Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КИНЕТИКА СТАЦИОНАРНОГО И НЕСТАЦИОНАРНОГО РОСТА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИКА СТАЦИОНАРНОГО И НЕСТАЦИОНАРНОГО РОСТА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ"



< МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ШИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РКВОЛИЩ I ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗВ1МВН1 ГОСУДАРСТВЕНШЙ УНШВНЯГГК ШИН М.В.ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах румошош

ДОРОФЕЕВ 'АЛЕКСАНДР ГЕННАДЬЕВИЧ

УДК 6Э1.46; 576.8.095 ч

. КИНЕТИКА СТАЦИОНАРНОГО К НЕСТАЦИОНАРНОГО РОСТА ПОЧВЕННЫХ ЖКРООРГАНЯЗИОВ

Спвщальность 03.00.07 - тпробтояогая

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учено* отвпеии кандидата сиоюгичесих наук

Москва - 1965

Работа выполнена на факультете Почвоведения Московского государственном * университета хм. I.В.Ломоносова

НауЧяіЯ руховодмтелы доктор*биологических я лук,

профессор Звягквцев Д.Г. Официальные оппоненты* доктор биологических яаук,

профессор КалвкуцхнЯ Я.В. кандидат биологических наук Гнльм&нов Т.Г.

Ведучая организация! Всесоюзны! иаучно*исследовательсхия институт биосинтеза белковых веществ (ОДШсннтезбелох)

Занята состоится на заседании

специализированного совета К05Э.05*£б ; Москва, ІІ9899, Ленгоры, МГУ, факультет почвоведения; Ученым совет,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения ШТ.

Автореферат разослан "/ " 1Э&С г.

Прнглаиаем Бас принять участие в обсуждения диссертация на заседания специализированного совета, а отзывы на автореферат присылать в 2-х экземплярах.

Ученая секретарь специализированного совета

доцент — * / Бабьева И.П.

Актуальность проблемы,, Для познания:особенностей функциониро вания кошт лвкса микроорганизмов в почве веобходимо летальное изучение : количественных:закономерностей микробного роста в пироком диапазоне изменения фактороввкешаейсреды, так какименао ростовые характеристики отдельных'микробных популяций определяет качественный и количественный состав сообщества микроорганизмов, его поведение и роль в процессе почвообразоваяялСПанхков, Звягинцев, 1983% До сих пор основным предметом кинетических исследований выл достаточно интенсивный стационарный рост микроорганизмов, который реализуется в хехостате,-либо в экспояеяяиалъной фазе периодической культуры, причем спектр исследуемых видов включал, главным образом, быстро растущие "легкокультивмруемае" микроорганизмы, представляющие интерес для микробиологической промышленности.-Ыежду тем, комплекс почвенных микроорганизмов характеризуется большим разнообразием.видов,, различающихся по своими экологическим стратегиям, то есть по совокупности признаков, обеспечивавших выживание и развитие организма в естественной среде обитания. В большинстве случаев популяции микроорганизмов в почве растут медленно,.* им свойственна низкая интенсивность физиологических процессов и нестационарный рост, вызванный регулярными изменениями внешних условия (Звягинцев, 1978î bazlti et al.,. 1976).

Цель работы? изучение особенностей кинетики стационарного я нестационарного роста некоторых представителей сообщества почвенных микроорганизмов в связи с особенностями их экологических стратегий.

Основные задачи иccлeдoванияt I. Изучение кинетики стационарного роста микроорганизмов^ относимых к различным-экологическим группам, с использованием разных непрерывных методов культивирова-ниягтхемостата, непрерывной диализной культуры, периодической культуры с подпиткой. 2.-Изучение динамики.переходных процессов при выведении микробной культурыиз стационарного состояния путем резкого увеличения концентрации лимитирующего субстрата..3..Изучение ^кинатики отмирания микроорг шизисв*^^длитеяьйон<гголодании.

Pt-ZZHDJ

«Ъгк^;;.,'; i С V. - ,' л:-,

___lia. H. Д._____

натчяая новизна. Проведено детальное количественное изучение непрерывного я периодического роста ряда почвенных микроорганизмов в кироком диапазоне концентрация лимитирующего рост субстрата -источника углерода и энергии, прослежена связь между ростовыми характеристиками микроорганизмов и их экологическими особенностями. Установлен факт непостоянства коэффициента поддержания я показано, что причина этого заключается в изменении относительного содержания внутриклеточных функционально активных компонентов* Продемонстрирована зависимость динамики переходных процессов в периодической к отмирающей культуре с предшествующими условиями роста. Использование новых функциональных связей между потенциальной активностью катаболизма клеток и концентрацией внеклеточного субстрата в дополнение к общепринятой теория микробного роста позволило разработать математическую модель, удовлетворительно описывающую роет культур как в стационарном, так и в нестационарном состоянии и объясняющую "аномальное" поведение микроорганизмов при сверхнизких уделышх скоростях роста. Проведено определение основных констант, характеризующих кинетику и стехиометрию роста почвенных микроорганизмов.

