Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ, ОБОГАЩЕННЫХ ГЛЮКОЗОЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ, ОБОГАЩЕННЫХ ГЛЮКОЗОЙ"



Факультет Почвоведения

На правах рукописи

САДАХ АЛИ АБУ ЭЛЬЧШГА

УДК 631,461

КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ, ОБОГАЩЕННЫХ ГЛЮКОЗОЙ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРШЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически! наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА*!982

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Звягинцев Д.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

лрой«ссор Емцев В.Т. кандидат биологических наук, доцент Великанов Л,Л,

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт

общей !л коммунальной гдгены им. А.Н.Са-сина АМН СССР

Автореферат разослан " " 1982 г.

Защита состоится "27" декабря 1982 г. в 15час. 30 мин. на заседании специализированного совета ло почвоведению в ИГУ им. М.В,Ломоносова в ауд. М-2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Ученого Совета , а отзывы ва автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 117234, Москва, Ленинские горн, 'ЛГУ, факультет почвоведения.

Ученый секретарь Совета, доцент

у*

И. Я. Бабье ва

Актуальность проблемы. Решение стоящих перед почвенной микробиологией долгосрочных экологических задач, таких как разработка методологии предсказания поведения микроорганизмов в разных экотопических ситуациях, познание законов функционирования микробных сообществ, создание научных основ эффективного управления природными процессами а др. немыслимо без привлечения элементов точных фундаментальных наук - математики, физики, химии. Наиболее плодотворно математическое моделирование находит ири-иёвеняв - в форые -бшоюшетических исследований, в которых использование математического аппарата неразрывно сочетается с натурными динамическими наблюдениями они экспериментальным изучением биологических объектов в строго контролируемых условиях, Б данном направлении уже сейчас достигнуты немалые успеха в общей, технической и медицинской микробиологии, например, при исследовании кинетических аспектов взаимодействия патогенных микроорганизмов с хозяином (Хания, Элькин, 1976), конкурентных взаимоотношений между разными микробными популяциями ( Печуркин, Терсков,. 1975), кинетика роста микроорганизмов служат теоретической основой управляемого микробного синтеза я эффективно используется при оптимизация биотехнологических процессов (Перт, 1978). Мек-ду тем, в почвенной микробиологии подходы биологической кинетика до сих пор практически не применялись, вероятно, вследствие сложности почвы как объекта исследования и отсутствия надежных методов измерения основной динамической переменной - количества биомассы почвенных микроорганизмов. Использование для количественного определения микробной биомассы прямых микроскопических методов сопряжено с большими систематическими а случайными ошибками, требует высокого индивидуального мастерства исполнителей анализа я поэтому не дает абсолютных и воспроизводимых показателей. Весьма перспективным является применение более удобных t точных физиологических и биохимических методов: определение в почве АТ$, ДНК, курамовой кислоты, хитина, активности ряда ферментов, использование фумагадионного и физиологического методов определения биомассы микроорганизмов а др.

Цель работы: изучение кинетики роста микроорганизмов в двух контрастных почвах, обогащенных разными количествами глпкозы, с использованием как традиционных микробиологических, так и но-шх физ иолого-баохимич е ских методов.

Í-20S2.

г

Основные задача исследования. I. Изучение кинетика разложения глвкоэн, вносимой в дерноьо-подзолистую почву и чернозем в широком интервале концентраций.

2. Изучение интенсивности дыхания я дегядрогеназной активности почв, обогащенных глшозой.

3, Изучение-динамики биомасса почвенник микроорганизмав в ходе секцессш, инициированной глюкозой, с использованием прямых микроскопических методов, а также фумигационного и физиологического методов.

Научная новизна. Впервые на однородном исследуемом материале в строго контролируемых условиях проведено сравнение разных методов определения биомассы и активности микроорганизмов и уточнены значения пересчетных коэффициентов, выявлен лучший метод, Изучена кинетика а динамика роста микроорганизмов в почвах после внесения в них глюкозы: произведена оценка степени "затравочного аффекта", величин экономического коэффициента и числа циклов реутилизации микробной биомассы, показано репрессирующее действие глюкозы на дегвдрогеназную активность почв.

Практическое значение. На основания проделанной работы в практику фундаментальных и прикладных научных исследований по микробиологии, агрохимия и бяогеоценолгии может быть рекомендован физиологический метод определения микробной биомассы, взя наименее трудоемкий и наиболее точный и воспроизводимый. Разработана модификация метода определения дег ид рог е каз яой активности почв. Материалы диссертации используются на факультете почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова при чтении лекций по курсам "Экология почвенных микроорганизмов" и "Основы биологической кинетики,"

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Г конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ (1983 г.),а также на заседаниях кафедры биология лочв .'ЛГУ (1980, 1981 г.г.).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 3 статьях.

Объем саботы.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, 4 глав, заключения а выводов, содержит страниц,машинописного текста, рисунков, таблиц и список литературы из назв.(иа них -зарубежные) .

