Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика роста и гормональная чувствительность суспензионных культур клеток некоторых сортов пшеницы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетика роста и гормональная чувствительность суспензионных культур клеток некоторых сортов пшеницы"

РГб од

1 9 ЛПРейШЗнскии государственный университет

На правах рукописи

КИРАКОСЯН АРА БЕНИКОВИЧ

УДО 581.143.6

КИНЕТИКА РОСТА И ГОРМОНАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1993

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор ДАНОСЯН Г.А.

доктор биологических наук, профессор ВАРДАПЕТЯН P.P.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор МАГАКЯН Ю.А.

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ХАЖАКЯН Х.Г.

Ведущее учреждение - Ереванский Зоотехническо-ветеринарный институт.

Защита диссертации состоится »13« U-c&p / <2. 1993 г. в часов на заседании специализированного совета К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна, I, Ереванский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан "/■/" ,h 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Л.Г.АНАНЯН

ВВВДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы в исследованиях по культуре тканей и клеток высших растений четко наметились два основные тенденции. Первое из них связано с углубленным исследованием биологии культивируемой растительной клетки, изучением особенностей ее метаболизма, роста, дифференцировки, присущей ей генетической и эпигенетической изменчивости. Второе направление прикладное, ставящее своей целью возможно более широкое использование приемов и методов культуры тканей и клеток для решения трудных практических задач, возникающих в растениеводстве, сельскохозяйственной генетике и селекции.

Одним из таких весьма эффективных и экономически выгодных приемов является клональное микроразмножение растений в культуре in vitro. Этот метод позволяет за короткий срок получать большое количество однородного посадочного материала. Коэффициенты микроразмножения достигают 10^-10^ растений в год, что в десятки тысяч раз больше, чем цри использовании традиционных методов вегетативного размножения. Кроме того, в последнее время предпринимаются попытки использования клеточных культур дот уменьшения загрязнения среды, производства энергии, получения белков, медицинских препаратов и т.п.

Совершенствование методов культивирования клеточных культур и разрабатываемые в последние годы методы генетической трансформации клеток открывают новые многообещающие пути для их более значительного промышленного использования.

Для успешного решения вышеприведенных задач необходимо:

а) провести отбор наиболее удобного растительного материала;

б) исследовать возможность получения длительно пассируемых кле-

. точных культур и определить основные параметры ее роста в процессе культ ив ирования;

в) исследовать консервативную способность культуры к сохранению цитогенетических особенностей сорта;

г) провести подбор наиболее оптимальных питательных сред;

д) исследовать изменение гормонального статуса в процессе культивирования.

Общим недостатком исследований, проводимых в данном направлении является отсутствие комплексного подхода, что не позволяет всесторонне исследовать рост конкретной клеточной культуры. По-

давляющее большинство исследований, проводимых в этом направлении генетиками и физиологами, осуществляется без привлечения пре-цеззионных методов биофизики и математической биологии. Со своей стороны методы популяционной математики и клеточной биофизики в основном используются при исследовании параметров роста бактериальных культур в реакторах прерывистого и непрерывного действия. Кроме того, практически не учитываются как генетические особенности исследуемого сорта, так и генетические особенности родительских форм гибридов. Зачастую не учитывается также гормональная чувствительность конкретных источников клеточных культур, и в средах инкубации используются концентрации фитогормонов, рекомендуемых вообщем для данного вида.

Цель и задачи исследований. Учитывая вышеизложенное, а также чрезвычайную важность выявления любых аспектов роста и морфогенеза клеточных культур с целью дальнейшего использования в биотехнологии и селекции, в настоящей работе были поставлены следующие задачи.

I. Исследовать способность образования первичного каллуса из суспензионных культур клеток различных сортов пшеницы, а также способность данных каллусных тканей к морфогенезу и регенерации в различных средах.

. 2. Исследовать кинетические параметры роста клеточных культур различных сортов пшеницы как в первые 24 часа пассирования, так и на протяжении всего цикла роста биомассы суспензионной культуры, а также митотическую активность различных сортов.

