Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ В ПОЧВЕ"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, . ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЕ РЕВСДЩИИ И ОРДША ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М, В, ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи УДК 631.461

П А Л Е Е В А Мария Вячеславовна

КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОМАССУ В ПОЧВЕ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учзноА степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1939

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М. В, Ломоносова

Научный руководитель: кандидат биологических наук

старший научный сотрудник Н.С. Пазиков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная

академия им. К.А. Тимирязева

Защита состоится 1989 г. на заседании

специализированного совета К.053,05.86; Москва, 119699, Ленгора, МГУ, факультет почвоведения. Ученый совет. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ. Автореферат разослан ^г'^уо^гл- 1989 г. Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании специализированного совета, а отзывы на автореферат присылать в 2-х экземплярах.

Ученый секретарь специализированного совета

С.С. Беляев

кандидат биологических наук научный сотрудник Н.П. Кириллова

доцент

- f-

Актуальность проблемы. Вопросы,,связанные о оценкой бвомар-

^ V • 4

еы и продуктивности почвенных микроорганизмов, всвгаа были.центральными вопросами почвенной микробиология, особу» актуальность они приобрели в связи с решением глобальных экологических задач. К настоящему времени созданы десятки'методов определения биомассы почвенных микроорганизмов, калдаЯ из которых имеет свои преимущества в недостатки: I) прямые микроскопические метода (Внног-радский, 1925,Jones , Mollleon , 1948, Звягинцев, 1972, Мирчинк, 1972), 2) биохимические методы ( Jenklnsoa , Powlson ,, 1976, Ausmus, 1973, Kaj-i , 1980},, предусматривающие определение содержания в почве химических соединений, входящих в состав микроорганизмов, и 3) физиологический метод, основанный на измерении биомассы по скорости окисления вносимой .в почву глюкозы ( Andereon, Dörnach , 1973-78). В известном варианте физиологического метода определяют количество только одной физиологической группы микроорганизмов (хемоорг&нотрофов, окисляющих глюкозу), причем выражают результат» не в абсолютных, а условных единицах скорости процесса. В настоящее время теория микробного роста позволяет ' преодолеть этот недостаток в перейти к абсолютным величинам.

jlgjlft - разработка методов определения биомасса разных трупа почвенных микроорганизмов по кинетическим параметрам процессов • превращения соответствующие субстратов, вносимых в почву.

Задачи: I. Изучение кинетики превращения следующих вносимых в почву субстратов — глюкозы, аммония, молекулярного водорода, микробной биомассы, а тахже изучение роста фототрофных микроорганизмов при искусственном освещении почвы. 2. Построение и проверка кинетических моделей роста микроорганизмов ва внесенных субстратах. 3. Разработка на основе выявленшос закономерностей

кинетических методов определения биомассы микроорганизмов следу-t'/OOl

щихм^ушх: использующих глюкозу бадтер&й и грибов, фоготрофных. микроорганизмов, водородных бактерий, нитрификаторов, микробояд-ных простейших, а также вносимых в почву популяций на примере Aaoapiriilua tiraeHenae . 4* Применение разработанных методов доя опенки побочного действия пестицидов на сообщество почвенных микроорганизмов■ ■

Научная новизна. I) Выявлены особенности динамического-шведе над ■'почвенных микроорганизмов (бактерий, грибов и простейших) после субстратного обогащения почвы, 2) Раскрыты кинетические механизмы сукцессии микробного сообщества* инициированной внесением глюкозы в почву. 3) Создан новый класс количественных методов учета микроорганизмов в почве и другое природных объектах, основанный на измерении кинетических параметров превращения вносимых субстратов.

Практическое значение. В практику рекомендованы кинетические методы определения биомассы почвенных микроорганизмов 6 групп.Материалы .диссертации могут быть использованы в целях оптимизации внесения пестишшов в почву, а также для разработки имитационных математических моделей при управлении природными экосистемами.

АггрпЛАгтая работы. Результаты исследований были доложены на конференциях "Грибы в биогеоценозах" (Ташкент, 1985), "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Москва, 1986, Кишинев, 1988), "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" (Вильнюс, 1966), совещании по проблемам почвенной зоологии (Тбилиси, 1387), симпозиуме "Ваодинашха почв"(Таллин, 1988), заседаниях кафедры биологии почв (1985-88).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 8 работах.

Об-^ем -работы. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, описания методов, 3 глав, заключения, выводов; содержит

г

, страния машияошоного.текста,.-^.рисунков, X таблиц и список литературы из названий (из них _ зарубежнне).,. ^_ .V . .'

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ , Почвы. В работе использованы образцы серой лесяой почвы под ячмене« (полевой опыт ИПФС АН СССР, т. Путано» Московская .обл.), . дерново-подэолистой почвы под ельником (Звенигородская биостанция, Московская обл.), а также аллввиально-луговой почвы (Чашнкково, Московская обл.). Образцы почв просеивали через сито.2 ми без высушивания а хранили до анализа при 4°С и естественной влажности.

