Особенности взаимодействия Bacillus atrophaeus B-9918 с растениями и фитопатогенными грибами

Коряжкина, Мария Федоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности взаимодействия Bacillus atrophaeus B-9918 с растениями и фитопатогенными грибами
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия Bacillus atrophaeus B-9918 с растениями и фитопатогенными грибами"

На правах рукописи

Коряжкина Мария Федоровна

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BACILLUS ATROPHAEVS В - 9918 С РАСТЕНИЯМИ И ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2012

005011000

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Дзержинская Ирина Станиславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Карпуиина Лидия Владимировна

доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Пушкин)

Защита состоится «14» марта 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ

и на сайте ИБФРМ РАН:

http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан «Ы» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор В Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют широкое распространение в биосфере, входят в состав сапротрофов и занимают различные экологические ниши в почвенных и водных экосистемах, однако по своей совокупной биомассе превалируют в почвенном покрове (Vargas-Ayala et al., 2000; McSpadden Gardener, 2004; Мелентьев, 2007; Современная микробиология..., 2009).

Представители рода Bacillus способны заселять ризосферу и ризоплану растений, используя питательные вещества, продуцируемые растениями в виде корневых экзометаболитов. Они могут также синтезировать необходимые для растений биоконтрольные вещества, фитогормоны и витамины (Martin et al., 1987; Foldes et al., 2000; Мелентьев, 2007; Idris et al., 2007; Ortíz-Castro et al., 2008; Ahmed, Hasnain, 2010; Chen et al., 2010). Все вышеперечисленные свойства позволяют отнести их, наряду с ризобиями, псевдомонадами и микоризными грибами к группе PGPR (Schippers, 1992).

Бациллы участвуют во всех формах взаимоотношений с растениями: могут являться возбудителями заболеваний (Hosford, 1982; Пересыпкин, 1989; George N. Agrios, 2005); способствовать устойчивому росту и развитию растения; защищать растение от фитопатогенов (Nielsen, Sorensen, 1997; Широков и др., 2002; Harsh et al., 2004; Мелентьев, 2007; Чеботарь, 2007; Halalisani Gumede, 2008; Saharan, Nehra, 2011).

На природном явлении антагонизма микроорганизмов по отношению к фитопатогенам основан микробиологический способ защиты растений от болезней, который является одним из самых перспективных в связи с эго эффективностью и экологичностью.

На протяжении последних двадцати лет рядом исследователей (Filippi, 1987; Kim et al., 1997; Кузьмина, 1998; Новикова, 2004; Мелентьев, 2007; Gacitúa et al., 2009; Patent US № 8025875, 2009) проводится работа по поиску бациллярных штаммов для создания эффективных биопрепаратов и средств защиты растений. Такие препараты перспективны, так как штаммы, входящие в их состав, продуцируют Б AB, гормоны и витамины, а также обладают пластичным метаболизмом и смешанной жизненной стратегией, сочетающей элементы r-, L- и К- стратегов (Новикова, 2005). Это позволяет им приспосабливаться к различным почвенным условиям, в том числе влажности (Backman et al., 1997; Мелентьев, 2000). Бациллярные биопрепараты совместимы с протравителями семян, гербицидами и инсектицидами (Кузьмина, 1998; Захарова, 2006; Фомина, 2009). У них выше

срок хранения, благодаря наличию эндоспор, позволяющих сохранить культуру в жизнеспособном состоянии длительное время (Алехин, Злотников, 2006; Lolloo et al., 2010), что является важным условием при использовании их в интегрированной защите растений.

Современный ассортимент биопрепаратов позволяет осуществлять защиту сельскохозяйственных культур от наиболее опасных заболеваний. Однако их эффективность зависит от множества факторов, например: конкурентоспособности штаммов, входящих в состав биопрепарата по отношению к аборигенным микроорганизмам и возбудителям заболеваний растений, почвенно-климатических и других региональных условий (Захарова, 2006; Хайруллин и др., 2010). Биопрепаратов и микробиологических средств защиты, максимально адаптированных к условиям аридной зоны России в настоящее время не разработано.

Таким образом, поиск среди представителей рода Bacillus штаммов, выделенных из агроэкосистем аридной зоны, и обладающих биоконтрольными свойствами является весьма актуальным.