3. Исследовать динамику размеров клеток, ядер и ядерно-плазменных отношений в цикле роста и в процессе пассирования суспензионных культур различных сортов пшеницы.

4. Провести сравнительный анализ гормональной чувствительности клеток суспензионных культур различных сортов пшеницы, а также исследование особенностей транспорта гиббереллина Ад в клеточные культуры различных сортов пшеницы.

Научная новизна и практическая ценность. На основании экспериментальных данных показано, что в процессе пассирования суспензионные клеточные культуры исследованных сортов пшеницы сохраняют свои морфогенетические потенции, что позволяет их использовать для всестороннего исследования и сравнительного анализа, в качестве исходного материала для соматической гибридизации и получения новых сортов. Выявлены особенности действия различных фитогормо-

нов на формировании "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов.

Обнаружено, что в первые 24 часа пассирования кривые роста суспензионных культур клеток можно описывать системами уравнений, обычно используемых для анализа роста бактериальных культур. Выявлено, что обычно используемые 24 часовые замеры не позволяют характеризовать особенности роста клеточных культур различных сортов из-за быстрого достижения стационарной фазы. Впервые предложен способ комплексного анализа генетических особенностей отдельных сортов на основании сравнения ряда параметров клеточного роста.

Впервые исследована динамика изменения площадей и объемов ядер и клеток, а также ядерно-плазменных отношений суспензионных культур пшеницы, во всем интервале между последующими пассированиями. Обнаружено, что после достижения стационарной фазы, ядерно-плазменные отношения достигают исходных величин.

Впервые исследован транспорт гиббереллина в клетки суспензионных культур различных сортов пшеницы. Выявлено, что число гиббереллин-связывающих сайтов различных сортов отличаются друг от друга. Обнаружено, что концентрация гиббереллиновых "рецепторов", а также параметры к^ и п в процессе образования клеточной культуры сохраняются. Показана различная концентрация гиббереллиновых рецепторов у различных сортов.

Выявление особенностей получения суспензионных клеточных культур различных сортов, а также особенностей их гормональной чувствительности, особенности роста в биореакторах, кинетика размножения, открывают широкие перспективы как для разработки рекомендаций для непосредственного внедрения в биотехнологию и сельхозпрактику, так и для поиска и получения новых сортов и гиб-•ридом, обладающих повышенным сродством к фитогормонам.

На защиту выносятся следующие основные положения.

1. Получены стабильные, длительно пассируемые суспензионные культуры различных сортов пшеницы, сохраняющие свои морфогенети-ческие потенции в процессе пассирования. Показано, что регенера-ционная способность суспензионных культур, а также роста "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов зависит от концентрации и соотношения основных фитогормонов.

2. На основе математических моделей роста прокариотических популяций предложена система комплексного анализа для характери-

зайди роста суспензионных культур. Подобрана система параметров, позволяющая характеризовать, а также идентифицировать и проводить сравнительный анализ особенностей роста суспензионных культур клеток различных сортов пшеницы.

3. Морфоцитологический анализ на системе анализатора изображений "1ВА8-2" (Ор-Ьоп, ФРГ) позволил идентифицировать динамику изменений ядерно-плазменных отношений и размеров ядер и клеток.

4. Сравнительный анализ транспорта гиббереллина показал сохранение сродства к фитогормону в процессе образования суспензионных культур клеток с одной стороны, и неодинаковую фитогормон-чувствительность у разных сортов, с другой.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ш Республиканской конференции "Достижения физико-химической биологии и биотехнологии в республике и пути их внедрения (Ереван, 1989), на научной конференции молодых ученых (Ереван, 1990), научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов университета (Ереван, 1991), на семинарах кафедры биофизики.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и принято к публикации 5 работ.

Объем работы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 18 рисунков. Список использованной литературы включает 183 наименований, в том числе 131 зарубежных источников.