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДА ЙССЛВДОШНШ

Почки, В работе использовали образца слабодерново-средне-подзолистой почад под елышсои волосистоосоковым (гор. А^, 5 - Ю сы, Малянское лесничество, Московская обл.) и типичного чернозема под озимой пшеницей (гор. Ад^ ,0-20 см, Курская ойд;-) . '^Оздушно-сухую почву освобождали от растительных корней, - просеивали через сито I мм, увлажняли до 60$ от полной влагоем-кости и хранили во влажном состояний при комнатной температуре.

Инкубирование почв с глюкозой. Поступление в почву свежих органических веществ, служащих субстратами микробного роста, имитировали внесением в почвенные образца разных количеств.глюкозы. Глюкозу добавляли в виде концентрированных растворов, содержащих также и Ш^РОд. Концентрацию растворов подбирали таким образом, чтобы количество глгаозн.составляло 0,110 мг/г почвы, нн*-к - I мг/г почвы#Ро2~ - Р -I мг/г почвы, а результирующая влажность не превышала 25 вес. % или 60 % от полной влагоемаости. Почву затем тщательно перемешивали для однородного распределения вносимых веществ, помешали во влажную камеру и инкубировали при 25 + 0,5° в течение 2-40 дней. В периодически отбираемых пробах почвы производили целый ряд химических, биохимических я микроскопических определений.

Определение остаточного содержания глюкозы. 1,0 г почвы встряхивали в течение 3 минут с 5,0 мл 0,1 н СаС12, почву затем отделяли центрифугированием, а в вадосадочной жидкости измеряли концентрацию глюкозы энзиматическим методом (Щербухин и др. 1975) с глшжозооксидаэой (Львовский завод бактпрепаратов) и пе-рохсидазоЗ (,Яаапа1 Венгрия).

Легядрогеназнтю активность почв определяла модифицированным методом Тэльиаяа ( Х2га1здоп, 1Э68) : 10 г почвы инкубировали о I % глюкозы и 10 мл I % раствора ТТХ в 0,1 11 трис~НС1 буфере ЕЙ 7,6 в анаэростатах при 37° в течение 2 час. О величине ферментативной активности судили.по интенсивности окраски ПФ (оптическая плотность при 546 ни), извлекаемого из.инкубационной среды смесью ацетона, СС14 и этанола (7:2: I).

Интенсивность дыхания почв измеряли по скорости образования С02. Для этого 10 г почвы помещла в стеклянные флаконы объемом 500 мл, герметически закрывала их резиновыми пробками и инкубировали при 25°. Периодически с помощью шряда из флаконов

отбирали через резднснув пробку пробы воздуха я.в них определяли концентрацию С02 на газовом хроматографе ЛХИ-З ЦЦ с катароме тром в качестве детектора (газ-носитель Не, колонка данной 100 см с Роагаракз, 42°), При превышения концентрация С02 в воздухе 2 % производила заиену газовой фазы флакона свободным от СХ>2 воздухом.

Определение микробной биомассы в почтх фумигадиошпи методом предполагает измерение избыточного по сравнении с контролем количество СО^, которое образуется в почве» обработанной хлороформом. В оригинальном методе (.г«11с1п9ва;1>ош1ааа , 197£) быдн сделана сдедудпие ыадосупвствекяые изменения: навеска почвы была уменьшена с 400 до 10 г, инкубацию почвенных образцов (контрольных я обработанных фумигантом) осуществляли при 25° в стеклянных, флаконах объемом 500 мл в течение 10 даей с последующим определением продуцированного С02 газ охроматогрэфич е ски, а ае титрлме трическим методом.

Определение микробной биомассы физиологическим методе« основано на измерения интенсивности дыхания почвы, обогащенной глюкозой, при этом интенсивность дыхания предполагается пропорциональной количеству микроорганизмов (Апйвг«от1,Пов»сК» 1978)* Глюкозу вносили в почву в смеси с тальком (I : 10) в количестве 2,5 иг/г почвы. Измерение интенсивности дыхания производили ранее описанным способом, во при температуре 20° я ограничивая время определения 5 часами, чтобы предотвратить возможный рост микроорганизмов за счет потребления внесенного субстрата.

Определение микробной биомассы в почвах на рснованяя ^нтгн-г пкямнх микроскопических методов. Численность бактерий учитывали методом люминесцентной микроскопия в отраженном свете с предварительной обработкой почв на низкочастотном дезинтеграторе УЗДН-1 (15 кГц, 0,4 А) И окрашиванием фиксированных препаратов акридином оранжевым (Звягинцев а др.» 1980). Длину а диаметр гиф грибного мицелия измеряли до окраска на тех хе препаратах в световом микроскопе МВИ-6 с фазово-контрастннм устройством (Кодевин и др., 1979). При расчете биомассы микроорганизмов объем бактериальной клетки принимали равным 0,1 мкмг, плотность сырой биомассы 1,1 г/см3, и'содерханив в ней води - 90

Результаты всех определений рассмтияии на абсолютно сухую навеску почвы, повторноегь анализов - 2-5-кратная. Результаты

исследований подвергались статистическое обработке (корреляционный и регрессивный анализы) с использованием ЭВМ "Мир-2".