Цель исследований. Исследование особенностей взаимодействия Bacillus atrophaeus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами для использования штамма в агротехнологиях.

Задачи исследований:

1. Выделить представителей рода Bacillus из агроэкосистемы и изучить их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства.

2. Исследовать взаимодействие выделенных штаммов с растениями и фитопатогенными грибами.

3. Идентифицировать штамм с наибольшей фунгицидной и фитостимулирующей активностью и определить его способность к колонизации растений.

4. Изучить влияние штамма на рост томатов в вегетационных условиях.

5. Изучить влияние штамма на рост и устойчивость растений к заболеваниям в полевых опытах на томатах и арбузах.

Научная новизна работы. Из агроэкосистемы аридной зоны выделено 16 бациллярных штаммов и изучено их взаимодействие с микромицетами. Впервые установлено, что штамм Bacillus atrophaeus В - 9918 обладает фунгицидной активностью к широкому спектру фитопатогенов, фитостимулирующей активностью и способностью к эффективной колонизации ризосферы и ризопланы растений (на примере томата).

Показана зависимость фунгицидной и фитостимулирующей активности штамма Bacillus atrophaeus В-9918 от фазы роста культуры.

Впервые показана перспективность применения суспензии штамма Bacillus atrophacus В-9918 как средства защиты сельскохозяйственных растений на примере томатов и арбузов.

Практическая значимость. Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 предложен в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и защиты их от болезней. Полученная лабораторная партия средства апробирована в вегетационных и полевых опытах. Разработана технология применения средства, включающая бактеризацию семян, инокуляцию под корень и опрыскивание.

Штамм В. atrophaeus помещен в ВКПМ под номером В-9918. Подана заявка на изобретение «Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней» (заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010)).

Результаты исследований являлись частью научной работы по

госконтракту: «Разработка микробного препарата для борьбы с

заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области» в 2010 - 2011 гг. Материалы диссертации использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами специальности «Микробиология», бакалаврами направления «Биология» и магистрами магистерской программы

«Микробиология и вирусология» института рыбного хозяйства, биологии и природопользования АГТУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Из агроэкосистемы выделен и идентифицирован штамм Bacillus atrophaeus, обладающий фунгицидными, фитостимулирующими свойствами и способностью к колонизации растений.

2. Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 подавляет рост F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaría tenuissima, Cladosporium sp., Mycelia sterilia, Phytium ultium, и вызывает аутолиз мицелия у Alternaría sp.

3. Фитостимулирующие свойства и способность к колонизации растений подтверждены в лабораторных экспериментах, вегетационных и полевых опытах активизацией ростовых процессов растений.

4. Показана, что фунгицидная и фитостимулируюшая активность штамма Bacillus atrophaeus В-9918 зависит от фазы роста культуры. Максимум антифунгальной и стимулирующей рост и развитие растений активности приходится на экспоненциальную фазу роста.

5. Выявлена оптимальная концентрация клеток В. atrophaeus В-9918 в суспензии (Ю7КОЕ/мл), при обработке которой наблюдается наибольший

эффект стимуляции роста и развития арбузов в полевых и томатов в полевых и вегетационных опытах, а также снижение развития фузариоза и альтернариоза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: научно-практической

конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008); 13-й, 14-й Путинских международных школах-кокференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009, 2010); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и

экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых

«Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009);

Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Международной научной конференции: «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ - 2010» (Астрахань, 2010); Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010); Международной конференции молодых ученых: «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2010), на Международной конференции с элементами научной школы для молодежи: «Экокультура и фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).

Работа выполнена в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета в соответствии с плановой темой НИР: «Скрининг микроорганизмов с полезными свойствами для использования в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии» (№ гос. регистрации 01201051559, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.). Работа поддержана госконтрактом с министерством сельского хозяйства Астраханской области на выполнение научно-исследовательских и фундаментально-прикладных работ в 2010 -2011 гг.: «Разработка микробного препарата для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области» (№ гос. регистрации

01.2.009.00158, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.).

Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные результаты получены лично автором. Определение концентрации цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определялось в Институте биологии Уфимского научного центра РАН совместно с к.б.н. Веселовым Д.С., нитрогеназную активность штамма В. atrophaeus В-9918 исследовали совместно с сотрудниками ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспериментов, вегетационных опытов и полевых исследований, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах ВАК. Подана заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010) на выдачу патента РФ «Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней» / Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 29 рисунками.

Работа выполнялась под руководством д.б.н., проф. И.С. Дзержинской которой автор выражает особую признательность и благодарность. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Т.С. Фоминых за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и ценные советы; к.б.н. В.К. Чеботарю за ценные советы и помощь в работе; д.с.-х. н. Ш.Б. Байрамбекову и к. с.-х. н. Е.В. Поляковой за методическую помощь в постановке полевых экспериментов; всему коллективу кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ за помощь и поддержку в процессе работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава посвящена описанию особенностей взаимодействия бацилл с растениями и фитопатогенами. Рассмотрены механизмы защитного и стимулирующего воздействия бацилл на растения. Выявлена перспективность бацилл для создания эффективных биопрепаратов и средств защиты растений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались микроорганизмы рода Bacillus, выделенные из агроэкосистемы Ахтубинского района Астраханской области; штамм В. subtilis 413, фитопатогенные микромицеты Fusarium culmorum, F. graminearum, F.poae, F. sporotrichoides, Phytium ultium, Altemaria tenuissima предоставленные лабораторией технологий микробных препаратов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН и микромицеты Aspergillus niger, Alternaría sp., Cladosporium sp., Mycelia sterilia из коллекции кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ, семена кресс-салата «Весенний», растения томата сортов «Победитель», «Новичок» и «Рио-Гранде Оригинал», растения арбуза сорта «Васко».

Пробы почвы и воды для выделения микроорганизмов отбирались непосредственно в агроценозе (станция №1) и во фрагментах естественных агроэкосистем (водоеме - станция №2 и дубовом лесу - станция №3), входящих в состав агроэкосистемы.

Пробы почвы и воды из исследуемой агроэкосистемы отбирались общепринятыми методами (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005) в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592-2000, ГОСТ 17.4.3.01-83; ГОСТ 28168-89. Отбор образцов растительного материала для фитопатологических анализов осуществлялся в соответствии с практикумами по фитопатологии (Попкова, 1988; Головин и др., 2002). Отбор проб для агрохимических анализов проводили классическими методами в соответствии с практикумами по агрохимии (Минеев, 1989; Практикум по агрохимии, 2001) и учебным пособием «Основы научных исследований в агрономии» (Моисейченко, 1996).

Микробиологические методы исследования включали: выделение и учет численности сапротрофных споровых и бесспоровых форм микроорганизмов (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005; Зимоглядова др., 2007), исследование морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; 1995; Избранные задачи большого практикума по микробиологии, 1991; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005), определение фунгицидной активности штаммов (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983), определение фитотоксичности и фитостимулирующей активности микроорганизмов (Методы экспериментальной микологии, 1982; Берестецкий, 1982; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991;

Ганнибал, 2007). Предварительную идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого'биохимическим признакам, используя монографию Скворцовой И.Н. «Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus» (1983), а также определители бактерий Берги (1980; 1997). Видовую идентификацию штамма В. atrophaeus В-9918 проводили путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК в ФГУП «ГосНИИГенетика». Для определения способности штаммов к колонизации томатов в лабораторных условиях использовали гнотобиотическую установку (Simons et al., 1996) и методику стерилизации семян разработанную Н.В. Мальфамновой (Мальфамнова, 2008). Определение концентрации цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Veselov et al., 1992).

Биотехнологические методы исследования включали: получение

маточной культуры и суспензии штамма В. atrophaeus В - 9918, а также определение кинетики роста микроорганизмов (Промышленная микробиология, 1989; Практикум по микробиологии, 2005).

Агрохимические анализы почв проводили по общепринятым методам: pH солевой вытяжки (ГОСТ 26483-85); влажность почвы, количество легкогидролизуемого азота, фосфора и калия (Практикум по агрохимии, 1989; Практикум по агрохимии, 2001). Постановку и проведение вегетационных и полевых опытов, фенологических наблюдений, снятие биометрических показателей, учет урожая вели в соответствии с практикумами по агрохимии (Ягодин, 1987; Практикум по агрохимии, 1989) и учебным пособием «Основы научных исследований в агрономии» (Моисейченко, 1996).

