Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КИНЕТИКА РОСТА ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРАХ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИКА РОСТА ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРАХ"

мосдоскик ордвна ійшнл.ордш октябрьской пвшшвм И ордш трудового красного шшл госхдакггвижв зпяшат , жвяи м.в.лдоиеюям

J-лтз

ФАКУЛЬТВТ ПОЧВОВИВНИЙ

, 8а ар«мх руковяон

бовдарнио татьяна «дооша

TBK 8TC*6»095f 631.427

кшвткха роста 00чв9шшс' бакяерий в перисщдческой m непрерывной ■ культурах

%

Спецмльяость 03*00*07 - мвкробшблогмя АВТОРВ&КРАТ . , '

дяосертаом m оояокаяяе учевої отелен■ кандидата бвологшчеоюи наук

Москва - 1983

Ь сис У nJ.fU.LOt*

Работа выполнена ва факультете почповедения ■' Московского государственного ушЕорситога ем.' М.В.Ломоносова

Научный руководитель * доктор биологических наук ,

' ' профессор Звягинцев Д.Г. Официальные оппонентыI доктор бполоппескш наук

Ерошив В.К.

• кандидат биологически* тук Гильыанов Т.Г.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых вещеотв ( ШИИсинтезбелок )

Защита ооотоится на заседании

специализированного совета К 053.05.16; Мсюква, 117234,'. Ленгэры, ШУ, факультет почвоведения. Ученый совет.

С дисоергацкеа ыожно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МП*

Автореферат разослан " " 1983г.-

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации ва ваоедавии специализированного совета, а отзывы ва автореферат присылать в 2-х экземплярах.

Ученый секретарь специализированного соьета,

доцент — * . - Д^бъг-ва И.П

• ЦЕг ^.^АЯ НАУЧ)-:дя б'-БЛ'ЮТЕНА Моск. г.надвмии

им К. А.

И ■•! в №

Актуальность проблемы- Киветжчеекке исследовав« чрезвычайно важны для углубления наших знаний о биологии отдельных видов микроорганизмов, Т&к как они позволяет выяснитьособеяности их поведения ■ количественно оценить интенсивность метаЛшюма в ыеняпвнхея-УСЛОВИЯХ окрухаицеЗ среды. Шекяоросговые характеристики определяют своеобразие распространения микроорганизмов -в разных почвах и в разных генетических горизонтах» влияние'их на почвообразовательные процессы (ЗаварзинДЭТб; Паников,Звягинцев,1983). От ростовых ха--рактеристшсз1,.иоит исход конкурентных взаимоотношений в ходе формирования естественных сообществ (Печурквн,1978). Представление результатов изучения особенностей роста микробной популяции вви-де кинетических в стехиометрических показателей, такех как вконо-маческий коэффициент, константа гасышения; максимальная уделышя скорость роста;' коэффициент поддержания жизнедеятельности, метаболическая коэффициент и тгд^ имеет очевидные преимущества но сравнен иг) с традиционными способами (например, графическим изобрахе— наем ростовой кривой) в силу того, что оно предполагает знание;определенного вяла функциональной зависимости меяду условиями гуль-тивировашш н состоянием микробной поцуляцир, а такие позволяет-прогнозировать динамику ростовых процессов, всходя из условий среди (Перт,1978>. К сохалени», до сих пор кинетические исследования были ограничены относительно кратким списком микроорганизмов, представлявших интерес с точки зрения микробиологической промышленности в медицины* Почвенные микроорганизмы почти не затронуты такими исследованиями. '■.'' •

Цель работы; изучение кинетики роста почвенных бактерий, занимавших разные экологические виши, для выяснения особенностей■стратегии их взаимодействия с окруиашей средой. -

Основные задачи исследования. I. Изучение кинетики роста бактерий (образования биомассы н потребления субстрата) в периодической культуре. *

2. Изучение хннетвкн отмирания и автолиза бактерий при длительном голодании.

3. Изучение кинетики непрерывного роста бактерий в хемостате (образования биомассы, потребления субстрата к кислорода) в условиях лимитирования по'источнику углерода (в энергии) в азота.

4. Изучение взаимосвязанных изменений скорости роста микробной популяции я морфологии клеток.

ретчная новизна. Проведено детальное кинетическое исследование достаточно широкого круга почвеннах бактерий и выявлены особенности кинетики роста, связанные с дифференциацией экологических ниш

пр^родянх Свкмриавъвнх пощгддавИ. Ваервив показала возможность ко-■ личественвого описания ■ предсказания динамики отмирания голодаодих ' 1Шфооргаюш»ов, Ерояемовотрироваяа нвтрвввальнооть кяаетнки роста кориивподобнмх бактерий, получила развитие инашлвдополнительное экспериментальное подтверждение новая кинетическая модель» связи» . ваппая скороотьроота микроорганизмов с внутриклеточной концентрате В активных центров, играющих роль "узкого иеота" в метаболизма лимитирующего оубстрата» Измерены важнейшие кинетические и ствхно* метрически« константы, характеризующие рост исследованных бактерий: выход бвтаесы «а единицу потребленной глпкозы, азота > кислорода, яоиффициввт поддержания, ковотавта насыщения».максимальная величи-ва удвльвой скороотя вотреблеяня глюкоза в кислорода,, удельная скорость роста, морфометрячеекие показатели и т.д.

