Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОСТРОМ ДЕФИЦИТЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОСТРОМ ДЕФИЦИТЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩВД

: Я ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГССУДРСТЕЁНННй УНИВЕРСИТЕТ имени И. В. ЛОМОНОСОВА

: ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОЩШИЯ

На правах рукописи ЕВДОКИШВА Наталья Вітальевна

УДК 631«46 ■

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ; СОСТОИТЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОСТРОМ ДЕФИЦИТЕ ПИТАШШиХ -ЕЕЩЕСїВ

.Специальность 03.00.07 - ыикровиологий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ч

Москва 1909

Г/Г/

Работа выполнена на кафедре биологин почв факультета почвоведения ¡¿ооновского государетввшого университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель! ' доктор биологических

. Н.С, Паннуов

Официальные оппоненты( доктор.биологических наук

; В.И. Дуда

кандидат биологических наук Т. Г. Мирчинк

Ведущая организация; , Институт биохимии и физиологии

■ микроорганизмов АН СССР, Цущино

Завета состоится ^990 г. на заседании

специализированного совета К.053,05.66} Москва, 119899, Ленгоры, МУ, факультет почвоведения, Ученый совет, -С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке факультет« почвоведения МГУ.

Автореферат разослан * • " 1990 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании специализированного совета, а отзыв прислать В 2 -х экземплярах, ч

Ученый секретарь специализированного совета </"" Л / И.П. Бабьева дсюнт ^ /

Дктуальность проблемы. Сведения о физиологическом состоянии поч-

пор остактся противоречивыми. С одной стороны, микроорганизмы в почве характеризуются достаточно высокими значениями аденилатного экер-гатичекого заряда ( Brock , 1987 ). С другой стороны, считается, что природные популяции микроорганизмов пребывают в малоактивном состоянии (Cray ( Williams , 1971 ), Об этом свидетельствует низкая скорость возобновления микробной биомассы в почве Í не более 10-20 генераций за сезон ). Наиболее вероятная причина низкой активности почвенных микроорганизмов - глубокое лимитирование роста доступными источниками анергии. Шло постулировано ( Звягинцев, 1987} Пер», IS76 ), что значительная часть микробных клеток в почве находится в гилометаСолическом состоянии, при котором потребленный энергетический субстрат расходуется лишь на поддержание жизнедеятельности клеток, но не на размножение. Однако эта гипотеза пока не получила экспериментального подтверждения, что связано с очевидными трудностями методического характера. Традиционные приемы лабораторного культивирования не позволяют воспроизводить физиологическое состояние микроорганизмов, адекватное их естественному ( Клвйеер, Ван-Ниль, Виноградский ). Для изучений физиологического состояний микроорганизмов в условиях острого дефицита питательных веществ представляется ■ целесообразным использование совокугшости методов непрерывного и периодического культивирования, позволяющих поддерживать крайне медленный рост со скоростями, близкими к наблюдаемые в природных средах.

Цель - изучение адаптивных изменений физиологического состояния микроорганизмов в условиях глубокого лимитирования роста органическим ( ноноыерныыи и полимерными } субстратами и биогенным элементом ( азотом ). * •

методов культи-

венных микроорганизмов непосредственно в среде их обитания до сих

вире дпиткой ) край-

не медленного роста бактерий и грибов, 2. Исследование особенностей динамического поведения и физиологического состояния микроорганизмов в условиях голодания, 3. Изучение количественных закономерностей роста микроорганизмов на полимерных субстратах и механизмов регуляции биосинтеза экзоферыентов-деполикераз. 4, Расшифровка механизмов адаптивних изменений физиологического состояния ьмкрооргшшзмов с применением математического моделирования процессов роста,

^аучная новизна. I) Шявлен ряд ноеых адаптивных изменений физиологического состояния шкроорганизыов в условиях ограниченного поступления энергетического субстрата; переход бацилл в гипометаболичеС-кое состояние поддержания с потерей способности к спорообразованию И неограїшчешо медленный рост микроьицета без образования иониДий. Е) Установлено» что при охотном голодании бациллы и шкроынцет Р.Ги-пісиїоаші образуют глубоко покоящиеся спор«, тогда как неспоровые бактерии подвергаются микроб остазису вследствие "смерти, ускоренной субстратом", о) Показано, 4то процессы спорообразования у кикро-ыидета, в отличие от бактерий» происходят при истощении источника азота, но не углерода и анергии. 4) Ешвлена специфика катаболитяой репрессии биосинтеза амилаз при лимитировании роста цинромицета на крахмале азотом.

Практическое значение. Подученные в работе количественные закономерности глубоко лимитированного роста могут б^ть использованы для построения шлітадиоккш; моделей биогеоценотическкх процессовг позволивших прогнозировать динамику и управлять биопродуктивностью экосистем суши, а также для оптимизации в биотехнологии микробного синтеза и для разработки ношх методов хранения коллекционных культур микроорганизмов.