Чистые культуры микроорганизмов раеидотопаа £1иогвасепзшт. 1472 и 312, Ат^ЪгоЪ&^ег е1оЪ1£огт1е 658 * Аго8р1г111ша Ъгая! -1епяв ЗР 7, Аяо^Ъао*ег сЬг-оососсит 888, Тв1гаЬутеаа руг1Хояа±в сь получены из коллекции кафедры биологии почв и ВКМ ИБФЫ АН СССР. Бактерии выращивали в периодических условиях на качалке (180 об./мин) при 25±0,5°С на синтетической среде с глюкозой (Пашков и др., 1980), культуру тетрахшен - на молочно-дрожжевой среде или на бактериальной суспензии.

Техника постановки экспериментов и аналитические метрдм- В увлажненную до 60£ от полной влагоемкости почву вносили соответ-ствуодий субстрат и проводила инкубацию в стеклянных флаконах при 25*0,5^. В периодически отбираемых пробах определяли: 1)ра-створимые органические вещества (РОВ) бюсроматным методом (Панк-ков ж др.. 1937) и по содержанию углерода после сжигания в токе кислорода (анализатор АН 7529, СССР), 2)концентрацию СО^ к в воздухе методом IX ва приборах ЛХМ-8ЧЗ и Газохром 3101 соответственно, 3)нитриты - с реактивом Грисса, 4) нитрата - дисульфофе-ноловым методом. Численность бактерий учитывали люминесцентной . микроскопией в посевом на МИД., длину грибного мицелия - прямым микроскопированивы почвенной суспензии в камере Горяева, числен-

ность простейших - методом агаровых пластинок с кольцами (Singh, 1946) * прямым микроскопиров&нием о карболовый' аритрозжиом, численность водорослей - люминесцентной микроскопией. .

Изучение добочнйго яййгугтцпт папт-иттдпч^ на ссккЗщество почвенных микроорганизмов проводили, выращивая ячмень в почва с минеральными добавками (К^НРО^ (0,13 кг/г) и (im^J^O^ (0,28 мг/г)) и десгищщами - лонтрелом (гербшшд, 0,2 икг/г), тидтом (фунгицид, 0,125 икг/г) и цнмбушеи (инсектицид, 0,1 мкг/г).

Численное моделирование провалили на EC-I015.

В работе использованы следующие обозначения: в - концентрация субстрата, х - биомасса микроорганизмов, 7 - биомасса простейших, Н - концентрация продуктов обмена, ИД - интенсивность дыхания, г а,ь - удельные скорости роста и отмирания микроорганизмов я простейших, q - удельная скорость потребления субстрата, X иv - выходы биомассы на единицу потребленного субстрата микроорганизмов и простейших, v - скорость превращения вносимого субстрата, Q, Ke , К± , Kjj - параметры кинетических уравнений, t - время.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ¡Вринпцд кинетических методов. Вносимый в почву субстрат потребляется микроорганизмами со скоростью, которая зависит от а , х, физиологического состояния микроорганизмов (оценивается переменной R) и условий среды (влажности, температуры и проч.). Одновременно происходит рост микроорганизмов, использугщих данный субст- ' рат. Вся совокупность событий описывается системой уравнений: 0 « -qx, q » RQa/(Ke+ в), £ - Yqi, R = oCqYO-R), » coast (4) При поддержании условий среды постоянными и внесении избытка субстрата (а» К^ скорость процесса возрастает во времени экспоненциально, а биомасса - по более сложному закону вследствие адапти-

4

вной перестройки обмена микроорганизмов:

т - Т(0>.е/" , 2 - Х(0)»[ 1 + - 1>]1/* СЗ)

где т(о) и н(о) - величины т 1 Ев момент субстратного обогащения почвы (1 » О). Переменная и есть мера относительного содержа-шш в микробных клетках функционально активных компонентов, положительно коррелирующих с уи (РЫК, рибосомальнда белки, ферменты центральных метаболических путей и др.). Она принимает значения от О до 1,0: щя длительной голодании и —и- О, при нелимитнрован-ном интенсивной росте А —1,0. Находят н по форме кривой динамики х (х измеряет любым доступный нендеалънш* методом, достаточно чтобы систематическая ошибка его была постоянна) после внесения в почву избытка субстрата, аппроксимируя экспериментальные точки уравнением 3. Чем.меньше и(0), тем сильнее на кривой х(г) выражена лаг-фаза. Удельную скорость роста /а находят по динамике тг^), а удельную метаболическую активность ц -> как частное от деления <5 = /г/У (Перт, 1978). У отделяют в чистых культурах или 1п в«ц путем учета доступных измерении слагаемых материального баланса микробного роста (для каждой грушш микроорганизмов задача решается индивидуально). Истинную биомассу микроорганизмов в исходной (до обогащения субстратом) почве рассчитывают по формуле;

*(о) - ▼(о)/<ал1(о) (4)

~ Грибр у баатетяш. дспол^зтюпре глу^озт. Подавляющее большинство хемоорганотрофных микроорганизмов способно использовать глшозу в качестве единственного источника углерода и энергии.