Практическое значение. В диосвртацид разработан новый опособ_ооп ределеняяинтенсивности дыхания микроорганизмов в непрерывное культуре, который может быть рекомендован дня широкого использования в практик* микробиологических исследований. Выявленные в работе коли»' че от ветше иавсономерноств роота почвенных бактерии могут бит» ио- ' шхльаовави в биотехкалргяя для разработки оптимальных режимов выращивания бактериальных культур - продуцентов практически ваквнх метаболитов, а также для создания высокоэффективных бактериальных удобрений. Материалы диссертации используются на факультете почвоведения МГУ Ю1.М.В.Ломоносова ара чтения лекций по курсам "Экология цочвеняых ¡лвярооргавязмов" ■ "Основы биологической кинетики", Дпробааия работ«. Результаты исследований были доложена на заседания ШО (1980г.>,ва III Всесоюзном совещании по управляемому кулътивярованюо микроорганизмов (Киев,1981г.). а также на заседании кафедры биология почв ИГУ (1981г.).

Ду^идаани. По теме диссертации подучено 2 авторских свидетельства я опубликовано 4 работы. ■

рбьем работы.' Диссертация состоит из введения, обзора лигерату-рм,' описания использованных методов, 2.глав, заключения в выводов, содержит 141 страницу машинописного текста, 36 рисунков, 10 таблиц к список литературы из 224 названий <яэ них 151.- зарубежные).

Автор выражает искренние дризиательнооть м.м.с. Н.С.Иаяикову за помощь прж проведения работы, а такие от.я.с. Г.А.Бонарцеьой.И.Н. Скворцовое, м.и.о.Т.Г.Добровольокой я Я.В.Лыеак за любезно предоставленные культуры бактерий.

ОБЪЕКта И ИЕТСДЫ ИОСЛЩВШИ

В работе исяольэоваяы следуюпивнультурм бактерий: №сШш •ubtllia 428 (получена ИЗ ВШ ИБОГАН СССР); |Ш1мЪ1ш »llíotl Ag (получена яз УШИ АН СССР)} Arthrob»ct«r rloMforal» Cj-4, Hhodo-coccu* «nrthropoll« 6IX« XleroeoceuB ««Uia 65И, P»#udo»on«e Пмтмм 312 (получены аз коллекции кафедры биологии почв МГУ),

Кулиури бактерий поддерживали на мяоо-септокном;агаре {I:10)и агаряэсваняом бобовой отваре, в случае клубеньковых бактерий, о еже-'местным! пересевами ва свежую питательную ореду. Для кянетнчеояих ясследовавийпртенялв синтетическую средуслвдущегосоставаЧ в кг/а): глюкоза - 200-1000} <HH4)2so4 - 400-100} К&ОД - 100; KgH-Р04 . 10001 UtSO^THgO - 100; CaCr2*2BgO - 20; OuSO^Sa^O—0.04} Kt - 0,1; »Clg-etlgO 0,4; lfcs04'4iyi - 0,4í*a¿toQ4*2%0 - 0,2; znso^HgO —0,4;,борная кислота -0,5; ЭДТА- яа - 3,0; pH — 7,6. -В качестве источника азота вместо (нН4)г Од х>оольаов8Дк аооарагва (500 иг/л) для H.eelllott я пептон (воо мг/л) дляН^Ша . В . питательную среду для выращивания B.euttili» я R.m«nÍotl дополнительно вносила в качестве стимулятора роста дроаево1»кстрагг; (0,01 иг/л).

В неерерыв ноЯ культуре бактерия выращивала вцелмостеядлняоа фвй»енТ8Ц»оннш сооуде объемом 250-600 ил а рубашкой для тврмоота-тяруипей жлдкооти и сливом по уровни, перемешивание среди осуществляли ывгяитноВ мешалкой ММ-2, питательную среду дозировала о во-пошью перистальтического насоса То»1р«п" и 3-31 (Солusa), диапазон скоростей подача питательной среди - 3-100 кд/чао.

Описанную установку использовали также для выращивания илкрорга-вявмов в периодическом режиме (оря отключения яодачя ¿итательво1 среди)* Периодическое культивирование проводили, кроне ТОГО, в жруглодонкых халоах на 750 мл с ватными пробками на качалке (180-об,/мпв)>

В качестве инокулята использовали односуточкуо периодическую культуру, подученную ва основной синтетической средь, Культпкро-вавве проведали ери 28*0,1°С (ддя K.agiile -при 20±0,1°0), реакция среди оря всех скоростях разбавления оставалась пряОлжмтелы» ва одном я той же уровне (рН 6,8-7,5) без инструментального кожтроля.

Контроль аа биомассой осуществляли путем измерения оотячеохо! /иотвооти клеточной суспензия, ва спектрофотометра СФ-261-001 Вря г длине волны 410 вы. цо достиженвя культурой стационарного состояния оря данной скорости разбавления определял* кодячлетво аухоЯ биомассы весовым методом с использованием мембраяши фильтров "*С«а-вор" (размер вор 0,24 шм).

Для определения раемеров ¿деток их фотографировали под микроско-■ вом МЕИ-12 с фазовым контрастом {объектов 901); размеры клеток измеряли о фотоотпечатков (общее увеличение 10000*).

ХиЗНвСПОСобНОСТЬ клеток.определяли методой цикрокультур (ро«геа-

Интенсивность дыхания бактерий в отбираемых аз ферментера пробах измеряли полярографическийс кислородным электродом Кларка (Щольц, Островский, 15Г78). Кроме того, был разработан специальный метод измерения интенсивности потребления кислорода не посредственно в фер- . ментере, для чего использовали стерилизуемый автоклавированием датчик растворенного кислорода (Паников,Бондаренко,1981).

В фильтрате хемостатной культуры определяли концентрацию алюния о фенолом и гипохлоритом и глюкозу - энэиматическим методом (Щербу-хиа и др*Д975) в глюкозооксидзэой (Львовский завод Оакпрепаратов) ш оероксядаэой (*Ъ««т«а ".Венгрия).

