Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование культуры клеток тканей для изучения взаимодействия растение-фитопатоген-биопрепарат

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование культуры клеток тканей для изучения взаимодействия растение-фитопатоген-биопрепарат"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

л п

На ирамах рукописи

ДЖАКИБАЕВА Гульнар Тураровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ТКАНЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РАСТЕНИЕ -ФИТОПАТОГЕН - БИОПРЕПАРАТ

03.00.07 — микробиология

А II г о р с ф с р а г

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АЛ МАТЫ - 1995

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии HAH PK-

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

— академик КазАСХН, д. б. и., профессор К. А. ТУЛЕМИСОВА,

— кандидат биологических наук, Л. П. МАМОНОВА

— доктор биологических наук., профессор Е.Т. НИКИТИНА

— кандидат биологических наук Н. БЕЙШИМБАЕВА

— Казахский научно-исследовательский институт картофельного и овощного хозяйства КазАСХН

Защита диссертации состоится « »_ 1995 г.

в __ часов на заседании специализированного совета Д 53.24.01 при

Институте микробиологии и вирусологии HAH PK по адресу: 480100, Алматы, ул. Богенбай батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии HAH PK,

Автореферат разослан «

.1995 г.

»

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

H.A. АИТХОЖИНА

_ Т -

введение . •

Актуальность проблемы ■ Углубление энаниИ биологии культивируемых растительны/, клеток необходимо для дальнейшего прогресса разработке принципиально новых, перспективных для практики технология. Культивируемые клетки растений являются новой зкопаримен-

?г.льис созданной биологической нсделч», котором ипищ.о и.'.чо'.ьау«'»»:* ь уумличемтарьннх исследодоннях для имения взнимост'«ик"»ш;1 лмчних биологических объектов (Бутевко, 1991; Рахнмбяев, 1992,1993;

шишиппп . I иг* ' -

»даги»'.', ".тс1 ргзличкнх ткацен, органон, срга:г,;:моп

Функционируют в л,п \risro в специфические метаболических усдоиичх. Поэтому з каждом конкретном случае необходим подбор питательной среды я условия, обеспечивающих создание полноценней биологнчес-кой системы. Для большинства исследователей получение и культиви-^ рование каллусних тканей на искусственных питательных средах считается необходимым звеном исследования.

Основным типом кугьткт'руе»«?;! рпстительноЯ клетки является

•гг.т.тг:,--г. г.. :>ггуг:;;:;: ■■ ^. : ц'и ::ол учччп о ¡-ч.ч;ч:: :,;чч\.

Сн.чюоч-чугь >-' И!,;:!,,

Лсч чпчётчч!::; г. м:::. .'■ "и-. ч; с_, ч :г, л:;и;<оч нндит^.'.дуо,:!. ноегчмн.

качеств мчее/п-чои .:

культуры клеток. Метод суспензионного культивирования прявлг;; с ч "" л е :! / гги ? (рч-ч";ч ч • с >-• -<.■ -. " . г

г-гс. чр ч ;:л ; ?: ч - ;-- •

ток. В настоящее время этот метод утгердил себя в производстве ферментов и других продуктов жизнедеятельности микробных клеток.

Из литературы .гзлестно, что'подобнее системы кз р&еютедъных о&ъектов исследователя»! донги ме удеза.-ч-сь р.е/уч.т-. Оки лч поля«-'"» намного позднее, ч«ч ку.*ьтугы клеток падете.* б'ртл!1«, 19И9; Конки, 199?). " "

Однако, исследований в области изучения вза.«исде«ст:>ия ¡■'.е-теиия с фитог.атогенсм ¿4 биопрепаратом на куяьтуро клагок ке приводилось. Сведения ой использовании метода культуры растительных

ПИН Ч../Л/ОИ ч ЧичИ;!/ ' .'/ !!!• ! .'.I'

>'ч; ■"ччч.; :, чо.ччч.чч 1т^ ч .. • ■ 1I ч-ч . , И ■•':•].-л * у;-, ¡'.'ч ■>;".'-■

у.; гонч-1.4- чч чл 'ч^чч, ч:ч.ч. ,ч-1 -

мч'-'л гзис! нччеччмй п 1л Ч'Чт,».--: рич'.-'" М'.чч

клеток для изучения механизма действия микроорганизма-возбудителя заболевания растения и микроорганизма в основе биопрепарата против возбудителя в доступной нам литературе отсутствуют.

Целесообразно проводить такие исследования при разработке биологически?; методов борьбы с болезнями растений, понять его сущность и потенциальные возможности применения биологических средств зашиты растений, разработать новые подходы к изучению проблемы взаимодействия растения и патогена.

Целью наших исследований явилось выявление возможности исполь-

зования культуры клеток высших растении в качестве модели для изу-, чения механизма взаимодействия клеток растения-патогена-биопрепа-ратп. Для достижения отой цели были поставлены следующие задачи:

1) Получение культуры ткани из пшеницы и картофеля, которые наиболее часто поражаются различными патогенами.

2) Изучение влияния фитогормонов на индукцию каллусогенеза в культуре тканей картофеля.

3) Отработать методы получения инфицированных тканей и методы заражения каллуса патогенными грибами.

4) Выявление закономерностей роста каллуса и фитопатогенного гриба.

5) Выявление изменений каллуса под влиянием биопрепаратов (антибиотиков).

6) Выявление возможности применения каллусной ткани кш: модели изучения взаимоотноиений между клетками растений, фитопатогенов и микроорганизмов в составе биопрепарата.