В серу» лесную почву вносили глюкозу (15 мг/г), (НН^^Од и К^НРОд (по X мг/г) я прослеживали динамику ИД, численности бактерий и длины грибного мицелия (рис.1)» Наблюдаемая динамика удовлетворительно согласовывалась с прогнозом, следующим из уравнений I - 3: на протяжении 10-30 часов после внесения глюкозы обнаруживался близкий к экспоненциальному рост ИД и количества микроор-3-/*М 5

Рис, I. Кинетический метод определения Оиомассн бактерий в грибов, исподъзуищих глюкозу {почва серая лесная): А - ддназшса интенсивности дыхания в шисутсгвии ингибиторов белкового синтеза; Б — динамика численности бактерий на МЛА; В - лияаь-ика длины грибного лщделзя. Кривые рассчитаны по уравнениям 1-5 с параметрами; А — тй= 2,04, 3,53 акт С/час/г,/»^» 0,15, 0,Обо час-Х, Б - Мо»

О.4.Ю7 ал/г. йЗ=. од.ОД час"1, 4, 3 - 216 м/г,

0,2,/«]* 0,0&о час , о'р я I.

ганхзмов. Однако, формы кривых численности бактерий а длены грибного мицелия живая четко выраженную лаг-фазу, что свидетельствовало об отличия величины £(0) от единицы. Рассчитанная по уравнения 3 Н(0) для бактерий ж грнбов составила соответственно 0,1 к 0,2. Таким образом, грибы я бактерии в почве находятся в малоактивном состоянии, вероятно, из-за острого дефицита доступных питательных веществ.

Для раздельного учета бактерий н грибов в почву одновременно 0 глюкозой вносили специфические ингибиторы белкового синтеза (Апйвгвоп г ГюаасЬ , 1975). Чтобы подавить рост прокариот {преимущественно бактерий {£)) применяли хлораи$енихоя и эукариот {главном образом грибов (Г)) - актидион (по 0,2 мг/г). В динамике определяли ИД:Г , тгд. В отличие от оригинального метода мы не ограничивались простым учетом ннгибируших эффектов антибиотиков, а добивались, поточечной аппроксимации всех трех динамических кривых (рис. I) слеяушимк уравнениями:

V И*^ так* $ + 'Б-^. ^ +

На ЭВМ с помощь» метода случайного поиска со скольжением были подобраны те значения параметров, которые отвечают минимальной ошибке имитации:/»]>=0,065, /^>0,15 час-1, ^3,96, т^ж2,04 мкгСО^-С/час/г почвн. Вклад грибов в суммарную дыхательную активность почвы оказался равным 665С, бактерий - 34^. Биомасса грибов и бактерий в серой десной почве, рассчитанная по (4), составила 305 и 136 мкг С/г соответственно.

Помимо ингабиторного анализа раздельный учет грибов и бактерий проводили путем дифференциального центрифугирования почвенной суспензии (Рае«г1 et.aU , 1977).Получали две фракции, одна из которых содержала быстро осаждаемые частицы, в том числе грибной мицелий (центрифугировали при 260 е ), другая - медленно осаждае-

7

мыв частицы, в ток числе бактерии (2670 в) . В каждую фракции затем вносили глшкозу ипрослеживали динамику ИЛ с последпщим расчетом ja по (2) х х so (4); В расчетах принимали к - I, вносили поправки на неполноту отделения бактерий по данным хх учета на МПА б двух полученных фракциях. Описанный призы подтвердил получение выше результаты: в обогащенной глюкозой ашшвиально-луто- . вой почве дола грибов варьировала в пределах 79-875Í, удельная скорость роста .грибов и бактерий составила соответственно 0,07 и 0,18 час-^. Метод давая удовлетворительное согласие с прямыми микроскопическими методами в длительной динамике разложения глюкозы в почве*