Содержание работы. Работа состоит из введения и четырех глав: I - Обзор литературы; П - Материалы и методы исследований; Ш - Результаты экспериментов и их обсуждение; 1У - Заключение, а также выводов и указателя литературы.

В главе I приводятся литературные данные о роли клеточных культур в современной молекулярной биологии и биотехнологии, требованиях, предъявляемых к клеточным культурам, морфоцитологичес-ких характеристиках и кинетике роста, клеточных культурах растений, особенностях клеточных культур злаковых и роли фитогормонов в росте и развитии клеточных культур. Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

- 7 -

iVlATEPilMIJ И МЕТОДЫ ИССЭДОВАШ>1

Проращивание эмбрионов

Соматические эмбрионы получали из скутеллиарного каллуса 4-х дневных проростков семян пшеницы сортов Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамир, все репродукции 1990 г., семена стерилизовали и проращивали в стерильном термостате при 27°С 4 дня.

Получение суспензионной культуры

Суспензионные культуры получали из проростков по методу Jlyp-са и Лёрца (Lührs and Lörz, 1988) с некоторыми модификациями.

Морфогенетический контроль клеточной культуры

Морфогенетический контроль проводили проверкой способности культуры к повторной трансформации в проростки по методу Лурса и Лёрца (Lührs and Lörz, 1988).

Выделение и культивирование протопластов

Протопласты выделяли из 6-дневной клеточной культуры по методу Столарца и Лёрца (Stolarz and Lörz, 1986).

Колонии, состоящие из протопластов диаметром около I мм , из агаровой среды переносили в жидкую среду ms с различными солевыми добавками. Регенерацию проводили в колбах 100 мл Эрленмей-ера на качалке 100 кач./мин (Lührs and Lörz, 1988). После формирования клеточной культуры регенерацию продолжали как в случае морфогенетического контроля.

Определение морфоцитологических параметров

Для анализа морфоцитологических параметров использовали смешанную пробу из 2-5 колб. ГЛорфоцитологические параметры определяли на автоматизированной системе анализа изображений "ibas-2" '{Opton, фрг) с использованием стандартного пакета программ.

Для морфометрических исследований и определения митотическо-го индекса клетки фиксировали равным объемом смеси этанол-уксусная кислота (3:1). Давленные препараты готовили стандартным методом после окраски квасцовым кармином по методу Майера (Кухтина, 1971).

Определение кинетических параметров

Концентрацию клеточной культуры и дисперсию клеток считали

на автоматическом счетчике клеток "Целлоскоп-101" (Швеция). Производили автоматический счет, регистрируя число клеток в I мм.

Для исключения возможных систематических ошибок, при исследовании параметров клеточного роста пересев в новую питательную среду проводили таким образом, что к началу пассирования во всех культурах были примерно равные исходные концентрации клеток.

Связывание гиббереллина А^ клетками суспензионных культур

Из новообразованных суспензионных культур пшеницы сортов Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамар, к началу пассирования определенную часть переводили в пять колб по 9 мл в каждую. В каждую цробу добавляли по I мл Ю-4, Ю"5, Ю~6, Ю-7, М ГКд, соответственно. Далее, в каждую колбу шшетировали по 0,1 мл 6,7-10"® М *4С-ГКд (меченного гиббереллина, "АтегсЬат", Англия) с удельной радиоактивностью 10 мКи/мМ (370 Бк/мМ).

После завершения инкубации клеточные суспензии центрифугировали, на осадок добавляли 10 мл 10$ *ГХУ и смесь пропускали через мембранные фильтры "ВА 85" (Б&з, ФЕГ). Фильтры промывали 5% ледяной ТХУ, далее сушили промыванием 10 мл спирта. Радиоак-. тивность препаратов измеряли в толуольном сцинтиляяторе на счетчике "вь-ЗООО" (11гЬез^ес1ц^ие, франция), принимая стандартную ошибку 5% или меньше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Действие фитогормонов на способность каллусообразо-вания клеточных культур пшеницы