Научная новизна и практическая ценность.Впервые показана возможность использования культуры клеток выспих растений в качестве модели для изучения механизма взаимодействия клеток растения-патогена-биопрепарата с целью получения оздоровленного материала от пораженных грибными болезнями растений. Впервые из каллуса, полученного из листовой части картофеля был выделен гриб „, ,виды котооого известны как возбудители забо-

леваняй растений (огурцов, хлопчатника, кукурузы, ячменя и т.д.). Гриб стойко сохранялся во всех пассажах, не оказывал ингибирую-цего влияния на рост каллуса. Он не является патогеном для испытанных нами сортов картофеля, не проникает внутрь клеток, ко образует межклеточный мицелий. Изучена биологическая активность гриба, установлена его способность синтеза эргоалкалоидов, подобных оргометрину, эрготамину, фестуклаэину. Выявлена оптимальная

среда для их выделения - среда .Бэкона.

Пречлсжеки оптимальнее по горонбльиону составу iiüiктильиие

I , МИДуГИруг ТИ- I' а." Л V О1 '-'И ■'' на ЛИ"Т1,!-ЧХ И ОT<:С 1 >-X 'i;iai! i U.-

прпбнгочнцх раото^ир ча:то'ели. Такими

'КЕаМИ Я ¡'ЛЯ')ТСЯ с:

н

J '

СИГ-." 11

г !,'

ю С ,1-1 мг/х кш.етина и I—10 мг/л 2,4 дихлср-

фепйк^иуксуеной кислоты. Установлено, что антибиотики I6IÖ-3l)b и

синости от концентрации и длительности их зоздойстрпл. Наяболь^;'П

нилиии! илипиъин ПШ1Л<Г1;Ш]Л ТНЛН11 V ИПГГНИПН нямяппппгп птм* »пшшии-

пи.,-, - / ,„.4,и,, - г «!-.:■,■!«."., с.успенгно:!

ной культуры - 0,1-0,5 мкг/мл - антибиотика А/23.

Выделенный из каллуса картофеля гсиб с1а<юсрогХи«п ар обладаюций ни с о ко Л биологпческс!'. актиьнэстьп представляет интерес как возможный продуцент биологически активных веществ для защиты растений. Разработан метод получения инфицированной ткани путём введения микроорганизмов в культуру клеток растения при их совместном культивировании. Установлено, что различные сггчтш грибов роде

' р ■г и hü j' л го ,l!i i'OPO ri -

iiujiunonviü лЫписимкс hq i'l'y.

- возможность использования KVJIbTVnii «fTOK iwfllliiv пялтрииа Й

ч г;-." i<o':•'.>'. ,• Г •>. • -и ; i.^'K:- ;аот<:;;лЛ и f и f.i-ü оргеи п.- шмн-

- Выявление нлиячия фптогормонов на индукцию г.аллучогенеза культуры клеток ткани и антибиотиков на рост и развитие культуры клеток каллуса и их взаимодействие с клетками растений.

- Оиб«от.Пб:ские отн»-чв><<!я каллуса и грибе. Clmlo^porium вр.,вцег> b:i? .¡.алеаного из катлусноЯ ткопи картофеля, облпцвоцего высокой биологической ект.«»ность»' и представляющего интерес как продуиен? эргоалкалоидов.

Апробация.Результаты исследований долскени на конференции молодых ученых Казахстана (Алматы,19Э[), на II Международной конфе-

рр.нции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алмати, Т993).

Публикация.По материалам диссертации опубликавано 't работы.

. Структура и объёи работы. Диссертация состоит из введения, об sopa литературы, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы О. источника на русском языке, на иностранных). Она включает ' страниц машинописного текста, таблиц.

овьЕкта а методы исследования

Объектами исследования :-сл^или каллусная ткань и суспензионная кyльтypа¡ полученные из зародыша пшеницы сорта "Краснодарская-23" и листовой пластинки картофеля сорта "Невский".

Культуру клеток растений выращивали на среде Мурпскге-Скуга.

Микроскопические наблюдения проводили в световом микроскопе " Joljvnr " с применением интерфереционного контраста по Номарс-кому.

Для выявления роли фигогориоиов ка индукцию коллусогенеза в культуре ткане!! картофеля использовали различны? сочетания о разными концентрациями 2,4 дихлорфеноксиуксусноП кислот« (1,3,5,6, 10 кг/л) и кинетика (0,1; 0,5; I; 2; 3; 4 мг/л).

При изучении влияния антибиотиков на рост каллусиоР. культуры картофеля и пшеницы использовали антрациклиновиЯ антибиотик If18— 306' и полиеноЕЫй антибиотик А/23, полученные в Институте микробиологии и вирусологии ПАИ PK (Тулемисова и др.,1931). Антибиотики испытывались в следующих концентрациях: 200; 100; 10; 5; 2; I и 0,5 мкг/мл.

В качестве тест-микроорганизмов использовали музейные культура из коллекции Института микробиологии и вирусологии HAH FK:

Puaariun uol.Tnij 112o Alternaría alternstn; 1 573 ЕеtryLia cir.'vrir ;

144£ üolninthosporiun; }35 i'.ízooto^ia solnni; 4Ct 3iicilib uubiiiic';

1247 ¿.'tv/íria cr.rr trwcrix:; nrichode;-ina lí¿nc-ra~>.

Идентификации гриба ciadouporiun эр., проводили по определителю Пйдопличко Н.М. (1977).

О токсических свойствах культуры cinuocivoriur. судили

rio приросту корня и стебля тест-растений. 3 качестве тест-растений испытывали пшеницу сорта "Мироновская"; о гурии сорт "Неженс-

kiifî"; редис сорт "ЕаЯлахаискиЯ"; кукурузу сорт "СахарниЯ".

Антпгонистические сьоПотва гриба ciauôBpofiua зр,проверяли методом агатовых блоков О'горов, l'.'OG).

