13; заявл. 20.11.89; публ. не подлежит 13.10.1992, Бюл. №29.

Патент

Научное издание ЯКО-печать ООО "ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ" Лицензия ПЛД № 69-253 Подписано к печати 20 октября 2005 г, тир 100 экз

I

J

)

№20 4 91

РНБ Русский фонд

2006-4 22935

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мироненко, Нина Васильевна

Введение 6

Глава 1. Генетическая структура и механизмы изменчивости 15популяций узко- и широкоспециализированных возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков

1.1. Биолого-генетические особенности возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков

1.1.1. Pyrenophora teres 18

1.1.2. Pyrenophora tritici-repentis 20

1.1.3. Pyrenophora avenae 22

1.1.4. Cochliobolus sativus 23

1.2. Использование ДНК маркеров в решении проблем таксономии и филогении фитопатогенных грибов

1.2.1. Полиморфизмы длин рестриктных фрагментов - 26-27 ПДРФ (RFLP)

1.2.2. Полиморфизм грибов по повторяющейся ДНК: ДНК- 27-30 фингерпринтинг

1.2.3. Полиморфизм грибов порибДНК 30

1.2.4. Идентификагщя грибов с помощью видоспецифичных 33-36 ДНК-проб. Видоспецифичная ДНК у грибов.

1.2.5. Идентификация грибов на уровне вида с помощью 35

1.2.6. Различение «истинных»рас, «квазирас» и 37внутривидовых групп грибов

1.3. Генетическая структура популяций фитопатогенных 45-47 грибов

1.31. Структура популяций грибов, не имеющих полового 47-49 процесса

1.3.2. Структура популяций грибов, имеющих половую 49стадию, но преимущественно размноэ/сающихся бесполым путем

1.3.3. Структура популяций фитопатогенных грибов, 53имеющих регулярный половой процесс

1.4. Генетика вирулентности и патогенности 55-61 фитопатогенных грибов: проблемы и перспективы

1.5 Механизмы расообразования у фитопатогенных грибов

1.5.1 Молекулярные механизмы расообразования у фитопатогенных грибов 1.5.1.1. Пластичность генома грибов. 62

Роль транспозонных элементов в пластичности генома грибов

Полиморфизм по длине и числу хромосом или изменчивость кариотипов грибов

Роль повторяющейся ДНК в изменчивости фитопатогенных грибов и отбор растением-хозяином.

1.5.1.2. Межвидовая гибридизация 72

1.5.1.3. Горизонтальный перенос генов 73

1.5.1.4. Роль репродуктивной изоляции в специализации грибов

1.5.2. Грибы рода Cochliobolus как модель для изучения 75эволюции гемибиотрофных фитопатогенных грибов

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы и стандартные методы исследований

2.1.1. Патогены и растения-хозяева 79

2.1.2. Методы анализа популяций гемибиотрофных 90-97 фитопатогенных грибов по ДНК маркерам

2.1.3. Методы анализа популяций грибов по типам 97-99 спаривания

2.1.4. Статистическая обработка результатов 99

2 Л .5. Методы изучения половой рекомбинации у 100гемибиотрофных патогенов злаков

2.1.6. Техники рекомбинантных ДНК.

2.1.7. Получение мутантов С. sativus действием у-лучей.

2.2. Методы, разработанные для выполнения 105 диссертационной темы

2.2.1. Модели генетического контроля вирулентности

2.2.2. Выявление генетического разнообразия устойчивости 104-109 при анализе мейотического потомства гриба

2.2.3. Создание клонотеки видоспецифичных повторов ДНК 110-111 С. sativus

2.2.4. Анализ клонированных ДНК и отбор повторяющихся 111 видоспецифичных ДНК клонов.

Глава 3. Изучение таксономии и филогении фитопатогенных грибов с помощью молекулярно-генетических методов

3.1. Полиморфизм рибДНК и повторяющейся ДНК 112-121 возбудителей листовой пятнистости ячменя и пшеницы Pyrenophora teres, P. graminea и P. tritici-repentis

3.2. Идентификация видов грибов с использованием 121-125 видоспецифичных ДНК фрагментов (на примере Cochliobolus sativus)

3.3. Идентификация видов фитопатогенных грибов 126-132 методом УП-ПЦР

3.4. Идентификация и анализ филогенетических 133-138 отношений различных форм P. teres (Т. sp. teres, f. sp. graminea, f. sp. maculata).

3.5. Филогенетические отношения между видами рода 138

3.6.

Глава 4.

Cochliobolus, специализированных к разным видам злаков

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы специализации возбудителей "гельминтоспориозных" пятнистостей зерновых культур"

Актуальность темы.

Фундаментальные знания о механизмах взаимоотношений паразита и ® хозяина и о направлениях микроэволюционных процессов у фитопатогенных грибов могут служить теоретической базой для создания сортов с длительной устойчивостью. Изучение механизмов специализации представляет особый интерес для прогнозирования появления новых форм и видов фитопатогенных грибов.

К числу наиболее вредоносных заболеваний ряда злаковых культур относятся «гельминтоспориозные» пятнистости листьев, вызываемые гемибиотрофными грибами родов Pyrenophora и Cochliobolus, анаморфы которых {Drechslera и Bipolaris) ранее относили к роду Helminthosporium. ф В последние годы наблюдается тенденция в усилении вредоносности и распространения гемибиотрофных патогенов на зерновых культурах. В ряде регионов РФ потери урожая ячменя от сетчатой пятнистости, вызываемой 9 грибом P. teres Drechs., могут достигать 20- 60%, от темно-бурой пятнистости, вызываемой С. sativus (Ito & Kuribayashi) Drechs. ex Dastur, недобор урожая достигает 30-40% при значительном снижении качества зерна (Кашемирова, 1995). Темно-бурая пятнистость пшеницы широко распространена в Приморском крае и на Дальнем Востоке. В Казахстане потери урожая пшеницы от С. sativus доходили до 43.8% (Здражевская, ® Шугуров, 1991), в странах Азии, Африки и Южной Америки - до 87 % 9

Hetzler et al., 1991). В настоящее время отмечается нарастающее распространение и вредоносность желтой пятнистости пшеницы, вызываемой грибом P. tritici-repentis (Died.) Shoemaker. Потери зерна от этого заболевания в условиях эпифитотии достигают 65% (Hirrell et al., 1990). Также наблюдается тенденция в усилении вредоносности красно-бурой пятнистости овса, вызываемой P. avenae Ito et Kuribay., которая может выражаться в потере урожая до 50 % и ухудшении качества зерна (Obst, • Huber, 1988).

Род Helminthosporium исторически включал различные роды грибов, объединенные по формальным признакам - морфологии конидиального аппарата и симптомам заболеваний. На протяжении ряда лет происходило уточнение и изменение таксономического статуса видов, входящих в этот род грибов (Drechsler, 1923; Ito, 1930; Хохряков, 1953; Shoemaker, 1959; Sivanesan, 1987). Однако морфологический подход не мог обеспечить решения многих проблем идентификации и филогении видов грибов в связи с их изменчивостью, обусловленной как нестабильностью генома, так и биологическими особенностями, связанными с типами размножения и адаптацией к новым растениям-хозяевам. Специализация является одним из путей симпатрического видообразования грибов (Хохряков, 1953; Дьяков, 1981). Механизмы специализации гемибиотрофных паразитов и, в частности, возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков остаются практически не изученными. Одна из причин такого положения, видимо, связана с таксономическими проблемами, возникающими в результате внутривидовой изменчивости и освоения паразитами новых видов растений-хозяев. Поэтому существует объективная необходимость в разработке новых методов идентификации видов грибов, основанных на использовании молекулярных критериев видового разнообразия - структурных особенностей ДНК, что могло бы служить инструментом, позволяющим определять видовой или внутривидовой (форма, раса) статус паразита, освоившего новый вид растения, и его филогенетическое положение по отношению к предполагаемой предковой форме.

Виды паразитов, имеющие широкий спектр растений-хозяев (например, С. sativus, поражающий все виды злаков), обладают потенциальной возможностью эволюционировать в направлении специализации к виду растения-хозяина.

Виды паразитов, поражающие преимущественно конкретные виды растений хозяев {Pyrenophora teres - ячмень, P. tritici-repentis - пшеницу, Р. avenae - овес), по-видимому, уже прошли в своем эволюционном развитии этап специализации. Однако внутривидовая дивергенция этих видов продолжается. Особый интерес представляет уникальный пример внутривидовой дивергенции P. teres, связанной со специализацией паразита по симптомам заболевания (f. sp. teres вызывает сетчатую, f. sp. maculata -округлую и f. sp. graminea - полосатую пятнистости).

Скорость и направленность микроэволюционных процессов, ведущих к специализации фитопатогенных грибов, определяются их эволюционным потенциалом, который может быть вскрыт путем изучения структуры популяций и генетической детерминации признаков патогенности и вирулентности у паразитов.

Анализ структуры популяций паразитов по комплексу признаков позволяет выявить роль генотипа сорта и вида растения-хозяина в формировании их генофонда. Наиболее изучена популяционная изменчивость по вирулентности у грибов P. teres и С. sativus, однако исследования генетической структуры популяций и генетики вирулентности этих паразитов находятся на начальной стадии. Совершенно отсутствуют сведения о генетической структуре популяций возбудителей P. tritici-repentis и P. avenae.

Изучение механизмов расообразования и адаптации патогенов к новым видам растений-хозяев особенно актуально в современных условиях загрязнения окружающей среды и глобального изменения климата, которые могут индуцировать генетические изменения микроорганизмов.

Цель работы - выявить молекулярно-генетические механизмы специализации к видам и сортам растений-хозяев возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд задач:

1. Разработать экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов.

2.Сравнить внутривидовое разнообразие узко- и широкоспециализированных гемибиотрофных паразитов.

3. Определить влияние генотипа растения-хозяина на генетическую структуру популяций узко- и широкоспециализированных видов фитопатогенных грибов (P. teres, P. tritici-repentis, P. avenae в сравнении с С. sativus) по локусам, выявляемым методами молекулярного ДНК фингерпринтинга.

4. Изучить особенности полового процесса внутривидовых форм P. teres - f. sp. teres и f. sp. maculata и филогенетические отношения между ними.

5. Изучить особенности полового процесса С. sativus и изучить филогенетические отношения между С. sativus и рядом узкоспециализированных видов рода Cochliobolus.

Ф 6. Изучить наследование признака вирулентности P. teres к ячменю и С. sativus к ячменю и пшенице

7. Выявить генетические факторы, влияющие на процесс адаптации С. sativus к различным видам растений-хозяев.

Научная новизна работы.

1. Предложен оригинальный метод молекулярной идентификации видов и внтривидовых форм грибов, который заключается в сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации. Использование этого метода расширило возможности идентификации видов и внутривидовых форм гемибиотрофных паразитов, адаптирующихся к новым растениям-хозяевам.

2. Впервые проведено сравнительное изучение структуры популяций 4-х видов гемибиотрофных патогенов злаков (Pyrenophora teres, P. tritici-repentis, P. avenae и Cochliobolus sativus), различающихся по уровню специализации к растениям-хозяевам, с использованием ДНК-маркеров и выявлены различия между ними по доле клональной фракции и уровню среднего генного разнообразия на локус.

Популяции узкоспециализированных паразитов P. teres f. sp. teres, P. tritici-repentis и P. avenae характеризуются меньшей клональной фракцией (0-60 %) и большим значением среднего генного разнообразия на локус (Н = 0.11-0.30), чем популяции широко специализированного вида С. sativus (клональная фракция составляет 75-90 % и Н = 0.061-0.192).

Выявлена специализация популяций С. sativus к пшенице, культурному и дикорастущему ячменю, которая на данном этапе микроэволюции проявляется в виде повышенной агрессивности к "своим" хозяевам, различиях в генетической структуре популяций, а именно в преобладании клонов с определенными генотипами, а также в нарушениях мейоза у «межпопуляционных» гибридов.

3. Снижение фертильности гибридов между разными формами P. teres (f. sp. teres и f.sp. maculata), и снижение жизнеспособности их мейотического потомства является следствием внутривидовой дивергенции в результате специализации форм гриба. На основании изучения внутривидовой изменчивости грибов P. teres на уровне ДНК выведены филогенетические отношения между формами - f. sp. teres, f. sp. maculata и f. sp. graminea, и доказана их дивергенция на уровне геномов.

4. На основании выведенных филогенетических отношений между С. sativus и близкородственными узкоспециализированными видами грибов р. Cochliobolus показана роль С. sativus в качестве предкового вида в эволюции грибов рода Cochliobolus.