Практическое значение. I. Закономерности кинетики роста, выявленные в настоящей работе, важны для балансовых расчетов материально-энергетического обмена в экосистемах. 2, Полученные данные могут быть использованы для оптимизации биотехнологических процессов выращивания и хранения-микробных культур. 3. Результаты работы используются в курсе лекции "Основы биологической кинетики", читаемом на кафедре биологин почв факультета почвоведения МГУ.,

Апробация работы. Материалы диссертации выли доложены на VI научной конференции молодых ученых факультета почвоведения ИГУ С1982), яа заседании ВИО (198*), а также на заседании кафедры Ожологж* почо ИГУ (1984).

ПуОяджяазя^ По теме диссертации опубликованы б работ.

Объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, изложения полученных, результатов в 2-х главах,.заключения я выводов, содержит 125 страниц машинописного текста, - 56 рисунков, 16 таблиц, список литературы из 152 названий (яэ них 115 - зарубежные).

Автор выражает глубокую благодарность ст.н.с. Н.С.Паникову за большую помочь при проведении работы, а также доц. И.П.БаЗьевой, ст.н.с. И,Н.Скворцовой, к.к.с. Т.Г.ДоброВольской и п.н.с. Л.В.Лы-сак за любезно предоставленные культуры микроорганизмов.

ОБЪЕКТЫ И НЕ ГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы культуры дрожжей Свъагуошусвз for-micariua BKH-I555 и Ырощусвв tetraspoxus 130 (получены из коллекции каф.биологии почв ИГУ) и Йактерий Bacillus subtilia 428 (получена из BKU ЯБ$Ы АН СССР), Pseudomoaae fluorescent 312 и Arthxobacter globifoxmis Cj-4 (получены из коллекции каф. биологии почв МГУ),

Кинетические исследования проводили с использованием синтетических сред с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии (Панихов и др., 1980; Бондаренко, 1983). Микроорганизма выращивала в непрерывной культуре, диализной культурен периодической культуре с подпиткой (Перт, 1978). В периодической культуре микроорганизмы выращивали в круглодонных колбах (750 мл) на качалке (180оИ/мин). Использовали также непрерывные культиваторы после отключения подачи питательной среда. Выращивание в непрерывных и периодических условиях проводили при 25*0,1°С (для диализных культур - 28+0,5°С). Реакция среды при проведении опыта оставалась приблизительно постоянной (рН 5,0 для дрожжевых и рН 7,5 для бактериальных культур).

Биомассу определяли измерением оптической плотности суспензии микроорганизмов при 410 ни на спектрофотометре СФ-261-001, с последующим пересчетом по калибровочному графику на вес абсолютно

сухой биомассы, а также бюсроматяыиметодом(Орлов, Гришина, 1981). Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазиым нетодои (Щербухин и др., 1975). Жизнеспособность клеток определяли методом микрокультур ( Postdate, Hunter, 1962). Интенсивность поглощения кислорода суспензией микроорганизмов измеряли полярографические кислородным электродом Кларка (Шольц, Островский, 1978). Скорость выделения С02 определяли в динамическом режиме по приросту концентрация углекислот на выходе из ферментера, либо в статическом рехиме по динамике накопления COg в герметично закрытых сосудах. Концентрацию С02 измеряли на газовом хроматографе ЛХЦ-8МД (СССР). Энергетические траты;на поддержание определяли по интенсивности эндогенного дыхания сразу после прекращения подачи субстрата в непрерывную культуру (Паников, 1984а).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава I. Стационарная и квазистационарная:кинетика роста. Хеностаг. В наших опытах была прослежена динамика достижения стационарной концентрации биомассы Зс при последовательном'изменении скорости разбавления. В культурах дрожжей величина х устанавливалась достаточно быстро вплоть до удельных скоростей, близких к ¿Jm (рис. I). Однако при низких скоростях разбавления D (менее 0,01 час"*) у L. tetraspoms наблюдали длительное колебательное изменение плотности культуры, сочетающееся с образованием агрегатов клетох, распадающихся при более высоких скоростях: разбавления. Необычной динамикой биомассы характеризовался рост ft. globifcrwis. При D< 0,05 чао*"1 стационарное состояние устанавливалось достаточно быстро, однако при превышении этой величины-удельная скорость роста культуры падала, и биомасса быстро снижалась. Стационарные состояния при D> 0,05 чао-1 оказались возможными линь после, многократного периодического разбавления культуры свежей средой (рис. 1в),

Численные значения х и $ использовали для расчетов выхода био-

Рис. I. Динамика биомассы К. formicanus (a), L. tetrasporus (Б) и globi forints (В) в хемостатной культуре. Стрелками обозначены моменты сиены D , цифрами -численные значения 3) .