Компонентный состав биологически активных вещестя определяли методой тонкослойно!! хроматографии о использованием ьгиср-.-плённых едоёи сяликогеля С jiiuibl -20*|,ЧСС°). Рпздедешше зоны оонару-довали в виде поглодычлх под * светом пятен и после окрьчшьания репктином i рагендор^а и .'¡iîi-j pxa. '

Результата подвергали математической обработке. Для оценки

ПА Л V П W« ¿1 li 1J fl l'inu Л nu »->.•«•..«<» л Лк^-и ляпкм ал » » — •»"» "" — -- — —..

• • ' * ...... .............1--------------

лпл'вм'зовл^иип vnnitianKil » тгпна и то < |intri«tj Ut-Ji l »

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение каллусноП ткани пиеници.

Для получения каллусной ткани ни использовали семена пшеницы сорта "Краснодарская-23".Процесс получения первичного каллуса требует строго стерильных условий, поэтому наиболее трудной задачей янлчете.я пояучение атчи* я ^опп растительного материала.

Д:. 1 п о i! г- :, v. : i> ■ ; т и о Л стерилизации оимя.н пшеницы применяла л" <" ]> .".т. г" .v .лили , .'-ичленлла зд родни н почесали агарн--,■/-,-.- ■••ь.-yv Ор- 4J , ; ;1Т0к0рмени дли инлулаан

-.ь зеваки агар;;эоьанные пнтат ¡9?

'у, l'i^: OOrU-lHIiMil КиаПОНсиаЛ:-! il д/гч

} .h-.'í .. ,:w. «.гея нимердяьнис соли (.макро- к микроэлемента,;,

■i ;точ i..' у г ''Г-^о " (сахаре ?л) . ьитамини и регуллто;а р',

■¡а. ' :;;;:!'ih;!e кллл^а проводили ъ темноте пр.; температуре 2... 'С . и подсль ¡эксплантат оо"р«зовивал первичннп каллус, который

С V¿K v Л ЬТИ ЛИ ГС Р.аЛС Я . Т . íl-nfí ПРИППИ nr. w нл r.TiPUfVifi гнл т f^ т*>п t- чу '£r>Gt>i't

IK , ; a:..: -и-.аЯ . i 'К: С Л 1 .'.¡1: СГ.айсОС!', í I р Ü ДО а |) j| ;¡ М ,

'- ■ сл ачСay~. iía-'-у ÍÍU Ci.^w^ejiuíiitOr» •

тури: рыхлая, легко распадающаяся на отдельные клетки, цвет каллусной массы - от белого до.«елтоватого. Время выращивания меялу пеоесадками зля пробирочной культура колебалось от 20 до 60 дней , для культур и колбах - от 3D до 90 дней.

При получении кал куса картофеля .использовали дисюзуя часть растения. Для стерилизации листовой пластинки картофеля сорта "Невский" применяли Ü,Í~jl растьор сулемы. Выращивание кадлусп картофеля проводили в.тех же условиях, что и каллус пшеницы.

Таким образом, нами был получен каллус пшеницы и картофеля, который использовался в дальнейших исследованиях, i

Получение суспензионной культуры и.з каллуснои ткани пшеницы.

Для получения суспензионной культур« нами использовалась кал-лусиая ткань, полученная из зародим семян пагнкци сорта "Красно-дс.рская-23". Кусочки сьсхеП массы каллусной ткани размером 2-5 г. помещали в ICO мл жидкой питательной среди того кс состава, который использовался для выращивания каллуса. Культивирование проводили в закрытых колбах при постоянном встряхивании в условиях качалки. Объём суспензии составлял I/I0-I/I5 часть объёма колбы, что обеспечивало необходимую аэрацию.

3 первые дни культивирования наблюдалось пожелтение суспензии, которое связано с гибелью части клеток, повреждённых во время переноса ткани или не способных выжить в данных условиях. На седьмые сутки происходило осветлен;!'-' суспензия за счёт интенсивного деления отдельных клеток. Через 3-4 недели на стенка;: колб образовывался ободок из светлых клеток, что свидетельствовало о достижении необходимой плотности клеток в среде и, o возможности её дальнейшей пересадки.

Кнэнеспособность суспензии определяли по соотношений живых и мертвых клеток, путём окрааизания их С,IX раствором иеткленэпого синего и микроскопирования.

Микроскопическое изучение динамики роста и развития суспензионной культура дало' следующуо карткчу. Через сутки обнаруживаются одиночные клетки. 3 клетках ямептся все характерные для них структурные элементы: ядро, ядрышки, вакуоли и т.д. О тон, что клетки живые, свидетельствует сохранившееся в них движение цитоплазмы, lia вторые сутки происходит деление- клеток. Увеличивается их число. Клетки делятся перегородками на много мелких, й результате митоза в катках обнаружено по 2 ядра. ¡!¿ четвертые сутки отдельные клетки образуют агрегаты. Клеточные стенки утолщены. В некоторых клетках обнаруживается наличие пигмента. На седьмые сутки обнаруживается старые клетки. Содержимое клеток отходит о.т стенок. Идёт плазмолиз. Не во всех клетках обнаруживается структурные компоненты.

Закнычи характеристиками полученных линий является высокая степень дезинтеграции, морфологическая внравненность клеток, от-

сутстзие трахеиподобных элементов. Микроскопический анализ полученной клеточной суспензии по указанным параметрам позволяет сделать заключение, что полученная нами суспензионная культура полностью удовлетворяет требованиям к "хорошей" линии.

Влияние фитогормонов (соотношение кинетина и 2,4 Д) на индукцию каллусогенеза в культуре ткаче:! картофеля.