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I, Скорость разложения глюкозы в почвах Разложение глюкозы - одного из юаяеных интермедиатов катаболизма поступаших в почву полимеров углеводной природы» посвящено немало работ, в которых с использованием методов радиоактивных индикаторов а респирометрии исследовалась скорость манерализашш глюкозы до 002, включение углерода глюкозы во фракция гумусовых веществ а микробные клетки, зависимость скорости разложения от температура и рН, присутствия глинистых минералов И т.д. (Фокин, 1977; Мауаийоп , 1Э71?'о*акоуа , 1972;Кипе, , 1974; ВеЬега,«двпвг , 1974). Однако нет работ, в которых бала ба детально изучена кинетика разложения глюкозы, вносимой в почву в широком интервале концентраций.

На рис. I данные по динамике разложения глюкозы представлены в полулогарифмических координатах "1и5 -1 где в -остаточная концентрация глюкозы, ь - время. Характер процесса разложения существенно зависел как от типа почвы, так и от уровня начальной концентрации глюкозы в почве - во . В интервале значений зо0,1 - 1,0 мг/г почвы распад протекал без латентного периода и все экспериментальные'точки в координатах рис. I удовлетворительно аппроксимировались прямыми, т.е.

1п 3 » 1п во - (I)

где 1с - константа. Дифференцирование (I) приводит к известному уравнению первого порядка:

йв/АЬ «-к* (2)

В вариантах с величинами 2,5 - 10,0 мг/г почвы уравнения (I) и (2) оказались справедливыми лишь для периода, начинающегося спустя 10-15 часов после внесения глюкозы в почву. До этого распад глюкозы был замедлен, вероятно, вследствие необходимости адаптации комплекса микроорганизмов почвы в ответ на поступление легкодоступных веществ в количествах, существенно превышающих естественные потоки энергетических субстратов.

Заслуживает внимание рассмотрение тех кинетических закономерностей, которые определяют рост почвенных микроорганизмов в ходе разложения глюкозы и одновременно удовлетворяют условию протекания процесса распада в соответствии с кинетикой первого ¿-ШХ

Рис. I, Динамика разделения гшонозы в черноземе (А) и дерново-подзолистой почве (Б). Исходное количество глюкозы («г/г почвы) : I - 0,1; 2 - 0,5; 3 - 1,0; 4'- 2,5 5 - 5,0; 6 - 10,0,

порядка. Известно (Перт, 1978), что скорость потребления субстрата пропорциональна биомассе микроорганизмов (X):

de/dt » - ix (3)

где 4 - метаболический коэффициент, обнадеживаший зависимость от концентрации субстрата, йсе многообразие типов зависимостей ч от s можно свести к двум предельна* ситуациям: Di не зависит от а , тогда da/dt » -ix (4)

где ь - константа;

2) 1 линейно возрастает с увеличением s и тогда

da/dt «= - 18 т , (5)

где 1 - константа. Очевидно, для рассматриваемого процесса справедлива последняя ситуация (5), причем константа к эмпирического уравнения (I) али (2) представлена произведением новой константы 1 я концентрации макроорганизмов х. Нетрудно убедиться в том,, что поскольку в ходе, разложения переменные х и в меняются в противоположном направления, то единственной возможностью сохранения постоянства произведения l.x-к является неизменность как 1 .так и х , т.е. по мере распада глюкозы в почве эффективная концентрация микробной биомассы г , участвуотей в данном процессе, сохраняется на одном и том же уровне. Таким образом, вследствие микроочагового распределения микроорганизмов в почве непрерывно возрастающая в ходе потребления глюкозы сулаерная масса микроорганизмов дкфференцируется на активную часть, которая находится в непосредственном контакте с разлагаемым субстратом и шло изменяется во времени, и неактивную составляющую, заключенную в тех микролокусах, где субстрат полностью исчерпан. Аналогичная ситуация возникает в процессе роста колоний мяцелиальных микроорганизмов на твердых средах, когда имеет место постоянство растущей периферической зоны колония на фоне непрерывного увеличения суммарной масса колонии (Пщш-ков и др., 1982).

Величина К не является истинной константой и обнаруживает зависимость от s0. выраженную в наибольшей степени в дерново-подзолистой почве, в которой К возрастай с увеличением So от 0,1 до 5 мг/г более, чем в 3 раза. Для чернозема к оставалась приблизительно постоянной, варьируя в пределах 0,13 - 0,16 час-1 и только в варианте с So 2,5 мг/г почвы резко увеличивалась до 0,32 час-1. Можно лишь предполагать о возможных причинах варьи-

ровандя к . В дерново-подзолистой почве, вероятно, увеличениек пра высоких значениях з0 обусловлено возрастанием ж (уравнение 5), тогда как падение к в варианте с 1С мг глюкозы/ г почвы, скорее всего, сопряжено со снижением константы 1 . Относительное постоянство к в черноземе удовлетворительно согласуется с :ойя«приаятым мнением о значительной инерционности и стабильности микробного комплекса этого типа почв*

Глава 2. Интенсивность дыхания почв, обогащенных глюкозой

Процесс дыхания занимает центральное место в энергетической обмене микроорганизмов, а ввделяшэяоя в ходе дыхания углекислота представляет собой конечный продукт деструкции поступающее в почцу органических веществ» Поэтому измерение скорости образования 00% или потребления почвами в лабораторных экспериментах ила непосредственно в поде служит, весьма информативным показателем биологической активности, который иожет быть использован не только дай оценки функционального состояния микроорганизмов в почве (согЪмч , 1934; сьаев.вга^ * 1957), во и в биоэнергетических исследованиях экосистем ( ираОДДО8 • зшвЬ , 1981).