Микроорганизмы, потребляйте водород (МПВ). Зависимость скорости потребления водорода от его концентрации в воздухе над почвой удовлетворительно аппроксимировалась уравнением Михаелиса-Иентен с параметрами: Ка = 5 нг Hg/см3, Q*x « 0,97 нг HgAac/r почвы. Начиная со значений в = 0,025 мкг Bj/cm3 и выше, концентрация Eg не лимитировала процесс его потребления. При снижении парциального давления кислорода скорость потребления Hg резко падала. Это свидетельствует о том, что в изученных нами почвах ЫПВ представлены главным образом аэробными бактериями. В ходе инкубации серой лесной почвы в атмосфере Hg (0,1 об.£, ежедневное восполнение убыли Hg) величина ^ возрастала экспоненциально (рис.2) с удельной скорость» роста р. = 0,032 час"**. Стехиометрия роста почвенных МПВ была охарактеризована в переходных режимах, когда измеряли ИД в присутствии (ИХ*-) и в отсутствии Hg (ИД~). ИД* была рщжр на величину автотрофвой фиксации СО^ ( ^qq^)- * рассчитывали по формуле: Т « (ЮГ- ИД+)/ Величина х составила в среднем I г С/г Hg, что близко к численным значениям в чистых культурах мгтя (Кондратьева, 1983)* Однако имели место я

в

Рис. 2. Кинетический метод определения биомассы МПВ в серой лесной почве: I - динамика тн2 в ходе инкубации почвы в атмосфере

(ОД об,50, 2 - расчет /1 , 3 - определение х по снижение скорости выделення С02 в присутствии , стрелками ♦ и I отмечены моменты соответственно введения и удаления Н<> из воздушной фазы нал: почвой. А

отклонения: в серой лесной почве, длительно инкубируемой под водородом, ¥ снижался до 0,2 г С/г Н£, В почве, инкубируемой с целлюлозой, развивались МПВ, у которых кажущаяся величина т увеличивалась до 2,12 г С/г видимо, из-за экспериментального артефакта, так как ЮГ- ИД* может быть больше вследствие подавления катабрдизма органических соединений. Биомасса ШВ, рассчитанная по <4>, варьировала в разных почвах от 0,2 до 2,94 мкг С/г почвы, что составило от 0,3 до 1% биомассы микроорганизмов, использующих глюкозу. Заметим, что предложенный нами метод пока является единственным средством определения количества МПВ. Его недостатком,помимо ошибок при определении у,является отсутствие возможности оценить величину К, поэтому приходится довольствоваться определением не суммарной, а активной биомассы .

ДототоскЪнне микроорганизмы. Почву и карбонатные породы с поверхностными разрастаниями водорослей инкубировали в закрытых стеклянных флаконах при круглосуточном искусственном освеще-

нии (10 тис. лк) с избыточным количествен COg (до 1^). Скорость фотоассимиляции СО^ (т^) измеряли по разнице между скоростью выделения СС>2 в темноте в на свету, vg возрастала экспоненциально в течение 2-х суток с удельной скоростью ja. = 0,031 час"1 (ркс^А) Последующее замедление роста фототрофов было связано, вероятно, с их выеданием простейшим», появление которых фиксировали кккроско-сически. Величина т = X по определенно,так как мы измеряем не истинную, а кажущуюся скорость фотоассимиляцеи. Кинетический (расчет по (4)) н прямой микроскошгчаский метод обнаруживали схожую динамику роста водорослей, однако, абсолютные значения в последнем случае были несколько кижэ.

Ниттшйишгоуташе микроорганизмы. в образцы дерново-подзолистой почвы вносили i(mh+>2s0+ (10 «г/г) и KjHPO^ (3 мг/г) и инкубировали при постоянной влажности и температуре. В динамике определяли накопление нитритов, нитратов и С02 (рис.З,Б). Концентрация но; за весь исследуемый период не превышала 0,04 мкг/г. Кривую накопления нитратов (Р) аппроксимировали интегральной формой уравнения (4):Р - вР* - 1X Скорость нитрификации возрастала во времени экспоненциально с удельной скоростью = 0,42 сут-^, Величину у(0) рассчитывали путем экстраполяции экспоненты к моменту времени t = О. Снижение выхода СО^ аз почвы в период интенсивного окисления аммония било связано с автотрофной ассимиляцией СС^ нитрифицирующими бактериями. Поскольку нитриты в почве но накапливались, т. е. две группы нитрпфикаторов функционировали строго согласованно, то величину y рассчитывали для всей совокупности нитрифицирующих микроорганизмов. Биомасса нитрифяка-торов до обогащения почвы составила 25 нг С/г почвы. Недостатком данного варианта кинетического метода являйся трудности в определении 7 в связи с его малой величиной. Применение меченых сое-

л

20 10

мг С

г-

0,5

I / •

Лл

X 3 2 ^г ,031ч-

0 2 сут

/ *

0-1 2 сут

Рис, 3. Кинетические методы определения биомассы фототрофов (А), нитшфикаторов (Б)и вносимой в почву популяции Агозр1г1Ццт ъгавШгше : А - разрастания водорослей на карбонатных породах, I - динамика ТФ при непрерывном освещении, 2 - расчет л, 3 и 4 - динамика х ишетическим и прямим микроскопическим методом соответственно, Б - дерново-подзолистая почва, I - дшшка накопления КО,' после внесения в почву ^о. (хо иг/г), 2 - расчет/», 3 и 4 - выгод С0? из почвы, соответственно обогащенной Ищи без обогащения, В - дериово-подзюшстая почва, I тг2 - скорости окисления суишната я глюкозы соответственно, 3 и 4 - динамика соответственно хя я кинетическим методом, 5 - динамика х0 методе« посева а

дкяеиий позволит этот недостаток устранить,

■ Вносимая в почит поптляпия шпяч^пт. ...