Основными компонентами питательной среди, регулирующими про-

пргри |гя1|Т1тптняпя ■ ппптп уаиипипц чч*вии ля1|шч<(*11 (ТпргАлпгипцц

Согласно со^ея закзнсмрнссги, отмеченной Скугом и Миллером, инициация образования каллуса происходит при соотношении 1:1 цитокининов к ауксинам. Однако взаимоотношение, вносимых в питательную среду регуляторов роста, вызывающих .формирование' каллусноя ткани, гораздо сложнее. При этом следует учитывать концентрации не только экзогенных фитогормонов, но также концентрации имеющихся в экспланте эндогенных веществ гормональной природы (Смоленская,1989).

В своих опытах для выявления роли фитогормонов на индукции кал лусогенезв в культуре ткачей картофеля использовали различные сочетания с разнили концентрациями 2,4Д и кинетина.

Культивирование фрагментов листьев на питательных среда*, ои-цедеацих относительно низкие концентрации кинетина (С,1; 0,5 и I иг/л) на фоне равных доз 2,4 Д (1;3;5; б:и 10 мг/л) вызывало формирование „тииусной ткани на значительной части эксплантов,т.е. про цент каллусогенеза был высоким и достаточно стабильным-от "72,2 до ЮС;"' (рис.1). Среднее значгние процента каллусообразования на лис-тс-^х планах било ра^но 90*. При использсганнц более высоких доз кинетина 2; 3 и 4 мг/л на фоне различных концентраций 2,4 1 наелгдклооь п..'НК5Сг1,1в частота ка.*.лусогенез& на листовых эксплам&г прог-нрчних р'-ет" 1н,1 сорта "Невский". Сбраэоьачие каллус ной ткпчи происходило на 25-100,'? фрагментов листьев. Следует отметить, что не только частота каллусогенеза в целом понижается при повышении содержания кинетина в питательной среде, но и рост каллуеной ткани также заметно ухудшается.

¡¡а основании результатов по оптимизации гормонального состшч питательной среди, индуцирующей каллусогенез в культуре ткпней картофеля сорта "Невский" мохно заключить, что относщ^льно низкие '¡концентрации кинетина на фоне разных доз 2,4 Ц вызывает интенсивный каллусогеиез на аксплантах листового и стеблезого происхождения. Средние значения процента каллусообразоЕания р г. в им 50 я

- а -

>4*00

Ч 20

о §

о

§ во

íf ¿0

С] *

/00 во го

t

-0 í

1

А

И

I

г

аЪ

1 & 5 6 JQ У 3 5 6 10 Ионцентрация 2,4ъ , мг/л

Рис. I. Влияние разных доз 2,4 Д на каллусообразование в культуре ■ тканей картофеля сорта "Невский". А-Е - кокц-ция кинетина в питательной среде: A-O.I; Б-0,5; 3-1; Г-2; Д-3; £-4 мг/л. 7/77\ - стеблевой эксплант; I I - листовой эксплант.

15% соответственно. При использовании более высоких концентраций кинетина средние значения процента каллусообразованкя равны 75 и 35..-. Повывение концентрации кинетина в питательной среде независимо от содержания 2,4 Д приводило ; к ухудиенио роста пеп?ячнсго ка.и:уса и повышению плотности каллусной ткани.

• - Таким образом, наиболее оптимальными по гормональному составу питательными средами, индуцирующими каллусогенез на листовых и стеблевых эксплантах пробирочных растений картофеля сорта "Невский" являются варианты среды Мураснге и Скуга, содержащие С,1-1 мг/л кинетина и 1-10 мг/л 2,4 Д.

Влияние различных концентрация антибиотиков на рост каллусной ткани

В гюспедние десятилетия наметились новые перспективные направления в разработке биологического метода защиты растений, связанные с использованием физиологически активных метаболитов ыикроорганиз-мсв-антагонистов и, в частности, антибиотиков. Испытание антибиотиков в этих целях началось, как только было обнаружено и доказано их угнетавшее действие на возбудителя заболевания. Следует отметить,

Ч-i'O nMTHl'mnf ИКИ Ш11пЯЯПТ ПЯПИГТПЛИН ННРПЯНП ПТЯ1Л1ЙП1РТ,ии BY nf yuuu-

чсоких веществ, и мигут быть принесены там. где последние неэффективны .

Кроме того антибиотики могут использоваться при приготовлении питательных сред для подавления плесневой флоры (Голубев и др.,1576).

Стимулирующее, иногда и ингибирупщее действие антибиотиков на рост растений установлено для многих известных антибиотиков медицинского -и немедицинского назначения.

В связи с этим нами было изучено действие антибиотиков А/23 и It'18-ЗСг,, з£$<г,:тивиых против различных возбудителей болезней pací е-кий бактериального и грибкового происхождения, на рост каллусни/ и суспензионных культур.

Результаты влияния испытанных антибиотиков на рост каллус ной ткани картофеля свидетельствует об отсутствиии увеличения накопления биомассы. Только при концентрации 5 мкг/мл отмечено превышение накопления количества биомассы в присутствии антибиотиков (табл.1).

Наибольший прирост биомассы у каллусной ткани пшеницы наблюдал-сп при концентрациях антибиотика А/23 - 5 мкг/мл и антибиотика It5I3-306 - 2 мкг/мл. Как видно из таблицы 2 прирост биомассы ткани для обоих антибиотиков отмечается начиная с концентрации I мкг/мл. Для антибиотика Л/23 стимулирующими являются концентрации 1,2,5 и 10 мкг/t а для антибиотика 1618-306 - концентрации 1,2 и 5 мкг/мл. При боль- ! аих концентрациях антибиотиков (10, 100 м200 мкг/мл 1618-306 и 100, 200 мкг/мл Л/23) реет каллусной ткани пшеницы полноетьп ингибиролал-ся.