5. Впервые изучено распределение типов спаривания в популяциях P. teres и С. sativus, обитающих на разных видах злаков. В популяциях обоих видов выявлено соотношение типов спаривания 1:1, что свидетельствует о прохождении половой стадии этих грибов в природе.

6. Впервые изучено наследование вирулентности у P. teres к 9 генотипам ячменя и С. sativus к 11 генотипам ячменя и 8 генотипам пшеницы. Показано, что взаимодействие генов авирулентности и устойчивости в патосистеме Н. vulgare — P. teres f. sp. teres осуществляется по типу ген-на-ген, согласно теории Флора (Flor, 1947). Кроме того, у P. teres f. sp. teres выявлены как специфические, так и неспецифические гены-супрессоры по отношению к генам авирулентности. Показан более высокий полиморфизм генов устойчивости и генов авирулентности в патосистеме Н. vulgare - P. teres f. sp. teres по сравнению с патосистемами Н. vulgare - С. sativus и Т. aestivum - С. sativus.

Практическая значимость результатов исследований

1. Разработан экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

2. Созданы коллекции аскоспоровых изолятов P. teres и С. sativus, которые могут быть использованы для оценки разнообразия генов устойчивости у доноров устойчивости ячменя к обоим патогенам и пшеницы к С. sativus и создания конвергентных сортов с большим числом генов устойчивости.

3. На основании результатов генетического анализа вирулентности созданы пулы ДНК изолятов P. teres, различающихся по вирулентности к сортам с различными генами устойчивости для проведения молекулярной идентификации и картирования генов авирулентности.

4. Разработан метод анализа генов устойчивости с использованием пар генетически охарактеризованных штаммов патогена и их мейотического потомства для патосистем Н. vulgare — P. teres f. sp. teres, H. vulgare - С. sativus и Т. aestivum - С. sativus.

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных конференциях "Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)" (1983, Пущино); "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (1989, Пущино); VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (1990, Пущино); 12-ой Международной конференции по микологии и лихенологии (1993, Вильнюс); VI Совещании "Вид и его продуктивность в ареале" (1993, С-Петербург); 2-м рабочем совещании по филогенетической систематике (1994, Аарус, Дания); 13-м совещании общества Willi Hennig (1994, Копенгаген, Дания); I Всероссийском съезде по защите растений (1995, С-Петербург); XIY Съезде Эукарпия "Адаптация в селекции" (1995, Jyvaskyla, Финляндия); Международном симпозиуме «Современные проблемы в устойчивости злаков к болезням» (2002, С-Петербург); Первом съезде микологов России (Москва, 2002); 11-ом Международном съезде по взаимоотношениям растений и микроорганизмов (2003, С-Петербург); 9-ом Международном симпозиуме по генетике ячменя (2004, Брно, Чехия); Международной научно-практической конференции (Краснодар 2004); III съезде ВОГИС (2004, Москва).

Работа была поддержана грантом ГНТП «Перспективные направления генетики» 1995-1997 гг., грантом RSS (Group Research Support Scheme Grant) 1367/1997, а также программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований ВИЗР «Фитосанитарная устойчивость агроэкосистем», международным проектом «Фитосанитарная стабилизация» министерства науки и образования РФ, грантами РФФИ № 00-04-49406 и № 03-04-49082, Федеральным Министерством защиты прав потребителей, продовольствия и сельского хозяйства Федеративной Республики Германии.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 114 работ, в том числе по теме диссертации - 86, из них 42 — в рецензируемых печатных изданиях, 2 методических указаний, 1 патент и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения; содержит 350 страниц машинописного текста, 93 таблиц (из них 20 даны в Приложении) и 61 рисунка. Список использованной литературы включает 419 источников, из них 61 на русском языке.

Положения, выносимые на защиту.

1. Молекулярно-генетические механизмы процесса специализации широкоспециализированного вида С. sativus заключаются в дивергенции геномов изолятов, адаптированных к виду растения-хозяина, ведущей к образованию хозяин-специфичной молекулярно-генетической структуры популяции патогена. Процесс специализации обусловлен наличием в популяциях паразита набора специфических аллелей генов вирулентности к разным видам растений-хозяев, а также нарушениями мейоза в скрещиваниях межу изолятами различного происхождения по растению-хозяину.

2. Молекулярно-генетические механизмы специализации P. teres заключаются в дивергенции геномов изолятов, вызывающих различные симптомы, которая сохраняется благодаря наличию репродуктивной изоляции. Возникновение новых вирулентных рас у P. teres при скрещивании авирулентных изолятов происходит в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих как сами гены авирулентности, так и гены-супрессоры, влияющие на их экспрессию.

3. Патосистемы, включающие широкоспециализированный патоген характеризуются меньшим разнообразием генотипов устойчивости и вирулентности по сравнению с патосистемами, включающими узкоспециализированные патогены 4. Метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых в УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

Исследования проводились в 1978-2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по программам ГНТП и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН, а также по договорам о сотрудничестве с ПИЯФ РАН, институтом фитопатологии (Ашерслебен, Германия), Центром сельскохозяйственных исследований (Йокиойнен, Финляндия).

Некоторые разделы работы были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунитета растений к болезням (ВИЗР) Афанасенко О.С. , Михайловой JI.A., Тимофеевой Е.Н., Гоголевой С.Г., Сердюк А.А., Филатовой О.А., Петровой А. С., а также Булатом С.А. (ПИЯФ, РАН), О. Маннинен и М. Серениус (МТТ, Финляндия), Д. Копаньке и И. Крамер (ИФ, Германия) и Б. Стеффенсоном (США).

15

Заключение Диссертация по теме "Микология", Мироненко, Нина Васильевна

Выводы

1. Показана возможность использования метода сравнения спектров ДНК-маркеров, выявляемых в полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР), и установления гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации для молекулярной идентификации видов и внутривидовых специализированных форм грибов.

2. Показано, что два ранее установленных таксономических вида грибов P. teres и P. graminea представляют один биологический вид и могут рассматриваться в качестве внутривидовых форм - f.sp. teres и. f. sp. graminea. Внутривидовые формы узкоспециализированного вида P. teres — f. sp. teres, f. sp. maculata и f. sp. graminea, вызывающие различные симптомы заболеваний на ячмене, представляют собой дивергентные формы внутри одного биологического вида, поскольку различаются по структуре геномов, выявляемой методом УП-ПЦР и рестрикционного анализа рибДНК, и сохраняют гомологичность геномов.

3. УП-ПЦР анализом и блот-гибридизацией ПЦР продуктов показано, что представители рода Cochliobolus - С. sativus, С. carbonum, С. victoriae, С. heterostrophus и С. cynodontis, различающиеся по степени специализации к растениям-хозяевам, представляют собой комплекс видов со сходной структурой и гомологичностью геномов. С. sativus является предковым видом в эволюции грибов рода Cochliobolus.

4. Различия по представленности клональной фракции и среднему генному разнообразию на локус в популяциях узкоспециализированных паразитов P. teres f. sp. teres, P. tritici-repentis и P. avenae и широкоспециализированного паразита C. sativus связаны с типом размножения. Обнаружено влияние вида растения-хозяина на структуру популяций С. sativus по ДНК маркерам, которое выражается в преобладании в популяции клонов с определенными генотипами.

5. Возникновение новых вирулентных рас P. teres f. sp. teres при скрещивании авирулентных изолятов происходит в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих как гены вирулентности, так и гены-супрессоры, влияющие на их экспрессию. Выявленное соотношение типов спаривания в популяциях P. teres, соответствующее 1:1, свидетельствует о высокой вероятности появления новых рас паразита за счет половой рекомбинации.

6. Обнаружение в популяциях С. sativus обоих типов спаривания в соотношении как 1:1 так и 2:1 позволяет предположить возможность спорадически возникающей половой стадии в жизненном цикле гриба.

7. На основании генетического анализа вирулентности к образцам ячменя с известными генами устойчивости доказано существование взаимоотношений паразита и хозяина в патосистеме Н. vulgare - P. teres f. sp. teres по типу ген-на-ген.

8. Показана возможность использования аскоспорового потомства изолятов P. teres f. sp. teres и С. sativus для выявления идентичных генов устойчивости у растений-хозяев и комплементарных им генов авирулентности. Предложены модели расщепления по вирулентности в аскоспоровом потомстве патогенов к сортам растений-хозяев при наличии (или отсутствии) у них тождественных генов устойчивости, комплементарных генам авирулентности у родительских изолятов гриба.

9. Авирулентность изолятов P. teres f. sp. teres к каждому из 11 использованных в генетическом анализе образцов ячменя контролируется от 1 до 4 доминантными генами и 1 или 2 доминантными генами-супрессорами. Показано, что авирулентность к 9 образцам ячменя контролируется более чем 30 генами. Выявлено 3 гена-супрессора, из которых один ген можно считать неспецифичным, поскольку он эпистатировал 3 различных гена авирулентности к сортам Диамонд и Харбин и образцу CI 5401, а два других - специфичными, так как они соответствовали конкретным генам авирулентности к образцу к-8721 и сорту Диамонд. Высокое разнообразие генов авирулентности обусловлено существованием большого полиморфизма генотипов устойчивости растения-хозяина.

10. Вирулентность изолятов С. sativus к каждому из 11 образцов ячменя и 8 образцов пшеницы, использованных в генетическом анализе, контролируется 1-3 генами - доминантными к ячменю и в большинстве случаев рецессивными к пшенице. Анализ на идентичность генов авирулентности выявил у изолятов С. sativus по 4 различных гена авирулентности к 9 образцам ячменя и 8 образцам пшеницы. Низкое разнообразие генов генов авирулентности у С. sativus обусловлено видоспецифичностью некоторых из них и малым полиморфизмом генотипов устойчивости растений-хозяев.

Практические рекомендации.

1. Для идентификации видов фитопатогенных грибов разработан экспресс-метод молекулярной диагностики, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.

2. Для использования в практической селекции предлагается ускоренный метод выявления генетического разнообразия устойчивости ячменя к P. teres и С. sativus и пшеницы к С. sativus, основанный на расщеплении фенотипов (авирулентный /вирулентный) в потомстве гаплоидного гриба к паре сравниваемых сортов, которое зависит от количества генов в родительских изолятах, контролирующих вирулентность к каждому сорту, взаимодействия генов патогена и наличия генов устойчивости в анализируемых сортах, комплементарных генам авирулентности.

3. Коллекция ДНК образцов генетически охарактеризованных изолятов Р. teres и С. sativus с альтернативными признаками вирулентности может быть использована для картирования генов авирулентности

В заключение считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность администрации Всероссийского НИИ защиты растений за предоставленную возможность разработки данной темы и обеспечение условий для проведения экспериментальной работы, моим учителям доктору биологических наук, профессору, академику РАСХН М.М. Левитину и доктору биологических наук, профессору, члену кор. РАН И.А. Захарову, которые являются для меня примером профессионализма и преданности науке, ушедшей из жизни заведующей лабораторией иммунитета растений к болезням доктору биологических наук, профессору Н.Н. Гусевой за постоянное внимание и поддержку на первых этапах моей работы, коллективу лаборатории иммунитета растений к болезням ВИЗР за помощь и поддержку в выполнении исследований, доктору Б. Стеффенсону (Университет Минессоты, США) за предоставление изолятов С. sativus для скрещиваний, доктору О. Маннинен (Центр сельскохозяйственных исследований Финляндии), директору института эпидемиологии и устойчивости Федерального Центра по селекции культивируемых растений (Германия) доктору Ф. Ордону и докторам И. Крамер и Д. Копаньке за предоставленную возможность проведения молекулярных работ с патогенами. Особую благодарность выражаю моим коллегам - заведующей лабораторией иммунитета растений к болезням ВИЗР, доктору биологических наук О.А. Афанасенко и доктору биологических наук JI.A. Михайловой за внимание и участие в обсуждении полученных данных, а также старшему научному сотруднику ПИЯФ РАН, кандидату биологических наук Сергею Алексеевичу Булату за плодотворное творческое сотрудничество в выполнении первых этапов данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мироненко, Нина Васильевна, Санкт-Петербург

1. Андронова А.Е. Пиренофороз озимой пшеницы на юго-западе России // Защита и карантин растений. 2001. № 5. С. 32.

2. Афанасенко О. С. Изменчивость популяций возбудителей гельминтоспориозных пятнистостей ячменя и генетический контроль устойчивости к Pyrenophora teres Drechs. // Автореферат дис докт. биол. наук /СПб., 1996.41 с.