Апробация работы. № з улітати исследований были долоаены на НІ Всесоюзной конференции "Ііюскнтєз ферментов микроорганизмами" ( Ко-Сілети , 198$ ), Всесоюзной совещании "Экология популяций" С Новосибирск, К'88 ), X Неучкой конкуренции молодів ученых ф-та почвоведе-

ния МУ ( Москва, 1988 ), на заседаниях кафедра биологии почв t 1966-IS89 ).

Дубликации. Материалы диссертации изложены в 5 работах.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы из iSQ источников ( на иностранных языках ). Объем работыt страниц машинописного текста, 33 ри-

сунков и б таблиц.

ОБШШ И МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы культура бактерий и грибов, полученные из ШМ и коллекции кафедра биологии почв МГУ: Bacillus subtilia 40, В. megateriuM EKM-5I2, Е. се reus НШ-504, Pseudотопаз

fluorescein ЭШ-1472, A.rthrobacter globtfermis ШМ-658,

Penlcillium funiculosum ШМР -30£I.

Для кинетических исследования использовали синтетические минеральные среда с глюкозой { Пансков и др.,1900 ) и крахмалом. Кислотность среды поддерживали фосфатными буграми на уровне 6,5 - 7,0 и 5,0 - 5,5 для бактериальных и грибных культур соответственно. Непрерывное культивирование осуществляли в режиме хемостата и периодической }:ультуры с подпиткой С Дорофеев, 1985 ). Диализное культивирование вели в полунепрерывном режиме с подачей глюкозы в диализную трубку каждые S — 4 дня. Периодическую культуру выращивали в колбах с пробоотборниками для жидкой и газовой фаз на качалке ( 180 об/ыин ) при 25 0 С.

Суммарную биомассу микроорганизме)» определяли методом бихромат-ного окисления, который предварительно калибровали с помощью весового метода и енн - анализа ( Паников и др., 1969 ). Биомассу спор рассчитывали ло пропорции на основании соотношения объемов спор и вегетативных клеток при фазово-контрастной микроскопии суспензии. Число жизнеспособных клеток оценивали методом кикрокультур (Foatgat« et nl., I$61 ). даательную активность определяли по спорости сбр'к'ОЕштя C0^4[iCOg". Концентрацию ССЦ в воздухе измеряли на базовом хроматог-

рафе ЛХМ-6ВД t СССР ), НСйі" определяли как CQg после подкисления культуральной жидкости до pH 1,5 ( Паников, 1969 ). Глюкозу определяли с гексокинаэой препаратом фирмы "Орион" (Финляндия), крахмал- йодо метрически, нитраты г с дису-въфофенодовой кислотой, Амилазную активность в культуральной гладкости определяли по скорости снижения вон-: центрации крахдала.

РОСТ ММРОСРГАШЗИОВ ПРИ ДЇВД1Щ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА И ШЕРПИ Рост природных популяцій почвенных микроорганизмов как правило ограничен доступними источниками углерода и анергии. Прежде есєго это касается т&лих местообитаний,как )линер>альные почвенные горизонту, ризосфера растений и др. ( Паникой, Звягинцев, ІР83 ).

Диализная и периодическая культура с подпиткой Условия глубоко лимитированного роста воспроизводили в диализной (ДО и периодической культуре с подпиткой (IffiJll, в которик отсутствует вшос клеток, и при постоянной скорости медленной подачи энергетического субстрата удельная скорость роста микроорганизмов снижается обратно пропорционально времена культивирования.

бактерии рода Bacillus Бациллы обнаруживали однотипную

динамику pocjg в ( рис.1 ). Вначале биомасса бактерий увеличивалась, а затеч рост резко прекращался, и клетки переходили в состояние поддержания, когда весь субстрат направляется на нузды основного обмена. Состояние лоддерг&ния характеризовалось неустойчивым равновесием. Это проявлялось в немедленном автолизе клеток после прекращения подачи лимитирующего субстрата ( глюкозы .Пругая особенность состояния поддержания заключалась в потере способности клеток образовивать спори. Клетки бацилл в состоянии поддержания отличались необычной мор-. фологией ( раздутые, извитые, копковидные формы ). Анализ фильтрата культуральной гшдкости показал, что наблюдаемые иор^о-фи є и ологические изменения клеток не бши связаны с накоплением автоингибиторов. Они обуславливались низкой скоростью потока энергетического субстрата,Все jciüLi клеток прорастали на полноценной питательной с^«де после продол-

х, мг С/л I

'ООО

40

12

ц мг См

24

36 сут

О 24 48 сут

Рис4 I. Динамика биомассы В, виЪЪШв В. «MgatM-l.ua (£), В» еегеиа в диализной культуре. Кривые рассчитаны пО уравнениям (I) - (7).

»цельного лаг-периоде. - 12-15 часов, В культуре обнаруживались реф-рактильные клетки ( 5 - 10 % ), не прорастаюцие на питательных средах в течение суток.