На первом этапе, до проверки каллусообразующей способности клеточных культур различных сортов пшеницы, нами проводился анализ ростовых показателей. На рис.1 приведено изменение концентрации клеток суспензионной культуры сорта Армянка 60 в первые 20 дней пассирования и после пересева на 6-й день. Как видно из рисунка, кривые роста клеточной суспензии практически полностью повторяют друг друга, хотя и наблюдается определенные различия. Так, если на 1-м этапе получения суспензионной культуры концентрация клеток в суспензии достигает максимума через 2 недели (рис.1-1), то после пересева аналогичный максимум достигается уже на 8-й день. Из полученных результатов следует, что в процессе образования клеточной суспензии в клетках происходят адаптационные изменения, способствующие в дальнейшем ее усиленному росту.

Рис.1. Изменение концентрации клеток в суспензионной культура пшеницы сорта Армянка 60 в зависимости от времени культивирования.

I - свежая клеточная культура, П - после пересева.

После достижения максимума, в течение последующих 2-3 дней концентрация клеток в культуре несколько понижается и в дальнейшем остается на постоянном уровне. Эта тенденция сохраняется при •последующих пересевах. Аналогичные результаты были получены при исследовании роста суспензионных культур клеток пшеницы сортов Безостая I, Наири 40, Ахтамар.

Для морфогенетического контроля суспензионных культур проверяли их способность к повторной трансформации в проростки. Для •этого на клеточную культуру в основной среде МБ добавляли различные концентрации фитогормонов.

Если обработка гиббереллином мало отражается на росте "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов, то обработка 2,4-Д

приводит к усиленному росту "бесцветной" популяции гетерогенного каллуса, а присутствие в среде каллусообразования зеатина приводит к резкой стимуляции роста/зеленого" гетерогенного каллуса. Аналогичные результаты были ролучены на всех исследованных сортах пшеницы, однако при использовании оптимальных для каждого сорта концентрации фитогормонов вообще и гиббереллина, в частности.

2. Кинетические параметры роста клеточных культур различных сортов пшеницы

Кинетические параметры роста определяли в первые 24 ч проращивания, делая замеры клеточных концентраций через каждый час. Для получения максимально приблеженных к реальному кинетических кривых роста, полученные данные замеров обрабатывали методом сплайн-интерполяции (Rump et al., 1980):

Xt = aXt-2 + bXt-1 + cXt + bXt+1 + aXt+2 (I) где xt концентрация клеток в момент t,

а, ъ и с - "весовые" коэффициенты, равные 0,1, 0,2 и 0,4 соответственно, t - время проращивания.

При учете ингибирувдего фактора, кривую роста можно характеризовать уравнением логистической кривой (Бейли, Оллис, 1989):

t Mt-t. J

1-SX0(1-e 1аБ )

где в= (x - концентрация биомассы в стационарной фазе), а

Лс S

J* - коэффициент клеточного роста.

Преобразуя уравнения (2), получаем

i-vxs ) -cA(t-tlag)-m(^ - 1) <3>

Нетрудно видеть, что, оцределив экспериментально xs , можно затем по графику зависимости in( ) от t найти «/*, а также определить * s

Вышеприведенные уравнения позволяют также определить tlog. .Исходя из условия:

М(Ь, /2-1:. ) и1^^2 V

X е ^ _ - - - = (4)

путем несложных преобразований получается

«(е^^Ю^^в5 . 1)2 . , (5)

_ 1 = /Т я /Ь

ш е 186 -1-,/ ' = Л/ * (6)

Чо^хвв - (7)

где ^ показывает интервал логарифмического роста численности популяции клеток.

Сравнительный анализ параметров роста культур клеток зачастую бывает затруднен из-за разного исходного количества клеток в среде и неодинаковой концентрации в стационарной фазе. Поэтому для сравнительного анализа кривых роста нами был веден масштабирующий параметр 6, определяемый из уравнения:

^ = х -X- (8), где 8 - параметр масштабирования.