В настоящей работе данные по интенсивности дыхания почв после внесения разных количеств глгооэн представлены в виде так называемых кривых дыхания, показывающих динамику образования С02 во времени (рис»2). В почвах без внесения субстрата интенсивность дыхания была низкой и общее количество С02 возрастало во времени л идейно. В вариантах с величиной Но 0,5 - 1,0 мг глшоэьг/г почвы кривые дыхания имела два четко различимые участка - резкого возрастания количества С02 в перше 90 часов после внесения глюкозы и более медленного линейного увеличения во времени содержания продуцированной углекислоты в последующий период 90-300 часов. В вариантах с величинами во 2,5 - 10,0 мг/г почвы на кривой дыхания дополнительно выделялись участки в первые 15 - 20 часов опнта, соответстцуотае постепенному увеличению скорости образования С02г в результате чего кривые дыхания приобрела 8 -образную форму.

В общем случае всю кривую дыхания оказалось возможным описать следующей системой уравнений:

нелинейное образо- I _

вание С02: * (?)

линейное образование С02: г^ > (8)

где Т - период замедленного образования СО^ в первые 15 - 20 часов после внесения высоких концентраций глюкозы в почву; Р1 и р£ - количество СОд, образующееся за счет окисления соответственно легкодоступных (глюкоза и интермедиа«! ее распада) я. труднодоступных органических соединений (собственно почвенное органическое вещество); ^ и - конечное количество С02. образутаееся в результате полного окисления соответствующих субстратов; и ~ константы первого порядка; Тр/х -выход СС>2 на единицу образовавшейся биомассы; х0- биомасса микроорганизмов в момент внесения глюкозы; я - удельная скорость роста микроорганизмов. Заметим, что в вариантах с I ыг/г почвы и меньше Т =0 а система уравнений существенно упрощается.

Найденные общепринятыми способами численные.значения кинетических параметров представлены в табл. I, а на рас. 2 построены кривые, рассчитанные по уравнениям 6 - 8. На уровне чисто визуальной оценки можно констатировать удовлетворительное согласие между экспериментально полученными и расчетными данными.

Таблица I

Параметры кинетических уравнений, описнваших кривые дыхания почв

Почва Зо мг глюкозы г почвы V час-1 X час мг С0о г почвы П МГ СО-ч г почва

Дерново- 0,5 0,04 0 0,84 0,0036

аодзолис- 1,0 0,06 0 1,16 0,0038

тая ¿,5 0,20 15 2,60 0,0034

5,0 0,07 20 7,70 0,0143

Ю.о 0.05 20 13.6 0.0141

Чернозем 0,5 1,0 0,04 0,04 0 0 0,63 1,10 0,0029 0,0033

2,5 0,05 15 2,70 0,0100

5,0 10.0 0,04 0,05 20 20 5,80 12,4 0,0157 0,0170

б

час час

Рис. 2. Динамиян образования СС^ в черноземе (А) и дерново-п од золист ой почве (Б). Исходиее количество глюкозы (мг/г почвы): I - 0} 2 - 0,5; 3 - 1,0; 4 - 2,5; 5 - 5,0; ё - 10,0 . р - количество С0<>, мг/г почвы.

Константа первого порядка скорости окисления глюкозы ic^ варьировала в зависимости от % в дерново-подзолистой почве в пределах 0,04 - 0,20 час-1 а оставалась неизменной в черноземе (0,04 - 0,05 час-*, подтверждая ранее полученный вывод о большей инерционности и стабильности комплекса микроорганизмов этого тша почв. Однако по сравнению с результатами предшествующего раздела по кинетике разложения глюкозы абсолютные величины констант скорости окисления этого субстрата оказались в 3-4 раза ниже. Следовательно, непосредственным источником CQg является не только глюкоза, но и промежуточные продукта ее разложения, включая, вероятно, помимо органических кислот биомассу микроорганизмов начальных стадий сукцессия.