¿-Ш7

массы по субстрату Для всех культур с увеличением В происходило закономерное возрастаниеУв (рис. 2). Нами были определены величины актуальной (<}) я, после добавления избытка глюкозы, потенциально* (О) удельной скорости потребления кислорода (выделения углекислоты) в стационарных состояниях при различных)* (рис. 3). Величина с увеличением ^ возрастала от значения, слизких к О, до максимальных значения, соответствующих причем зависимость

от^ только в области25^ мохно было аппроксимировать об-яепринятой линеЯной функцией су» ^,,+т, где максимальный выход биомассы на единицу потребленного кислорода,т - коэффициент поддеркания. Величина а и удельный расход энергии на поддержание жизнедеятельности т оказались непостоянными и возрастали с увеличением^! по насыщающей кривое.

Диалкэнад культура. С целью изучения кинетики роста микроорга^-аизмов при крайне низких концентрациях лимитирующего субстрата оыли поставлены опыты с непрерывными диализными культурами. Динамика биомассы микроорганизмов в первом приближении имела линейный характер (рис. 4). Классическая модель роста в диализной культуре (ЗсЫЬ:, СегЬопИ, 1967) предсказывает замедление роста и последующую стабилизации биомассы на таком уровне, когда весь субстрат -источник углерода и энергии расходуется только на поддержание. Однако экспериментальные данные многократно (в 5-6 раз) превыпали ожидаемые величины максимально возможной биомассы, рассчитанные при условии постоянства ш . Такое расхождение может бить объаске-но лишь значительным снижением гп при уменьшении р , что подтверждает выявленную для хемостатной культуры аналогичную закономерность. Потенциальная удельная скорость дыхания, прослеженная в культуре ИТопмсппде , в течение первого месяца быстро снижалась, а затем наблюдалась тенденция к стабилизации на уровне 2,5-2,8 шаль С^/ч-г биомассы.

Пермцргаеская культура с подпиткой. Для получения наиболее на-

г йиомассы/г глюкоз»

Ys, г биокасса/г глюкоза

о

0,2 0,3 L&J 0,05 0,10

Рис. 2. Зависимость выхода биомассы от удельной скорости роста в хемостатной культуре (А,В) и периодической культуре с подпиткой (Б,Г). А,Б -D. formUarios ; В,Г -Ц. tetra-spopus . Кривая I рассчитана по системе уравнений (4), кривая 2 - по уравнению « Oís") + m/Ц.

ммоль СмСОо) п л ммоль сои

^ л -—--=— о. m__

7 г оиомассы час

0,10 0,20 0,30 чГ* " 0,05 0,10

Рис. 3. Зависимость параметров 0. (1),(2) ит(3) от удельной скорости роста хемостатной культуры IX Тогт1сатш& (А) к ЬЛе1гаьроги& (Б). Стрелками указаны значения, полученные в периодической культуре с подпиткой. Кривые рассчитаны по системе уравнений (4).

Рис. 4. Динамика виомассы(I), А.дЬЬИопЫа (2), 1). Тогпнсагшэ (3) и Р. Ииогеьсел» СЮ в диализной культуре.

(3,1) в периодической культуре с подпиткой. 1,3 -Ые1га-?роп>5 , 2,4-I).Логпйсаниз . Кривые рассчитаны по системе уравнений (4).

дехных количественных оценок параметров глубоко лимитированного роста микроорганизмы выращивали в периодических условиях с подпиткой. На рис. 5,6 показана динамика общей биомассы ОС и плотности биомассы х клеток дрожжевых и бактериальных культур. У дрожжевых культур и ПНиогезскв изменение общей скорости накопления биомассы носило затухающий характер, и через 15-20 суток скорость роста менялась незначительно. Величина х постепенно снижалась в 1,5-2 раза. Нарастание биомассы в культуре МЬЫЬпмв течение всего опыта носило линейный характер. Своеобразную динамику роста обнаружила культурав,зиЫ;111в. В двух вариантах опыта, различающихся концентрацией глюкозы, изменение ОС протекало однотипно! за плавным снижением общей скорости роста следовало резкое падение || в О к прекращение нарастания биомассы.

В течение опита относительное количество спор В.аиъъШа было приблизительно постоянным и составляло в среднем 13$. В культуре О1 (огшсапиз доля аохоспор также оставалась неизменной - 10-14$. Жизнеспособность клеток во всех опытах была достаточно высокой, не менее 92$ от общего количества вегетативных клеток.