3 о

Из масштабированных кривых роста (рис.2) видно, что формы кинетических кривых у культур клеток сортов Безостая I, Арнянка 60 и Ахтамар практически не отличаются, а кинетическая кривая сорта Наири 40 является достаточно пологой, что указывает на общую низкую скорость роста численности популяции.

Дополнительный интерес вызывает сравнение точек 'ье0 (времени, при котором рост популяции достигает своего половинного значения) и параметра ^с^+^ае» показывающего долю клеточной популяции, растущей в логарифмической фазе.

Анализ таблицы I показывает, что максимальным сходством по числу параметров выделяются клеточные куль-

туры сортов Безостоя I и Ахтамар.

Время, ч

Рис.2. Масштабированные кривые роста клеточных культур пшениц сортов Безостая I ( о-—о ), Наири 40 ( •-• ), Армянка 60 ( о—о ), Ахтамар ( ©-в ).

Таблица I

Параметры роста культуры клеток различных сортов пшеницы

Безостая I Наири 40 Армянка 60 Ахтамар

!1а6 ** 8,71 14,43 9,18 8,03

2,01 1,43 4,07 2,62 2,94 1,73 12,30 1,28

с/1 1оБ 0,485+0,008 0,264+0,012 0,400+0,030 0,535+0,016

4,566 4,900 5,376 5,280

8,20 13,30 8,26 7,61

В-10 7,0 6,8 8,0 7,0

9Чов+ЧаБ 0,750 0,607 0,664 0,540

- 13 -

Клеточная культура сорта Армянка 60 в свою очередь параметром К и 9q ^ lag похожа на клеточные культуры сортов Ахта-мар и Безостая I, соответственно.

Сходные результаты получаются при сравнении кривых утилизации сахарозы клеточными культурами.

3. Морфоцитологическое исследование суспензионных культур клеток пшеницы

Одним из критериев контроля способности клеточных культур к длительному пассированию является сохранность ее морфоцитоло-гических параметров.

На рис.3 приведены изменения значений объема и площадей клеток и ядер суспензионных культур Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамар, соответственно. Полученные результаты можно разделить на две группы. Пшеницы первой группы (Безостая I и Наири 40), (рис.За,б) характеризуются достаточно большим инкубационным периодом с последующим ростом величин объемов и площадей, превышающим исходное значение. Это можно объяснить медленной адаптацией данных сортов при переходе от каллусной культуры к суспензионной. Для сортов Армянка 60 и Ахтамар (рис.Зв.г) характерно наличие . краткого адаптационного периода, достижения максимальных значений площадей и объемов на третий-пятый день пассирования, с последующим падением вышеуказанных параметров до уровня контроля на 7-й день.

Сравнение величин ядерно-плазменных отношений показало, что у первой группы (сорта Безостая I и Наири 40) на первом этапе роста (1-4 день) наблюдается значительное падение величин ядерно-плазменных отношений площадей и объемов (рис.4а,б). На втором этапе наблюдается значительная возрастания этих параметров и ядерно-плазменные отношения практически достигают своих исходных значений.

Иная картина наблюдается у сортов Армянка 60 и Ахтамар (рис. 4в,г). Здесь на первом этапе (1-4 день) наблюдается значительное возрастание ядерно-плазменных отношений. В дальнейшем эти отношения уменьшаются и опять практически достигают своих исходных величин.

Рис.3. Динамика изменений площадей и объемов ядер и клеток

суспензионных культур клеток пшеницы сортов Безостая I (а), Наири 40 (б), Армянка 60 (в) и Ахтамар (г).

Время,сутки

Рис.4. Динамика изменений ядерно-плазменных отношений площадей ( •-• ) и объемов ( о-о ) клеток суспензионных

культур пшениц сортов Безостая I (а), Наири 40 (б), Армянка 60 (в) и Ахтамар (г).

к - данные на четвертый и шестой день пассирования, после пересева.