Конечное количество продуктов окисления глюкозы было линейно связано с величиной s<>{pHC.3 а). По наклону полученной прямой можно рассчитать степень окисления глюкозы yp/s-дре/лвс, где лЗс - количество углерода потребленного субстрата иарс -количество углерода COg» образующегося за счет окисления глюкозы, Величина оказалась одинаковой в дерново-подзолистой почве и черноземе - 0,65 + 0,09, что соответствует весьма низкому значению экономического коэффициента, характеризующего эффективность роста почвенных микроорганизмов на окисляемом субстрате: У »1« Yj/s = 0,35 г С биомассы/г С глюкозы. В начале опыта при t it степень окисления глюкозы, измеренная по отношению скоростей образования 00g (dp/dt) и потребления глюкозы (de/dt)бела значительно ниже - 0,37 + 0,06 (рас. 36), что соответствует величине **0,63 г С биомассы/г С глюкозы, лежащей в пределах варьирования значений экономического'коэффициента чистых культур микроорганизмов (Г«У»« , 1970). Наблюдаемые изменения кажущихся величин *, очевидно, обусловлены тем, что рост сообщества почвенных микроорганизмов в отличие от чистых культур сопровождается многократной реутилизацией органического углерода микробной биомассы; число циклов реутилизации мохно оценить по следующему соотношению:

*яах.» {9)

где I - кажущаяся величина у , численно рагаая отношению углерода биоиэсск к углероду внесенного в почву субстрата в данный момент времени, ^ в Yp - истинные величины * , характеризующие максимальный выход по углероду бтошссн на единицу использованной глюкозы и реугилиэируемой биомассы соответствен-

но. Приникая = Ур - 0,63, получаем, чго к моменту завершенжя окисленяя глюкоза п оказывается раЕяям 1,27, т.е. на протяжении 90 - 120 часов опта биомасса микроорганизмов, внросшиг на глюкозе, прошла более одного полного цикла рвугвмзация.

1^ГЫГ С/г и.

О-чернозем

(J3

<>1ИЯ ) иг С/ час-г п.

+Яерново-подзолистая почва 6

г^» аэ7+аоб

&

о

0,2 ат

2 3 4 Sjj, иг С/г почва

0,1 0,2 Q3 <\4 0,5

ds/dt ,чг С/час* г почвы

Рис. 3. Экспериментальны» данные, используемые для расчета^

Произведение кинетических констант может служить в ка-

честве количественной мерн "затравочного эффекта" глюкозы, т.е. стдаулирупцего воздействия глюкозы на разложение собственно почвенных органических веществ (Ьтс , 1Э80). Величина к 2Р2 возрастала с увеличением зс , но не линейно, а по кривой насыщения, приближаясь к максимальным значениям при з0 5-10 мг/г почвы (табл. I), в черноземе по сравнению с дерново-подзолистой почвой величина бала несколько няже при низких , но

достигала больших значений при высоких 3„ . Важной кинетической особенностью затравочного эффекта является то, что внесение глюкозы увеличивает не скорость разложения органических веществ почвы, а их количество Данный вывод следует из лилейного характера кривой дыхания почвы после завершения окисления глюкозы: произведение к 3(1*2 ~ Р2' мало отличается от к 2^2 как при низких, так и высоких з0 , т.е. к 2 остается низкой по абсолютной величине, и высокая скорость дыхания в рассматриваемый период обеспечивается увеличением Следует отметить однако, что в анализируемой ситуации практически невозможно раз-

граничение окисления внеклеточных трудноразлагаемых субстратов типа гумусовых кислот и эндогенное дыхание почвенных микроорганизмов, очевидно, что вклад последнего должен возрастать с увеличением 30 вследствие роста суммарной микробной биомассы.

При условий длительного многодневного прослеживания динамики образования С02 ход кривой дыхания уже не может быть на поздних стадиях аппроксимирован линейным уравнением (8), в этом случае по уравнение первого порядка возможно раздельное определение параметров к2 и р£>, имепцих конкретный биологический смысл: величине соответствует количество потенциально разлагаемых органических соединений почвы, а к2 характеризует их относительную доступность микробному разложению.

Глава 3* Дегидрогеназна^ активность почв, обогащенных глюкозой

Дегидрогенаэа являются конститутивными внутриклеточными ферментами, участвующими в энергетическом обмене всех известных ныне микро- и макроорганязмов. Во многих исследованиях была установлена достоверная корреляция между уровнем дегидрогеназной активности (ДА? и такими показателями биологической активности почв, как интенсивность дыхания, скорость нитрификации, протео-литическая активность, содержание доступных разложению органических веществ и др. ( Галстян, 1974; ЬепЬаг<1, 1956-1966; Зки;)-1пв , 1974). В почве дегидрогеназы локализованы, по всей вероятности, только в составе ялвой <£азы и вне клеток быстро теряют свою активность (Алиев, 1975; Павлютук, 1982). Учитывая вышеизложенное, ш избрали ДА в качестве одного из показателей активности почвенных микроорганизмов и попыталась установить количественное соотношение между ДА и скоростью микробиологических процессов в серии опытов с внесением в почвы разных количеств глюкозы. Однако, прежде всего; были решены некоторые методические вопросы.