Р. funiculoaun В.ЩП удельная скорость роста микронице-

та снижалась до величин 0,003 - 0,004 ( вреия генерации около 9 суток ). Состояние поддержания { как у бацидл ) при э^ он не устанавливалось ( рис. 2А ). Потенциальная дыкательнаи активность, определяемая после внесения избытка лицитирущего субстрата, постепенно уменьшалась с 0,20 до 0,03 «г С-С02 / М и С бйом ( к 10 суткам опыта ), ото свидетельствует об адаптивном снижении потенциальной метаболической активности микроорганизмов, а следовательно и трат на поддеркание ( Паников, 1284 ). Параллельно в культуре накапливались фрагменты мицелия, подвергшиеся частичному автолизу. Спор образовывалось не более 10 &

Иеспоровш бактерии. Взятие в настоящей работе шташа Рз* Геасепз tt А. globiformla уже достаточно глубоко

изучены с точки зрения кинетики их роста в ДК и ГПШЧ Дорофеевт Паников, 1068 )* Их поведение принципиально не отличается от того, что было обнаружено в случае funi culosu« ; биомасса бактерий

возрастала во времени линейно, состояние подцеркания не устанавливалось ( рис. '¿к ).

Таким образом, в условиях глубокого лимитирования роста источником углерода и энергии изученные микроорганизмы реализовывали две адаггтишке тактики, Мнкрокицет и неспор вые бактерии оказались способами к крайне медленному росту в условиях глубокого лимитирования за счет постеленного снижения трат на поддервение. Бациллы не при некоторой критической концентрации .субстрата резко прекращали рост и переходили в состояние поддержания, характеризующееся квагиста-Сильностью н потерей способности к спорообразованию.

Периодическая культура

В динимике периодической культуры наибольший интерес для нас

кг С Сион/ л

Рис. 2. А, Динамика роста микроорганизмов в диализной и периодической кульtype с подпиткой: I - Р, fuaiculosum 2х- A. globiformie 3х- pa. fluoreeoena

Б. Динамика голодания микроорганизмов в периодической культуре ¡ГрИЕые рассчитаны iio модели (СХМ)

дашкм Дорофеева и ¿р., 1984 и Лапикова^ 1909

представляла фаза отмирания, когда после исчерпания источника углерода и энергии микроорганизме начинали голодать.

Бактерии рода Bacillua после исчерпания глюкозы в среде

образовывали спори ( рис. 3 У В. aiiMille а В. meseterlmn

они появлялись в первые 2 часа голодания, Динамика сдорообрааоващш в. сегеиэ отличалась низкой скоростью процессов созревание спор и выхода из материнской клетки ( первые споры появлялись через S6 часов с момента падала голодания ). Через неделю голодания популяции всех видов бацилл целиком состояли из спор.

Р. f uní culo eunt В условиях голодание ро энергетичес-

кому субстра!у после потребления глюкозы гифы мицелия подвергались интенсивному автолизу. Процесс отмирания замедлялся к началу второй недели голодания ( рис. 2Б ). Спори в этом случае не образовывались.

Не с перовые бактерии по-разному реагировали на условия голодания ( Пшиков, 1909 ). Клетки псевдомонад быстро отпирали в первые сутки голодания, затем автолиз замедлялся'¿следствие того, что криптически вырастающие клетки отмирающей популяции становились устойчивее к го-1 лодшшю, Оттирание артробактера происходило на порядок медлегаеа( рис. 2Б ). В культуре накапливались клетки с низкой потенциальной метаболической активностью С о чем судили rio низкой дайательной актиьности и содержанию ГШ ).

ТШшы образом, при голодании по источнику углерода и энергии изученные микроорганизмы вели себя по-разному. Хи1ль спорообракующие бактерии с этик уелоьиях формировали специалвзировашие иокояциесн клетки - спори. Пенициллы, потенциально способнее к егюрообразоышию, оставались в форме вегетативного мицелия и быстро летаропались, как и псездомон&ды. Артробактер даже в вегетативном состоянии характеризовался значительной устойчивостью к голоданию, сохраняя жизнеспособность многие месяцы. .

Ймитц^онное моделирование длндкики роата микроорганизмов Для изучения механизмов, neiiaa^u. в основе различных проявлений

X, мг с/л

120

36 72 108 144 час'

Рис, 3. ([даэмива роста и спорообразования В* (I),

В. виъиив (2), В* ссгеив (3) в периодичес-

кой культуре, лимитирование« энергетически* субстратом! а - биомасса вегетативных клеток, б - биомасса спор. Крпеке рассчитаны по модели, учитывающей сегрегации биомассы.