Результаты исследований обработаны статистически с использованием ЭЕЛ "Мир-г".

РЕЗУЛЬТАТЫ 11 ОБСУЗДЕЖЕ '

Глава I. Периодическая культура

Гомогенная периодическая культура позволяет моделировать рост природных микробных популяций в микро- и мезозонах, возникающих в результате пертурбационных воздействий ла стационарные (климаксные) системы - внесения удобрений, попадания в почву экскрементов и трупов животных, замораживания и оттаивания почвы и т.д. Во всех перечисленных случаях в почве высвобождаются легкодоступные органические соединения и, тем самым,, создаются условия для быстрого роста микроорганизмов. Исчерпание доступных субстратов приводит к прекращению роста и последующему отмиранию накопленной биомассы вследствие эндогенного дыхания и наличия отрицательных межпопуляционных взаимодействий внутри микробного сообщества.

Кинетика роста и потребления субстрата. Для шести изученных бактериальных культур была прослежена динамика образования и потребления лимитирующего субстрата (глюкозы) во временя. На рис.1 полученные результаты продемонстрированы на примере Р.Пиогвасапа И д. ' в1йМГоп»1« . связь между приростом бактерий (*х) и потреблением субстрата (**) однозначно определялась величиной экономического коэффициента У,\* : ... „ж у» Н

У««.»^* ' . (I)

где т. - метаболический коэффициент, характеризующий непроизводительные траты субстрата (коэффициент поддержания),У* — истинная ве-

Pmo.I. Дянамшса образования Оноиасса (1*2) и потребления

Еликозм (3,4) в периодических культурах л.кіоьігоглі» (і) а p. fluor** се па (Б).

0 - биоыаоса; + - концентрация лимитирупцего субстрата.

1 - рассчитано по уравнена» (3); 2.- по уравнении (4); 3 — по уравнении Моно; 4 -по линейной медеда.

личина экономического коэффициента, )4 - удельная скорость роста» В общем случае Yum, является динамической переменной, Однако поскольку в периодической культуре замедление роста, вызванное потреблением субстрата, происходят достаточно резко, то для большей части ростовой кривой величина Уйм. сохраняла приблизительно постоянное значение (табл.1). Большинство изучении* организмов характеризовалось Слизкими величинами Y," .Коэффициенту также варьировал в довольно узких пределах и только у в.виьtills неароиэводитель-г ныв расхож субстрата били весьма значительными — 0,5 г гл/г СВ'час.

В соответствие о общепринятой точкой зрения снижение скорости роста бактерий в периодической культура при переходе от лог-фазы к стационарной фазе роста обусловлено субстратным лимитированием метаболических процессов, которое описывается уравнением Ыоно:

■ ««

где fJ„ к К, - константы.

Интегрирование (2) при допущении Y« Ум* »const и граничных условиях t -0,эс -х;, 5 - s приводят к выражению:

(liM^^f^fU:, <3)

где Хя~ JC..S.Y '

Для проверки адекватности и нахождения численных значений параметров К, я уравнение (3) было представлено в линеаризованном виде, а экспериментальные данные отложена в координатах ft"*(пж/хф —

ЭС )

t" &» xZ ~xr ) * Как следует из рио.2, уравнение (3) с успехом они-сывает роот периодической культуры P.fluor«ec*ne , для которой экспериментальные точка удовлетворительно аппроксимируется прямой. Аналогичные результаты были подучены ДЛЯ B.eubtllla, п.№«11 loti И u.agiiip . Однако динамика биомассы л.вюмгопщ« описывалась в коор. двнатах рас.2 se прямой, а ломаной кривой, что свидетельствует о неадекватноотя уравнения (3) применительно к данному организму, роот которого в периодической культуре происходит не экспоненциально, а линейно:

r*..U.S>» L-const. :

I ~ , SiO

В табл. I представлены численные значения кинетических параметров уравнений (31 я (4) для всех изученных культур; в качестве количественной меры согласия между экспериментальными ш рвссчетнымя значениями была избрана величина средней квадрзтической ошибки имитации (R 0<Ki).'Сравнивая значения R 0.к.* Н01Ш0 сделать вывод о

* -0,6 -0,4 -0,2

X -0,6 -0.4 -0,2

Рнс.2 Представление кривых роста Р.Пиоге»о«п»М в л.£1оЪ1*«ла1*

(2) в лпнеаризуидщ координатах:

большей адекватности модели Мояо для куяьтурКпивгме««* ян.мШоъ1 Я Лжне4н0й модели - ДЛЯ А.е1оЪ1Гогя1* ,П.сгуМ1ГороИ« ' * В.вв111в. В случав Е.вуъиив оба уравнения давали близкие величины К. , Необычная кинетика росте коривеподобных бактерий, проявляющаяся в отсутствии экспоненциальной фаза роста, может быть обгяснена тем* что размножение ятях бактерий в периодической культуре контролируется не экзогенный субстратом, а каким-топромежуточкым продуктом обмена, оинтез которого прекращается в момент начала лияейвоа фезн роста.

В микрозонах почвы .о периодическим поступлением легкодоступных органических соединений отбор в микробных сообществах, очевидно, дошек осуществляться по признаку максимальной скорости роста. Поэтому в таких макрозонах преимуществом должны овладеть р.Г1иог«всвпя кВ.ямьии* , характеризулдиеся большими абсолютными значениями в белее выоокии сродством к субстрату (низкими значениями К,), тогда как корязеосдобные бактерии, которые не способны к быстрому экспоненциальному росту, должны в условиях периодического поступления питательных веществ подвергаться конкурентному исключению.