Выход биомассы по субстрату Чз в периодической культуре с подпиткой оставался высоким (рис. 2). Полученные результаты невозможно объяснить с точки зрения классической теории, в соответствии с которой при снижении удельной скорости роста .4$ падает до О. На рис. 2 приведены теоретические кривые, рассчитанные по уравнение Ч$вЧ5*+пл/|л с использованием величин т , определенных традиционным способом в хемостате. Очевидно, при низких р теоретическое предсказание не соответствует экспериментальным данным. Результате прямого измерения величины т показали, что по сравнение с быстрорастущими хемостатными культурами траты на поддержание снизились в 6-10 раз,' что подтверждает.выводы, сделанные на основании хемостатных опытов, а также расчетыт по данным динамики биомассы

в диализной культуре.

3-/79?

Рис. б. Динамика суииаряой Оиомассц (I) и плотности биомассы (2) в периодических культурах с подпиткой. А - Р. АдогеБсепз » Б - В/зиМПЬ , Б - А. 91оЬНогш'|5. . Кривые рассчитаны по системе уравнений (<0.

Модель роста .микроорганизмов в стационарном и квазистапиояар-ком состоянии. На основании экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что Q х Ш непостоянны и является функциями удельно! скорости роста, а, следовательно, концентрации лимитирующего рост субстрата в среде, была построена математическая модель роста микроорганизмов в стационарном состоянии. Основные положении модели следующие: I. Потенциальную удельную скорость дыхании Q можно рассматривать как меру относительного содержания Функционально активных жлеточкых компонентов е . Величина е , а, следовательно, и Q., зависит от равновесной концентрации субстрата s по гиперболическому закону

CL«Q0+(QW-QO)S/<KS+S) где константа равновесия, Q¿p некая минимальная (конститутивная), aQ^ максимальная удельная дыхательная активность клеток. 2. Энергетические траты на поддержание Ш пропорциональны не суммарной микробной биомассе, а количеству функционально активных кл клеточных компонентов, существование которых требует затрат энергии: m- Kía-Qo) (2) где К- постоянная.

На рис. 7а,в приведена зависимость между величинами Qn S для дрожжевых культур. Численные значения рассчитывали по уравнению Иихаэлмса - Ыентен с учетом непостоянства величины Кт(Паников, I9ñ4): S (3)

где L - отноиевиеQ/Knr постоянное для данной культуры микроорганизмов. Кривые могут быть вполне удовлетворительно аппроксимированы гиперболической функцией (I). Связь между m и Q. близка к линейной (рис. 76 ) и хорошо описывается уравнением (2).

Используя уравнения (I) и (2), дополним общепринятую модель микробного роста в непрерывной культуре следующим образом:

Г dx/dt-чц-тох, р-УЧ^-т), т»к(й-а0) < ¿sfa+=MSo-s)-<pc t <f«absyta+Ls) сю

Теоретические кривые зависимости параметров И ^ от^,рас-

считанные по системе уравнений (А),при условиях стационарности

достаточно хороио описывают экспериментальные данные Срно. 2Д табл. 1>.

Для описания дннаыики процессов, происходящих в периодической культуре о подпиткой, мы предполагали, что в связи с медленный изменением^ культура находятся в квазкстационарном состоянии, при котором содеркание функционально активных клеточных компонентов находятся в равновесии с концентрацией лимитирующего рост субстрата. В этом случае система уравнений, описывающая процессы, происходящие в периодической культуре с подпиткой, аналогична (4), однако в связи с непостоянством объема культуры необходимо учесть изменение В '

с подпиткой приведены на рис. 5,6.

Чтобы учесть дискретный характер роста в.зчЪМИз, ввели новое

В остальных случаях модель достаточно хороно описывала динамику популяций без дополнительных условий,с использованием определенных для хемсстатной культуры констант (табл. I).

Таким образом, непрерывное культивирование выявило ряд обяих и специфических особенностей кинетики роста микроорганизмов. Все культуры, независимо от систематической и экологической принадлежности, со снижением стационарной концентрации субстрата в среде уменьшали свою потенциальную метаболическую активность, что обеспечивало им снижение энергетических трат на поддержание и мшшпсп перехода к более экономичному росту. Однако степень

где I: - время, Ц>- исходное значение Х> .

Теоретические кривые динамики кнЗС в периодической культуре

условие - раз

Тавлида î.