диншического поведения микроорганизмов, исцользоб&щ подходы био-иинетика. В качестве имитационной модели была применена синтетическая хемостатная модель {СХМ)( Пашков, 1089 )» а которой особую смые левую нагрузку несет переменная физиологического состояния г . Дан ная переменная является мерой содержания активных клеточных келто-нентов, обеспечивавших интенсивный рост { рибосомальные белки К т.д. ). Рост микроорганизмов в базовой модели рассматривается каз непрерывны! процесс превращения, экэосубстрата в интерыедиаты клеток ного вещества:

5

экзосубстрат 13 мономе риые Ij, клеточные

соединения полимеры ,

где q8 , и а - удельные скорости процессов транспорта, прев ранения l р х и оборота клеточных полимеров соответственно. Уде льные скорости потоков задаются выражениями;

rQLV(KL+L)f a=r»t , где Qa и Qj, - максимальные скорос ти процессов, К( , ^ на' - константы. Оборот клеточных подаыет ров включается при снижении s до порогового уровня в* , с помощью CXJJ бия описан непрерывный рост неснораьых бактерий и состояние голодания в периодической культуре ( Паников, 1983 ). Для описания роста бактерий рода Bacillus вводили условие сегрегации клеточного вещества на компартыенты ж1 и*" по схеме!

в ——»- ь

qa ■ . - -- ^

рост х" инициируется белком В, сшгаеэ которого репрессируется высокими концентрациями субстрата. Роль белка В могут играть продукта Spo - 0 генов, осуществляема замену tf -факторов FJlK-лолиыораэы, участвующей е синтезе вещества снор ( X-osick t iggi ), р0ст х" ( потенциальные проспоры ) п[олсходит за счет ссбстиешой метаболической активности (qL" ), а такке би о синтетических щ оцвссов внутри материнской sacsiioi ( ), Ее док В такке ашмьт к^екчикность

Таблица І

СХМ, описывающая рост и спорообразование бактерий рода ВасІІІиа

-1---:-

Переменная ! Уравнение

4-

ЛимйтирующиЙ І а * - я^х' - (I)

субстрат, мг С/л [ Для периодической культуры С - О

I .

Пул внутриклеточных ! 1 * ч^х'О-Ю + - -

мономерных сседине- ] + аг'х' + аг"*и ,

ниЯ, иг С/л І Ь - 1/(х'+х") (2) Биомасса, мг С/л: )

компартмент X' І х'- ї•- т')*' - аг'х* - (3)

компарткент х" ( ї"(ч£ - тя)хя - агвт" + , (4)

І ї'- ї0/ (1+ А В), їп- Ів- сопяі

Переменная ^изиоло- | ,

гического состояния ! *,<!Ъ ~ г,) (5)

для компартменгов !

х- и х" соответствен! <ТП(»ь + <Ч**/х")(В/<Кг+а) - г") (6) но I йш клеточный белок- |

-регулятор, мгС/л І Е " "'в1' ^

'_]_'

Пороговой принцип переключения потоков

Є =

] 0 при в > а* | к* 0 при в < в*

і 0 при в <в* | 9*> 0 при в >в*

«I лри в а;;> а1 приз < а*'

роста (У ), т.е. играет роль автоингибитора. Решение системы уравнений ( таблица I ) осуществляли путем численного интегрирования методом ЗС'ерта-Едерера. Анализ модели покаьал, что состояние поддержания ( рис. I )в Д£ вызывается снижением ш до порогового уровня, когда инициируется интенсивный оборот клеточных полимеров, и одновременно снижаетсл эффективность роста. Постоянная подпитка субстратом мешает "нормальному" протеканию дальнейших стадий спорообразования, так как проспоры не превращаются в истинные споры ( г"> 0 ), сохраняя метаболическую активность, чередущуюсд с отмиранием. Та же модель вполне удовлетворительно описывает рост и спорообразование бацилл в периодической культуре С рис. 3 }. Таким образом, предложенная модель является достауофю гибкой и универсальной. Сна правильно воспроизводит динамику [.оста и отмирания бацилл н ыикромицета как В периодической культуре, так и в и ПКП ( рис, 2 ).

РОСТ МЦ[РООРГА1Ш1,:ОВ ПРИ даВДТЕ ИСТОЧНИКА АЗОТА " В природных средах в условиях относительного избытка энергетического субстрата ( при запашке в почву солош, поступлении низкозольного растительного опада и т.д. ) рост микроорганизмов временно или локально ограничен источником азота. Азот является субстратом конструктивного обмена. В периодической культуре, исходно лимитированной азотом, рост гетеротрофных аэробных микроорганизмов монет происходить за счет многократной реутилизации дефицитного элемента. Поэтому со временем лимитирующим субстратом может стать источник углерода и энергии, ¿ля избежания указанной неоднозначности использовали следующий прием: метки, выращенные на полноценной среде, отмирали двукратным центрифугированием и инкубировали в безазотистой среде с повышенной концентрацией глкжозы (2-5 г/л ) и с концентрированной фосфатной буферной смесью ( б г/л К2 НРО^ Шуо^ ) для стабилизации ¿Л. В итоге создавались условия глубокого лимитирования роста микроор- , гакизь.ов по азоту. Источником азста слуы'ли о/^ни лишь шу три к л е точные { ре} ти и! з»!>о к ы ш ) соединения.