3. Афанасенко О. С., Зубкович А. А., Макарова И. Г. Генетический контроль устойчивости образцов ячменя к штаммам Pyrenophora teres Drechs. // Генетика. 1999. Т. 35, № 3. С. 336-340.

4. Афанасенко О. С., Кушниренко И. Ю. Наследование устойчивости к возбудителю сетчатой пятнистости у некоторых сортов ячменя // Генетика. 1989. Т. 25, № 11. С. 1994-2000.

5. Афанасенко О. С., Левитин М. М. Структура популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя по признаку вирулентности. I. Идентификация рас // Миколог, и фитопатол. 1979. Т. 13, вып. 3. С. 230-234.

6. Афанасенко О. С. , Левитин М. М., Михайлова Л. А. Методы изучения вирулентности и агрессивности возбудителя сетчатого гельминтоспориоза ячменя // Миколог, и фитопатол. 1976. Т. 10, вып. 5. С. 433-436.

7. Бенкен А. А., Гайке М. В., Хацкевич Л. К. Сетчатый гельминтоспориоз ячменя // Труды 5 Всес. совещ. по иммунитету растений. Киев. 1969. Вып. 5 (2). С. 38-42.

8. Булат С. А., Кабоев О. К., Мироненко Н. В., Ибатуллин Ф. М., Лучкина Л. А., Суслов А. В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. 1992, а. Т.28, №.5. С. 19-28.

9. Булат С. А., Мироненко Н. В. ДНК-полиморфизмы фитопатогенных грибов Pyrenophora teres Drechsler. и Pyrenophora graminea Ito and Kurib // Генетика. 1989,a. T.25, №5. C.838-850.

10. Булат С. А., Мироненко H. В. ДНК-полиморфизмы фитопатогенного гриба Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler // Генетика. 1989,6. T.25, №11. C.2059-2063.

11. Булат С. А., Мироненко H. В. Видовая идентичность фитопатогенного гриба Pyrenophora teres Drechsler и Pyrenophora graminea Ito and Kuribayashi // Миколог, и фитопатол. 1990. T.24, №5. C.435-441.

12. Булат С. А., Мироненко Н. В. Полиморфизм дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans (De Вагу), выявляемый в полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами: состояние дивергенции вида // Генетика. 1992. Т.28, №4. С. 19-30.

13. Булат С. А., Мироненко Н. В. Полиморфизм грибов: ДНК маркеры // Успехи современной генетики. 1993, а. Вып.18. С.75-120.

14. Булат С. А., Мироненко Н. В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами // Генетика. 1996. Т.32, №.2. С.165-183.

15. Булат С. А., Мироненко Н. В., Кабоев О. К. и др. Способ идентификации вида организмов. Российский патент No. 1833644, 1989.

16. Булат С. А., Мироненко Н. В., Макарова О. В. Видоспецифичная ДНК у грибов // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.: Наука, 1991. С.157-167.

17. Великанов JI.JI., Хасанов Б.А. Таксономия формальных родов Helminthosporium, Bipolaris, Drechslera, Exserohilum и Curvularia // Новое в систем, и номенклатуре грибов. 2003. С. 304-341.

18. Войтова JI. Р. Сетчатая пятнистость ячменя // Защита растений. 1971. № И. С. 44.

19. Дьяков Ю.Т. Физиология и генетика грибов-паразитов растений // Успехи микробиологии. 1981. Вып. 16. С. 215-230.

20. Дьяков Ю. Т. Критерии биологического вида // Миколог, и фитопатол. 1993. Т.27, вып.6. С.68-82.

21. Дьяков Ю. Т., Долгова А. В., Рыбакова И. Н., Багирова С. Ф. Дивергенция популяций фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.) De Вагу в связи со специализацией к растениям-хозяевам // Журн. общ. биологии. 1994. Т. 55, №2. С. 179-197.

22. Дьяков Ю. Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. М.: Муравей. 1998. 382 с.

23. Захаров И.А. Курс генетики микроорганизмов. Минск: Высш. Школа, 1978. 192 с.

24. Здражевская С.Д., Шугуров И.М. Особенности защиты яровой твердой пшеницы в период вегетации от комплекса болезней // Проблемы защиты зерновых культур от фузариоза и других болезней. Минск, 1991. С.97-106.

25. Ишкова Т.И., Берестецкая Л.И., Гасич Е.Л. и др. Диагностика основных грибных болезней хлебных злаков / Научн. ред.: Павлюшин В.А. -СПб.: ВИЗР. 2002. 76 с.

26. Каратыгин И.В. Коэволюция грибов и растений / Под ред. Н.С. Голубковой. СПб: Гидрометеоиздат. 1993. 116 с.

27. Кашемирова JI. А. Фитосанитарные диагностические системы защиты ярового ячменя от темно-бурого и сетчатого "гельминтоспориозов" // Автореф. дис. канд. Биол. наук, 1995. 23 с.

28. Лакин Г.Ф. Биометрия.- М.: Высшая школа. 1990. С. 122-124.

29. Левитин М.М. Генетические основы изменчивости фитопатогенных грибов. Ленинград: Агропромиздат. 1986. 208 с.

30. Левитин М. М., Афанасенко О. С., Структура популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя по признаку вирулентности. III. Локальность популяций // Миколог, и фитопатол. 1980. Т. 14, вып. 2. С. 130-132.

31. Левитин М.М., Петрова А.Н., Афанасенко О.С. Сравнительное изучение популяций Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem. по признаку вирулентности //Миколог, и фитопатол. 1985. Т.19, вып. 2. С. 154-158.

32. Макарова И. Г. Генетический анализ устойчивости ячменя к возбудителю сетчатой пятнистости // Дис. канд. биол. наук. СПб, 1996. 195 с.

33. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984.-479 с.

34. Мироненко Н. В. Филогенетические отношения видов грибов рода Cochliobolus, специализированных к разным хозяевам // Вестник защиты растений. 2000. № 1. С. 49-54.

35. Мироненко Н.В. Современные достижения в изучении генетической структуры популяций фитопатогенных грибов // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124, №3. С. 234-245.

36. Мироненко Н.В., Булат С.А. ПЦР-диагностика патогенов картофеля: проблемы и перспективы на примере грибов // Миколог, и фитопатол. 1997. Т.31, вып.4. С.72-85.

37. Мироненко Н.В., Булат С.А. Видоидентификация фитопатогенных грибов методом УП-ПЦР: (Методич. пособ.) / РАСХН, ВИЗР, СПб, 2003. -25 с.

38. Мироненко Н.В., Сердюк А.А., Филатова О.А. Распределение типов спаривания в популяциях Cochliobolus sativus II Миколог, и фитопатол. 2001. Т. 35, вып. 5. С. 36-40.

39. Михайлова Л.А., Гоголева С.Г., Гультяева Е.И. Взаимодействие штаммов Bipolaris sorokiniana и образцов пшеницы // Миколог, и фитопатол. 2002. Т. 36, вып. 2. С. 64-66.

40. Михайлова Л.А., Гультяева Е.И., Кокорина Н.М. Лабораторные методы культивирования возбудителя желтой пятнистости пшеницы Pyrenophora tritici-repentis //Миколог, и фитопатол. 2002. Т. 36, вып.1. С.63-67.

41. Мокроусов И. В., Булат С. А. Различение биологических видов гриба Aureobasidium pullulans (De Вагу) методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами // Генетика. 1992. Т.28, № 4. С.31-38.

42. Монастырский Н. В., Рубан Д. Н., Токарская О. Н., Рысков А.П. Геномная дактилоскопия штаммов грибов рода фузариум, различающихся по токсигенности // Генетика. 1990. Т. 26, № 2. С. 374-377.

43. Пересыпкин В.Ф. Атлас болезней полевых культур. Киев.: Урожай, 1987. 144 с.

44. Петрова А.А. Вирулентность популяций возбудителей темно-бурой и сетчатой пятнистостей ячменя и принципы создания инфекционных фонов // Автореф. дис. канд. биол. наук. JL, 1985. 16 с.

45. Петрова О.С. Структура популяций возбудителя красно-бурой пятнистости овса на Северо-Западе РФ и источники устойчивости к болезни // Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб., 2004. -22 с.

46. Петрова О.С., Мироненко Н.В., Афанасенко О.С. Структура популяций Pyrenophora avenae в Ленинградской области по признаку вирулентности и ДНК-маркерам // Миколог, и фитопатол. 2005. Т. 39, вып. 1.С. 66-75.

47. Пидопличко Н. М. Грибы паразиты культурных растений. Киев. Наук. Думка, 1977. Т. 2. 299 с.

48. Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. Минск: Высшая школа, 1974. 447 с.

49. Рочев М.В. Биоэкологические особенности Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorik.) Shoem. и исходный материал для селекции болезнеустойчивых сортов ячменя на Среднем Урале // Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1986. 16 с.

50. Рысков А. П., Джинчарадзе А. Г., Просняк М. И. Геномная «дактилоскопия» организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 // Генетика. 1988. Т.24, №1. С. 227.

51. Сиренко А.С. Защита озимого ячменя от болезней в интенсивном земледелии Краснодарского края // Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб., 1994.-22 с.

52. Сулимова Г. Е. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК: методология и свойства// Сельскохоз. биология. 1989. №.1. С. 60-67.

53. Филатова О.А. Доноры устойчивости ячменя к возбудителю сетчатой пятнистости и генетический контроль взаимоотношений в системе растение-патоген // Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб., 2005. 23 с.

54. Хасанов Б. А. Таксономия рода Helminthosporium sensu lato и критерии для идентификации видов родов Bipolaris, Drechslera, Exserohilum и Curvularia И Миколог, и фитопатол. 1987. Т. 21, вып. 5. С. 433-442.

55. Хасанов Б. А. Несовершенные грибы как возбудители основных заболеваний злаков в Средней Азии и Казахстане // Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1992. 44 с.

56. Хасанов Б. А., Выприцкая А. А., Глухова JI. А. Методы дифференциации и внутривидовая таксономия возбудителя сетчатой пятнистости ячменя // Биол. науки. 1992. № 5. С. 34-41.

57. Хохряков M.JI. Морфолого-биологическое обоснование систематики грибов рода Helminthosporium (sensu lato) на злаках // Диссертация докт. биол. наук. Л., 1953. С. 398.

58. Afanasenko O. Investigations on populations of Pyrenophora teres f. teres, the cause of net blotch of barley // J. Russian Phytopathol. Soc. 2001. Vol. 2. P. 918.

59. All S., Francl L. J. Population race structure of Pyrenophra tritici- repentis prevalent on wheat and noncereal grasses in the Great Plains // Plant Dis. 2003. Vol. 87. P. 418-422.

60. Ammon H. Uber einige Arten aus den Gattungen Pyrenophora Fries und Cochliobolus Drechsler mit Belminthospor-iwn als Nebenfruchtform // Phytopatol. Zeitschr. 1963. N47. S.244-300.

61. Anaya N., Roncero M. I. G. skippy, a retrotransposon from the fungal plant pathogen Fusarium oxysporum II Mol. Gen. Genet. 1995. Vol. 249. P 637-647.

62. Anderson P. A., Lawrence G. J., Pryor A. The inheritance of restriction fragment length polymorphisms in the flax rust Melampsora lini // Theor. Appl. Genet. 1992. Vol. 84. P. 845-850.

63. Aragona M., Montigiani M., Porta-Puglia A. Electrophoretic karyotypes of the phytopathogenic Pyrenophora graminea and P. teres II Mycol. Res. 2000. Vol. 104. P. 853-857.

64. Assigbetse К В., Fernander D., Dubois M. P., Geiger J.-P. Differentiation of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum races on cotton by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis // Phytopathology. 1994. Vol.84. P.622-626.

65. Barrault G. Albertini L., Sarrafi A. Epidemiologie de Drechslera teres (Sacc.) Shoem. (f. teres et f. maculata) parasite de l'Orge (.Hordeum vulgare L.) // Rev. Cytol. et Biol. Veg. Bot. 1990. Vol. 13, № 4. P. 209-211.

66. Bakonyi J., Pomazi A., Fischl G., Hornok L. Comparison of selected species of Bipolaris, Dreschlera and Exserohilum by random amplification of polymorphic DNA // Acta Microbiol, et Immunolog. Hungarica. 1995. Vol. 42. P. 355-366.