Динамика отмирания бактериальной биомассы. После полного ясчер-пання глюкозы в периодической культуре бактерия оказываются в состояния голодания по субстрату - источнику С ш энергии я начинает отмирать с разной скорость» в зависимости от биологических особенностей конкретного организма (ряс.З). Во всех случаях скорость отмирания превышала скорость автолиза« в результате чего в культуре накапливались нежизнеспособные клетки, количество которых достигало

Тайдида 1

Кинетические а стезжштряческие показатели роста почвенных бактерий в периодической ¿^льтуре

Культура у V" V Модель Моно Линейная модель

г св/г и г СВ/т га ггя г СВ-час ы час" 2 и иг СБ/час Кс.^

I

Рма4«вам 0,28 - _ 0,45 9,6 2,7 21,09 5,7

*1иогмсюш

ВиШш 0,21 0,52 0,500 0,44 48,0 3,8 8,73 2,4

пьиш *

ШюЫп 0,81 1,75 0,053 0,13 К,С 1,0 6,10 2,0

а»И1ои

Иетосооси« 0,41 0,50 0,045 0,04 102,0 9,2 2,13 5,8

•

АггЬгоЪес1*г - о,за 0,50 ; 0,060 0,31 48,0 9,15 1,4

ЕЬлЮсоссоа , 0,30 . 0,40 0,065 0,18 14,0 . 5,5 5,24 2,1

•гу1Ьгороив;'

гл - глюкоза; СВ - сухой вес бактериальной бгоиассы;Уд*- кажущаяся величина вконошгсескою коэффициента;^^ истинная :величина экономического коэффициента;^ коэффициент паддеряания; Р* - шквальная удельная скорость рома; Ь - абсолютная скорость роста; средняя . относительная квадратическая ошвЗга имитации; ^ • константа васвдениц

x.wrCB/л зс,мгСВ/л

Рип. 3. Дгяглика отепранпя и автолиза почоегопос бактерий в периодической ізгльтуре послп исчерплния субстрата. Кпише І(цунктир) л 2 іт'осчитоїш по урашадгачм (С) я (7), ооотвотственио, ft -à.globlfQTViiB, ц - P.fluor«î>c«ne» О - B.«rythropolte» Г - B.eubtilte, Ä - R.a«liloti,e - И. exilia.

10-152 7 A.globlforala HR.erythrepolle И20-ЗД5 у Р.Г1иог»вс«п», W.«siU« я fl."*liioti , Б орцессе голодания наблюдались морфологические изменения - уменьшение размеров клеток» фрагментация, паЛОЧКОВИДНЫХ клеток A.clobtforola на жоккж и образование эндоспор у ><nUU1* «

Удельная окоростк отмирания о —dx/d t (эс"1) в голодающей культуре я^мтемоотавадась постоянной величиной, что предполагает справедливость уравнения первого порядка для описания процессе отмирания ; ' : j . J ,

dx/dt »-оэс,

где о - постоянная величина.

Для других культур удельная скорость отмирания оо временем снижалась. Чтобы оочяснить »то явление было предложено два гипотезы:

I) а вшеняетоя прямо пропорционально величине популяционной влотнооти эс , тогда: ■

dx/dt»-atx(x**a»xt «(ж)-«.«, (S)

т.е., скорость отмирания формализованно описывается уравнением второго порядка;

* 2) о снижаетсяобратно пропорционально времени в результата* адаптивных эпигенетических'перестроек энергетического обмена голо-давдях микроорганизмов:

Для выбора между двумя постулируемыми механизмами было проведено сравнение расчетных данных о реальной динамикой отмирания голодающих бактерий. Оказалось, что уравнение (б) более точно описывает отмирание P.fluoreaoen* , а уравнение (7) - отмирание A.globifor-а1«,и.асш«* В олучае R.«rythropoii«то и другое уравнение давало приблизительно равную величину ошибки имитации.

Возможность использования уравнения (7) удовлетворительно согласуется о эмпирически установленным фактом необходимости белкового синтеза как обязательного условия длительного сохранения жизнеспособности ГОЛОДаЩЯХ бактерий рода Arthrob»cter( Bolen , Oordon ,1980). Вероятно* аналогичными свойствами обладает два других представителя коринеподобвых бактерий — R.«rythrepoll* ж lt.««nie. Обусловленная адаптивными перестройками обмена устойчивость этих бактерий к голодании объясняет преобладание их во многих олиготрофных природных местообитаниях, в том числе в минеральных почвенных горизонтах, длительное время не получавших свежего органического материала*

0,1

О 10 . 20 30 40~ SO t.oyx. Pec»' 4 Динамика биомассы р.Пию*и*в* (I) и Л.в1«Ыг«гя1а(2) в хемэстатной культуре.Стрелками обозначены моменты смены $ / цифрами — численные значения ,

Глава 2. Непрерывная культура

Непрерывные методы культивирования, в частности хемоотат, позволяют моделировать рост природных микробных популяций в тех микро-я меэозонах, в которые более иля менее регулярно (непрерывно) поступает питательные субстраты яэ внешних, по отнопенио к микробным популяциям, источников. Примерами таких местообитаний могут служить ризосфера я разослана растений, пищеварительный тракт беспозвоночных животных, поверхность каналов внутрипочвенной массы, через которые фильтруется почвенные растворы я Т.Д. -