Для А. ЪгааНепве сутащнат является более предпочтительным субстратом до сравнению с глюкозой, В чистой культуре величина отношения К&= ИДСуКа/КДглш составила в среднем 2,1. Для сообщества почвенных микроорганизмов аналогичный показатель К„ был значительно ниже- 1,19. Бели допустить, что величина К& и Кц остаются во временилпоетоянными, то биомассу внесенных азоспирилл (3^) и почвенных микроорганизмов (Хд) можно рассчитать по уравнениям:

т /Р*УТ° т

тле тс - ИД почвы с сукцинатоы и глюкозой, и - удельные скорости метаболизма этих субстратов аэоашряллами и почвенными микроорганизмами соответственно. Величину находили в опытах с чистыми культурами, Кд - с контрольной почвой без внэ-г сения А. ЬгаэИепае . Кривые динамики, полученные кинетическим и методом посева, совпадали (рис.3,Г). Величина к пятым суткам опыта снижалась в три раза из-за выедания простейшими, увеличение численности которых регистрировали прямой микроскопией. Минимальная биомасса А. ЪгавИепе* , которая фиксируется кинетическим методом,составляет 10 мкг С/г, поэтому при внесении в почву меньших количеств клеток необходимо использовать более чувствительные приемы регистрации ^ к^, например, по выходу 14С.

ВЕпсррбрядныд простейшие.Практически все почвенные простейшие является микроб офагами. Поэтому оценить биомассу простейших в почве можно по скорости потребления внесенных клеток микроорганизмов. Кинетические закономерности выедания изучали в- бинарной системе Т^гаЬуяепа руг1Гогт10 д Ра еи<1 отстав Пиогеасепа (рис. 4). Возрастание численности простейших сопровождалось снижением х. Однако, выедание псевдомонад происходило не до нуля, а

Рис.4. Динамика роста Tetruhymene pyrlformla на бактериях

Paeudomonae fluoréscens»

I - биомасса бактерий в бинарной системе и 2 - в монокультуре (1а и 2а - данные кинетического метода, 16 и 26 - по светорассеянию), 3 - влияние концентрации бактерий на удельную скорость роста простейших, 4 - зоомасса простейших (4а - рассчитано во динамике 1а, 46 - по динамике 16), 5 - число простейших, 10Бкл/д, 6 и 7 - соответственно большой и малый диаметры клеток, мкм, 8 -материальный баланс по С, Э и 10 - концентрация РОВ в бинарной системе и монокультуре соответственно, II - дыхание простейших, 12 и 13 - потенциальная дыхательная активность бактерий в бинарной системе и монокультуре соответственно, мкг СОй-С/час/л. Крявие рассчитаны по.уравнениям 6 о параметрами: г =0,4, v«û,44 ME С/мг С, a=û,0I8t Ъ=0,012 и 3-10,376 час , К*г15,4, Ь=60,б я

иг С/л, Q=0,47 мг С/ч/мгСг , oí.i=I4, 0=0,77,Y «0,107 При t-0 R»Q,26, Х=140, У=0,4 МГ С/л

1Ь

до пороговой концентрации бактерий (х*), которая недоступна .хищникам. Сходимость материального баланса по углероду (рис,4(8)) свидетельствует о правильности выполненных определений. Эффективность обмена тетрахимен была охарактеризована следующим образом: 4Q£ углерода съеденных бактерий пошло на построение зоомассы простейших, : 13—20?» - на экскреторные продукты и 40£ - на дыхание с окислением пищи до С02. Выявленные закономерности были сформулированы в виде кинетической модели, которая учитывает не только выедание,но и критический рост голодающих бактерий на продуктах автолиза:

i -/их - &Бх - tjy/V, у » rjy - by, ¿/IR./1 » YSaB

H . (, - в,*Нх ♦ ra7/V,^ ^-Ч-V t6)

i - (i - xV/Kj где 9 я У- стехиометрические коэффициенты.