67. Bateman G. L., Ward E., Antoniw J. E. Identification of Gaeumannomyces gram in is var. tritici and G. graminis var. avenae using a DNA probe and non-molecular methods // Mycol. Res. 1992. Vol.96. P.737-742.

68. Bennett R.S., Milgroom M.G., Bergstrom G.C. Population structure of seedborne Phaeosphaeria nodorum on New York wheat // Phytopathology. 2005. Vol. 95. P. 300-305.

69. Bidochka M. J., McDonald M. A., Leger R. J., Roberts D .W. Differentiation of species and strains of entomopathogenic fungi by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) // Curr. Genet. 1994. Vol.25. P.107-113.

70. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. Vol. 7. P. 1513.

71. Bockelman H. E., Sharp E. L. Eslick R. F. Trisomic analysis of genes for resistance to scald and net blotch in several barley cultivars// Canad. J. Bot. 1977. Vol. 55. № 15. P. 2142-2148.

72. Booth C. The genus Fusarium II Commonwealth Mycological Institute, The Eastern Press, Ltd., London. 1971. 237 p.

73. Braithwaite K. S., Irwin J.A. G., Manners J. M. Ribosomal DNA as a molecular taxonomic marker for the group species Colletotrichum gloeosporioides II Aust. Syst. Bot. 1990. Vol. 3. P. 733-738.

74. Braithwaite K., Manners J. M. Human hypervariable minisatellite probes detect DNA polymorphisms in the fungus Colletotrichum gloeosporioides II Curr. Genet. 1989. Vol. 16. P. 473-475.

75. Braithwaite K. S., Manners J. M., Irwin J.A. G., Maclean D. J. DNA markers reveal hybrids between two diverse background genotypes in Australian collections of the bean rust fungus Uromyces appendiculatus II Aust. J. Bot. 1994. Vol.42. P.255-267.

76. Braithwaite K. S., Manners J. M., Maclean D. J., Irwin J. A. G. A molecular approach to distinguish the bean rust and siratro rust pathogens // Austr. J. Bot. 1991. Vol.39. P.527-534.

77. Brandle U. E., Haemmerli U. A., McDermott J. M., Wolfe M. S. Interpreting population genetic data with the help of genetic linkage maps // The gene-for-gene relationship in plant-parasite interactions. CAB Inter., 1997. P. 157-171.

78. Brasier С. M. The dynamics of fungal speciation // Evolutionary biology of the fongi. Cambridge, 1987. P.231-260.

79. Brasier С. M., Kirk S. A., Pipe N. D., Buck K. W. Rare interspecific hybrids in natural populations of the Dutch elm disease pathogen Ophiostoma ulmi and O. novo-ulmi II Mycol. Res. 1998. Vol.102. P. 45-57.

80. Bronson C. R., Taga M., Yoder О. C. Genetic control and distorted segregation of T-toxin production in field isolates of Cochliobolus heterostrophus //Phytopathology. 1990. Vol. 80. P. 819-823.

81. Brown J. К. M. Recombination and selection in populations of plant pathogens // Plant Pathology. 1995. Vol. 44. P. 279-293.

82. Brown M.P., Steffenson B.J., Webster R.K. Host range of Pyrenophora teres f. teres from California // Plant Dis. 1993. Vol. 77. N9. P.942-947.

83. Bruns T. D., White T. J., Taylor J. W. Fungal molecular systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1991. Vol.22. P.525-564.

84. Bulat S., Lubeck M.s Mironenko N., Jensen D. F., Lubeck P. S. UP-PCR analysis and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and Gliocladium II Mycol. Res. 1998. Vol. 102. P. 933-943.

85. Burdon J.J. The structure of pathogen populations in natural plant communities // Annu. Rev. Phytopathol. 1993. Vol. 31. P. 305-323.

86. Burdon J.J., Roelfs A.P. Isozyme and virulence variation in asexually reproducing populations of Puccinia graminis and P. recondita on wheat // Phytopathology. 1985, a. Vol. 75. P. 907-913.

87. Burdon J.J., Roelfs A.P. The effect of sexual and asexual reproduction on the isozyme structure of populations of Puccinia graminis II Phytopathology. 1985, b. Vol. 75. P. 1068-1073.

88. Burnett J. M. Speciation in fungi // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1983. Vol.81. P.l-14.

89. Burr В., Evola S. V., Burr F. A., Beckmann J. S. The application of restriction fragment length polymorphism to plant breeding // Genetic Engineering, 1983. Vol. 5. P. 45.

90. Campbell G. F., Lucas J. A., Crous P. W. Evidence of recombination between net- and spot-type populations of Pyrenopphora teres as determined by RAPD analysis 11 Mycol. Res. 2002. Vol.106. №5. P. 602-608.

91. Canada S. R., Dunkle L. D. Polymorphic chromosomes bearing the Tox2 locus in Cochliobolus carbonum behave as homologs during meiosis // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 63. P. 996-1001.

92. Caten С. E. The concept of race in plant pathology // Populations of plant pathogens Blackwell scientific publ., Oxford. 1987. P.21-37.

93. Chalvet F., Grimaldi C., Kaper F., Langin Т., Daboussi M.J. Hop, an active Mutator-like element in the genome of the fungus Fusarium oxysporum II Mol. Biol. Evol. 2003, in press

94. Chang H-R., Bronson C.R. A reciprocal translocation and possible insertion(s) tightly associated with host-specific virulence in Cochliobolus heterostrophus //Genome. 1996. Vol. 39. P. 549-557.

95. Chen D., Zeigler R. S., Leung H., Nelson R J. Population structure of Pyricularia grisea at two screening sites in the Philippines // Phytopathology. 1995. Vol. 85, №9. P. 1011-20.

96. Chen R-S., McDonald В .A. Sexual reproduction plays a major role in the genetic structure of populations of the fungus Mycosphaerella graminicola II Genetics. 1996. Vol. 142. P. 1119-1127.

97. Chen X. M., Line R. F., Leung H. Relationship between virulence variation ® and DNA polymorphism in Puccinia striiformis II Phytopathology. 1993. Vol.83.1. P.1489-1497.

98. Christiansen S. K., Giese H. Genetic analysis of the obligate parasitic barley powdery mildew fungus based on RFLP and virulence // Theor. Appl. Genet. 1990.• Vol.79. P. 705-712.

99. Ciuffetti L. M., Tuori R. P. and Gaventa J. M. A single gene encodes a selective toxin causal to the development of tan spot of wheat // Plant Cell. 1997. Vol. 9. P.135-144.

100. Coddington A., Matthews P. M., Cullis C., Smith К. H. Restriction digest patterns of total DNA from different races of Fusarium oxysporum f. sp. pisi — an improved method for race classification // J. Phytopathol. 1987. Vol. 118. P. 9.

101. Cooley R. N., Caten С. E. Variation in electrophoretic karyotype between strains of Septoria nodorum II Mol. Gen. Genet. 1991. Vol. 228. P. 17-23.

102. Covert S. F. Supernumerary chromosome in filamentous fungi // Curr.• Genet. 1998. Vol. 33. P. 311-319.

103. Crow J. F. // Basic concepts in population. Quantitative and evolutionary genetics New York, 1986.

104. Crowhurst R. N., Hawthorne В. Т., Erik H. A. et al. Differentiation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA//Cur. Genet. 1991. Vol.20. P.391-396.

105. Cubeta M. A., Echandi E., Abernethy Т., Vilgalys R. Characterization of anastomosis groups of binucleate Rhizoctonia species using restriction analysis of an amplified ribosomal RNA gene // Phytopathology. 1991. Vol. 81. P. 1395-1400.

106. Czembor P. C., Arseniuk E. Segregation and recombination of PCR basedmarkers in sexual progeny of Phaeosphaeria species // Mycol. Res. 2000. Vol.104. P. 919-926.

107. Daboussi M. J. Fungal transposable elements: generators of diversity and genetic tools // J. Genet. 1996. Vol. 75. P. 325-339.

108. Daboussi M. J. Fungal transposable elements and genome evolution // Genetica. 1997. Vol.100. P. 253-260.

109. Daboussi M., Capy P. Transposable elements in filamentous fungi // Annu. Rev. Microbiol. 2003. Vol. 57. P. 275-299.

110. Daboussi M. J., Langin T. Transposable elements in the fungal plant pathogen Fusarium oxysporum II Genetica. 1994. Vol. 93. P. 49-59.

111. Daboussi M. J., Langin Т., Brygoo Y. Fotl, a new family of fungal• transposable elements // Mol. Gen. Genet. 1992. Vol. 232. P. 12-16.

112. Daviere J.M., Langin Т., Daboussi M.J. Potential role of transposable elements in the rapid reorganization of the Fusarium oxysporum genome // Fungal Genet. Biol. 2001. Vol. 34. P. 177-192.

113. Day P. R. Plant-parasite interaction: a genetical perspective // Plant Pathol. 1986. Vol. 35. P. 263.

114. De Queiroz M.V., Daboussi M.J. impala, a transposon from Fusarium oxysporum, is active in the genome of Penicillium griseoroseum II FEBS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 218. P. 317-321.

115. De Wit P.J.G.M. Molecular characterization of gene-for-gene systems in plant-fungus interactions and the application of avirulence genes in control of plant pathogens // Annu. Rev. Phytopathol. 1992. Vol.30. P.391-418.

116. Dewar K., Bernier L. Electrophoretic karyotypes of the elm tree pathogen Ophiostoma ulmi (sensu lato) // Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 238. P. 43-48.

117. Dewar K., Bernier L. Inheritance of chromosome-length polymorphisms in Ophiostoma ulmi (sensu lato) // Curr. Genet. 1995. Vol. 27. P. 541-549.

118. Di Pietro A., Anaya N., Roncero M.I.G. Occurrence of a retrotransposon-like sequence among different formae speciales and races of Fusarium oxysporum II Mycol. Res. 1994. Vol. 98. № 9. P. 993-996.

119. Diolez A., Marchez F., Fortini D., Brygoo Y. Boty, a long-terminal-repeat retroelement in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea II Appl. Environ. 1995. Vol.61. P.103-108.

120. Dobinson K. F., Harris R. E., Hamer J. E. Grasshopper, a long terminal repeat (LTR) retroelement in the phytopathogenic fungus Magnaporthe grisea II Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. Vol. 6. P. 114-126.

121. Dodd J. L. Recent developments in the maize pathogen Bipolaris zeicola Shoemaker// Maydica. 1993. Vol. 38. P. 201-204.

122. Drechsler C. Some graminicolous species of Helminthosporium II J. Agric. Res. 1923. N24. P. 641-740.

123. Duncan S., Barton J. E., O'Brien P. A. Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay // Mycol. Res. 1993. Vol.97. P.1075-1082.

124. Duveiller E., Altamirano G. Pathogenicity of Bipolaris sorokiniana isolates from wheat roots, leaves and grains in Mexico // Plant Pathology. 2000. Vol. 49. P. 235-242.

125. Eastwood R. F., Lagudah E. S., Appels R. A directed search for DNA sequences tightly linked to cereal cyst nematode resistance genes in Triticum tauschii II Genome. 1994. Vol.37. P.311-319.

126. Ellingboe A. H. Inheritance of specificity: the gene-for-gene hypothesis // Recognition and specificity in plant host-parasite interactions Jpn. Sci. Soc. Press, Tokyo, and university park Press, Baltimore. 1979. P. 3-15.

127. Ellingboe A. H. Segregation of avirulence on three rice cultivars in 16 crosses of Magnaporthe grisea И Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 597-601.

128. Elliott M. L., Des Jardin E. A., Henson J. M. Use of a polymerase chain reaction assay to aid in identification of Gaeumannomyces graminis var. graminis from different grass hosts // Phytopathology. 1993. Vol.83. P. 414-418.

129. El-Nashaar H. M., Stack R. W. Effect of long-term continuous cropping of spring wheat on aggressiveness of Cochliobolus sativus II Canad. J. Plant Sci. 1989. Vol. 69. P. 395-400.

130. Enkerli J., Bhatt G., Covert S.F. NHT1, a transposable element cloned from a dispensable chromosome in Nectria haematococca II Mol. Plant-Microbe Interac. 1997. Vol.10, № 6. P.742-749.

131. Excoffier L., Smouse P. E., Quattro J. M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction sites // Genetics. 1992. Vol. 131. P. 479-491.

132. Farman M. L., Taura S., Leong S. A. The Magnaporthe grisea DNA fingerprinting probe, MGR586, contains the 3' end of a inverted repeat transposon //Mol. Gen. Genet. 1996b. Vol. 251. P. 675-681.