Двнамика .бактериальной биомассы. Как известно (Перт,1979), хе-мостат представляет собой алии яз простейших типов саморегулирующихся открытых сиитем, которые быстро достигает стационарного состояния, в котором скорости роста я удаления микроорганизмов яз культиватора равны, а уровень популяшюнвой плотности я свойства бактериальных клеток не изменяются во времени. Как правило, хемоо-татные культуры всех.изученных бактерий могли поддерживаться в стационарном состоянии неограниченно долго, а после изменения скорости протока происходило плавное увеличение или уменьшение биомассы бактерий с достижением вового стационарного состояния через период времени,'равный 3-6 геверацвям (рис,4). Единственное исключение составляла хемостатная культура A.giobiforral» при высоких .]) (0,15 час_1м выше), когда даже незначительное повышение скорости протока

вначале приводило к вымывании бактерий, затем происходило медленное возрастание концентрации клеток в ходе адаптации культуры к новым;условиям роста. Переходный период продолжался в течение 1520 генераций С достижением нового стационарного состояния* При 1) ■0,25 чао"*1 в непрерывной культурвА.Е1оЪ1Гогв1авообще не устанавлв-. велось стационарного состояния, и рост был возможен только в автоколебательном режиме со значительной амплитудой колебаний бяомассы бактерий ж остаточной концентрации глюкозы.

Отмеченная особенность непрерывного роста А.вХоЫГопаю . вероятно, свойственна многим другим почвенным бактериям, обитающим в одиготрофных местообитаниях. Нормой физиологической реакция этих организмов является стабильный рост с низкими удельными скоростями, соответствующими малоинтенсивному притоку питательных веществ, тогда как ври высоких концентрациях субстрата внутриклеточные ре-гудяторине механизмы оказываются недостаточно надежными, чтобы поддерживать стабильность ростового процесса.

Потребление глюкозы при разных скороотях разбавления хемоствт-ной культуры. На рис,5 дня всех изученных организмов представлены данные по измерению стационарных величин концентрации бактериальной биомассы £ , концентрации лимитирующего субстрата 1 , а также доли жизнеспособных клеток при разных скоростях разбавления хемос-татной культуры, лимитированной глюкозой. Наибольший интерес, с точки зрения кинетического анализа, имеют данные по зависимости стационарной концентрации бактериальной биомассы ас от I (так называемые хемостатные кривые). Характер хеностатной кривой л.в1о-Ъ1Гог»1в зависел от направления изменений 1) . При последовательном переходе от меньших значений 3) к большим величинах была выше по сравнению с теми величинами, которые были получены в серии стационарных состояний о обратным направлением смены3> (рис.ЗВ). Наблюдаемое явление Зистабилитета ш своего рода гистерезиса хемостат-ной кривой может быть объяснено следующим образом: верхняя часть хеиостатной кривой описывает состояние микробной популяции, лимитированной глюкозой, а нижняя - соотоякие субстратного ннгкбирова-ния. Форма хемостатных кривых остальных бактериалышх культур на-ходитоя в согласии в основными положениями классической теории хе-мостата. Изменения эс в зависимости от Э могли быть объяснена возрастанием остаточной концентрации лимктнрушего оубстрата при высоких в варьированием выхода биомассы У . обусловленным наличием энергетических трат субстрата не только на рост, но в на поддержание жизнедеятельности ( Р1» ,1965);

0,2 0,3

¡J ,4BQ-I

fi .час-

Ряе.Ь.Хшостапше кривые почвенных гіпкторяй а условиях лимитирования глюкозой її - биомасса(ас,«г СЕ/л11 2 - относительное количество асиэ!iôciîocodщлс клэток (A,îOl 3 - концентрация лимитйрупцего субстрата в культуре (І ,мр гл/л).

Д - P»fluor*ee«n«,ß - B,»ubtlll«,g « l.globifaro-la, Г - R.«rytbropoUetA - М.*с1І1а, В - R.MUUti.

мач У»УГ (е)

где - удельная скорость потребления глюкозы (г^ш

ке»$фиц«еят поддержания, У? - истинная величма зкономячеокаго коаф-

фициента.

Наибольшие ра»меры энергетических трат на поддержание характери-аовали Р.Пиог«ас*п« а в.аиМШ» <табл.2), яаяменъаяе - я.вяШои, А.(1оЪ1Гога1* я я.вгугЪгороИ» . Промежуточное положена® занимает У.иИ11 • Величина "истинного" »коноывческого коэффициента варьировала 7 пятя изученных культур в отнооительно узких пределах ■ лишь у к.««Шв била заметно мша, очевидно, в омяв о тем, что для денного организма бил взят всточвжк азота, содержащий ассимилируемый углерод - пептон.

По сравнения о периодической культурой тратя аа поддержание в хе-мостате била существенно нкже, особенно велики различия в случае культуры я.акъии* , у которой величина т в хемостате оняжалаоь ш> сравнение о пврводиче^ко! культурой на порядок. Для остальных организмов указанные различия были выражены в меньшее степена* В то же время величины У, окааалмоь приблизительно равными оря том я другом способах культивирования.

Ругребленре кислороде (интедумность дыхаим). Скорость потребления кяслорода в хемостатноА культуре опкоывалась уравнением, аналогичным (9Ь л

где тч - козффециент поддержания по кислороду, - "нстквная" величина выхода биомассы на единицу потребленного кислорода, а. -удельная скорость потребления кяслорода* *

Подтверждением справедливости (9) служат вксиерямеиталысые данные, отложенные нарио. 6 в координатах " -Э Величины стехиометри— ческнхпоказателей п>п я У^ (табл.2) удовлетворительно соответствовала аналогичным подавателям гт> и У , харахгераэутаим потребленяе глюкозы. В частности, отношение тч:т вря ях представлении в молярном выражении в среднем равнялось 6, что отвечает стехиометрии ояиоленяя глюкозы* А соотношение у0. в У определялооь уравнением материального баланса: ^АУ-в,

где А - количество кислорода, затрачиваемое на полное окяодевие* ' единицы энергетического субстрата (для глюкозы - 33.33 мг мольО^/ г гл) я В - количество кяслорода, затрачиваемое на полное сжягание единицы микробной биомассы.