4. Исследование транспорта гиббереллина Ад в клетки суспензионных культур некоторых сортов пшеницы

В таблице 2 приведены данные по связывающей способности гиббереллина Ад клеточными культурами, полученными из сортов пшеницы Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамар, в присутствии различных концентраций гормона в среде.

Как видно из таблицы 2 во всех клеточных культурах наблюдается тенденция к насыщению связывающей способности, что косвенным образом указывает на наличие ограниченного числа связывающих сайтов.

Таблица 2

Связывание ГКд клетками суспензионных культур различных сортов пшеницы в зависимости от концентрации гиббереллина

Концентрация ГКд в растворе в М 7,7-10"^ I,67'I0~V 1,067-IO"6 I.007-I0"5 1,00-Ю-4

Безостая I

в-ю10 0,477 0,566 0,655 0,670 0,674

i/в-га"10 2,094 1,766 1,528 1,489 1,485

B/F'IO6 619,870 339,160 61,330 6,670 0,674

B-IO10 - Наири 40

0,326 0,423 0,551 0,585 0,589

I/B-IO-10 3,068 2,363 1,814 1,709 1,700

B/F-IO6 423,247 253,413 51,678 5,846 0,589

B-IO10 Армянка < 60

0,458 0,545 0,633 0,650 0,653

I/B-IO"10 2,185 1,833 1,579 1,537 1,532

B/F'IO6 594,800 326,950. 59,325 6,465 0,653

B-IO10 Ахтамар

0,535 0,643 0,750 0,773 0,776

I/B-IO"10 1,871 1,555 1,333 1,293 1,290

B/F'IO6 694,156 385,030 70,291 7,678 0,776

где В - количество связанного 14С-ГКд, F - концентрация ГКд в М.

Для более подробного анализа полученных результатов нами было использовано преобразование Скетчарда (Keith et ai., 1982), позволяющее с большой точностью оцределять параметры связывания

биологически активных соединений с лигандами различной природы. Из уравнения Скетчарда:

в _ п__в_

р ~ кБ ~ кс

видно, что пересечение графика зависимости | от в с осью в можно получить значения числа гиббереллин-связывага-щих участков (п).

Графики преобразования Скетчарда для всех исследованных культур приведены на рисунке 5.

Рис.5. График преобразования Скетчарда конкурентного связывания

*4С-ГКд с ГК3 в клеточных культурах. Безостая I (о-э ),

Паири 40 ( •-• ), Армянка 60 ( о-о ), Ахтамар (о-е).

Как видно из рисунка, значение п для клеточных культур различных сортов пшеницы отличаются друг от друга и равны для сортов Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамар - 6,74 нМ, 5,89 нМ, 6,53 н,'Л, 7,76 нМ, соответственно.

Подставляя значение п в уравнения Скетчарда, можно опреде лить константу диссоциации (кв) гиббереллина Ад. Расчеты показывают, что KD гиббереллина Ад для клеточных культур сортов Безостая I, Наири 40, Армянка 60 и Ахтамар равны 0,429+0,069 нМ, 0,674+0,039 нМ, 0,321+0,013 нМ, 0,355+0,012 нМ, соответственно.

Интересно, что значение KD гиббереллина Ад для сорта Безостая I, полученное на прорастающих зародышах (Вардапетян и др., 1991), хорошо согласуется с результатами, полученными на клеточных культурах и равны 0,357+0,011 нМ и 0,429+0,069 нМ, соответственно.

Из полученных результатов следует, что различные сорта проявляют неодинаковое сродство и обладают различным числом гиббе-реллин-связываицих рецепторов. Эта разница может достигать значительных величин и среди исследуемых наш сортов цревышает до 2-х раз (см. на пр. Наири 40 и Ахтамар).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие исследований по культуре тканей и клеток растений требует новых методических подходов и разработок. По мере увеличения числа видов растений, тканей и клеток, выращиваемых в культуре in vitro, совершенствования техники их выращивания и методов исследования их жизнедеятельности, становилось все более понятным, что мы имеем дело не цросто с еще одним методом физиологии растений, а с появлением новой экспериментальной биологической системой - культив1фуемыми клетками высшего многоклеточного организма.