Светесптическое изучение влияния антибиотнкоз Л/23 и 1618-30' на каллус ппечипн позволило выявить изменения происходящие в клетках кр.глусч действие« высоких концентраций. После месячного роста об:-:г;р/кенц три ^ида клеток: много мелких мертвых клеток с отстед-

Влияние антибиотиков 1618-306 и А/23 на рост каллусной ткани картофеля сорта "Невский".

конц-цни

контроль 200

100 10

5 i

I

0,5

Л/23 _

внешний вид ¡ оиомасса

1618-306

внезнйТПэид каллуса

оиомасса

светло-ксрич

светло-корич влаж.

75 59,5

на светлом фо- 74 ' 56.7

не полвл.тем-но-коричн.пятно

светло-коричн. 132 104,8

каллус темнее, ИВ 93,6 чем при больших концентрациях, но сучке 116 92,0

1Г4 90,4

окрашен от антибиотика в красно-кооичч. цвет. ,влажн. IIfi 92,0

коричн.цвет 118 93,6

светло-коричн.102 60,9

темнс-коричн. 140 111,1 сухой

120 95,2

светло-коричн. 98 77,7 cvxoii

70 55.5

глей плазмолемой; клетки с утолщенной оболочкой и крупными липиднчнп каплями; клетки, заполненные крупными вакуолями. 3 трехмесячных клетках видно отложение темного пигмента, что по литературном данным С gpeneer et а-- ,1990) является первым признаком отмирания.

Действие антибиотиков исследовали и на полученной нами суспензионной культуре клеток пшеницы, так как именно суспензионная культура свободнокивутих клеток представляет собой незаменимую модельную систему для изучения клеточно-популяционной кинетики.

- Т1 -

Влияние антибиотиков А/23 и 1610-306 на рост каллусной ткани пшеницы сорта "Краснодарская-23".

КОНЦ-ЦШ1 1 А/23 1618-306

1 , внеиний вид ! биомасса ' ! внесший вид! биомасса

• каллуса ! ! I иг " 1 г каллуса ! нг ! %

сухо!!, рпспа-' дающийся ¿1(111 11 н) чич/

200 - - - -

100 - - - -

10 52.1 130,2 - -

5 535 133,7 «15 101,2

2 109,0 хедтсго 11?*?—4(50 та.'рзслад. Т22,'5

1 1!~ет ст желтого ПЧГЛ>.0»-!Т 3 о нетло-кор /чч. 412 103,0 402 100,3

о _ ручоД■ьас гад. 362 30,5 ¡<сри)н.пве- £'¡0 та,сухой 60,0

Влияние различных концентраций антибиотиков А/23 и 1618-306 на накопление биомассы клеточной суспензии пшеницы.

конц-ция ант-ка ккг/мл 1 вес сысюй биомассы в мг/ил

! Л/23, мг !■- % ! К18-ЗС6, мг . ! Г

контроль 0.164 100 0,164 • 1СС

100 О.О&О 24,4 0,1Г2 63,3

50 0.047 28,6 0,097 59,1

ю 0,064 39.С 0,030 48,7

5 0.066 . 52 .4 0,062 37.8

2 0,104 63,4 0,175' 106,7

I 0,156 ?6,3 0,144 87,3

0,5 0,196 119,5 одзо 79,8

0,1 • 0.230 140,2 0,104 63,4

Изучение влияния антибиотикоз А/23 и 1С18-306 на накопление биомассы клеточной суспензии, показало, что вес биомассы клеточной суспензии в контроле превышает накопление биомассы с различными концентрациями антибиотиков в большинстве вариантов опыта. То есть, отмечается в основном отрицательное влияние испытанных концентраций антибиотиков на накопление биомассы клеточной суспензии пшеницы. Исключение составляет варианты с концентрацией антибиотика А/23 равные -0.1 и 0,5 мкг'/мл. В этом варианте особенно ярко .прослеживается обратно пропорциональная зависимость накопления биомассы от концентрации антибиотика.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отрицательном влиянии высоких концентрация испытанных антибиотиков на рост и развитие растительных клеток. Из этого следует, что при применении антибиотиков цля защиты растений ст различных патогенов необ-хг.димо тщательно отрабатывать их оптимальные концентрации, при кото- ' рых бзч.ет достигаться положительный эффект без ущерба для растений.

Для дсстикемия поставленной цели в качестве модели, на первом этапе исследований возможно использование растительной культуры клеток.

Изучение взаимодействия культуры ткани картофеля и мицелиальных грибов.

Для проведения исследований по изучению взаимоотношений и взаимодействия между растением-патогеном-биопрепаратом, необходимо отработать методы получения инфицированных тканей. Поэтому елздувщим

этапом наших исследований была попытка получения подобного материала.

С целью получения ассоциаций внутриклеточного типа нами пред-

ППИНЧТМ ШШМТКП впсаспии нппииии! ипп^пии и .... - . ^ГГГ^.ТЛ

при их иОМ кулЬГиЬНрОНс»п.1«.

Первая попытка инфицирования осуществлялась проведением совместного культивирования путём внесения мицелия гриба Риег.г1ии после его выращивания на соответствующей среде, в среду на которой выращивался каллус (смешанная культура). В литературе имеются ссылки на использование подобных методов для получения искусственных ассоциаций растения с микроорганизмами (Бутечко и др.,1987) для моделирования и изучения на клеточном уровне природных оимбиотических отно-п;-лд (например, бсбслых растений с клубеньковыми бактериями), имеющих большое практическое значение, для понятия механизмов возникновения и условий для формирования их заново в природе.