Тайша 2

Кивзтгвсме ж сгагиоиетргчесззе показатели роста почвенник бактергй в хеиостамо* вузьтуре

Культура m V у ЙД г гя , р^В -uaxbOg (Г гСВ-час Q" кр мотьО* час S кг гала V

иг та ышгьО«

гСВ-час г СВ-час г св-тае

70 2,ТОО o;4i 29 0 17,7 . 0,46 0,14 1,30

flnereCMM

£ iClUus 40 1,30 0,47 32 б 15,4 0;4Б 2,50

«ЬШІ*

Ir^Ti І.ЯІ 5 0,17 о,чі 23 - ■ - ■ . - і;єі

aim«U

irtbroboot«? 15 0,50 0,46 ЗІ 0 7,8 0,-25 0,25 6,13

globiioiad« ф

Btotoceoons 0 0,*50 0,30 48 о ' <Д 0,17 ОДО 3,88

(Tjlïnflllt

lUeroewcw 25 0,83 0,78 50 - ■ — ; — 0,61

сп I

га - гзпкоза; СВ - (7x08 seo бактериальной óraaccu;ro - ко*$гаіевт поддердшм; % - дсыцццй исовомэтеский коэффициент по глжоэв; Y* _ жстинн^ »юшапесиа-ковффяадевт то югслороду; ft*— ШЕСЕІЕЛІЕ2Я уД«ЬПаЯ скорость EOTpeCUeaZÄ Og При ; £Г~ тдельяая скорость гот-

тейдеввз кислорода пря - тіиідшгшіг удельная скорость — Koecwn тсадвякі;

\ - горфсадтрапесюй показатель..

и. w

"Vfflb Ь

^"час

МГ гл/л

0,1 0,2

2. ' К., иг гл/л

0.С5 С,10 0,15 0,1 0,2 з>, час"1

?лс,б Зелэтпяы параметров Q (І),0-{2) я К, (3) пра разни; скоростях раэбаалешм іемостатной лульттра, лзстлроваяно2 глшозой. Кривая I рассчитана по уравнении 15. 4 - ?.Пивгм««», S - B.MbUll«, ■

В - а.«7ІЬорвИ»» Г - л* clablfentla.

Влияние концентрации субстрата на скорости роста и окидлекк^ глюкозы. Влияние концентрации субстрата на скорости роота и окисления глюкозы исследовали с применением методики острых опытов: в пробы хемостатной культуры* достигшей стационарного состояния, вводили разные количества глюкозы и регистрировали изменения нятеноивнос к дыхания полярографическим методом (рис*?А). Скорость потребления кислорода ("V ), соответствующую концентрация вносимого субстрата St , измеряли по наклону касательной, проведенной на начальном участке кривой. Зависимость Y от S( аппроксимировалась кривой* имеющей форму гиперболы, смещенной в область отрицательных значений на величину Д. , которая соответствует концентрации окисляемых, субстратов в хемостатной культуре до внесения глокозы (рисЛЬ). С учетом Л влияние концентрации субстрата на удельную скорость дыхания « V/* удовлетворительно описывалась уравнением Ыкхаэлиоа-Ыентен:

дь.-ашм.. os . /и»

где $ - истинная концентрация окисленного субстрата (4 - S{ + А >» О - максимальная величина i К, - константа Ыихаэляса. .

Кинетические параметры К» я Q в самом общем случае не являлись истинными константами, и справедливость уравнения Михаэлиса-Монтая сохранялось лишь в пределах фиксированной скорости роста микробной популяции. Ори в™ом у трех культур — P.fluoreacen* .R.arythrûpoHa , A.giûMformi« величины оатавалиоь постоянными и менялась только Q » а у B.aubtiit» менялись какО , так и Км » во оотавалооь постоянным их отношение L « Q /К„ . Как было показано на примере дрожжей D»barjT3B>yc*« fonilcariu« (ЦаниковД$ЭЗ), варьирование параметров Q и при разных Э можно объяснить непостоянством внутриклеточного содержания активных центров ферментных систем микробной клетки, играющих роль "узкого места" в катаболизме глюкозы. Боли синтез таких активных центров £ оосисходит в результате равновесного взаимодействия субстрата S с компонентами биомассы H , яв-ляшцшюся предшественниками- £ : о -z с

■ 4 ** * (12)

где К4 - константа равновесия, то

q.K^.QM^U, t аз)

где Кмг. - каталитическая константа,; £ - концентрация Е . Q -величина Q при S -О я Q"- максамальная величина Q при условии , которое реализуется при критическом значении 3> в хемоо-татной культуре.

Рис <7 Пример определения К, и о использованием методики

острых опытов (лимитированная глюкозой хвмостатиая куль- • туре ьПмгмо«м)|

А - динамика изменения концентрации 02 в ходе определения (стрелкой обозначен момент введения глюкозы); Б — зааиспмостъ начальной скорости дыхания культуры от колцентрвции субстрата; В - графоаналитическое определение К$ и

Дія вывода уравнения, описывавшего зависимость О. от 3 * необходимо учесть влияние концентрации субстрата как на £( , так в на

, что достигается подстановкой уравнения (ІЗ) в (И):

а связь между ^ -2) и (Ц следует из соотношения:

(15)

Дія проверки адекватности уравнений (14) в (15) оравчим вх предсказания с экспериментальными данными. Б табл.2 приведены численные значения параметров (} , Ц* и К, , определенные из аависшостх 0 от 5 , на рис.б отложены экспериментальные данные со взаимосвязанным изменением я 0 , а на pac.fi - по влиянию I на о- , Одновременно на рисунках построены кривые, рассчитанные по (14) в (15) о использованием численных значений табл.2. С точки зрения визуальной оценки можно констатировать високуп степень согласия между экспериментальными к расчетными данными. На рио.б по абсциссе точки пересечения кривой зависимости 0 от Л) и зависимости от 3> мож-ко определить критическую скорость разбавления хе»достатной культуры 3) которая устанавливает верхний предел удельной скорости і»оста микробной популяции:

Сравнивая полученные значения о величинами р* , определен-

ными в периодической культуре, модно отметить их совпадение.