В работе также были использованы методы фитопатологии: определение видового состава комплекса плесневых грибов (Пидопличко, 1977; Саттон, 2001), развитие альтернариоза (Котова, 1986), развитие фузариоза (Попкова, 1988; Головин и др., 2002).

В вегетационных опытах проводили исследование влияния на томаты сорта «Победитель» бактеризации семян суспензией штамма В. atrophaeus В -9918 с титром клеток 109 КОЕ/мл, а также однократной и двукратной инокуляции под корень суспензией штамма с титром от 107до 109 КОЕ/мл.

Полевые испытания были проведены в Астраханской области в Енотаевском районе (2009 г) на гибриде арбуза первого поколения «Васко» и в Харабалинском районе (2010 г) на томате «Рио-Гранде Оригинал». Для бактеризации семян использовался рабочий раствор с концентрацией клеток

штамма В. atrophaeus В -9918 - 107 КОЕ/мл. В опытах проводили фенологические наблюдения, снятие биометрических показателей, определение степени поражения растений заболеваниями.

Анализ достоверности данных вели стандартными биометрическими методами (Доспехов, 1985; Ягодин, 1987; Практикум по агрохимии,1989; Платонов, 2000) с использованием пакета статистической обработки данных Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование взаимодействия представителей рода Bacillus с растениями и фитопатогенными грибами

Изучение представителей рода Bacillus, выделенных из агооценоза и фрагментов естественных агроэкосистем. Учет численности и оценка микробного разнообразия в сапротрофных сообществах проводились с целью исследования аэробных споровых форм. Исследования показали, что среди этой группы были выделены бактерии, актиномицеты и микромицеты (таблица 1). Численность аэробных спорообразующих бактерий в агроценозе составляет 8% , в почве дубового леса - 64%, в эвтрофированном водоеме -21% от общей численности споровых форм.

Таблица 1. Численность некоторых групп микроорганизмов в салротрофном сообществе агроэкосистемы_________________________________________________________

Место Численность сапротрофов, lg х

отбора проб Общая численность Споровые формы Аэробные спорообразующие бактерии Актиномицето -подобные формы Плесневые грибы

Агроценоз (1 станция) 9,274±9,26 7,130±4,81 5,728±5,67 6,653±5,70 6,301±6,00

Дубовый лес (2 станция) 9,021± 8,98 б,875± 6,40 6,602±6,00 б,097±5,88 6,006±5,99

Эвтрофный водоем (Зстанция) 5,170*4,90 4,398±3,70 3,732±3,66 4,17б±3,70 3,732±3,66

Аэробные спорообразующие бактерии выделяли чашечным методом с использованием питательных сред, селективным агентом в которых являлись соединения фосфора.

Среди выросших колоний были отобраны бактерии с типичными для микроорганизмов рода Bacillus признаками: палочковидной формой клеток, грамположительные, спорообразующие, имеющие фермент каталазу. Всего было выделено 16 аэробных спорообразующих бактерий и получены их чистые культуры.

Исследование морфологических свойств чистых культур показало, что все исследуемые штаммы — грамположительные прямые палочки размером 1,5-6,3x0,6-2,5 мкм, с овальными или круглыми эндоспорами. Изучение культуральных и физиолого-биохимические свойства штаммов подтвердило, что все они являются представителями рода Bacillus.

По совокупности изученных свойств, штамм № 4 можно отнести к В. megaterium, штаммы № 6,8,11,13 и 15 к В. cereus, штамм №14 - кВ. macerans. Штаммы № 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 16 не имеют совокупности физиолого-биохимических свойств, характерных для видов, описанных в определителях Скворцовой (1983) и Берги (1980; 1997).

Исследование взаимодействия выделенных штаммов с фитопатогенными грибами Среди полученных 16 чистых фосформобилизующих штаммов бацилл был проведен первичный скрининг по фунгицидной активности. В качестве тест-культур использовались фитопатогенные микромицеты F. cuhnorum и F. graminearum.