Исходя из вышеизложенного, при проведении аналогичных исследований, изначально необходимо определение сохранности регенера-ционных способностей клеточных культур. Проведенные нами эксперименты показали, что суспензионные культуры клеток всех исследованных сортов пшеницы, сохраняют свои морфогенетические потенции на всех этапах пассирования. При этом необходимо отметить, что включение регенерационных программ приводит к образованию как "зеленого", так и "бесцветного" гетерогенных каллусов (Shimada and. jamada, 1979; Nabors et al., 1982). Дальнейшая интенсивность роста гетерогенных каллусов зависит как от концентрации, так и от соотношения концентраций исследованных фитогормонов.

Конечной целью изучения кинетики клеточного роста является математическое количественное описание влияния генетической при-

роды организма и сроды на скорости процессов, осуществляющихся в популяции этих организмов. В настоящее время имеется ряд частных моделей, одни из которых учитывают незначительные генетические изменения, другие - небольшие отклонения в составе среды, а третьи - описывают гетерогенность клеток культуры (Бейли, Оллис, 1989).

В проведенных до настоящего времени исследованиях обычно постулировалась сохранность длительности митотического цикла в процессе образования клеточных суспензионных культур.

Анализ кинетических кривых роста показал, что в процессе формирования суспензионных клеточных культур происходит резкое изменение длительности циклов клеточного деления. Если в норме длительность митотического цикла практически для всех злаков составляет около 24 час, то после перехода в суспензионную клеточную культуру наблюдается резкое падение длительности клеточного цикла для всех исследованных сортов, вообще, однако в разной степени. Так, параметр td для сорта Ахтамар составляет всего 1,3 часа, а для сорта Наири 40-2,6 часа (табл.1). Дисперсия в значениях td вероятно, обусловлена генетическими особенностями исследованных сортов. Большая дисперсия наблюдается также в-длительности lag фазы, показывающей адаптационные способности отдельных сортов. Однако, полный анализ особенностей роста суспензионных культур клеток можно проводить только с использованием всех предложенных параметров клеточного роста (табл.1). Необходимо отметить, что параметры роста клеточных популяций у генетически родственных сортов практически полностью совпадают.

Исследование суспензионных культур клеток не может считаться полным без исследования морфоцитологических параметров. Как показали наши результаты, ядерно-плазменные отношения существенно изменяются в процессе пассирования (рис.4). Необходимо отметить, что у разных сортов наблвдаются существенные отличия в динамике изменения как площадей и объемов ядер и клеток, так и ядерно-плазменных отношений.

Наряду с индивидуальными особенностями, в динамике изменений морфоцитологических параметров у различных сортов наблюдаются общие тенденции. У всех исследованных сортов в первые 3-4 дня пассирования, в период интенсивного роста и размножения клеток, наблюдаются существенные отклонения морфоцитологических параметров от исходных значений. В последующие дни после стабилизации роста

культур клеток, эти параметры приближаются к исходным значениям, что характеризует адаптацию клеток к размножению в условиях пассирования. После завершения процесса адаптации при последующих пассированиях, существенные изменения морфоцитологических параметров не наблвдается.

Как наш было показано, присутствие фитогормонов в инкубационной среде существенно влияет как на процесс каллусообразова-ния, так и тешах роста "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов. В связи с этим, представлялось интересным исследование чувствительности клеток к фитогормонам в цроцессе образования суспензионных культур на примере гиббереллина. Целью данных экспериментов было исследование изменения гормонального статуса клеток пшеницы в процессе адаптации и условиям культивирования суспензионных культур, с одной стороны, и сравнительный анализ гор-мон-связыващей способности различных сортов, с другой.

Результаты экспериментов показали, что в зависимости от концентрации гиббереллина в среде все исследованные культуры показывают тенденцию к насыщению (табл.2), что указывает на наличие ограниченного числа гормон-связывавдих сайтов в клетках суспензионных культур.