Основные кинетические параметра стационарного роста микроорганизмов

Культура Qo ШІОЛЬ О2 Um кколь 0>2 Яго чао" Ks иг гя 1 киоль Oj-Л К m "s КГ бИОМ tniti ч кг dnoif Srwn кг гл

г оиом-час г оиом-час ■л Г ЙИОМ'Ч'МГ гл КГ гл кг гл л

D.formicarlua ' 2,0 6,8 0,42 0,135 8,3* 0,21 0,66 0,18 0

L.tetraaporue 0,5 2,78 0,14 0,36 3,3 0,38 0,64 0,38 0

P. fluoréscana 2,5 16,5 0,41 0,11 13,0** 0,09 0,43 0,09 0

i.elobilomtia 2,75 8,25 0,26 0,33 9,0** 0,29 0,52 0,35 0

B.subtllla 0 ' 10,0 0,31 0,35 11,0** 0,28 0,54 0 0,05

* - по данный Н.СЛаникова (1984а)

«х - по данный Т.Ф.Бондаренко (І983)

кислорода от равновесной концентрации субстрата в хемо-статной культуре (А) и соотношение между величинами и т.(Б). I - D. tonrncarius , 2 - L, tetrasporus . Стрелками указаны значения, полученные в периодической культуре с подпиткой.

Рис. 8. Динамика биомассы p. fluoresceins (1,2) и I, globiforims,

(3,4) после снятия субстратного лимитирования. Предшествующие удельные скорости роста (ч~*): I - 0,125; 2 -0,0057; 3 - 0,024; 4 - 0,002. Кривые рассчитаны по системе/равнений (б). '

снижения m и, следовательно,^ у микроорганизмов различна. Наиболее высокие значении^при низких jX обнаружили L.Vetrasporus к A.qlo-ЫогЫЗ (величины минимального выхода биомассы Ч^™? рассчитанные дл4 JA-D« О, приведены.в табл. I). Вместе с тем, в условиях избытка субстрата при высоких скоростях разбавления рост этих микроорганизмов отличался нестабильность» к значительно более низкими значениями |1тпо сравнению с Uforwlcariirs, ftfluorescjens н Ь. wMil'ts.

Глава 2. Нестационарная кинетика роста.

Рост микроорганизмов после снятия субстратного лимитирования.

Для выращивания микроорганизмов в периодическом режиме использовали инокулят из непрерывной или отмирающей культуры.

Сразу после внесения кнокуяята в среду с избытком глюкозы во всех случаях без заметного лаг-периода начиналось интенсивное нарастание биомассы. Единственное исключение составили бактерия Ь. аиЫШз , предварительно выращенные в периодической культуре с подпиткой, которые обнаружили лаг-фазу около 10 часов. По типу динамик« биомассы изученные микроорганизмы были разделены на две группы. У первой группы, в которую вошли D.fbrmtacrws, Р.fluorescens и Ь. subtiUs , увеличение биомассы происходило с нарастающей удельной скоростью, причем в переходном режиме ее величина была ниже Jim и зависела от предыстории культуры: с увеличением предшествующей удельной скорости роста продолжительность переходного процесса сокрапалась (ряс. 8). У второй группы, в которуп были отнесены L.-tetrasforvsH ^gloliformis» динамика биомассы носила более сложный характер, В первые часы роста наблюдали резкое-увеличение плотности биомассы, причем удельная скорость роота достигала величин, многократно превышающих^. Затем интенсивность роста падала, и в дальнейшем плавно возрастала до^. Первоначальный скачок биомассы сопровождался быстрым увеличением интенсивности потребления глюкозы при незначительном изменении скорости дыхания. Это, по-видимому, связано с включением глюкозы в состав биомассы, напри- •

- 16 -

мер, в клеточную стенку, без значительного расхода энергия.

Одновременно с динамикой биомассы прослеживали изменение: величины . В течение первых минут после добавления субстрата она достигала потенциальной удельной скорости дыхания О,и затем постепенно увеличивалась до (^параллельно возрастанию до величины

Для описания роста микроорганизмов в переходном.режиме была предложена моде», учитывающая запаздывание во времени аффективной удельной скорости потребления 02» определяющей интенсивность роста биомассы , по сравнению с реальной величино! определяемой в опыте. Запаздывание может быть связано о процессами холостого окисления глюкозы, изменением энергетического заряда клеток и т.п. Система уравнений, описывающих переходный процесс в периодической и непрерывной культурах, исеет вид:

1 сіа . (б)

I стдн - - са-сы]

В случае культур А.в1оЫГогш1в и Ь.і«ігварогив учитывали также включение глюкозы в биомассу без окисления в первые часы:

где ^-постоянная.

Кривые, рассчитанные-по уравнениям (6) и (7), вполне удовлетворительно описывают процессы в периодической культуреСрис. в, численные значения кинетических параметров уравнений (б) и (7) приведены в таблЛ,2).Очевидно, при условиях <Іх/<І1*=сІз/сН'><1(5/сй'=0 система (б) упрощается до системы, предложенной для описания стационарного роста, т.е. в рамках одной математической модели удается описать динамику ростовых процессов как в стационарной, так я в нестационарной куяьтуре.