133. Farman M.L., Tosa Y., Nitta N., Leong S.A. Maggy, a retrotransposon in the genome of the rice blast fungus Magnaporthe grisea И Mol. Gen. Genet. 1996a. Vol. 251. P. 665-674.

134. Felsenstein J. 'PHYLIP' phylogeny inference package version 3.2. // Cladistics. 1989. Vol.5. P. 164-166.

135. Fetch T.G., Jr., Steffenson B.J. Identification of Cochliobolus sativus expressing differential virulence on two-row barley genotypes from North Dakota // Canad. J. Plant Pathol. 1994. Vol. 16. P. 202-206.

136. Fincham J.R.S., Day P.R., Radford A. // Fungal genetics. Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1979, 636 p.

137. Flor H.H. Inheritance of reactions to rust in flux // J. Agric. Res. 1947. Vol. 74. P. 335-357.

138. Flor H.H. Host-parasite interection in flax- rust- its genetics and ohter implications // Phytopathol. 1955. Vol. 45. № 12. P. 680-685.

139. Forster H., Kinschert T. G., Leong S. A., Maxwell D. P. Molecular analysis of the mitochondrial genome of Phytophthora II Curr. Genet. 1987. Vol. 12. P. 215.

140. Francis D., Michelmore R. W. Two classes of chromosome-sized molecules are present in Bremia lactucae II Exp. Mycol. 1993. Vol.17. P. 284-300.

141. Frazzon a.P.G., Matsumura A.T.S., Van Der Sand S.T. Morphological characterization and genetic analysis of Drechslera teres isolates // Genetics and Mol. Biol. 2002. Vol. 25. № 2, 235-241.

142. Freeman S., Pham M., Rodriguez R.J. Molecular genotyping of Colletotrichum species based on arbitrarily primed PCR, A+T-rich DNA, and nuclear DNA analysis // Experim. Mycol. 1993. P. 309-322.

143. Garber R. G., Yoder О. C. Mitochondrial DNA of the fdamentous ^ ascomycete Cochliobolus heterostrophus // Curr. Genet. 1984. Vol. 8. P. 621.

144. Giovannoni J. J., Wing R.A., Ganal M W., Tanksley D. D. Isolation of molecular markers from specific chromosomal intervals using DNA pools from existing mapping populations //Nucl. Acids Res. 1991. Vol.19. P.6553-6558.

145. Ghazvini H., Tekauz A. Population structure of Bipolaris sorokiniana in western Canada // Poster: 9th Internat. Barley genetics Symposium, Czech Republic, 2004.

146. Goodwin P.H., Annis S.L. Rapid identification of genetic variation andpathotype of Leptosphaeria maculans by random amplified polymorphic DNA assay// Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol.57. P. 2482-2486.

147. Goodwin P. H., Euglish J. Т., Neher D. A., Duniway J. M., Kirkpatrick B.• C. Detection of Phytophthora parasitica from soil and host tissue with a species-specific DNA probes // Phytopathology. 1990. Vol.80. P. 277-281.

148. Goodwin P. H., Kirkpatrick В. C., Duniway J. M. Cloned DNA probes for identification of Phytophthora parasitica II Phytopathology. 1989. Vol.79. P. 716-721.

149. Goodwin P. H., Kirkpatrick В. C., Duniway J. M. Identification of Phytophthora citrophthora with clone DNA probes // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol.56. P.669-674.

150. Goodwin S. B, Saghai-Maroof M. A., Allard R. W., Webster R. V. Isozyme ® and restriction fragment length polymorphisms in Rhynchosporium secalis II

151. Phytopathology. 1986. Vol. 76. P. 1102.

152. Gordon T.R., Okamoto D. Vegetative compatibility groupings in a local population of Fusarium oxysporum II Canad. J. Bot. 1991. Vol.69. P. 168-172.

153. Grajal-Martin M. J., Simon C.J., Muehlbauer F.J. Use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) to characterize race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. pisi/I Phytopathology. 1993. Vol.83. P.612-614.

154. Guadet J., Julien J., Lafay J.F., Brygoo Y. Phylogeny of some Fusarium species, as determined by large-subunit rRNA sequence comparison // Mol. Biol. Evol. 1989. Vol. 6. № 3. P. 227-242.

155. Gupta S., R. Loughman, R. Lance, and M.G.K. Jones. Genetics of seedling and adult plant resistance in barley against Pyrenophora teres f. teres II Abstracts• of 2nd International workshop on Barley leaf blights, ICARDA, 7-11 April, 2002. P. 32.

156. Gusella J. F. DNA polymorphism and human disease // Ann. Rev. Biochem. 1980. Vol. 55. P. 831.

157. Hamelin R.C., Ouellette G.B., Bernier L. Identification of Gremmeniella abietina races with random amplified polymorphic DNA markers // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol.59. P.1752-1755.

158. Hamer J.E. Molecular probes for rice blast disease // Science. 1991. Vol. 252. P. 632-633.

159. Hamer J. E., Farrall L., Orbach M. J., Valent В., Chumley F. G. Host species-specific conservation of a family of repeated DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen // Proc. Nat. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 99819985.

160. Hayden H. L., Carlier J., Aitken E.A.B. The genetic structure of Australian populations of Mycosphaerella musicola suggests restricted gene flow at the continental scale //Phytopathology. 2005. Vol. 95. P. 489-498.

161. Hayden H. L., Pegg K. G. Aitken E.A.B., Irwin J.A.G. Genetic relationships as assessed by molecular markers and cross-infection among strains of Colletotrichum gloeosporioides II Aust. J. Bot. 1994. Vol.42. P.9-18.

162. He C., Masel A. M., Irwin J.A.G., Kelemu S., Manners J. M. Distribution and relationship of chromosome-specific dispensable DNA sequences in diverse isolates of Colletotrichum gloeosporioides II Mycol. Res. 1995. Vol. 99, № 11. P. 1325-33.

163. He C., Nourse J. P., Kelemu S., Irwin J. A. G., Manners J. M. CgTl: a non-LTR retrotransposon with restricted distribution in the fungal phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides II Mol. Gen. Genet. 1996. Vol. 252. P. 320-331.

164. Heath M.C. A generalized concept of hosr-parasite specificity // Phytopathology. 1981. Vol. 71. P. 1121-1123.

165. Heath M.C. The role of gene-for-gene interactions in the determination of host species specificity // Phytopathology. 1991. Vol. 81. P. 127-130.

166. Henson J. M. DNA hybridization and polymerase chain reaction (PCR) tests for identification of Gaeumannomyces, Phialophora and Magnaporthe isolates // Mycol. Res. 1992.Vol.96. P.629-636.

167. Henson J. M. DNA probe for identification of the take-all fungus, Gaeumannomyces graminis II Appl. Environ. Microbiol. 1989. Vol.55. P.284-288.

168. Hillis D., Dixon M. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference // Quart. Rev. Biol. 1991. Vol. 66. P. 411-452.

169. Hirrell M.C., Spradley J.P., Mitchell J.K., Wilson E.W. First report of tan spot caused by Drechslera tritici-repentis on winter wheat in Arkansas // Plant Disease. 1990. Vol. 74. № 3. P.252.

170. Но К. M., Tekauz A., Choo Т. M., Martin R. A. Genetic studies on net blotch resistance in barley cross// Canad. J. Plant Sci. 1996. Vol. 76. P. 715-719.

171. Hosford R. M., Jr., Solangi G.R.M., Kiesling R.L. Inheritance in Cochliobolus sativus II Phytopathology. 1975. Vol. 65. P. 699-703.

172. Hrushovetz S.B. Cytological studies of ascus development in Cochliobolus sativus II Canad. J. Bot. 1956. Vol. 34. P. 641-651.

173. Hua-Van A., Daviere J.M., Langin I., Daboussi M.J. Genome organization in Fusarium oxysporum'. clusters of class II transposons // Curr. Genet. 2000. Vol. 37. P. 339-347.

174. Hulbert S. H., Michelmore R. W. DNA restriction fragment length polymorphism and somatic variation in the lettuce downy mildew fungus, Bremia lactucae И Mol. Plant-Microbe Interac. 1988. Vol. 1. P. 17-22.

175. Ito S. On some new ascigerous stages of the species of Helminthosporium parasitica on cereals // Proceed. Imp. Acad. Tokyo. 1930. N6. P. 352-355.

176. Ito S., Kuribayashi K. The ascigerous forms of some graminicolous species of Helminthosporium in Japan // J. facul. Agric., Imp. Univ. 1931. Vol. 29. P. 85125.

177. Jeffreys A. J., Wilson V., Thein S. I. Individual-specific "fingerprints" of human DNA // Nature. 1985. Vol. 316. P. 76-79.

178. Jones L.C. Studies of compatibility in Australian isolates of Bipolaris sorokiniana И Aust. J. Biol. Sci., 1971, 24, 51-55.

179. Jones D.A. Genetic properties of inhibitor genes in flax rust that alter avirulence to virulence on flax // Phytopathology. 1988. Vol. 78. P. 342-344.

180. Jones. M. J., Dunkle L. D. Analysis of Cochliobolus carbonum races by PCR amplification with arbitrary and one-specific primers // Phytopathology. 1993. Vol.83. P. 366-370.

181. Jonsson R., Sail Т., Bryngelsson T. Genetic divercity for random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in two Swedish populations of Pyrenophora teres II Canad. J. Plant. Pathol. 2000. Vol. 22. P. 258-264.

182. Judelson H. S., Randall T. A. Families of repeated DNA in the oomycete Phytophthora infestans and their distribution within the genus // Genome. 1998. Vol. 41. P. 605-615.

183. Julien J., Poirier-Hamon S., Brygoo Y. Foretl, a reverse transcriptase-like sequence in the filamentous fungus Fusarium oxysporium II Nucl. Acids Res. 1992. Vol.20. P. 3933-37.

184. Kachroo P., Leong S. A., Chattoo В. B. Mg-SINE: a short interspersed nuclear element from the rice blast fungus Magnaporthe grisea II Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 11125-29.

185. Kachroo P., Leong S. A., Chattoo В. B. Pot2, an inverted repeat transposon from the rice blast fungus Magnaporthe grisea II Mol. Gen. Genet. 1994. Vol. 245. P. 339-48.

186. Kafer E. High frequency of spontaneous and induced somatic segregation in Aspergillus nidulans //Nature (Lond.). 1960. Vol. 186. P. 619-620.

187. Kafer E. The processes of spontaneous recombination in vegetative nuclei of Aspergillus nidulans II Genetics. 1961. Vol. 46. P. 1581-1609.

188. Kaneko I., Tanaka A., Tsuge T. REAL, an LTR retrotransposon from the plant pathogenic fungus Alternaria alternata II Mol. Gen. Genet. 2000. Vol. 263. P. 625-634.

189. Kang S., Sweigard J.A., Valent B. The PWL host specificiry gene family in the blast fungus Magnaporthe grisea II Mol. Plant-Microbe Interac. 1995. Vol. 8. P. 939-948.

190. Kang S. Organization and distribution of MGLR-3, a novel retrotransposon in the rice blast fungus Magnaporthe grisea II Fungal genet. Biol. 2001. Vol. 32. P. 11-19.

191. Kathariou S., Spieth P. T. Spore killer polymorphism in Fusarium moniliforme II Genetics. 1982. Vol. 102.P. 19-24.

192. Keiper F.J., Hayden M.J., Park R.F., Wellimgs C.R. Molecular genetic variability of Australian isolates of five cereal rust pathogens // Mycol. Res. 2003. Vol. 107. P. 545-556.

193. Keller N.P., Bergstrom G.C., Yoder O.C. Mitotic stability of transforming DNA is determined by its chromosomal configuration in the fungus Cochliobolus heterostrophus II Сип. Genet. 1991. Vol. 19. P. 227-233.

194. Keller S.M., McDermott J.M., Pettway R.E., Wolfe M.S., McDonald B.A. Gene flow and sexual reproduction in the wheat glume blotch pathogen Phaeosphaeria nodorum (anamorph Stagonospora nodorum) // Phytopathology. 1997. Vol. 87. P. 353-358.

195. Kempken F., Kuck U. Restless, an active Ac-like transposon from the fungus Tolypocladium inflatum: structure, expression, an alternative splicing // Mol. Cell. Biol. 1996. Vol.16. P. 6563-72.

196. Kenneth R. On the taxonomy, morphology and geographic origins of Pyrenophora teres Drechslera and allied species // Bull. Res. Counc. of Israel. 1962. Vol. 1 ID. P. 55-77.