Известные методы определения ДА (Галстян, 1974, тьаХтапп , 1968) предполагают инкубашш навески почвы с субстратами дегид-рогеназнрй реакции в течение 16 - 24 час. Между тем, на протяжении этого периода скорости микробиологических процессов (потребления глюкозы, дыхания и т.д.) могут меняться в несколько раз. Кроме того, в течение суточной инкубации происходит значительные изменения численности и активности почвенных микроорга-

низмов, что сильно искажает результаты определения. За основу предложенной нами модификации бшг взят метод определения ДА, предусматривающий инкубацию почвы с субстратами (трифенилтетра-золий хлористый д глюкоза) в буфере при рН 7,6 с последующим извлечением окрашенных продуктов (трифенялформазона - ТТФ)'-смесью ацетона и СС14 (тьа1ямшп г 1968). Минишльная продолжительность инкубации, составляющая по прототипу 16 час., была снижена до 2 часов за счет повышения температуры инкубации с 30° до 37°, создания с помощью анаэростатов анаэробных условий для предотвращения возможного переноса восстановительных эквивалентов с субстратов дегидрирования на и, наконец, применением более эффективного экстрагеита ГРФ - смеси ацетона, СС14 и метанола (7:2:1). Использование указанного экстрагента оказалось к тому же более надежным, так как обеспечивало полное отсутствие помутнения.окрашенных растворов ТТФ, иногда наблюдаемое при определении ДА по методу ТЬльмана. Изучение кинетики образования ТТФ показало, что в условиях определения нулевой порядок реакции сохранялся в течение 10 - 12 часов, однако' уже через 2 часа окрашенные продукты реакции накапливались в количестве, достаточном для измерения ДА с относительной погрешностью не более 5 - 8 % (разность между величинами оптических плотностей при 546 нм опыта и контрольной пробы составляла 0,05-0,2 единицы).

На рас. 4 приведены результаты изучения динамики ДА в дерново-подзолистой почве и черноземе после внесения 0,5 - 10 мг глюкозы на I г почвы. Интересно, что в первые часы опыта ДА достоверно падала, а затеи возрастала* достигая максимальных значений в варианте с зо10 мг/г почвы на 26 час. опыта. Далее на протяжении 30 - 100 часов ДА быстро снижалась вплоть до уровня исходной необогащенной почвы и ниже. В почвах без внесения глюкозы ДА обнаруживала аналогичную динамику с достижением максимумов, превышающих таковые для почв с внесением 0,5 - 2,5 мг глюкозы на I г почве. Снижение ДА под действием глюкозы, вероятно, обусловлено иатаболитной репрессией синтеза ферментов; менее вероятно проявление ккгибирупцего действия глюкозы на уровне ферментативной реакции, так как во всех вариантах опыта глюкоза была обязательных компонентом реакционной смеси для определения ДА.

Рис. 4. Динамика дегидрогенаэной активности в черноземе (А) и дерново-подзолистой почве (В). Исходное количество глюкозы {ыг/г почвы): I - О, 2 - 0,5 , 3 - 2,5 , 4 ~ 10

Существенными были различия в уровне ДА меаду разными почвами: чернозем как в исходном почвенном образце, так а во все сроки инкубации с глвкозой характеризовался в 3 - 4 раза большее ДА по сравнению с дерново-подзолистой почвой.

Динамика ДА обнаруживала коррелятивную связь с изменениями интенсивности дыхания почвы ( г= о,81 и 0,85 для чернозема а дерново-подзолистой почва соответственно). Однако, величина отношения "ДА : интенсивность дыхания" сильно различалась даже в дцух изученных почвах, составляя 1,5 мг Тфф/мг 00^ в дерново-подзолистой почве и 9,8 «г ТФФ/мг С02 в черноземе. Следовательно, показатель ДА в количественннх исследованиях имеет ограниченную область применения и может оказаться полезным лишь при изучении одного ила близких типов почв.

Глава 4. Динамика микробной биомассы в почвах, обогащенных глюкозой

Проведенный в обзоре литературы диссертации критическая анализ,показал, что наибольший интерес с точка зрения количественных исследований динамика микробной биомассы имеют из физяолого-биожамическкх методов - фумигадаошшй а физиологический методы, а аз микроскопических методов - измерение длины грибного ми-целая на предметных стеклах и подсчет числа бактерий на фиксированных препаратах методом лшинеспеятной микроскопии.

На рис. 5 результаты изучения динамики количества микроорганизмов микроскопическими методами представлены на примере варианта с я<> 10 мг/г почвы. Длина гиф грибного мицелия возрастала после внесения глюкозы линейно, достигая максимальных значений на 10 сутки опыта, затем количество мицелия бистро уменьшалось и на 20 сутки становилось равным таковому в исходной необога-щенной почве. Численновть бактерий возрастала с меньшей скоростью по сравнению с грибами и достигала наибольших значений на 15 -17 сутки. Далее количество бактерий снижалось, но не резко, оставаясь через месяц после внесения глюкозы еще на порядок большим по сравнению с исходной почвой. Суммарная биомасса грибов а бактерий, определяемая биообъемом микроорганизмов, зависела, главным образом, от количества грибного мицелия (рис.6» ) и повторяла динамику последнего.