3 пргчесс.е микроскопического наблюдения за ростом каллуса было установлено, чтс испольгуечия р работе штаммы грибов по-разному воздействуют на рост каллуса картофеля. Некоторые из них вызывали подавление, а другие - некоторое усиление роста каллуса по сравнению с контролем. ,1 процессе роста каллуса под воздействием грибов наблюдалось изменение его окраски.

Вторая серия опытов была проведена с использованием' высева Триест- на ~пэор»ность агаризовпнкои среды рчдем с кадлусои 7а<с:ш сбра--лм, ' г,-би -¡а перло а стащи роста грибы не соприкасались о каллусом (совместная культура).. - .

Интересно отметить, что во всех'Вариантах конечный результат аналогичный предыдущей серии опытов при получении смешанной культуры. (\уи:<. ирсц*»' с происходящих изменений оказался значительно сдвину- • тым'рнол пп} Т1.н) ¡¡с времени.

Первые изменения в клетках каллуса происходят, безусловно, лсд воздействием биологически активных веществ продуцируемых грибами, которые диффундируют в среду выращивания. Скорость изменения зависит, вероятно, от количества и качества этих метаболитов и спорости их диффузии. •

Таким образом, проведённые исследования показывают, что взяячо-

действие патогенов с клетками растений носит индивидуальный характер и, вероятно, требует подбора соответствующих методов и условий для каждого конкретного случая.

Изучение взаимодействия гриба с1айоь>ро.гд.шп цр.( с каллусной тканье картофеля

В'процессе получения каллуса из листовой части картофеля сорта "Невский"'в одном из пассажей нами был получен каллус черного цвета.

* Тщательное микроскопическое изучение этого явления позволило выявить наличие гриба, имеющего тёмный пигмент. Попытки очистить ' каллус от наличия гриба путём многократных пересевов не увенчались успехом. Гриб стойко сохранялся во всех пассажах. Интересно отметить, . что гриб не оказывал ингибирупщего влияния на рост каллуса. Напротив, если интенсивный рост здорового каллуса отмечался на 8-10 день, то у поражённого каллуса он наблюдался уже на 5-7 сутки. I

Так как одной из задач наших исследований являлось заражение ! здоровых каллусных культур патогенными грибами, то полученный вариант очень заинтересовал нас. '

Опыты по проверке его патогенности показали, что выделенный гриб не является патогеном для используемого сорта картофеля.

Проведённое светооптическое изучение каллусной ткани, поражённой грибом позволило установить, что гриб не проникает внутрь клеток, образуя межклеточный мицелий. Эктофитный мицелий ветвящийся дихотомически, септированний, образует фиалиды с цепочками конидий. Кроме того, 3-7 дневный мицелий образует частые септы, стенки его утолщастся; откладывается тёмный пигмент. Попытки заражения этим грибом здорового каллуса другого сорта картофеля были-безуспешны. Ни в одном варианте поражения здорового каллуса не наблюдалось. Это может быть связано с восприимчивостью данного вида -картофеля, либо с тем, что данный вид гриба является сапрофитным.

Для проведения дальнейших исследований гриб был выделен в чис-. тую культуру и проведена его идентификация, которая позволила' оп-редеяить его родовую принадлежность - с'1ас!озрог1ип ср.

В ходе изучения выделенной культуры гриба с1п<Зо8рог1ига ер., нами было проведено определение его биологической активности (токсичность, антагонистические свойства), компонентного состава, продуцируемых ии алкалоидов, а также изучено влияние антибиотиков

»я ппл.т с. ff Wfft

L -i Q '10 "pur \ Nif, :-ф ' 1

я,.. г,, ,

контроль 149,6 t 26,1 100 134,6 - 19,7 ICO

опыт 85,5 i 7,8 57,8 81,2 t f.;k 63,9

Проростки пшеницц

контооль 127.0 ¿ 14,3 100 67,3 t 7.2 100

опыт 120,6 - 15,2 93,4 45,4 ¿ 8,6 54,3

ít p о л о стк и _о г рц о в

Кг.птрг.ль 120,5 t 14,8 ТОО ПО,5 9.3 WO

осит 11У,8 - 10,1 vC'.ö - 8,2 104,2

Проростей редиса

кочтр^ь 74,'i t 5,'! 100 'И,- -2,9 100

опыт 5-3,0-4,7 77,4 ■ "2- 2,1 95,5

1618-306 и А/23 на его рост.

Олити, проведённые на проростках кукурузы, пшеницы-, редиса и огурцов показали, что данная культура оказывает ингибирупщее действие на рост корней и стеблей, т.е. обладает токсическими свойствами в отношении изучаемых тест-растений.

Изучение антагонистических свойств гриба Cladoepo.ri.um ер., показало, что культуральная жидкость и мицелий отличаются по своей активности. Культуральная жидкость оказалась активной в отношении трех тест-культур, тогда как экстракт из мицелия подавляет рост только одной культуры - АИетпПя. аНеп^а 1120.Культуральная жидкость не проявляет ни какой активности в отношении этой культуры. Подобную закономерность можно отметить и в других вариантах (культуральная жидкость - активно, м. елий- нет).

Исследования в области изучения биосинтеза эргоалкалсидов, поиска новых соединений этого класса ведутся в течении нескольких десятков лет. Большой интерес был виззан широким спектром биологической активности эргоалкалоидов, в особенности, алкалоидов ряда лизерги-новой кислоты, классическими продуцентами которых являются грибы рода СХя'/Хсера ср., паразитирующие на различных иидах растений (Козловский и др.,1980).