197. Khan T.N. Host specialization by Western Australian isolates causing net blotch symptoms on Hordeum II Trans. Br. Mycol. Soc. 1973. Vol. 61. № 1. P. 215-220.

198. Kim H.G., Meinhart L.W., Benny U., Kistler H.C. Nrsl, a repetitive element linked to pisatin demethylase genes on a dispensable chromosome of Nectria haematococca II Mol. Plant-Microbe Interac. 1995. Vol. 4. P. 524-531.

199. Kistler H. С., Bosland P. W., Benny U. et al. Relatedness of strains of Fusarium oxysporum from crucifers measured by examination of mitochondrial and ribosomal DNA // Phytopathology. 1987. Vol. 77. P. 1289.

200. Kistler H.C., Miao V.P.W. New modes of genetic change in filamentous fungi // Ann. Rev. Phytopathol. 1992. Vol. 30. P.131-152.

201. Klassen G.R., Balcerzak M., de Cock A.W.A.M. 5S ribosomal RNA gene spacers as species-specific probes for eight species of Pythium II Phytopathology. 1996. Vol. 86. P. 581-587.

202. Kline D.M., Nelson R.R. Variation in mating capacities among 103 isolates of Cochliobolus sativus II Phytopathology. 1968. Vol. 58. P. 1059.

203. Kline D.M., Nelson R.R. The inheritance of factors in Cochliobolus sativus conditioning lesion induction on gramineous hosts // Phytopathology. 1971. Vol. 61. P. 1052-54.

204. Kohli Y., Kohn L.M. Random association among alleles in clonal populations of Sclerotinia sclerotiorum II Fungal Genetics and Biology. 1998. Vol. 23. P. 139149.

205. Kohli Y., Morrall R.A.A., Anderson J.B., Kohn L.M. Local and trans-Canadian clonal distribution of Sclerotinia sclerotiorum on Canola // Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 875-880.

206. Kohn L. M. The clonal dynamic in wild and agricultural plant-pathogen populations//Canad. J. Bot. 1995. Vol. 73 , Suppl.l. P. S1231-40.

207. Kohn L. M., Petsche D. M., Novak L. A., Anderson J. B. Restriction fragment length polymorphisms in nuclear and mitochondrial DNA of Sclerotinia species // Phytopathology. 1988. Vol. 78. P. 1047-1051.

208. Kolmer J.A., Liu J.Q., Sies M. Virulence and molecular polymorphism in Puccinia recondita f. sp. tritici in Canada // Phytopathology. 1995. Vol. 85. P. 276285.

209. Krishnapillai V. Horizontal gene transfer // J. Genet. 1996. Vol. 75. P. 219232.

210. Krupinsky J. M. Grass hosts of Pyrenophora tritici-repentis II Plant Disease. 1992. Vol.76. N1. P. 92-95

211. Kumar J., Nelson R. J., Zeigler R. S. Population structure and dynamics of Magnaporthe grisea in the Indian Himalayas // Genetics. 1999. Vol. 152. P. 971984.

212. Lacicowa В. Бобовые растения хозяева Helminthosporium sorokiniana Sacc. II Ochrona Roslin. 1972, № 8-9. P. 9-10.

213. Lamb B.C. Ascomycete genetics: the part played by ascus segregation phenomena in our understanding of the mechanisms of recombination // Mycol. Res. 1996. Vol. 100. P. 1025-1059.

214. Langin Т., Сару P., Daboussi M. J. The transposable element impala, a fungal memeber of the Tc-1 mariner superfamily // Mol. Gen. Genet. 1995. Vol. 246. P. 19-28.

215. Lau G.W., Chao C.T., Ellingboe A.H. Interaction of genes controlling avirulence/virulence of Magnaporthe grisea on rice cultivar Katy // Phytopathology. 1993. Vol. 83. P. 375-382.

216. Lauge R., Joosten M.H.A., Haanstra J.P.W. et al. Successful search for a resistance gene in tomato targeted against a virulence factor of a fungal pathogen // Proc. Nat. Acad. Sci. 1998. Vol. 95. P. 9014-18.

217. Levis C., Fortini D., Brygoo Y. Flipper, a bacterial-like transposable element in Botrytis cinerea II Mol. Gen. Genet., in press.

218. Leung H., Borromeo E.S., Bernardo M.A., Nottenghem J.L. Genetic analysis of virulence in the rice blast fungus Magnaporthe grisea // Phytopathology. 1988. Vol. 78, № 9. p. 1227-1233.

219. Levy M., Romao J., Marchetti M.A., Hamer J.E. DNA fingerprinting with a dispersed repeated sequence resolves pathotype diversity in the rice blast fungus// Plant Cell. 1991. Vol.3. P.95-102.

220. Lewontin R.C. On measures of gametic disequilibrium // Genetics. 1998. Vol. 120. P. 849-852.

221. Liew E.C.Y., Irwin J.A.G. Comparative studies on Phytophthora megasperma isolates from chickpea collected in Australia and Spain // Mycol. Res. 1994. Vol.98. P.1284-1290.

222. Liew E.C.Y., Maclean D.J., Irwin J.A.G. Specific PCR based detection of Phytophthora medicaginis using the intergenic spacer region of the ribosomal DNA // Mycol. Res. 1998. Vol. 102. P. 73-80.

223. Linder-Basso D., Foglia R., Zhu P., Hillman B.I. Crypt 1, an active Ac-like transposon from the chestnut blight fungus, Cryphonectria parasitica II Mol. Genet. Genomics. 2001. Vol. 265. P. 730-738.

224. Liu J. Q., Kolmer J. A. Molecular and virulence diversity and linkage disequilibria in asexual and sexual populations of the wheat leaf rust fungus, Puccinia recondite II Genome. 1998. Vol. 41. P. 832-840.

225. Luo C.X., Fujita Y., Hirayae K. et al. Identification of Magnaporthe oryzae avirulence genes to three rice blast resistance genes I I Plant Disease. 2004. Vol. 88. P. 265-270.

226. Luttrell E.S. Systematics of Helminthosporium and related genera // Mycologia. 1964. Vol. 56. P. 119-201.

227. Luz W.C., Hosford R.M. Twelve Pyrenophora trichostoma races for virulence of wheat in central Plains of North America // Phytopathology. 1980. Vol.70. N.12.P.1193-1196.

228. Magee B.B., D'Souze T.M., Magee P.T. Strain and species identification by restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal DNA repeat of Candida albicans //J. Bacteriol. 1987. Vol.169. P.1639-1643.

229. Manicom B. Q., Bar-Joseph M., Rosner A. et al. Potential application of random DNA probes and restriction fragment length polymorphisms in the taxonomy of the Fusaria II Phytopathology. 1987. Vol. 77. P. 669.

230. Manicom B.Q., Bar-Joseph M., Kotze J.M., Becker M.M. A Restriction fragment length polymorphism probe relating vegetative compatibility groups and pathogenicity in Fusarium oxysporum f. sp. dianthi II Phytopathology. 1990. Vol. 80. P. 336-339.

231. Manninen O., Kalendar R., Robinson J., Schulman A.H. Application of BARE1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net blotch in barley//Mol. Gen. Genet. 2000. Vol. 264. P. 325-334.

232. Manninen O., Serenius M., Mironenko N. Progress in mapping of Pyrenophora teres chromosomes // Modern problems of cereal resistance to deseases: Internat. Symp. St.-Petersburg, 2002. P.265.

233. Mahuku G.S., Riascos J.J. Virulence and molecular diversity within Colletotrichum lindemuthianum isolates from Andean and Mesoamerican bean varieties and regions // European J. Plant Pathol. 2004. Vol.110. P.253-263.

234. Manulis S., Kogan N., Reuven M., Ben-Yephet Y. Use of the RAPD technique for identification of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi from carnation // Phytopathology. 1994. Vol.84. P.98-101.

235. Masel A., Braithwaite K., Irwin J., Manners J. Highly variable molecular karyotypes in the plant pathogen Colletotrichum gloeosponoxdzs // Curr. Genet. 1990. Vol.18. P. 81-86.

236. Masel A. M., Irwin J. A. G., Manners J. M. DNA addition or deletion is associated with a major karyotype polymorphism in the fungal phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides II Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 237. P. 73-80.

237. Masel A. M., Irwin J. A. G., Manners J. M. Mini-chromosomes of Colletotrichum spp. infecting several host species in various countries // Mycol. Res. 1993. Vol. 97, № 7. P. 852-856.

238. Masel A. M., Struijk N., Mclntyre C. L., Manners J. M. A strain-specific cyclin homolog in the fungal phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides II Gene. 1993. Vol. 133. P. 141-145.

239. Maynard S. J., Smith N. H., O'Rourke M., Spratt B. G. How clonal are bacteria? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 4384.

240. McDermott J. M., McDonald B. A., Allard R. W., Webster R. K. Genetic variability for pathogenicity, isozyme, ribosomal DNA and colony color variation in populations of Rhinchosporium secalis II Genetics. 1989. Vol. 122. P. 561-565.

241. McDonald B.A. The population genetics of fungi: tools and techniques // Phytopathology. 1997. Vol.87. P. 148-453.

242. McDonald B.A., Linde С. The population genetics of plant pathogens and breeding strategies for durable resistance // Euphytica. 2002. Vol. 124. P. 161-180.

243. McDonald B. A., Martinez J. P. Restriction fragment length polymorphisms in Septoria tritici occur at a high frequency // Curr. Genet. 1990. Vol. 17. P. 133138.

244. McDonald B.A., Martinez J.P. Chromosome length polymorphisms in a Septoria tritici population // Curr. Genet. 1991. Vol.19. P. 265-271.

245. McDonald B.A., Martinez J.P. DNA fingerprinting of the plant pathogen fungus Mycosphaerella graminicola (anamorph Septoria tritici) II Experim.Mycol. 1991. Vol.15. P.146-158.

246. McDonald B.A., Mundt C.C., Chen R-S. The role od selection on the genetic structure of pathogen populations: evidence from fieald experiments with Mycosphaerella graminicola on wheat // Euphytica. 1996. Vol. 92. P. 73-80.

247. McDonald B. A., Zhan J., Burdon J J. Genetic structure of Rhynchosporium secalis in Australia // Phytopathology. 1999. Vol. 89. P.639-645.

248. McDonald W. C. Heterotallism in Pyrenophora teres II Phytopathology. 1963. Vol. 53, №7. P. 771-773.

249. McDonald W.C. Variability and the inheritance of morphological mutants in Pyrenophora teres II Phytopathology. 1967. Vol. 57. № 7. P. 747-755.

250. McHale M.T., Roberts I.N., Noble S.M., Oliver R.P. CfT-I: an LTR-retrotransposon in Cladosporium fulvum, a fungal pathogen of tomato // Mol. Gen. Genet. 1992. Vol. 233. P. 337-347.

251. Megnegneau В., Debets F., Hoekstra R.F. Genetic variability and relatedness in the complex group of black Aspergilli based on random amplification of polymorphic DNA // Curr. Genet. 1993. Vol.23. P.323-329.

252. Miao V.P., Covert S.F., VanEtten H.D. A fungal gene for antibiotic resistance on a dispensable ("B") chromosome // Science. 1991. Vol. 254. P. 177376.

253. Michelmore R.W., Hulbert S.H. Molecular markers for genetic analysis of phytopathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopathol. 1987. Vol.25. P.383-404.

254. Migheli Q., Berio Т., Gullino L. Electrophoretic karyotypes of Fusarium spp. // Exp. Mycol. 1993. Vol. 17. P. 329-337.

255. Milgroom M.G. Recombination and the multilocus structure of fungal populations // Annu. Rev. Phytopathol. 1996. Vol.34. P. 457-477.

256. Mironenko N. V., S. A. Bulat. Genetic structure of Cochliobolus sativus {Bipolaris sorokiniana) populations isolated from different hosts as revealed by UP-PCR (RAPD-like) technique // J. Russian Phytopathol. Society. 2001. Vol. 2. Part 1. P.25-30.

257. Mironenko N., Filatova O., Afanasenko O. Genetic control of Pyrenophora teres virulence to three barley accessions // Proc. 6th Conf. of EFPP 2002, Prague. / Plant Protection Sci., (Special Issue 2). 2002. Vol.38. P. 612-614.

258. Mode C.Y., Schaller C. W. Two additional factors for host resistance to net blotch in barley //Agricult. J. 1958. Vol. 50. P. 15-18.