С экологической точки зрения интересно отметить, что различия между величинами і 0 - актуальной и потенциальной метаболической активкостьо микроорганизмов, в наибольшей степени выражены в культурах Р./1иог»»свпв и в.виььіи« , у первого организма вследо*-вие ВЫСОКОГО значения О" И НИЗКОГО К{ ! ; второго — вследствие высокого 0,* • Напротив, у А.віоЬі Готіаи Я. в гу Старої і« различия между (у и 0 во всей диапазоне 13 относительно невелики. Отсутствие у микроорганизмов второй группы (л.віоМ готів . н.вгуиігороіі») столь ярко выраженного избытка каталитически активных структур позволяет им более экономично осуществлять, свой энергетический обмен » условиях глубоко дотированного роста, затрачивая на процессы доддержания значительно меньше энергии по сравнении с р.гіиог«всвп» ■ в.оиьиііа , Однако, бактерии первой группы, очевидно,' имеет напомненное Преимущество ПередА.еІоЬІГогаів и Н.»гу1Игоро11« в моменты появления доступного субстрата в больших количествах, тогда нянчив избытка ферментативных в белок-оинтеаирущях структур позволяет им резко увеличить скорость роста беа дополнительного вх сия—

Рио. 8 Зависимость удельной скорости потребления кислорода от равновесной концентрации субстрата в хёмостатной куль туре.Кривые рассчитаны по уравнению (14).

+ — данные химического определения глюкозы;

О- концентрация субстрата, рассчитанная по интенсивности дытакия в соответствии с уравнением (II),

X - Р.Г1ивгмо*пв„ 2- В.гиЬгИДв, 3- Л.в1©Ъ1Гогт1в, 4 - Я.вг^Ьгоро-

11«

т«за,

ротребление источника азота. Зависимость удельной скорости роста от концентрации НН4 в среде для p.riuore»c»na, *.gloMfon»ie в r. erythro poli »описывалась уравнением Moho а величинами К* соответственно 3.5; S.0 к 1,5 иг н/л. В случае «ими 1« били выявлены две сиотемн потребления KirJ, одна из которых характеризовалась высоким сродством К* (менее 0,1 мг я/л), а другая — низким сродотвом к субстрату -( К? - 5,9 мг н/л). Бактерия вида а «иъгшч следовательно , наилучшим образом приспособлены к условиям азотного голодания и способны растя с высокой скорость» в средах, содержащих связанный азот в концентрациях менее I мг И/л. Наименьшим сродством к HJlJ Обладают P.fluoreeone И A.gloMfonnla , В ОЛучав R.erythropolie имеет место промежуточная степень сродства к субстрату - источнику » . Оотается неясным, представляют ли полученные данные янтерео с точки зрения интерпретации адологических свойотв почвенных бактерий, так как в естественных ср..„ах обитания, как правило, лимитирующим трофическим фактором олужит наличие -легкодоступных органических соединений.

¡Морфология и клеточные размеры. Морфология микроорганизмов представляет для специалистов-экологов очевидный интерес, так как размеры я форма микробных клеток также имеют приспособительное значение. При разных скоростях разбавления хемоотатяых культур бактерий было осуществлено измерение размеров клеток и отмечены особенности их морфологии. Для наиболее простых в морфологическом отношении бактерий B.euMllie И P.flUoreecene происходило только увеличение длины их клеток с увеличением скорости роста, для других видов име» ло место более сложное изменение морфологии: образование разветвленных в v-обраэных структур У А.еПЫГоичИИ fl.ffrythrajwli« , у M.egtll» , наряду с делением преимущественным механизмом размножения становилось дробление и образование вытянутых клеток типа "вн-ногр-чвого зерна".Еще более сложные изменения морфологии были отмечены у клубеньковых бактерий, характеризующихся резко выраженной полиыорфносты). При морфометрической оценке разных бактерий мы рассчитывали среднюю длвну элементарной клеточной структуры (¿а ), эквивалентной новообразованной дочерней клетке. В итоге проявилась общая тенденция, свойственная всем без исключения микроорганизмам: закономерное увеличение длины клеток о увеличением скорости роста (рис.9), при этом нулевой скорсти роста соответствовало некоторое ненулевое значение t„ я Для оценки я количествен-

ной характеристики этого явления удобно было использовать безраь-

Fio* Э.Изменэния минимальных размеров бактериальных клеток (¿»V в еавхоиыостн от удельной скорости роста в хемостатноД пульту- ■

ре.

О- рост,-лзгиктиропашюа глюкозой; О- роет* лвмитврованный источником азота; 1 - r*tlV«r*eowit 2 - B.vubtllift* 3 - ¿.eleMfamla, 4 * В.«ггшге>*11м* 5 -Ы .msIU«. 6 - R..*«liloti,

меринй параметр, харвжтвриэужвдй изменчивость равыеров клетки а заваскмости от U t

У, (16)

V er* . .