Бактерии рода Bacillus __ .в -лимитированный рост бацилл характеризовался наличием минроцикла, когда исходная материнская клетка без роста дробилась на 2 - 3 дочерние, в каждой из которых затем образовывалось по одной споре. Микроцикл позволял значительно увеличить число образующихся спор - их выход составил 90 Si от суммарной биомассы клеток. При дефиците глюкозы выход спор не превышал 60 X. Физиологическое состояние скор из культур, лимитированных азотом и глюкозой { назовем их it- и С-с порами соответственно ), существенно различалось. Глубину покоя спор оценивали по терцорезистентности и по длительности яаг-периода прорастания после переноса на полноценную среду. Н-споры оказались более устойчивы»® к нагреванию. Увеличенный в 1,5 раза ( по сравнению с С-спорами > период прорастания такле свидетельствовал о большей глубине покоя покоя N -спор.

Г. funleulosum_L Лимитирование роста азотом так же, как

и у бацилл, инициировало процесс интенсивного спорообразования. Выход спор превышал 90 Si. В культуре обнаруживались конндинльные структур! разной степени редуцировавости, вплоть до образования недифференцированных с порю генных* нитей мицелин, а также наблюдался шкро-цикл ( образование спорогенных структур непосредственно на ростовой трубке ). Я -споры ыикромицета характеризовались! I) физиологической гетерогенностью, проявлявшейся в разных сроках прорастания на питательных средах; 2) значительной продолжительностью периода прорастания ( у 30-40 Jf спор его длительность превышала 120 ч, у остальных 60-70* спор составила около 15 ч).

Неспоровци бактерии. В культуре Га. fluoreec«ia { рис, 4,1б) число жизнеспособных клеток в ходе W -лишт про ваши резко уменьшалось в течение первых суток роста, Сумарная биокасса и оптическая плотность d gQQ снижались медленнее, нежели число клеток, даюь!их при рассеве колонии, Ето свидетельствует о сохранении в культуре не-прорастающих клеток с ненарушенным барьером проницаемости. Г1хокая интенсивноегь дшакнл слукила доказательством высокого уроьня пета-

мг С-СО^/ч/мг С

0,08!-

Рис, 4. Динамика выживания Рз. Пиогеаоепв

в безазотистой среде: I - биомасса, а - > б - суммарная биомасса взвешенных часмтц по данным бихроматного метода; 2 - удельная интен-сгеность дщхания; 3 - глюкоза и растворимые продукты обмена (РОВ).

15 '

бодической активности у значительной части нлеток популяции. Отсутствие элективных механизмов снижения уровня метаболической активности привело к тому, что к Е6 суткам роста 80 - 90 Я клеток подверглись автолизу. Оставшаяся часть клеток включала : I) клетки, прорастающие на ША ( I -2 % от исходного числа ), 2) непрорастащие клетки ( 5 X от исходного числа ), 2) мертвые клетки-тени.

Культура а. б1оМГогга1в реагировала на азотное голодание быст-рш и резким снижением интенсивности дыхания ( рис. 5 ), а затем следовало уменьшение числа прорастающих на ША и голодном агаре меток Ц61. К 10 суткам роста в ьикрокультуре обнаруживались следующие типы клеток, различающиеся по $всецу физиологическому состоянию; I) кокки размером 0,5 - 0,6 мкм, прорастающие в палочки после переноса на 1ДТА; 21 непрорастающие кокки; 3) крупные ( 1,5 - 2,0 мкм ) кокки, дающие после переноса на ША не более трех делений} 4) не прорастающие крупные сильно преломляющие свет кокки. Клетки 2,3 и 4 Групп не образовывали визуально различимых колоний на агаризованных Средах. На их долю приходилось до 99 % клеток, Природа покоя клеток артробактера и псевдомонад та асе, чго и при "смерти, ускоренной субстрат ом заг* , Нип**г , 1С64 ), когда добавление избытка катаболита приводи^ в потере способности клеток пролетать на твердцх питательных средах. В популяции псевдомонад только небольшая часть клеток ( см, вше ) достигала этого близкого к покою состояния. Популяция клеток артробактера почти целиком подвергалась "субстратной смерти". Восстановление способности прорастать на питательных средах оказалось возможным с помощью инкубации клеток в среде без катаболита ( глюкозы )(Содержащей избыточное количество минерального азота.

Имитацию динамического поведения микроорганизмов при дефиците азота осуществляли с помощь» рассмотренной ранее синтетической хеыо-статной модели. Переменная физиологического состояния г согласно модели однозначно сеяэана с внутриклеточным содержанием азота 6 : г «= ( в - <Г„ )/( - <1в ), где вп и б<, - максимальное и мк-

О 4 8 12 сут

Рис, ¿шашка выживания А* £1оЪ1?огв1в

в беэаэотистой среде: I - биомасса; а -б - суммарная касса взвешенных частиц| 2 - удельная интенсивность дахения; 4,- глюкоза и растворимые продукте обмена.