259. Morales V.M., Seguin-Swartz G., Taylor J.L. Chromosome size polymorphism in Leptosphaeria maculans II Phytopathology. 1993. Vol.83. P. 503-509.

260. Mouyna I., Renard J.L., Brygoo Y. DNA polymorphism among Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis populations from oil palm, using a repeated and dispersed sequense "palm" //Curr. Genet. 1996. Vol. 30. P. 174-180.

261. Mundt C.C. Probability of mutation to multiple virulence and durability of resistance gene pyramids // Phytopathology. 1990. Vol. 80. № 3. P. 221-223.

262. Murakami J., Tomita R., Kataoka T. et al. Analysis of host specificity of Magnaporthe grisea toward foxtail millet using a genetic cross between isolates from wheat and foxtail mille // Phytopathology. 2003. Vol. 93. P. 42-45.

263. Muthumeenakshi S., Mills P.R., Brown A.E., Seaby D.A. Interspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in the British isles // Microbiology. 1994. Vol. 140. P. 769-777.

264. Nagy R., Hornok L. Electrophoretic karyotype differences between two subspecies of Fusarium acuminatum II Mycologia. 1994. Vol. 86. P. 203-208.

265. Nagy R., Taborhegyi E., Wittner A., Hornok L. Mini-chromosomes in Fusarium sporotrichioides are mosaic of dispersed repeats and unique sequences // Microbiology. 1995. Vol.141. P. 713-719.

266. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA ) 1973. Vol.70. P. 3321-3323.

267. Nelson R. R. A correlation of interspecific fertility and conidial morphology in species of Helminthosporium exhibiting bipolar germination // Mycologia. 1960, a. Vol. 52. P. 753-761.

268. Nelson R. R. Evolution of sexuality and pathogenicity. I. Interspecific crosses in the genus Helminthisporium II Phytopathology. 1960, b. Vol.50. P.375-377.

269. Nelson R. R. Evidence of gene pools for pathogenicity in species of Helminthosporium II Phytopathology. 1961, a. Vol. 51. P. 736-737.

270. Nelson R. R. Evolution of sexuality and pathogenicity. II. A comparison of the pattern of sexuality in Cochliobolus victoriae and related species // Phytopathology. 1961,b. Vol. 51, № 4. P. 222-223.

271. Nelson R. R., Kline D. M. Intraspecific variation in pathogenicity in the genus Helminthosporium to gramineous species // Phytopathology. 1962. Vol. 52. P. 1045-1049.

272. Nelson R. R., Kline D. M. Gene systems for pathogenicity and pathogenic potentials. I. Interspecific hybrids of Cochliobolus carbonum x Cochliobolus victoriae 11 Phytopathology. 1963. Vol. 53. P. 101-105.

273. Nelson R. R., MacKenzie G.L., Scheifele G. L. Interaction of genes for pathogenicity and virulence in Trichometasphaeria turcica with different members of genes for vertical resistance in Zea mays И Phytopathology. 1970. Vol. 60, №8. P. 1250-1254.

274. Neuveglise C., Brygoo Y., Vercambre В., Riba G. Comparative analysis of molecular and biological characteristics of strains of Beauveria brongniartii isolated from insects // Mycol. Res. 1994. Vol. 98, № 3. P. 322-328.

275. Nicholson P., Rezanoor H.N. The use of random amplified polymorphic DNA to identify pathotype and detect variation in Pseudocercosporella herpotrichoides //Mycol. Res. 1994. Vol. 98. P. 13-21.

276. Nishimura M., Hayashi N., Jwa N. S., Lau G. W., Hamer J. E., Hasebe A. Insertion of the LINE retrotransposon MGL causes a conidiophore pattern mutation in Magnaporthe grisea И Mol. Plant-Microbe Interac. 2000. Vol. 13. P.892-894.

277. Nixon K., Wheeler Q. D. An amplification of the phylogenetic species concept // Cladistics. 1990. Vol. 6. P. 211-223.

278. Notteghem J. L., Silue D. Distribution of the mating type alleles in Magnaporthe grisea populations pathogenic on rice // Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 421-424.

279. Obst A., Huber G. Wirkungslucken der quecksilberfreien Getreidebeizmittel: Helminthosporiosen // Gesunde Pflanzen. 1985. Bd.37. S.324-331.

280. Oliveira A. M. R„ Matsumura A. T. S., Prestes A. M., Van der Sand S. T. Intyraspecific variability of Bipolaris sorokiniana isolates determined by random-amplified polymorphic DNA (RAPD) // Genet. Mol. Res. 2002. Vol. 1, №4. P. 350-358.

281. Orolaza N. P., Lamari L., Ballance G. M. Evidence of a host-specific chlorosis toxin from Pyrenophora tritici-repentis, the causal agent of tan spot of wheat//Phytopathology. 1995. Vol. 85. P. 1282-1287.

282. O'Sullivan D., Tosi P., Creusot F., Langin T. Variation in genome organization of the plant pathogenic fungus Colletotrichum lindemuthianum II Curr. Genet. 1998. Vol. 33. P. 291-298.

283. Ouellet Т., Seifert K. A. Genetic characterization of Fusarium graminearum strains using RAPD and PCR amplification // Phytopathology. 1993. Vol. 83. P. 1003-1007.

284. Panaccione D. G. The fungal genus Cochliobolus and toxin-mediated plant disease // Trends in microbiol. 1993. Vol. 1, № 1. P. 14-20.

285. Panaccione D.G., Pitkin J.W., Walton J.D., Annis S.L. Transposon-like sequences at the TOX2 locus of the plant-pathogenic fungus Cochliobolus carbonum II Gene. 1996. Vol. 176. P. 103-109.

286. Pecchia S., Mercatelli E., Vannacci G. PCR amplification and characterization of the intergenic spacer region of the ribosomal DNA in Pyrenophora graminea IIFEMS Microbiol. Letters. 1998. Vol. 166. P. 21-27.

287. Peever T L., Milgroom M. G. Genetic structure of Pyrenophora teres populations determined with random amplified polymorphic DNA markers // Canad. J. Botan. 1994. Vol. 72. P. 915-923.

288. Perkins D. D. In praise of diversity // More gene manipulations in fungi / Eds. J.W. Bennett, L.L. Lasure. 1991, AP, Inc. P.3-26.

289. Piening L. J. The occurrence of Pyrenophora teres on barley straw in Alberta//Canad. Plant Dis. Survey Dec. 1961. Vol. 41, № 5. p. 299-300.

290. Plummer К. M., Dunse K., Howlett B. J. Non-aggressive strains of the blackleg fungus, Leptosphaeria maculans, are present in Australia and can be distinguished from aggressive strains by molecular analysis // Aust. J. Botan. 1994. Vol.42. P.l-8.

291. Plummer K.M., Howlett B.J. Major chromosomal length polymorphisms are evident after meiosis in the phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans II Curr. Genet. 1993. Vol. 24. P. 107-113.

292. Poupard P., Simonet P., Cavelier N., Bardin R. Molecular characterization of Pseudocercosporella herpotrichoides isolates by amplification of ribosomal DNA internal transcribed spacers//Plant Pathology. 1993. Vol.42. P.873-881.

293. Pringle R.B. Comparative biochemistry of the phytopathogenic fungus Helminthosporium. XVI. The production of victoxinine by H. sativum and H. victoriae II Canad. J. Biochem. 1976. Vol. 54. P. 783-787.

294. Pukkila P. J., Skrzynia C. Frequent changes in the number of reiterated ribosomal RNA genes throughout the life cycle of the basidiomycete Coprinus cinereus H Genetics. 1993. Vol. 133. P. 203-211.

295. Raemaekers R. H. Helminthosporium sativum: disease complex on wheat and sources of resistance in Zambia // Wheat production constraints in tropical environments. CIMMYT. 1988. P. 175-185.

296. Raju N. B. Ascomycete spore killers: chromosomal elements that distort genetic ratios among the products of meiosis // Mycologia. 1994. Vol. 86. № 4. P. 461-473.

297. Raju N. B. Meiotic drive in fungi: chromosomal elements that cause fratricide and distort genetic ratios // J. Genet. 1996. Vol. 75. P. 287-296.

298. Rasmussen M., Rossen L., Giese H. SINE-like properties of a highly repetitive element in the genome of the obligate parasitic fungus Erysiphe graminis f. sp. hordei II Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 239. P. 298-303.

299. Reeves J. C., Ball S.F.L. Research note: preliminary results on the identification of Pyrenophora species using DNA polymorphisms amplified from arbitrary primers//Plant Varieties and Seeds. 1991. Vol.4. P.184-189.

300. Reis E. M. Selective medium for isolating Cochliobolus sativus from soil // Plant Disease. 1983. Vol. 67. P. 68-70.

301. Ristaino J. В., Madritch M., Trout C.L., Parra G. PCR amplification of ribosomal DNA for species identification in the plant pathogen genus Phytophthora II Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol.64. P. 948-954.

302. Rollo F., Amici A., Foresi F., Silvestro I. Construction and characterization of a cloned probe for the detection of Phoma tracheiphila in plant tissues // Appl. Microbiology and Biotechnology. 1987. Vol.26. P.352-357.

303. Romera F., Jimenez M.M., Puertas M.J. Factors controlling the dynamics of the В chromosome polymorphism in Korean rye // Heredity. 1991. Vol. 67. P. 189195.

304. Russell B.W., Mills D. Electrophoretic karyotypes of Tilletia caries, T. controversa, and their F1 progeny: further evidence for conspecific status // Mol. Plant-Microbe Interac. 1993. Vol. 6. P. 66-74.

305. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase// Science. 1988. Vol.239. P.487-491.

306. Salamati S., Zhan J., Burdon J.J., McDonald B.A. The genetic structure of field populations of Rhynchosporium secalis from three continents suggests moderate gene flow and regular recombination // Phytopathology. 2000. Vol. 90. P. 901-908.

307. Santini A., Capretti P. Analysis of the Italian population of Ceratocystis fimbriata f. sp. platani using RAPD and minisatellite markers // Plant Pathology. 2000. Vol. 49. P. 461-467.

308. Sauer R.M., Hulbert S.H., Tisserat N.A. Identification of Ophiosphaerella /zerpotricha by cloned DNA probes // Phytopathology. 1993. Vol.83. P.97-102.

309. Schaller C. W., Wiebe G. A. Sources of resistance to net blotch of barley // Agr. J. 1952. №6. P. 334-336.

310. Scheffer R.P. Role of toxins in evolution and ecology of plant pathogenic fungi //Experientia. 1991. Vol. 47. P. 804-811.

311. Schwartz D. C., Cantor C. R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis // Cell. 1984. Vol. 24. P. 579-613.

312. Scneider S., Kueffer J.-M., Roessli D., Excoffier L. Arlequin ver.l.l: a software for population genetic data analysis. Distributed by the authors. Genetics and biometry laboratory, University of Geneva, Switzerland. 1997.

313. Sebesta J., Zwatz В., Roderick H. W. et al. Incudence of Pyrenophora avenae Ito et Kurib. in Europe between 1994-1998, and the varietal reaction of oat to it// Plant Protect. Sci. 2001. Vol. 37. N3. P. 91-95.

314. Serenius M., Mironenko N., Manninen O. Molecular diversity on Finnish barley net blotch {Pyrenophora teres) populations. Abstract on NJF's Congress, 2003.

315. Serenius M., Mironenko N., Manninen O. Genetic variation, occurence of mating types and different forms of Pyrenophora teres causing net blotch of barley in Finland // Mycol. Res. 2005. Vol. 109. N7. P.809-817.

316. Shoemaker R.A. Biology, cytology, and taxonomy of Cochliobolus sativus II Canad. J. Bot. 1955. Vol. 33. P. 562-576.

317. Shoemaker R.A. Nomenclature of Drechslera and Bipolaris grass parasites segregated from Helminthosporium // Canad. J. Bot. 1959. Vol.35. P.52-56.

318. Shull V., Hamer J.E. Genetic differentiation in the rice blast fungus revealed by the distribution of the fosbury retrotransposon // Fungal Genet. And Biol. 1996. Vol. 20. P. 59-69.

319. Silue D., Nottenghem L., Tharreau D. Evidence of a gene-for-gene relationship in the Oryza sativa — Magnaporthe grisea pathosystem // Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 577-580.

320. Simcox К. D., Nickrent D., Pedersen W. L. Comparison of isozyme polymorphism in races of Cochliobolus carbonum II Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 621-624.

321. Sivanesan A. Graminicolous species of Bipolaris, Curvularia, Drechslera, Exserohilum and their teleomorphs // Mycological Papers. 1987. No. 158. P. 1261.