Ори внесении бактерий непосредственно в почву закономерности, полученные в гомогенных системах; были в основном подтверждены (рис.5)1 В отличие от тетрахимены величина комплекса почвенных простейших (главным образом амеб) была значительно ниже, а пороговая концентрация бактерий - выше, так как часть пищи могла быть локализована в мелких межагрегатных порах, недоступных для простейших. Выло отмечено также увеличение доли экскреторных продуктов до 42При расчете исходной биомассы простейших по (4) принимали Н(о) = I, а величину *(0) находили путем экстраполяции ИЦ простейших к t(0). Биомасса простейших составила 0,76 мкг С/г, традиционные методы (прямая микроскопия и метод Сингха) давали согласующиеся результата - 0,74 - 1,76 мкг С/г. Недостаток кинетического метода, однако, состоит в его многостадийноcíth и трудоемкости. Кроме того, не все требуемые для расчета параметры легко определяются in situ (В частности, ненадежно определение v.так как в отличие от микроорганизмов в материальном балансе простейших

У

М*Д05кл/г 40

сут

Рис. 5. Динамика выедания бактерий Рвеш1ошопаа Пиогевсепа , внесенных в серую лесную почву:

1 - остаточная биомасса бактерий кинетическим методом

2 — численность бактерий на. ЬИА

3 - численность бактерий на ШЛ при подавлении роста простер-

ших актидионом (0,2 мг/г почвы)

4 - дыхание бактерий и простейших

5 — дыхание простейших

6 к 7 - биомасса и численность простейших соответственно 8 - численность простейших в почве о актидионом Кривые рассчитаны по уравнениям ( 6) с параметрами: т

** - 17?Гкх= 160 МКГ с/г. Па = 0,075. Ъ = 0,1 час-1, 0,31, » 0,42 г С/г С, -с в 1.0 сут

велика доля -экскреторных продуктов.

XXX

Разработанные ваше кинетические методы суммированы в таблице I Все предложенные метода имеют теоретическое обоснование, которое получило экспериментальное подтверждение. Пересчетный коэффициент от скорости процесса к биомассе берется не произвольно, как в прямых микроскопических и фуиигационном методе, а однозначно рассчитывается из экспериментальных данных* Определения хорошо воспроизводимы ж на страдают субъективностью. Однако, у кинетических методов .есть ж ограничения: I) не всегда удается измерить В , в таких случаях результаты учета выражаются в единицах не физической массы, а в единицах массы функционально активных клеточнах компонентов, 2) определению не подлежат покоящиеся Форш, 3) нельзя оценивать биомассу тех микроорганизмов, которые используют полимерные субстраты иди вызывают трансформацию субстратов (так как в таких случаях отсутствует экспоненциальный рост). Возникает вопрос: насколько верно в рамках перечисленных ограничений определяется биомасса кинетическими методами? Сравнение с методами традиционными (прямая микроскопия и посев) выявили либо совпадение, либо более полный учет микроорганизмов кинетическими методами. Однако критерий сравнения работает алою, так как совершенно безупречного метода просто не существует. Для кинетических методов есть другой не абсолютной, но достаточно эффективный критерий истинности - это возможность практического использования заложенных в основу методов теоретических положений для непротиворечивого описания сопряженной д^ятштт протекающего в почве процесса.

¡'тэд^р^ш .шлю ГРИШ.

хогсз ргыг^сии. [гнипиирозанцой внеуерием купокоэн- Для проверки правильности предложенных методов изучали не только начальный отк-

Таблица!

Кинетические методы определения биомассы мкхрсюргаянзмаа в почве

Учитываемая Вносимые груцда субстрат

микроорганизмов

Регистрируемый Расчет I, Диапазон*

процесс для, г С/г зле- варьжрова-

измерения I)* , мента суб- ния биоиа-

2) г страта ссы,мкг С/г

микроорганизма, утилиаир^ ццие глюкозу

в том числе

бактерии

(прокариоты)

и хрибы (эукариоты)

микроорганизмы,

потреблявшие

водород

нитрифицирующие бактерии

фототрофнне микроорганизмы

микробоядные хищники

вносимые популяции

глгаоза,

8КТИДИ0Н

глюкоза,

хлорам-

феникод

1)выделение СОо 2употребление л

то х»

то хе

& -*Р 08

то хе

то хе

со«

отмытые микробные клетки,х

предпочтительный

субстрат

Употребление Но -I р 2)потребление

с02 Рад,)

2)потребление^

'авт

Фотоассимшшшя . СОцпри периоди- о Р* ческом ^сведении д у*

почвы

ГФ

4

20-140*

10-40?-бО-ЗОСГ*

10-100* жх

100-100С?®

0,2-3, 0,007-0.02*

0-60*

1) снижение х {6х)

2)выделение СО«, ф^-АР-д!} образование §к-5х скрементов (6Е)

I{выделение СОо по чистым 2)потребление " культурам

Х-Ю

10-1000

к - активная биомасса, хх - суммарная биомасса

лик эшсросрганизмоа -нанесенный субстрат, ¡но:и разверзнутую динамику иршессаво вреюии^рис.бЭ» Для;жиитации вайлпдаемой-динамита использовали кянетическую модель((табл.2), составленную из отдельных блоков уравнений (1-6), которые ;испаеьзовалжсь для описания начального отклика микроорганизмов -трех :грудд (бактерий, грибов к простейших).