минимальное значение б . Входе голодания <$ + 6а » поэтому г*-О, І'Інши словаки, "субстратная смерть" является следствием резкого снижения содержания актишьи клеточных компоненто» при дефиците азота. По-видимому, в основе спорообразования и "субстратной смерти" в случае азотного голодания лежат близкие молекулярные механизмы* РОСТ КА псжчгиюм СУГСТРЛІВ В природных местообитаниях часто набл«адается отсутствие процесса разложения биополимеров (Гуэев, Еызов, 1984 ), причина которого не всегда ясна. Поскольку основными деструкторами биополимеров являются трибы, в качестве объекта исследований был выбран ішкрошцетї. Ггщіоиіовиш , который вырт^ивали на средах с крахмалом. Периодическая культура При высоких нелимитирумцих концентрациях азота а среде имела место диауксия - последовательное использование сначала глюкозы, а затем крахмала. Рост на крахмале начинался после сникения концентрации глюкозы до 50 т 60 мг/л, При низких концентрациях азота на фоне X --лимитирования лаг-период, пределе ствуот^й росту на крахмале, значительно увеличивался. Изучение стехиометрии роста на полимерном субстрате показало значительное возрастание потребности в азоте, связанное с биосинтезом зкзо^ерментов, йшитированная по азоту культура переходила к спорообразованию, а ііицелиальная часть ( на ее доли приходилось менее 20 % бцо^ассы ) подвергалась "субстратной смерти".Рост На крахмале инициировался добавлением высоких доз хлорі їда натрші { 8 г/л ) .вызывающего частичный автолиз к рысвобоздение части внугрішае-точного азота.

Непрерывные культуры Количественные закономерности р-осга и биосинтеза амилаз изучали с помощью ПКҐІ ( удельное скорости разбавления 0,003 - 6,010 ч"1 ) и хеиостаткои культуры ( и к О,СІ- С,12 ч"* І. При кандоы значении О определяли биомассу микрсорг^иаиоа х, остаточну а концентрации крахмала в , сумму продуктов гидролиза крахмала и экзс4ерментов ■ ' + е

х, кг С/л

■ ' +• е. мг С/л

80 В 1] 11

¡1 /' 1 —

40 • _ л. „ _ _.

О, е, мг С крахи/ч/ыг С

1000 у......._ г

0,06 0,10 Ч

Рис. 6, рост и биосинтез амилаз в непрерывной культуре Р. Гцп1еийоеищ ( лимитированной пода-

чей крахмала! а - биомасса; б - крахмал, ч^О" - удельная интенсивность дыхании} в - сумма продуктов гвдролиэа и эка ферментов; г - максимальная скорость гидролиза крахмала. Кривые рассчитаны по моделям: Г - А, Я - В, Э -В, 4 - Г, 5 - Д.

19

Таблица 2

Модель непрерывного роста микроорганизмов на среде с полимерным С-субстратом ( ^ крахмалом )

Переменная 1 1 Утавдегме

^ЦИТИРОВАНИЕ РОСТД КРАУМ^Л^М

крахмал, мг С/л ♦ в » (I)

мономеры, мг С/л • в* ■ (2)

амилазы, мг С/л * е * вУ(ч -м)* - Не (3)

биомасса, мг С/л * зс » »1 - (1-а)^(Ч-т)х - Их (1-оЖч®-т) (4) (41

ЛИМИТИРОВАНИЕ РОСТА АЗОТОМ

источияк азота, ЫГ 5 /л • н (Б)

амилазы, «ГЦ /л * в ■ в'ч^^- Бе ' (б)

биомасса, мг С/л X - О-е'^ж/й-Тх, )» «(1-ог)чн/й (7) (7)'

внутриилеточный азот, мгя /л • б (в)

Использованные при описании модели обозначения

11 - скорость разбавления непрерывной культуры ~ удельная активность ашлаз

- максимальное значение %

I - вькод биомассы на единицу потребленного субстрата и - коэффициент поддержания

6 - дола внутриклеточного потока углерода, идущая на синтез экзо-

ферментов в* - аналогичный 0 для потока ^зота «с р - концентрация азота на входе в ферментер и в культуре -бе , ^ нижний и верхний предел варьирования (Г, Достигаемый при условии я 0 и м ■+• *» '

- содержание азота £ зкзоферментах

% 1 Г константы насыщения для процессов потребления и установления стационарного значения 6 9Н - максимальная скорость потребления азота

Численные значения параметров:* = 0,4? гС/гС, « 0,2 игС/л, и О, СОЙ гС/ч/гО, * 0,265 гС/ч/гС, . 60 мгС/ч/мгС ферм, Й*. 0,16 гИ/гС, --- 0,07 гК/гС, 0,16 г* /гС, = = 0,018 г» /гС, К» = 0,6 мг» /л, ' Ц = 0,4 мг * /л