322. Slatkin M. Isolation of distance in equilibrium and non-equilibrium populations. // Evolution. 1993. Vol. 47. P. 264-279.

323. Smedegard-Petersen, V. Pyrenophora teres f. maculata f. nov. and Pyrenophora teres f. teres on barley in Denmark / Yearbook of the Royal Veterinary and Agricultural University. Copenhagen, DK. 1971. P. 124-144.

324. Smedegaard-Petersen V. Inheritance of genetic factors for symptoms and pathogenicity in hybrid of Pyrenophora teres and Pyrenophora graminea II Phytopath. Z. 1977. Vol. 89. P. 193-202.

325. Smedegaard-Petersen V. Cross fertility and genetic relationship between Pyrenophora teres and P. graminea. The causes of net blotch and leaf stripe of barley // Seed Sci. & Technol. 1983. Vol. 11. P. 673-680.

326. Sneath P. H. A., Sokal R. R. Numerical taxonomy. San Francisko, California, 1973.573 p.

327. Sone Т., Suto M., Tomita F. Host species-specific repetitive DNA sequence in the genome of Magnaporthe grisea, the rice blast fungus // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. Vol. 57. P. 1228-1230.

328. Stakman E. C. Biologic forms of Puccinia graminis on cereals and grasses // J. Agric. Res. 1917. Vol. 10. P. 429-495.

329. Steffenson B. J. Durable resistance to spot blotch and stem rust in barley // Burley Genetics 2000. Vol. 8. P. 39-44

330. Steffenson B. J., Hayes P. M., Kleinhofs A. Genetics of seedling and adult plant resistance to net blotch {Pyrenophora teres f. teres) and spot blotch {Cochliobolus sativus) in barley // Theor. Appl. Genet. 1996. Vol. 92. P. 552-558.

331. Stenlid J., Karlsson J-O., Hogberg N. Intraspecific genetic variation in Heterobasidion annosum revealed by amplification of minisatellite DNA // Mycol. Res. 1994. Vol. 98. P. 57-63.

332. Talbot N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea II Annu. Rev. Microbiol. 2003. Vol.57. P. 177-202.

333. Talbot N. J., Salch Y. P., Ma M., Hamer J. E. Karyotypic variation within clonal lineages of the rice blast fungus, Magnaporthe grisea II Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59, № 2. P. 585-593.

334. Taylor J. L. A simple, sensitive, and rapid method for detecting seed contaminated with highly virulent Leptosphaeria maculans II Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59. P .3691-3685.

335. Taylor J. L., Borgmann I., Seguin-Swartz G. Electrophoretic karyotyping of Leptosphaeria maculans differentiates highly virulent from weakly virulent isolates // Curr. Genet. 1991. Vol. 19. P. 273-277.

336. Taylor J. W., Jacobson D. J., Kroken S. et al. Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi // Fungal genetics and biology. 2000. Vol. 31. P. 21-32.

337. Tekauz A. Characterization and distribution of pathogenic variation in Pyrenophora teres f. teres and P. teres f. maculate from western Canada // Canad. J. Plant Pathol. 1990. Vol. 12. P. 141-148.

338. Tham F. Y., Lucas J. A., Wilson Z. A. DNA fingerprinting of Peronospora parasitica, a biotrophic fungal pathogen of crucifers // Theor. Appl. Genet. 1994. Vol. 88. P. 490-496.

339. Tibayrenc M., Ayala F.J. Towards a population genetics of microorganisms: the clonal theory of parasitic p rotozoa // Parasitology Today. 1991. Vol. 7, № 9. P. 228-232.

340. Tinline R.D. Studies on the perfect stage of Helminthosporium sativum II Canad. J. Bot. 1951. Vol. 29. № 5. P. 467-478.

341. Tinline R.D. Cochliobolus sativus. V. Heterokaryosis and parasexuality // Canad. J. Bot. 1962. Vol. 40. P. 425-437.

342. Tinline R. D. Cochliobolus sativus, a pathogen of wide host range // Advances in Plant Pathology / Eds. D.S. Ingram et al. Acad. Press. London. 1988. Vol. 6. P. 113-122.

343. Tinline R.D., Dickson J.G. Cochliobolus sativus. I. Perithecial development and the inheritance of spore color and mating type // Mycologia. 1958. Vol. 50. P. 697-706.

344. Tinline R.D., Harding H. Inheritance of some genetic markers in Cochliobous sativus II Mycologia. 1988. Vol. 80. № 6. P. 863-865.

345. Tisserat N.A., Hulbert S.H., Nus A. Identification of Leptosphaeria korrae by cloned DNA probes // Phytopathology. 1991. Vol.81. P.917-921.

346. Tredway L.P., Stevenson K.L., Burpee L.L. Genetic structure of Magnaporthe grisea populations associated with St. Augustinegrass and tall fescue in Georgia // Phytopathology. 2005. Vol. 95. P. 463-471.

347. Tsai H-F., Liu J-S., Staben C. et al. Evolutionary diversification of fungal endophytes of tall fescue grass by hybridization with Epichloe species // Proc. Nat. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 2542-2546.

348. Tsuchiya D., Taga M. Cytological karyotyping of three Cochliobolus spp. by the germ tube burst method // Phytopathology. 2001. Vol. 91. P. 354-360.

349. Turner B.C., Perkins D.D. Spore killer, a chromosomal factor in Neurospora that kills meiotic products not containing it // Genetics. 1979. Vol. 93. P. 587-606.

350. Tzeng T-H., Lyngholm L.K., Ford C.F., Bronson C.R. A restriction fragment length polymorphism map and electrophoretic karyotype of the fungal maize pathogen Cochliobolus heterostrophus II Genetics. 1992. Vol. 130. P. 81-96.

351. Valent В., Farrall L., Chumley F. Magnaporthe grisea genes for pathogenicity and virulence identified through a series of backcrosses // Genetics. 1991. Vol. 127. P. 87-101.

352. Vaillancourt L. V., Hanau R. M. Genetic and morphological comparisons of Glomerella (Colletotrichum) isolates from maize and from sorghum // Exper. Mycol. 1992. Vol.16. P.219-229.

353. Valjavec-Gratian M., Steffenson B. J. Genetics of virulence in Cochliobolus sativus and resistance in barley // Phytopathology. 1997. Vol. 87. P. 1140-43.

354. Valjavec-Gratian M., Steffenson B. J. Pathotypes of Cochliobolus sativus on barley in North Dakota // Plant Disease. 1997. Vol. 81. P. 1275-78.

355. Vandenberg C. G. J., Rossnagel B. G. Epidemiology of spot type net blotch on spring barley in Saskatchewan // Phytopathology. 1991.Vol. 81, № 11. P. 14461452.

356. Vilgalys R., Hester M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from Cryptococcus species // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 4238-4246.

357. Vos P., R. Hogers, M. Bleekers, M. Reijans, T. van der Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper and M. Zabeau. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. //Nucl. Acid. Res. 1995. Vol. 23. P. 4407-4414.

358. Walton J.D., Panaccione D.G. Host-selective toxins and disease specificity: perspectives and progress // Annu. Rev. Phytopathol. 1993. Vol. 31. P. 275-303.

359. Waugh R., Powell W. Using RAPD markers for crop improvement // TIBTECH. 1992. Vol. 10. P. 186-191.

360. Weiland J.J., Steffenson B.J., Cartwright R.D., Webster R.K. Identification of molecular genetic markers in Pyrenophora teres f. teres associated with low virulence on 'Harbin' barley // Phytopathology. 1998. Vol. 89. P. 176-181.

361. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers//Nucl. Acids Res. 1990. Vol. 18. P.7213-1718.

362. Welton J.D. Host-selective toxins: agents of compatibility // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P.1723-1733.

363. Welz G., Leonard K.J. Genetic variation in field populations of races 0, 2 and 3 of Bipolaris zeicola in 1987 (Abstr.) // Phytopathology. 1988. Vol.78. P. 1574.

364. Welz H.G., Leonard K.J. Gametic phase disequilibriea in populations of race 2 and race 3 of Cochliobolus carbonum II Europ. J. Plant Pathol. 1995. Vol. 101. P. 301-310.

365. Whisson S.C., Drenth A., Maclean D.J., Irwin J.A.G. Phytophthora sojae avirulence genes, RAPD, and RFLP markers used to construct a detailed genetic linkage map I I Mol. Plant-Microbe Interac. 1995. Vol. 8. P. 988-995.

366. Whisson S.C., Howlett B.J., Liew E.C.Y. et al. An assessment of genetic relationships between members of the Phytophthora megasperma complex and Phytophthora vignae using molecular markers // Aust. Syst. Bot. 1993. Vol. 6. P. 295-308.

367. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D. et al. The product of the tobacco mosaic virus resistant gene N: similarity to toll and interleukin-1 receptor // Cell. 1994. Vol. 266. P. 789-793.

368. Wilcoxson R.D., Rasmusson D.R., Miles M.R. Development of barley resistant to spot blotch and genetics of resistance // Plant Dis. 1990. Vol. 74. P. 207-210.

369. Williams G.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 6531-6535.

370. Williams J. G. K., Reiter R. S., Young R. M., Scolnik P. A. Genetic mapping of mutations using phenotypic pools and mapped RAPD markers // Nucl. Acids Res. 1993. Vol. 21. P. 2697-2702.

371. Wolfe M. S., Brandle U., Koller В., Limpert E. et al. Barley mildew in Europe: population biology and host resistance // Euphytica. 1992. Vol.63. P. 125139.

372. Wu H.-L., Steffenson B. J., Li Y., Oleson A. E., Zhong S. Genetic variation for virulence and RFLP markers in Pyrenophora teres II Canad. J. Plant. Pathol. 2003. Vol. 25. P. 82-90.

373. Wyss P., Bonfante P. Amplification of genomic DNA of arbuscular-mycorrhizal (AM) fungi by PCR using short arbitrary primers // Mycol. Res. 1993. Vol. 97. P. 1351-1357.

374. Xue В., Goodwin P. H., Annis S. L. Pathotype identification of Leptoshpaeria maculans with PCR and oligonucleotide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences // Physiol, and Mol. Plant Pathology. 1992. Vol. 41. P. 179-188.

375. Yaegashi H. Inheritance of pathogenicity in crosses of Pyricularia isolates from weeping lovegrass and finger millet // Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 1978. Vol. 44. P. 626-632.

376. Yang, G., Rose, M.S., Turgeon, B.G., and Yoder, O.C. 1996. A polyketide synthase is required for fungal virulence and production of the polyketide T-toxin // Plant Cell. Vol. 8. P. 2139-2150.

377. Yao C., Magill C. W., Frederiksen R. A., et al. Detection and identification of Perenosclerospora sacchari in maize by DNA hybridization // Phytopathology. 1991. Vol. 81. P. 901-905.

378. Yoder О. C., Valent В., Chumley F. Genetic nomenclature and practice for plant pathogenic fungi // Phytopathology. 1986. Vol. 76. P. 383-385.

379. Zeigler R. S., Cuoc L. X., Scott R. P et al. The relationship between lineage and virulence in Pyricularia grisea in the Philippines // Phytopathology. 1995. Vol. 85. P. 443-451.

380. Zhang H.-F., Francl L. J., Jordahl J. G., Meinhardt S. W. Structural and physical properties of a necrosis-inducing toxin from Pyrenophora tritici-repentis //Phytopathology. 1997. Vol. 87. P. 154-160.

381. Zhong S., Steffenson B. J. Genetic and molecular characterization of mating type genes in Cochliobolus sativus II Mycologia. 2001. Vol. 93. №5. P. 852-863.

382. Zhong S., Steffenson B. J. Identification and characterization of DNA markers associated with a locus conferring virulence on barley in the plant pathogenic fungus Cochliobolus sativus II Theor. Appl. Genet. 2002. Vol. 104. P. 1049-1054.

383. Zhong S., Steffenson B. J., Martinez J. P., Ciuffetti L. M. A molecular genetic map and electrophoretic karyotype of the plant pathogenic fungus Cochliobolus sativus II Mol. Plant-Microbe Iinterac. 2002. Vol. 15. №5. P. 481492.

384. Zhu P., Oudemans P.V. A long terminal repeat retrotransposon Cgret from the phytopathogenic fungus Colletotrichum gloeosporioideson cranberry // Curr. Genet. 2000. Vol. 38. P. 241-247.

385. Zolan M. E. Chromosome-length polymorphism in fungi // Microbiol. Rev. 1995. Vol.59. P. 686-698.338