Близкие данные по динамике микроорганизмов в почве после внесения глгаозн была получены в других исследованиях (Кочкива,

Рис, 5 , Динамика роста почвенных микроорганизмов в черноземе (А) и дерново-подзолистог: почве (Б) по данным прямого дакроскопирования . ^ = 10 мг/г почвы I - длина мицелия, и/г почвы, 2 - число бактерий, 1<Я кветок/г

1981), подтверждая тот факт, что независимо от типа почвы внесенный субстрат в первую очередь используется грибами в силу несомненных преимуществ эдщелиального роста при колонизации свободных ыикролокусов в почве. Эти результаты удовлетворительно согласуются также с обсуждаемыми в I главе особенностями кинетики распада ттхсозы в почве, в частности, справедливость уравнения I возможна лишь при условии участия в процессе распада ми-целиальннх организмов, способных сохранять постоянство ростовой зона на фоне непрерывного увеличения суммарной биомассы.

На рас. 6 данные микроскопических определений сопоставлены с результатами, полученнши фтмдгадионным я шиз дологическим методами.

Динамика микробной биомассы, изученная всеми тремя использованными методами, описывалась одновершинными кривыми с достижением максимальных значений на 4 - 10 сутки после внесения в почву глюкозы. С увеличением происходило закономерное возрастание микробной биомассы со сдвигом максимума в сторону более поздних сроков, что коррелирует с динамикой образования СО^ С рис.2). Однако, точки перегиба на кривых дыхания при всех з0 обнаруживались на 2 - 3 сутки раньше, чем моменты достижения максимумов биомассы, что свидетельствует об участии кометаболя-зяружюу: органических веществ почвы не только в энергетическом, но я конструктивном обмене микроорганизмов. Начиная с 4 - 10 суток имело место уменьшение количества микробной биомассы, вероятно, в результате ее реутилизации и эндогенного распада клеточного материала микроорганизмов, лишенных доступных субстратов.

Разные методы давали противоречивую информацию о некоторых специфических особенностях динамики микробной биомассы. Так, роет микроорганизмов происходило лхводяо со триним прямого счет х нзлх в*Яво — во »у*»»™ другкг методов. Опшрикв биомассы после достижения максимума протекало экспоненциально и с высокой скоростью по данным прямого счета, тогда как физиологический метод обнаруживал более медленное близкое к линейному уменьшению количества микроорганизмов, а по даянш фумигадионного метода имело место даже повторное увеличение биошссы на 28 сутки.

С точки зрения общих кинетических закономерностей роста микробных популяций наиболее достоверную информацию о динамике биомассы дает физиологический метод, так как полученные с его

Рис. 6. Изменение микробной биодассы в черноземе (А) и дерново-подзолистой почве (Б) I - прямые микроскопические метода(ыг С/г и), П - $умкгациояныЯ ме-тод(мг СО^/ г п), Ш - физиологический метод(мг СО^/чвс г п). Исходные количества глюкозы(мг/г п): 1-0; 2-1,0; 3-5,0; 4-10,0 .

помощью кривые роста и отмирания микроорганизмов в почве удовлетворительно согласуются с данными по актуальной активности микробного населения (кривые дыхания -почв). Действительно, во-первых, рост микроорганизмов в перше сутки опыта не может.протекать линейно (с постоянной скорость*) в салу того, что потребление субстрата замедляется по мере его исчерпания (уравнения I я 2), кроме того, постоянно происходят отмирание и реутилизация микробной биомассы, что также способствует замедлению прироста клеток и мицелия; во-вторых, низкая скорость отмирания биомассы после достижения шксицума подтверждается тем, что в этот период интенсивность дыхания почв сохраняется на некотором постоянном относительно низком уровне, тогда как быстрое экспоненциальное отмирание сопровождалось бв более интенсивным выделением С02 по затухающей кривой; в-третьих, наличие второго максимума биомассы на 28 сутки по данным Имитационного метода не подтверждается усилением интенсивности дыхания в этдт период, к тому же рост микроорганизмов спустя месяц после внесения глюкоза маловероятен из-за того, что к этому времени ростовые субстрата практически полностью исчерпываются.

Для более строгой количественноЗ оценки разных методов в качестве эталона сравнения была использована величина максимальной при данном микробной биомассе хр , рассчитанная исходя из количества продуцированной углекислоты (лр ). Допуская, что выход биомассы на единицу внесенной в почву глюкоз^ и на единицу кометаболйзируемого почвенного органического вещества приблизительно одинаковы и давая экономическому коэффициенту значение 0,35 (см. главу 2), получаем следующее выражение для расчета хр:

л (Ю)

Хр «др/ (¥+1) - А р. 0,54 (мг с/г почвы)

Из рис. 7 следует, что прямопропордяональная зависимость между расчетными и экспериментальными значениями микробной биомассы существует лишь для микроскопического и физиологического методов. При использования ^уиигадионного метода были получены аномально высокие г ячения микробной биомассы в контрольной почве (без внесения глюкозы). Вероятной причиной атому является чисто химическое воздействие хлороформа на почвенный гумус, приводящее к стимуляции его окисления, в результате величины микробной биомассы оказывается завышенными, причем в боль

Рис. 7. Сравнение разных методов определения , микробной биомассы с расчетными величинами биомассы хр

шеЗ степени в черноземе, чем в деряово-подзолиотой почве, со-двршащей меньшее количество гумуса.