и максимальную скорость гидролиза \г * Чв е ( определяли по динамике убыли крахмала после внесения его избытка в культур альную жидкость ). В условиях лимитирования роста крахмалом ( рис. б ) наблюдалось совпадение профиля зависимости х и ■ т от в .В условиях лимитирования роста азотом амилазная активность снижалась более резко, нежели биомасса; Изучение механизмов регуляции биосинтеза амилаз проводили с помощью кинетической модели, являщейся упроченной версией СХМ (в установившемся режиме хемосгата и хваэистационарном состоянии ПКП принято,что у « I ). Рост на полимерном субстрате представлен

следующим графом: минеральные соли--^

полимер — .....мономеры- ——» ■ ■ биомасса + зкзоферменты

1 * : ^ При описании л -лимитированного роста ( таблица 2 ) учитывали влияние лимитирующего субстрата не только на скорость его потребления ч^р но и на варьирование внутриклеточного содержания элемента в биомассе б ( см. 'уравнение (8)). .¡¡ля ситуации двойного С или перемещающегося ) лимитирования выбирали минимальное из двух значений удельной скорости роста р . Рассматривался ряд гипотез регуляции биосинтеза и активности экэоферментов: А - синтез амилаз не зависит от внешних эффекторов, Б - синтез подвержен действию катаболвтной репрессии мономерами, В - биосинтез регулируется уровнем активного фермента в среде, Г - ингибирование амилаэной реакции продуктами деполимеризации, Л -- совместная регуляция катабблитной репрессией, инактивацией ферментов и их повторной реутилизацией микроорганизмами. Идентификацию параметров »одели проводили по экспериментальным данным. Решение систем уравнений осуществляли аналитически или приближенно с заданной точность!) методом Ньютона-Канторовича^ Анализ расчетных кривых показал, что наилучшее согласие с энсперюентой дали версии Б и Д.

ЗАКЛИЕНИЕ

В настоящей работе были изучены рост и отдельные показатели физиологическом состояния (дыхательная активность, биосинтез фермен-

тов, химический состав биомассы, морфология клеток ) нескольких широко распространенных в почвах микроорганизмов. Выращивание микроорганизмов производили в условиях глубокого лимитирования# что позволило воспроизвести в лабораторных культурах такие темпы размножения микробных популяций, которые обычно наблюдаются, in gitu . Спектр возможных физиологических состоянийf полученных р лабораторных культурах, суммирован в таблице Зт Оказалось, что переживание острого дефицита питательных веществ происходит по-разному у различных организмов и зависит от природа дефицитного элемента. Гилометаболическое состояние поддержания, постулированное для всех почвенных микроорганизмов { Звягинцев, IS87; Перт, IS78 ), обнаруживалось только у бактерий рода ciilus. Остальные ¡¿нкроорганмзш при лимитированном н непрерывном поступлении субстрата продолжали сколь угодно долго рост без автолиза и перехода в покоящееся состояние. Вгшавдцее значение в реализации такого роста имеют адаптивные изменения физиологического состояния клеток, связанные со снижением непроизводительного расхода источника анергии ( траты на поддеркание, холостое окисление органического субстрата ). В условиях полного голодания на среде без источника энергии бациллы переходили в состояние спор, остальные микроорганизмы^ включая микро-мицет, сохраняли вегетативную форму клеток { мицелия ). Голодание на беэазоткстых средах приводит к обильному спорообразовании у бацилл и грибов в ходе »мкроциклическогр -развития популяций, причем формируются споры с большей глубиной покой, нежели при дефиците источника энергии. У неспоровых бактерий при дефиците азота и избытке катаболитов возникают клетки, по тещи ал ьн о жизнеспособные, но не прораставшие на полноценной среде, Данное явление * смерти, ускоренной субстратом" нашло объяснение в рамках СХМ как глубокое не табели чес кое хиштирова^ ние роста внутриклеточной концен трахеей Р-компонентов, абсолютно необходимых для роста. Введение специального прнеца ( инкубирование на среде без глюкозы с избытком азота ) позволило снять шкробостатичес-кое действие и вернуть голодание г^нтки к росту после "субстратная

Таблица 3

Типы физиологических состояний никроорганизмов при остром дефиците питательных веществ

i ) ефицит источника угле- : Дефицит источника Микроорганизмы | РВДа и энергии { азота

{Лш/итирован-; i Лимитированное поступ- ¡Голодание ¡ нос поступление j j ление Голодание

В. euVUlis ¡Состояние | Спорообразо* р L - стратегия ( поддержанияj вакие j Спорообразование

р. funículo»«« ¡л^йнцд смешанной тип .'рост стратегии,близ-! кий к К ( К -ь)! Интенсивна;! автолиз без! Рост спорообра- ! зованил ! Спорообразование

ре.fimoreséens j Линейный г -стратегия | j Автолиз с ¡ криптичес- } Рост ким ростом ¡ Автолиз и "субстратная смерть"

A.gloMformia | К-стратегия | í i Imspbrne cj криптнчес- i к™ ростом,} образование Рйе_ устоЛчлшх ¡ к голоданию} вегетатив- j "Субстратная смертй1