В связи с тем, что гриб Слаоьро^ии ар. , так же как апухса^о является патогеном растений, вызывающим оливковую плесень хлебных злаков, поражающим семена сои, листья и корнеплоды сахарной свеклы, являющимся возбудителем гуммоза - парат огурцов, нам было интересно изучить п сравнительном плане методом ТСХ компонентный состав этих двух грибов. И зная точно состав алкалоидов, содержащихся и (ЛпуЗ.сс'-ш ¿о. .попытаться в этих ке условиях'культивирования идентифицировать соединения присутствующие в экстрактах из мицелия и культура'льисй жидкости гриба С1а<1оарог3.ига зр . Для сравнения были взяты и птамнц Тг^сЬоиепяа ■ Ищюгит ' , которые проявляет способность продуцировать биологически активные вещества - алкалоиды. При сравнении-оказалось, что в экстрактах из мицелия грибов присутствует соединения сИ, ' 1=0.15;К£г =0,8; дг^ =0,85, которые соответствуют, эргокетрину, эрготамину и фестуклавину. Компонентный состав гриба С1а<1овро?1ип «р, зависит от среды культивирования. Самый богатый компонентный состав получен-на среде Бэкона - 6 сое-цкненпа.

Изучение, влияния антибиотиков 1618-306 и А/23 на гриб

С!,»riosro»*ii,m показало, что только антибиотик Л/23 подавляет рост гриба при концентрации ТСС мкг/мл. Размер зоны подпел"чип л cp»v-НиЧ ¡! П [,'(' .ЧТО ум ' j.ix ПСЛГН 2!)-?-7 мм.

Подучтшие цтшс о гисскоЯ биологической пктчр'нооти'выделенной культуры гриба Сladoepcitrt ер г.рздставлчвт интерес inn дчльпсЛ-шего изучения с целью использования отой культу ¡а з практических

Щ'Г11< ДЛЯ ]•;-: рЧС ? ji!H,! .

ДЛч -ЧЧ Л1Ч| чч;:,; 0 « t>, •(<•> йЭа.МСД«;. ТЛ.И Кс'ЛЛучЧ ЮП ТКЧНИ И Г''йЗГ» Cladoaporiun opнеобходимо проведение более глубоких б'иохимичес-..

Виявленяо изменения п растительной.клетке под действием патогена и биопрепарата.

При проведении экспериментов для введения патогена в популяцию культивируемых клеток пшеницы использовался способ внесения клеток микроорганизмов непосредственно б суспензионную культуру (смеиан-ние культуры). Основная задача состояла в создании модельной еис- .

,'л.: :•.".••! : ~г,клеток ¡лптадая с патогсксм под

1.:ч г 1 4 1 и '41- и.ч<чоЛ |Ч»":ыутч. - ч.ч* г.чл>-' п.. к чу ., - ч • мол

ческими свойствами, наблюдается мзссоргач глчЬлЬ '.и1'-

... .-•;••- —,чт "т »«втпчняз г.тзнжа. цитоплазма ссбрепа б колен. чшчги nnn.nr.rib Л'- 1-.: . ЧЧ'Ч ,Г1 . ¡4 : .Ч.'^Ч." ',

при этом остаётся интактноЯ.

!!а плпзмолемме наблюдается отложение мелких тёмно-окрагаснких :у>:ул, ч-ст^ч:: рр»"улч плотно прил-егавт друг к чругу, образуя

?"ЛС""ноИ мнг.п., сч ■...:. ..ччлич ;:хч ч

ляет (¡ред„олс.г..->тг. ».-.гут б-.'ть тг.:мни, к'лорч'. отк.!'пнм.г>точ ¡сак звд.пнач о акция клетки на д«Лстьие гг-огчпа Ь,

;:Гл добавлении а.-тибиотикоз 1Ш-Ж л Л/23 , еЛ/пд.чяккх личной антимикробной активность«), с цель» подавления дсдстдня патогена на растительные клетки наблюдаются различия з реакции последних.

Поскольку исследуемый патоген грибного происхождения, то при применении антибиотика 1618-306, обладающего, в основном, антибактериальной активностью наблюдается кассовая гибель растительных клеток и результаты изменения в них аналогичны в опытах с действием патогена на суспензию.

Антибиотик А/23, обладающий фунгицидним действием, в испытанной концентрации, предотвращает гибель части клеток суспензии. В конгламерцтах просматривается часть живых клеток с нормальным цито-плазматическим содержимым. У некоторых - плазиолемма отходит от стенок и видны профили ядер и тонопласти вакуолей. Мёртвые клетки просматриваются как на поверхности комков, так и внутри. Это вероятно, можно объяснить или недостать ной концентрацией антибиотика пли различной реакцией клеток разного возраста на присутствие антибиотика.

Полученная информация приводит к выводу о принципиальной возможности использования подобной системы в качестве подели для изучения более глубоких изменений, происходящих в растительных метках под влиянием патогена ц биопрепарата при использовании электронно-микроскопического уровня. Это позволит пенять причини снижения или повышения эффективности при применении тех или иных биопрепаратов п,т.я борьбы с различными возбудителями болезней растений при MO_,£v.¡ровйгкы различных природных взаимоотношений. При использсва-ип;. в качестве биопрепарата живых культур микроорганизмов-антагонистов, очевидно, будут формироваться зоны смешанного роста. В этих зонах, очевидно, должны складываться особые условия, обеспечивающие, с одной стороны, изоляцию партнёров от условий среды,исходно неоптималыюП или да же неблагоприятной для их развития, с другой стороны, способствующие установлению метаболических взаимоотношений партнёров.