Исходя из численных. . значений параметров уравнений регрессии, описывали? экспериментальные данные в координатах рис.7 можно получить дополнительную информации об особенностях используемых методов. Так, микроскопический метод характеризуется недоучетом 30 % микробной биомасса, что, вероятно, прежде всего обусловлено недоучетом отдельных групп почвенных микро- ... * организмов ж произвольностью выбора значений шш^с№снр<й биомассы и содержания в ней сухого вещества. Е*е~болъше£о-рае~ -хоадейм следует ожидать на поздних этапах микробной сукцессии, когда могут недоучитываться грибные споры и допускаются значительные ошибка в измерения объема бактериальных клеток.

Коэффициенты пересчета скорости образования ОО2 в единицы биошссы в физиологическом методе различаются в дерново-подзолистой почве и'черноземе более, чем в два раза, составляя 0,055 и 0,023 мг С02'час г почва соответственно. Коэффициенты пересчета в этом случае, фактически являются усредненными величинами максимальной удельной скорости дыхания почвенных микроорганизмов и укладываются в пределы варьирования аналогичных параметров чистых культур почвенных микроорганизмов. Физиологический метод, таким образом, при всех его достоинствах (быстрота и точность определения, объективность отражения действительной динамики микросчо£ биомасса) обладает тем существенным ограничением, что для данного типа почвы и заданного диапазона изменения внешних условий должны быть определены величины пересчетных коэффициентов, характеризующих усредненные показатели метаболической активности почвенных микроорганизмов.

В случае использования фумигационного метода для расчета микробной биошссы нельзя пользоваться одним пересчетнш коэффициентом, с в ной целью необходимо вводить полученные данные в уравнение регрессии, содержащее дополнительно свободный член (рис.7 )• В противном случае исследователь получает тем большую ошибку, чем нижа абсолютное значение микробной биомассы.

Сказанное подтверждается результатами проведения корреляционного я регрессионного анализа по сравнению трех использованных методов с учетом данных по всем срокам и для всех 50 . Нал-

более тесная корреляционная связь была установлена между данными но иикроскопичемкому и физиологическое методам ( г«0,94 и 0,80 для-чернозема и дерново-подзолистой почвы соответственно), наименьшие значения коэффициента корреляции характеризовали связь между данными, полученными прямым счетом и фумягапдонным методом С ,69 и 0,58 для чернозема я дерново-подзолистой почвы соответственно). При этом всегда нулевым значениям микробной биомассы по данным микроскопического и физиологического методов соответствовали высокие положительные величины образования СО^ по Имитационному методу.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что скорость потребления глюкозы почвенными микроорганизмами описывается уравнением первого порядка с варьированием константы скорости в зависимости от исходной концентрации субстрата, которое выражено в большей степени в дерново-подзолистой почве, чем в черноземе.

2. Кривые динамики образования СО^ в почвах, обогащенных глюкозой, описываются системой дифференциальных уравнений, раздельно учитываших окисление вносимого субстрата а собственно почвенного органического вещества. Кинетический анализ интенсивности дыхания почв позволил рассчитывать выход микробной биомассы на единиц использованного субстрата у (0,35 - 0,63 г С биомассы па

I г С глюкозы) и число циклов реутилизация микробной биомассы в ходе разложения глюкозы.

3. Дегидрогеназная актишость почв подавляется глюкозой и в динамике коррелирует с интенсивностью дыхания почв. Относительный вклад дегидрогеназ в энергетический обмен почвенного микробного населения больше в черноземе, чем в дерново-подзолистой почве.

4. Прямым микроскопическим учетом и на основании косвенных кинетических данных установлено, что независимо от типа почвы внесенный субстрат в первую очередь используется грабами, тогда как бактерии развиваются на продуктах грибного ресинтеза. Рост микроорганизмов происходит за счет использования как вносимой глюкозы, так и кометаболизаруемых органических вешеств почвы.

5. Произведено сравнение трех методов определения микробной биошссн в почвах. Наиболее простым и надежным способом определения количества активной биомассы микроорганизмов является фа-

эяологйчесюй метод Дядерсова я Домша, который мохет быть-использовав при условии предварительного определения пересчетного коэффициента для каадого конкретного типа почв.

Материалы диссертации опубл.шюванн в работах:

1. Кинетика разложения глпкозн :в почве (в'соавторстве.с Д.Г. Звягинцевым и Н.С. Паниковым). Почвоведение,КЗ,с.70-78, 1932.

2. Кинетический анализ кривых дыхания почв, обогащенных глюкозой (в соавторстве с Д.Г.Звягинцевш и .Н.С.Паниковым)Вес1шПс--Моск. ун-та, сер. Почвоведения (в печатя). "

3. Дегидрогеназнал активность почв как. показатель бногассн и активности микроорганизмов. Труды У научной конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ, П., 1932 г. (редкая. Вестник МГУ, сер. Почвоведения, Москва; 1902 г., I с Ркопись деп. в ВИЮПИ 1982 г.

ПлйГГй™™'¿ЩхЙ&г

Фа», п. д. 4 У Уч.-взд. я.^ V

з*т20П т»»

Идм« Ммталп утшерс««та. Мкжм, К-3. ул. Герое«*, 5/7. Тюографня НмгИ МГУ. Иосан, Лсагоры