Для более детального анализа параметров связывания были использованы преобразования Скетчарда (Stoddart and Venia, 1980). Как видно из рис.5, число гиббереллин-связывающих участков (п) у различных сортов неодинаково. Наибольшее отличие по исследованным параметрам выявляются у сорта Наири 40, который отличается от других сортов не только генетическими предшественниками, но и параметрами роста (рис.2).

По своему сродству к гиббереллину исследованные сорта располагаются в следующей последовательности: Армянка 60 >'Ахтамар > Безостая I » Наири 40. Необходимо отметить также хорошую корреляцию между величинами kd, полученными для белков цитозоля прорастающих семян (Вардалетян и др., 19906, 1991) и суспензионных культур сорта Безостая I и равных 0,357+0,011 нМ и 0,429+0,069 нМ, соответственно. Эти данные указывают на то, что гормональная чувствительность клеток в процессе образования суспензионных культур практически не меняется.

Таким образом, из наших результатов следует, что при подборе исходного материала для культивирования и соматической гибридизации необходимо всестороннее исследование донорных сортов для

подбора наиболее оптимальных условий роста и прогнозирования особенностей, полученных гибридом.

ВЫВОДЫ

1. В процессе длительного пассирования суспензионные культуры клеток различных сортов пшеницы сохраняют свои морфогенетичес-кие потенции, что позволяет их использовать в качестве генетического материала для культивирования в биореакторах и соматической гибридизации с целью получения новых гибридом.

2. Показано, что регенерационная способность гетерогенных каллусов суспензионных культур исследованных сортов зависит как от концентрации, так и соотношения основных фитогормонов в среде.

3. Выявлено, что параметры роста клеток в суспензионных культурах подчиняются закономерностям, характерным для роста прокарио-тических популяций.

4. Предложена система комплексного математического анализа для характеризации роста клеточных культур в суспензии и позволяющая характеризовать, идентифицировать и проводить сравнительный анализ особенностей роста отдельных сортов.

5. Обнаружено, что основные морфоцитологические характеристики в процессе образования суспензионных культур существенно изменяются, а после адаптации, в стационарной фазе роста, достигают своих исходных величин.

6. Впервые показано, что в процессе образования суспензионных культур сродство клеток к гиббереллину, а также к0 и число гормон-связывающих сайтов (п) практически не меняются и могут служить в качестве дополнительного параметра для характеризации индивидуальных особенностей каждого сорта.

7. Показано, что для культивирования в биореакторах и использования в качестве исходного материала для соматической гибридизации необходимо учитывать не только индивидуальные и генетические особенности сортов, но также способность культур к размножению и их чувствительность к фитогормонам.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

I. Вардапетян P.P., Киракосян А.Б., Паносян Г.А., Арутюнян P.M., Мартиросян К.Ю. Динамика изменений морфоцитологических характеристик суспензионных культур клеток некоторых сортов пшеницы. "Ученые записки" ЕГУ, 1992, J& 2.

2. Вардапетян P.P., Киракосян A.B., Тираиуян С.Г., Паносян Г.А. Параметры роста клеточных культур некоторых сортов пшенивд. "Ученые записки" ЕГУ, 1993, № I.

3. Вардапетян P.P., Киракосян A.B., Тираиуян С.Г., Паносян Г.А. Исследование транспорта гиббереллина Ад в клетки суспензионных культур некоторых сортов пшеницы. Биологические науки, 1993,

A-. Vartapêtian H.R., Kirakossian A.B., Haroutiounian R.M., Mnrtirossian K.Yu., Tchartchoglian A.G. Etude morphocitologique des cellules suspensiaires de quelques sortes de blés. C. r. Acad. agr. France, 1993, en presse.

5. Vartapêtian H.R., Kirakossian A.B., Tiratsouyan S.G., Haroutiounian R.M. Etude comparative de l'aptitude à la croissance des culture cellulaires de différentes sortes de blés. C. r. Acad. a^r. France, 1993, en presse.

№ 3