смерти". явленные различия в физиологическом состоянии микроорганизмов находят удовлетворительное объяснение в особенностях их стратегий жизни. Рациллы являются ярко выраженными -стратегами, 11х впаивание определяется главным образом способностью образовывать эндоспоры.Слабая конкурентоспособность бацилл функционально связана с процессом спорообразования! при жесткой конкуренции с другими видами за энергетический субстрат они переходят в состояние поддержания, искличаясь таким образом из дальнейшей конкурентной борьбы. Пенициллы также несут черты патиентности, но они проявляются лишь в условиях и -лимитированного роста, что весьма характерно для горизонтов лесных подстилок, сильно обедненных зольными элементами и азотом, действуют как эфемеры, время от времени выделяя гццролазн. Артробактер - К-стратег, Представитель микрофлоры рассеяния. Сэроятно, сильная подверженность "субстратной смерти" исключает его дошиирование в горизонтах подстил-

ни. Пеевдомонады плохо церешвают голодание, их вшивание основано на взрывной росте в момент поступления свежего опада (г -стратегия )илк влокусах звсудации корней растений , ■

1. Физиологическое состояние микроорганизмов при остром дефиците питательных веществ существенно различается у представителей разных стратегий жизни. Оно зависит также от природы дефицитного субстрата и рекима его поступления в среду ( непрерывное, однократное ).

2. При глубоком лимитировании роста источником углерода и энергии в диализной и периодической культуре с подпиткой бациллы прекращают рост при некоторой мининыгшой критической концентрации субстрата и переходят в состояние подцерешжя^ характеризующееся инициацией процесса спорообразования и связанным с ним снижением эффективности роста. Йукариотный споро образующий! микроорганизм Р. Гию1си1оеид не способен переходить э состояние поддержания, проявляя тем самым сходную с неспоровыми бактериями .динамику глубоко лимитированного росте.

3. После полного исчерпания С-субстрата в периодической культуре опорообразуюп;ие бактерии рода Еас111из пе^юходят к спорообразованию, а шкромщет Р. Гип1си1ов1да быстро отын^ет, не образуя спор, т.е. демонстрирует однотипную С псевдоморедами реакцию на. голодание по источнику углерода и энергии.

4. В ходе голодания по источнику азота микроорганизмы применяют различнее адаптивные перестройки физиологического состояния I спорообра-зущие бактерии рода ^аоШие я шкромицет ?< Гив1с«1оя\ш переходят к интенсивному образованию спор, в том числе в ходе шкроциклн-ческого развития. Споры обладают большей глубиной покоя по сравнению

с таковой в условиях голодания по энергетическому субстрату. Неспр-ровые бактерии ( Ря.?1иогвасеаа и А. ^1оЬ1Гогп1в ) подвергаются "субстратной смерти", вызванной резким снижением потенциальной метаболической активности при голодании по але менту кошт руктивпо го абкхиа, ^ля внъедепия из ссото;гния макроСостазиса необходимо внесение в культуру избытка де|ш;итного элемента на фоне снижения концентра ык не-

точника энергия.

5. Отсутствие роста микромицета на полимерном субстрате при дефиците азота связано с образованием глубоко лояояцдахся спор, а также с явлением "субстратной смерти" мицелиальной части биошссы, Фунгиста-эис снимается не только внесение« экзогенного источника азота, но и Путем осмотического шока, который инициирует автолиз части мицелия.

6. Проверка правильности предложенных механизмов регуляции физиологического состояния микроорганизмов в условиях острого дефицита питательных веществ произведена с помощью имитационных моделей нестационарного и установившегося роста микроорганизмов.

Материалы диссертации опубликованы в работах: X. Особенности рефляции биосинтеза аыилолитических ферментов в культуре Fenicilliue fualeuloeum при лимитировании роста минеральными салями ( в соавторстве с Паниковым Н.С. К В сб.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов ill Всесоюзной конференции. Кобулети, КВ6, с. Е8 - 29.

2. Структура популяций споро образующих бактерий рода Bacillus в связи с кинетикой их роста. 5 сб.: вколотя популяций. Тезисы докладов Всесоюзного совещания. Новосибирск, I960, с. 177 - 178.

3. Некоторые аспекты распространения в почвах представителей рода Bacillus в связи с кинетикой их роста. ТруДи Х научной конференции молоди* ученых ф-та почвоведения МГУ. Москва, IÇ68, с. 25-26.

4. Влияние минеральных солей на рост и биосинтез амилаз в периодической культуре Pénicillium funiculoeun ( в соавторстве с Паниковым Н.С. ). Прикладная биохимия и микробиология, 1989, т.25, вып. I, (X. 84 - 90".

5. Рост и биосинтез амилаз в хеыостатиой культуре Pénicillium fti-nleulosm ( в соавторстве с Паниковым Н.С. и Андреевым C.B. ). Прикладная биохимики микробиология, 198Э,_т; 25, вып.5, о. 671-690.

Л15572 от 30/Х-Шг. 3ак.1439р. Тир Л 00. Тип.В/0"ЗнаКиеЧ "