: Таблица 2

Имитационная модель микробной сукцессии, .инициированной внесением

глюкозы в почву

переменная

дифференциальное уравнение

субстрат

бактерии

трибы

переменные физиологического состояния

простейшие

продукты обмена

я - -<1.,*, - «2*2 + а^ ът

¿1 » (^1(4-1 ■+ - — 1рг/у

» (12(42 + _

Е, »ЛГ1(ч1 + а1)(Р1 - К1), Р1 ■.* {е - в*)/(К^+в-в») ¿2 - 12Чг(Рг - К2), - + в)

7 - цу - Ъу

Я » (ч, + + +■ -

удельные скорости потребления субстрата бактериями к трибами

удельная скорость роста простейших

удельные скорости оборота бактерий и грабов

удельная скорость отмирания простейших

а.(1Лв - в*)

«1 - - в*}(1 + Е/157 ^ а<в* ЧЛ = О

Я-в-в Н2СЦН

«2 ■ фН Ь - К^Г"3

С. -

Ц - О

при а < £ .0 при в > З1

П - Е^Г-"^

при

при (я-В*><1£

при (в-Я*)>£

При кл*

При I С I*

Ь - ,01 при х _

,015 при X* (**+•£)

1: ^ + С) t >(** + *) t < 4»

'в - 5, я* - 250, К2- Kj- к4- %- 250ике С/Е' • , Qt- 0,7, , Q2- 0,07, Q3- 0,003 тас"т, 1.,= 0,4,. т2- 0,4 дог С/мкГ С * ;

Xj- 0,1, К^- 74,2,. 180, X* - SOOjutü C/p ,^«0,075- " чае"1, 4, «íj» 15, a1- o,oi4*B1„ аг- 0,0025-R^; ча^Ч. f . 0,1бшст C/Wr С , я - о,г„ Rf - 0„1„ —о;.

o,oi, ofoi5 час"1

С учетом подученных ранее результатов суть модаетруеыых механаз-нов сукцессии сводится к следующему: I) бактерии потребляют внесенный субстрат с большей скоростью, чем трибы, однако они не могут использовать всю глюкозу вследствие локализации довольно большой ее части (в») в недоступных для бактерий инкрозшах, 2) грибы. благодаря мицалиальной организации, обладает лфеимущеехзом в колонизации гетерогенного пространства и потребляют весь оставшийся после бактерий субстрат, а также продукта обмена (сваи, бак— теряй ж простейших), 3) простейшие выедают бактерии до пороговой концентрации (т*), грибы выеданию ае подвергаются, 4) после выедания всех доступных жертв простейшие с момента времени %* начинают голодать, оборот их компонентов возрастает, обмен перестраивается ж спустя время они переходят в покоящееся состояние. Результаты имитацхх удовлетворительно описывали экспериментальные данные, а внутренняя непротиворечивость модели может служить достаточно весомым критерием правильности■предложенного механизма. Дополнительным подтверждением может служить совпадение численных значений, параметров, полученных в целостной в частных моделях,подложенных в основу каждого кинетического метода.

Цримененяе кинетических методов для оненуи ш^удиг? действия пестипиЕОВ да сообщество почвенных микроорганизмов. В данном разделе работы оценивали способность кинетических методов отражать возможные изменения состояния микробного сообщества почв, происходящие под действием антропогенных факторов. Растения выращивали в лабораторных условиях в почве после внесения трех пестицидов - гербицида лонтрела, фунгицида твлта и инсектицида цимбуша. В еженедельной динамике учитывали рост растений, интенсивность дыхания почвы и биомассу всех шести групп микроорганизмов, для которых были разработаны кинетические методы. Достоверность влия-

сут

Ряс. 7. Влияние пестицидов на динамику роста микроорганизмов з серой лесной почве под ячменем: (*] - бактерии, Й - грибы

вия пестицидов определяли с помощь» приемов непараметрической статистики по,критерию Вилкоксона (Благовещенский и др.,1985, Оуэн;. 1966) Все пестициды (особенно тидт и цимбуш) стимулировали рост растений.и изменяли характер динамики биомассы практически всех учитываемых групп микроорганизмов. На уровне значимости »i» 0,125 г ниже отмечено действие лонтрела на водоросли, тилта - на водоросли, простейшие, грибы и суммарную биомассу использующих глюкозу микроорганизмов, цимбуша - на МПВ, простейшие и бактерии. Вопреки ожиданию фунгицид тилт не подавлял, а стимулировал рост почвенных грибов; особенно в поздние сроки опыта (рис.7). Обнаруженный эффект обусловлен; вероятно, иягибируюцнм действием пестицида на активность микробоядиых простейших или антагонистической микрофлоры. Таким образом, кинетические методы могут быть с успехом использованы в прикладных почвенно-ыикробиалогических исследованиях. Они способны выявить достаточно тонкие изменения в составе микробного сообщества.