Продолжительность переходного периода после снятия субстратного лимитирования у изученных культур значительно варьирует: так,

Таблица 2.

Усредненные* значения параметров уравнений (б), (7) и (8), описывающих иестационарный рост микроорганизмов.

Культура час час и P мг биом ММОЛЬ Uo

D.íoimicarius 0,40 0 0,048 0,3 0,11

Ъ.tetrasporus 0,13 0,30 0,100 0,3 0,22

F.fluoresceaa 3,38 0 0,036 0 0,04

A.globJjtormis 0,04 0,65 0,090 0 0,15

B.eubtiUs 0,18 0 6,0 0,5 0,43

х - усреднение проводилось по всем вариантам опыта (разные пред-чествующие удельные скорости роста) для одной культуры

Р. Ииогеасвпа достигает ^ ухе через несколько часов, тогда как для А.б1оЪ1Гопв1а требуются сутки. По степени инерционности, мерой которой в данном случае может служить величина, обратная коэффициенту , микроорганизмы располагаются в следующий ряд: A.6loЬifoIIllІs^L.tвfeгaapoшs,B.suЪtllis>D.fonnioaгlua>P.nuoгввoeюa

Отмирание микроорганизмов после прекращения поступления питательного субстрата.

Изучалась кинетика отмирания микроорганизмов, предварительно выращенных в непрерывной культуре с различными скоростями разбавления. Использовали также периодическую культуру, выращенную с максимальной удельной скоростью роста (рис. 9). Для дрожжевых культур была прослежена динамика концентраций внеклеточных субстратов (р): в процессе отмирания ока увеличивалась в соответствии с убылью биомассы клеток (рис. 9 ). В отмирающей культуре происходили не только количественные, но и качественные изменения. В частности, уменьшалась потенциальная удельная скорость

дыхания Q.. За месяц ее величина у D.iormicariua.упала с 8 до 2,4 ммоль 0^/ч-г биом и приблизилась к определенной в непрерывной культуре Отмирание вегетативных клеток B.subtilla сопровождалось интенсивных спорообраэованиеи, и ухе через 7 суток инкубировании вся популяция состояла преимущественно из спор. Относительное количество мертвых клеток к концу опыта не превышало 10-15$, за исключением р.Пиогевсзпя , для которого оно составляло 30$.

Для описания отмирания микроорганизмов при голодании была предложена модель, учитывающая следующие процессы: а) распад биополимеров, интенсивность которого пропорциональна величине CO.— б) ресинтеэ биомасса за счет продуктов распада с выходом биомассы Yk* при этом образуется клеточное вещество о минимальной величиной Q-Qoi ») гибель части клеток- с высвобождением в среду продуктов автолиза в концентрации р i

( dx/d* =-n(Q-Q0)x/b(l-i)

I dp|<U = - b?-dx|dt CS>

где Ь - количество кислорода, необходимое для полного сжигания биомассы, П - коэффициент, эквивалентный К при голодании;!? -постоянная.

Рассчитанная по системе уравнений (6) динамика биомассы, концентрации продуктов автолиза и потенциальной удельной скорости: ■■' потребления:^ вполне удовлетворительно описывает эксперименталь-/ ные точки (рис. 9, табл. 2).

Таким образом, интенсивность отмирания, аналогично удельной скорости роста, связана с потенциальной удельной скоростью дыхания* Следовательно, чем быстрее росла культура в период, предшествующий голоданию, тем вы*«.. значение удельной скорости отмирания.

х,мг биомассы/л

- 19 -

0,126 имольОг

5 10

1-х, иг биомассы/л

25 сутки

200

150-

р 9

ымоль 92

л- 100-

I.

о-1 50

30 сутки

Рис. 9. Динамика биомассы (I), удельной потенциальной скорости * потребления кислорода (2) и концентрации продуктов автолиза (3) в отмирающих культурах Б. Гогткагшв (А) и I.. 1еТга5рогиб(Е). Цифрами обозначены предшествующие удельные скорости роста (ч ). Кривые рассчитаны по системе уравнений (8).

При голодании происходит постепенное снижение величины а, I» следовательно, удельной скорости отмирания. Мерой инерционности (интенсивности падения скорости отпирания) в этой случае может служить величина 1/пУц, • Для изученных культур этот показатель увеличивается в ряду: В*8иЪЗД11в< А.еЮЬ1£огт1з<1..1;в1;гааро11»в<В.Го1т1еа-гм»5< Р. Ниогдесепз. Таким образом, культуры, обладавшие высокой мобильностью при снятии субстратного лимитирования и быстро достигающие максимальной метаболической активности (р.Пиогвасепз и б. Гогш1саг1иа)) в условиях голодания проявляют Сольную инерционность, что приводит к быстрому падении плотности биомассы в первые дни отмирания.