выводи

I, Подобраны оптимальные параметр« получения каллусной и суспензионная культуры из зьродивевой части семян пшеницы и листовой пластинки картофеля. Лзученле влияния фитогормснов на индукцию каллусоге-нр?а в культуре ткг.ней картофеля показало, что оптимальные по гор-чонаньному составу среды Нураеиге-Скуга содержат 0,1-1 мг/л кинети-hí и I-Ii, иг/я 2,Ц Д.

2. С'ТрабоТПНЧ Ч^ТОДН "0Г;Г'!»'Р':1 ■< Л'Нма; ТХан.Ч П)Т''ч рГ> С Д к м '7 НИК 1 'СО .'Та 'Л1 л кул I, ; о» ^Л^'Т^НН,! ; 1 х С С Г1!' ее '1 НС'* г V г: V-

тяпирчпчми. Устпноидено, -что разные штаммы грибов рода ГшзагХш •

го~рг,?ном.у воздействуя? но каллус - стимулируя или ингкбпруч г го рост. Крсишспозеиие патогена ь кцстки каллусе не наглодалось.

3. устнноплрны различия в вскствки антибиотике,! !' i

лг л ъ зу с мах у чадите растений, чп осразоппние каллус нсГ: <чанн порч-.-п;: и карто?еля б зависимости от концентрации и длительности и/, иоэде«ет-

ii.nimf.i4j кдпл^т.п пшшипц наблюдался прп кои- шгг/мя и лии-^ии — пш/пм.

кие .концентрации угнетали реет каллусной ткани. У суспензионной культуры - 0,1-0,5 мкг/мл - антибиотика А/23.

Впервые выявлены симбиот;гческие взаимоотношения культуры каллуса 1 картофеля и гриба С1сйсврог1ит ир . Выявлено, что в процессе пассажей гриб стойко сохраняется в культуре.ткани, сказывая стимулирующее влияние на её рост и развитие. ■ 5. Изучена биологическая активность гриба С1а<1оарог:.иш ар. > доказана его способность к си«тезу яргпалкаяоядоЕ.' подобные ?рго»етрину, .-.готам.шу. фестуклаэнну. Лтлзны его антагонистические и ростстн-улпруь.тпе свойства. Установлено, что по своей биологической актив-ости, выделенный гриб С1лсс.эрог1ш эр., представляет интерес, как возможный продуцент для использования в защите раетеннч. С. йгсрвис пскязг.нг. вознсашссть использования культуры тканей рас теин ,1 в качестве модели для изучения механизма взаимодействия растемие-»ктс.-чпогоь-биг.препарпт на премере суспензаснноЯ культуры поениин н « его патогенного гриба гиЛь.Хи^.^^.'Аи!.

Публикации по теме диссертации

- Г.?. г вакл-аа! г '.эч.г-г-т.'к ко'.аеатрсрнЯ -

тиков на рост суспензионной культуры клеток /Теаиеы ОйиЛогич. молодых ученых Казахстана.-Алма-Ата,1991. -с.32, 2. Кулдибаев М,М.,Акерхвшна Б.Л. .Лха.члбаевя Г.Т. Влияние фитогормо-

-.-л., ,-] г,-.. »'¡п;,,.;-,,'', ' Л! гостит АН. лчата, Г053. -Знп.З.'С1* ч^чгг.О« 1. ЗГжякиЙаевл ГЛ. .Мамонова Л .П., лит-никова «!.11.,Туге«а5СГЛ К.А. Изучение чзег.мсдсГ'.ствия гри^а рода С1*4сьрогИэг к: »е кпллуоасЧ тень*» •

зля ..'"Депснкровя.нные научные рьботн".-Кпэ*'осЛНТЯ.- Алкпга -Вып.Э,

-20-.

k. Дкакибиева Г.Т., Мамонова Л.П., Тулемисова К.А. Влияние различных концентраций антибиотиков на рост каллусной ткани./"Депонированные научные работы".-КазГосИНТИ.-АлматыДЗЭЗ^ып.З,-с.

Дуакибаева Гу.м^а? Тураркызы

"Торил ес1нд1Лвр н&батышц есшдгтердп; 6ip-6ipiHa-фито-зо.рд*-птчлыц-6иопрвпар»-т-арн,нпы пайдалицуын зерттэу"

¡Кумистыц иаксате ееЫдгк тори«. ос^ндтларЪиц. подели рю-пнде -еопуйк-зардаптылык-биопрепарьт-иехнизьщ:^ эсорлн зерттеу.

Ньллусты^ жэне кузтндт ториал^р осгидтсхн бидай иен картоптан оп*ии«одац п*рлгатр шамаивн лйыру «нынталдо.

Тора;* аеЬдослц куклалн цоздиргии гуырумен зациыдащу себеб' зар-«r«uyji. Алгч.щн рет тзрша к«шлу№ картоп кдне сацыр*у г^'л-и;

Зартталгзн Сйцура.у цулац ciadosporiua sp., биологиялы^ naciefi swrun*ii ос!цд}к цоргау ymin паЯдаяы продуцент Оолып табылады.

■ Dzhakibaeva Gulnar i'urarosria

" The usage 'of the culture of tissue cells for investigation of the plajit-phytopatliogen-biosubstRn^e interaction™.

Tha aim of the present, work is to use the culture; of tissue cells ea tk »ortsl for the study of the interaction between в plant, pathogen '¡»id "bicsubetance. She optimal parameters for obtaining the callus ала Bunpeusion culture from wheat and potato.

■The methods of obtaining of the infected tissues have been worked

OVt .

for the first tiite there haa been investigated and studied the <3u»l culture of the potato callus and its interactions with the fungus ClKdct.foriun sp.

It has Veen «stalolishsd that the extracted fungus Clcdosporius sp. Див te> it? tdologj c«l activity, iscf scientific interest яа a possible preparer to Ъе used is -plant protection.