ВЫВОДЫ

I. Исследована кинетика превращения вносимых в почву глюкозы, аммония, молекулярного водорода и микробной биомассы, а такие фотоассимиляции С02 при искусственном освещении почвы. Выявлены следующие общие закономерности: а) зависимость мгновенной скорости превращения вносимого субстрата v от его концентрации я описывается уравнением Михаелиса-Ментен (осложняется явление« субстратного торможения в случае выедания бактерий простейшими), б) при насыщающих а или непрерывном поступлении субстрата (Hg. СО^ на свету) имеет место экспоненциальное увеличение ▼ во. времени,обусловленное' ростом соответствующих микроорганизмов, в) сопряженная динамика их биомасс« отклоняется от простого экспоненциального за-

кона вследствие изменения физиолотаческого состояниячто.может.'!' быть описано с помощью : переменной Е» ,'"V ' '''

2. На основе выявленных закономерностей разработаны кинетические методы определения биомассы отдельных групп почвенных микроорганизмов их situ . Метод предусматривает измерение начальной скорости превращения вносимых субстратов о расчетом биомассы (х) по формуле: д(О)-- t(0)/q/R(0). Величину R(o) находят по динамике условной меры ж, Q - по динамике TÍt), 1 *

3. Разработаны кинетические методы определения 6 групп почвенных ' микроорганизмов: использующих' глюкозу грибов и бактерий, нктри- ' фккаторов, фототрофов, водородных бактерий, микробоядных простейших, а также - вносимых в почву популяций на примере Asosptriilum " fcrasllenee.

i

4. Проверка правильности предложенных методов произведена*с помощью имитационной модели длительной динамики роста бактерий, грибов" и простейших в процессе разложения глюкозы в почве.

5. Возможность применения разработанных методов показана на примере выявления побочного действия гербицида лонтрела, фунгицида тилта и инсектицида цимбуша на сообщество почвенных шйроорганиз- ' мов. Обнаружено достоверное влияние пестицидов на' динамику биомассы изученных груш микроорганизмов. Наиболее чувствительными оказались численность простейших, а также биомасса бактерий и грибов.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1.' Динамика разложения лонтрела в дерново-подзолистой почве (в соавторстве с Паниковым U.C.). Агрохимия, 1986, * 10, с. 106-106.

2. Относительный вклад грибов в суммарную биомассу и активность' сообщества почвенных микроорганизмов (в соавторстве с Паниковым

2Ъ

H,С. ). Микология н фитопатология, 1986, T. 20, В 6, о. 466-473. 3* Использование смешанных культур для моделирования особенностей ПОПуляЦИОННОЙ динамики . Pseudomonas fluorescein s Arthro-baet»r globiformie в почве x ризосфере (в соавторстве с Оанико-вым B.C.), В сб.: Микробиологические процессы в почвах х урожайность сельскохозяйственных культур. Материалы к секции республиканской конференции "Пути повышения эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного производства". Вильнюс, 1986, е. 282-284.

4. 'Влияние гербицида лонтрела на кинетику роста микроорганизмов в дерново-подзолистой почве, В сб.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тезисы докладов IIX Всесоюзной научной конференции. Москва, 1986,' с. 28.

5. Кинетический принцип оценки количества беспозвоночныхчлосробо-фагов в почве (в соавторстве с Оаниковым Н.С. и Гальцером Ю.Г.). В ей.: Проблемы почвенной зоологии. Материалы докладов IX Всесоюзного совещания. Тбилиси, 1987, с. 212-213.'

6. Влияние пестицидов и минеральных удобрений на структуру и функционирование микробного сообщества дерново-подзолистой почвы (в соавторстве с Пашковым Н.С,). В сб.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тезисы докладов республиканской конференции. Кишинев, 1988, с. 142-143.

7. Влияние пестицидов на динамику и кинетику роста микроорганизмов' в почве (в соавторстве-с Паниковнм Н.С.). В сб.: Биодинамика почв. Тезисы III Всесоюзного симпозиума. Таллин. Издание АН ЭССР, 1988, с. 124,

в. Quaatitatiye aspects of protozoa dynamics In soil (with P&ni-кот U.S.). la Abstracts of 10th International Soil Zoology Colloquium. Bangalore, India, 1ЭЭЗ, p. 53.

Подписано к скитк ¿312.т.

Усл. пич. л. У'ч.-а.ш.л.

Тираж ЛХ) «з- Заиз К

ОрдйВй 'Экик Почета" нздвгелспо Московского увдцвпви. 103009, Москва, ул, Геро&яа. 5/7. ТкпограФня орана Почета' вмнльспа МГУ. 11Э8Йв. Москва. Лавнвскн горы.