Stqt параметр ямеет максимальное аяячевие у JUelobirorai« затем падает в ряду R.«rythroFoiia>B.MUlotl>Bl*ubtlu«?-F.ílti»-т*а«*па > ».«gilí» . Умеяыоекяа дляяы клеток повыаает удельиую поверхность меточных мембран и» следовательно, создает возможность , более эффективного сотребленвя оуОстрата нэ разбавленных растворов«

Ва ооноваянх проделанной роботы данные морфометричвокяхизмерений могут быть использованы пра прямом мвкроскопировааия сочв ж грунтов для оценка скорости роста отдельных индикаторных видов бактерий.

ШВОДУ

1. Paeudaaora» fluore«e«n», nhiioblu» oelllotl ,Bacillu« «üb» tili« в периодической культуре обнаруживает экспоненциальный

- рост, который описывается интегральной формой уравнении Uoio, • тогда как роет Jtrtfcrobacter elotlfon*latltho<lttooe«tte *rythr»p«lta(lll«' rococcu» »eiIi» имеет линейный характер,

2. В условиях длительного голодания по субстрату - источнику энергии — отмирание R.eeliiott- протекает в соответствие о ка-нехякой первого порядка, Р.fiworeaeene — второго порядка, а A.eioMfor»i«(R.«ñrthrop<)iie, н.«silla способны перестраивать свой энергетический обмен таким образом, что удельная скорость отмирания снижается обратно пропорционально ъремвия, .

3. В непрерывной хемостатной культуре все изученные бактерия, за истечением A.si«MCermi*, достигают стациоааряого состоякяя. характеризующегося равенством акороотей роста а вымывания клеток; в случае д.в1оМГогв1« при высоких скороотях разбавления кайдю-даетоя наличие неэатухащях колебаний концентрация биомассы ж дд»-цектращш остаточного суботрата.

4. Эффективность использования питательных субстратов на построение бактериальной биомассы характеризуется соответствующими стехиометричесхкмя показателями Y , ш У,, которые фуикаюваль-

: но связаны с концентрацией субстрата я уделььой скорость» роста |1 . Варьировали« Y и Y» в зависимости от J4 целиком определяется иалячнем энергетических трат иа:поддержание, которые возрао-таит в периодической культуре по сравнению с хемостатной культурой, лимитированной глюкозой, н падают в ряду организмов:

... " ' 2(4 ' ■ '

Р.Г1иог«ае«м, В.«иМ111». к.*в111а, А.в1оЫГогп1«, П.»гугЬгсро)1»,

5. В хемостатной культуре бактерий величины коастанта мнсыщргня К, » максимальная удельная скорость роста ц*, и максимальная скорость метаболизма 0 изменяется при разных скоростях росте. чго отражает закономерное варьирование в зависимости от концентрации субстрата внутриклеточного содержания активных центров ферментных систем клеток, участвующих в метаболизме лкмитирутаего субстрата. Содержание активных центров для всех культур находится в избытке по сравнению с тем количеством, которое требуется для обеспечения актуальной скорости роста, в наибольшей степени это проявляется

у р.п<и1**е*п1 ■ В.1иН111| . , В наименьшей - у коринепо-добиых бактерий.

6. Универсальный характер имеет линейная зависимость между размерами клеток бактерий и удельной скоростью роста. Различие в степени проявления указанной зависимости находит выражение в своеобразии морфогенеза изученных бактерий.

7. Обнаруженные в работе принципиальные различия в кинетике роста почвенных бактерий отражают различия в стратегии взаюю-действия микроорганизмов о охружаще* средой. Корннеподобные бактерии могут быть отнесены к категории К-стратегов, доминирующих В зрелых экосистемах, а Р.Г1ш»Г*«еепа,В,мШри,В.*иМШа х г-стратегам, преобладающим иа ранних стадиях сукцессии.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Измерение интенсивности дыхания микроорганизмов в непрерывной культуре ( в соавторстве с Н.С.Паяиковым ).Прикладная биохимия и микробиология, т.17, №. с.728-733, 1931.

2. Некоторые экспериментальные и теоретические подходы для изучения нестационарной кинетики роста микроорганизмов ( в соавторстве с Н.С.Паяиковым). В сб.: Теория и практика управляемого культивировании микроорганизмов. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции, Киев, с.21-23, 1981.

3. Способ определения кинетических параметров роста микроорганизмов ( в соавторстве с Н.С.Наниковым и Д.Г.Заягинцевым). Авторское свидетельство # 950768, 1983.

4. Способ определения интенсивности дыхания микроорганизмов { в соавторстве с Н.С.Паяиковым и Д.Г.Звягинцевым) .Автор«кое свидетельство * 958496, 1982.

б» Рост почвенных ижкрооргакизмов в непрерывной двалізяоВ культуре { в соавторстве о Л.Г.Дорофеевым, Д',Г.Эвагннцевым, . 3«С.Дамаковым), Ылкробяологяя, 7.52, 1933*

6. Метод жзмереякя хнтеяонвностк дыхания микроорганэмоа в непрерывной культуре ( в'соавторстве сй.С.Пйкиковым в Д.Г.Звягинцевым). В СбгШОВЫе приборы И нзобретевня ученых МГУ КМ.ЦкВ. Ломоносова, Иэд-во УГУ. 1983.

Подписана з мечеть 4/Ш.83 г- Л-9І772

Формат 60x84/15 Печать офсетная

Леч.д. 1.5 Уч.-азд.л.І.г Ткрсж 100 вкв. Эах.Ш7

Цех оперативной полиграфии ОнтаТЭИни;:робио вро ц ■ ІС9004, Цосгао, Б.Коииунлотичвская, 27