них

Проведенные исследования выявили значительные различия в ростовых характеристиках культур, позволяющие объединить их в две четко различавшиеся группа.

Культуры В.Гогв»1саг1иэ и Р-Пиогоэсепа характеризуются малой ■ инерционностью и высокой потенциальной метаболической активностью Шп\ 6,8 и 16,5 мколь од/ч-г биом), что позволяет им при резком . увеличении концентрации субстрата в среде быстро достигать высоких скоростей роста С час-1) и стабильно расти при высоких скоростях разбавления в непрерывной культуре. Вместе с тем, высокая метаболическая активность клеток в момент исчерпания субс.ра^ та в среде приводит к быстрому самоокислению биомассы в процессе эндогенного дыхания, а, следовательно, к высоким скоростям отмирания в первые сутки голодания.

А.е1оЪ1Гот1в и ь. 1геьгаврохиз имеют меньшую потенциальную метаболическую активность 8,75 и 2,75 ммоль 02/ч-г биом соответственно), и их максимальные удельные скорости роста значительно ниже (0,25 и 0,14 Час-1). У А.б1оЪ1Гош18 переход от низких к высоким Ц сопровождается выделением продуктов метаболизма и нестабильностью динамики ростовых процессов, что приводит к

длительномупериоду адаптации » високим схоростям разбавления в непрерывной-культуре. Это свидетельствует оО отсутствии у этих бактерий надежноа прн избытке:субстрата регуляции обмена веществ и их неспособность» в этих.условиях конкурировать с видами,-имеющим* такую систему*

Однако энергетический обмен у A.giobifomis и L.tetraaporue при - остром дефиците источника углерода и энергии отличается высокой экономичностью 0,35 и 0,38 мг биом/мг глюкозы;соответственно) вследствие значительного снижения энергозатрат на поддержание, и эффективность роста этих культур при глубоком лимитировании намного ВЫпе, чем у P.fluorescens ИИ.ГогпіІсагІиа ( 0,092 и 0,18 мг биом/мг глюкозы соответственно). В этих условиях A.globifonnls и ь.tetraaporue обнаруживают способность включать экзогенный субстрат в состав клеточного материала без окисления при переносе культур на среду с сахаром.. Представляется возможным рассматривать выявленную закономерность как способ адаптации микробных популяций, позволяющий за короткий промежуток времени.(2--3 часа) запасать значительные количества (до 50-І25<Є от исходной биомассы)'резервного энергетического субстрата.-Вследствие более низкой метаболической-активности отмирание A.elobifonois и Ь. tetra apoiua происходит медленнее, чем у P.fiuoreacea и D.formlcartva соответственно.

Выделенным по кинетический характеристикам группам микроорганизмов можно поставить в соответствие две группы организмов, различающихся по типу экологической стратегии. К первой группе - Z- стратегов - относятся популяции, подверженные в природе резким всплескам в сообществах,, находящихся на ранних стадиях сук-цессии при наличии неполной занятости пространства местообитаний. Анализ кинетики роста свидетельствует, что к реализации этой программы в Оольией'степени приспособлены P.fluorescens и D.toxulca-rius .Вторая группа организмов;- к -стратеги - характеризуется

стабильной популяционной плотность» и доминированием к& поздних: стадиях сукцессии в климаксном состоянии. Эти организмы способны с максимальной эффективностью использовать поток вещества и энергии через экосистему. К ЭТОЙ группе могут быть отнесены А.еЮЫ-Гогш1зИ Ь.ЪеСхазрогиз•

Кинетические характеристики в.яиЬ«111а не позволяет четко отнести этот вид к одной из двух:выделенных группировок. По ростовым, свойствам он занимает промежуточное положение между г- и К -стратегами: высокая потенциальная метаболическая активность (0»п*

10 ммоль 02/ чг биом), определявшая высокую максимальную ухелькую

*

скоромь роста (0,3-0,42 час"), сочетается с достаточно высокой инерционность» и способность» к длительному выживание в условиях голодания за счет образования эндоспор; Указанные ростовые особенности предполагают возможным отнесение в.еиЫШв к третьей экологической группе организмов -и -стратегам. Эти организмы характеризуется редкими всплесками роста на фоне длительного существования в условиях переживания неблагоприятных факторов внешней среды.

Таким образом, изучение кинетики стационарного и нестационарного роста микроорганизмов позволяет выявить физиологические механизмы адаптации видов к факторам внеиией среды и, следовательно, определить способы реализации.экологической программ» микробных популяций в естественной среде обитания;

ВЫВОДЫ

I. При непрерывном выращивании микроорганизмов в хемостате, диализной культуре и периодической культуре с подпиткой в режиме глубокого лимитирования.источником углерода и энергии обнаружены отклонения от классической хемостатной теории,. которые проявились в отсутствии пороговой/стационарной концентрации лимитирующего субстрата, а также:в существовании некоторого положительного значения 'минимального выхода биомассы"Сори неограниченном замедлении роста. Единственное*исключение составляют спорообразующие бакте-

рия- в-заьи.11в ,. размножение которых скачкообразяопрекраяается при некоторой критическое концентрации субстрата С - 0,05 мг глюкозы/л). Наибольиие величины.Уь"оОнарукенм у автохтонных почвенных микроорганизмов Ь^ейгаврогиз И А.е1оЪ1Гот1в. 2,- Отмеченные отклонения от - классической хемостаткой теории определяются непостоянством энергетических трат на поддержание, которые варьируют в зависимости от концентрации лимитирующего рост субстрата и линейно связаны с содержанием метаболически активных клеточных компонентов.

Исходя из численных значений кинетических и стехиометрических параметров, определенных в стационарном и квазистационарном режимах (Оа»(}т»\,пи Т.п.), может быть предсказано поведение микроорганизмов в переходных режимах, когда концентрация лимитирующего рост субстрата резко изменяется в сторону увеличения или уменьшения.

4. При переносе лимитированной микробной культуры в Ъреду с избытком субстрата происходит несбалансированный рост микроорганизмов с изменением качественного состава биомассы. Динамика переходного процесса определяется тем, с какой удельной скоростью, размножались микроорганизмы перед переносом, и может быть предсказана кинетической моделью, предусматривающей эффект запаздывания. Наибольшей инерционностью в переходных режимах характеризовались Д.е1оЬ1Гопп1а и Ь.ЪеЪгаерогио , наименьшей - р.Пиогев-свла Н Б.1охт1саг1и8.

5., Обнаружены явления включения глюкозы в состав биомассы д.е1о-ЫГогт1а и Ь.ЪеЪхазрогоабеэ окисления, которые происходят в первые часы после переноса глубоко лимитированной культуры на среду с избытком сахара. Эта метаболическая реакция служит экономичным путем запасания углеродистых соединений без увеличения энергозатрат на поддержание.

б. При отсутствии экзогенных субстратов микроорганизмы отмирают

со скоростью, которая функционально связана с предшествующими условиями роста, при этом снижается «тносительное содержание активных клеточных компонентов и происходит накопление-продуктов^ автолиза в среде, ¿..elobitoimls и.1 L.tetrasporus в этих условиях обнаруживают повниенную способность к критическому росту и быстрому снижению потенциальной дыхательной активности, что определяет их-более длительное выживание при■голодании.

Материалы диссертации опубликованы :вработах^

1. Энергетические траты на поддержание ВеЪ&гтоттсез - fomicarius

в хемостатной-и непрерывной диализной культуре (в соавт. с Панико-выи Н.С. и ЗвягянцевымД.Г.). Микробиология. 1902, т.51, с.723.

2. Использование непрерывной диализной культуры при интенсификации синтеза вторичных метаболитов микроорганизмами (в соавт. с Паниковым Н.С., Степановым А.Л.). В сб.i.Новые приборы, устройства, методики, материалы и технологические процессы, разработанные учеными ИГУ для внедрения в народное хозяйство и науку. ИГУ, 1982, с. «V

3. Методы■непрерывного культивирования^ в почвенно-микробиологических исследованиях (в соавт. с Воробьёвой Е.А., Кольчугиной Т.П.).£ сб.; Современные методы.исследования почв. Материалы Всесоюзной научной конференции. ïl., 1983, с.47.

4. Кинетика роста микроорганизмов с разными-экологическими стра-тегиямив диализной культуре при низких удельных-скоростях роста* (в соавт. с Бондаренио Т.Ф;, Звягинцевым Д.Г., Ивняковым Н.С.).-Микробиология.. 1984, т.53,.с. 271.:

5. Стехиометрия-и энергетика:медленного роста почвенных микроорганизмов. Вестник ИГУ, сер. Почвоведение,1984, * 2, е..37..

6. Особенности строения клеток почвенных бактерия-в условиях лимитированного роста (в соавт. с Сойкой Б.Д., Паниковым Н.С.). Тезисы докладов на Всесоюзном совецании по цитологии микроорганизмов ..Пуяино, 1985.■

tili і—с in к пиап /HvCWT Л- Ц<Я Формат te* *¡>/b

Усл. от. Я. Уч^ам. л 4,0

Тцш «и. Заказ Mf

HagmUM Moe*o»í*aro упмрсітп* 103009, Мое»»«, ул. Гіциі, S/7. Ttowp*4aa Им и МГУ, Момм, Липни горы