Таблица 2. Фунгицидная активность исследуемых чистых культур бацилл

№ чистой культуры Диаметр зоны ингибирования, мм

Fusarium graminearum Fusarium culmorum Aspergillus myj'r Allemaria sp. Zladosporium sp. Mycelia sterilia

Bacillus sp. 1 19,5±1,0*** 0 - - -

Bacillus sp.2 0 21,5±1,1”* - - - -

ВкИЬатЗ 21,5±I,J*** 2&5Ü.4*** ШНМ***

Bacillus spA 0 0 - - - -

Bacillus sp. 5 0 20,0±1,0* - - - -

Bedttm sp.6 2йДЫ.в*** !7jS±2,7*** 30*14,1** 23*a,i*** 17М5Я***

Bacillus sp.l ПДЮ,6*** 17,0±0,9** - - - -

Bacillus sp. 8 15,0±0,8*** 0 - - - -

Bacillus sp. 9 16,5±0,8*** 0 - - - -

ВясіЯжг sp. 10 ÎSJttHJ*** ISÆtM** 2йЛ±2,7** алыл***.-

Bacillus sp. 11 0 0 - - -

Bacillus .vp.12 0 20, Oil, 0** - - - -

Bacillus sp. 13 13,5±0,7* 20,0±1,0*** - - - -

Bacillus sp. 14 16,0±0,8* 19,5±1,0* - - - -

SaciBas sp.iS 22Л±и*« Iljftfcl.t*** 155*1,4« 22ДШМ* lA&fcf**- І7&&А***

Bacillus sp.\6 18,5±0,9*«* 0 - - - -

Примечание: жирным шрифтом обозначены штаммы с высокой фунгицидной активностью одновременно к К сиЬпогит и К graminearum^, * - усиленное спороношение, ** - аутолиз мицелия, *** - полное подавление роста, «-»- свойство не исследовалось.

Анализ данных представленных в таблице 2 показал, что фунгицидной активностью по отношению к Р. gratnineanm обладают 11, к Р. си1тогит -10 из 16 исследуемых штаммов, 2 штамма (№ 4 и 11) не проявляли

фунгицидной активности ни к одной из тест-культур. Штаммы № 3,6,7,10,13,14,15 ингибировали рост одновременно двух тест-объектов. Исследуемые антагонисты отличались по характеру воздействия на мицелиальные грибы, которое проявлялось в аутолизе мицелия (№7), усиленном спороношении (№13,14), полном подавлении прорастания конидий (№ 3,6,10,15). У штаммов № 3,6, 10 и 15 также были обнаружены наибольшие зоны ингибирования роста фитопатогенов (18,5-25 мм).

Таким образом, для вторичного скрининга отобраны штаммы № 3,6,10,15. Данные штаммы исследовались на наличие фунгицидной активности по отношению к Aspergillus niger, Alternaría sp., Mycelia sterilia и Cladosporium sp. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что аутолиз мицелия Aspergillus niger и Cladosporium sp. вызывают штаммы № 10 и 15, полностью подавляют рост данных микромицетов штаммы № 3 и 6. К усиленному спороношению Alternaría sp. приводят штаммы 3,6, 10, штамм № 15 вызывает аутолиз его мицелия. Все исследуемые штаммы подавляют рост Mycelia sterilia.

Проведенное исследование подтверждает мнение А.И. Мелентьева (2007) о том, что действие бацилл может быть избирательным и специфически проявляется по отношению к определенным видам грибов. По нашим данным (таблица 2) наиболее устойчивой к воздействию исследуемых бацилл является Alternaría sp., наиболее чувствительной - Mycelia sterilia.

Вторичный скрининг показал, что штаммы № 3 и 6 обладают наибольшими зонами ингибирования микромицетов и полностью подавляют их рост. Для исследования взаимодействия этих штаммов с растениями кроме них для сравнения использовали штаммы № 10 и 15. Изучение взаимодействия выделенных штаммов с растениями Взаимодействие выделенных штаммов с растениями изучали на основании проявлениями ими фитотоксичности и фитостимулирующей активности в эксперименте на прорастание семян кресс-салата «Весенний». Семена замачивали в суспензии штаммов с титром клеток Ю9-1010КОЕ/мл. Токсичными считали культуры, вызывающие снижение всхожести семян или угнетение роста проростков и корней более чем на 30% по сравнению с контролем (Методы экспериментальной микологии, 1982). Количество проросших семян, а также длина корня и побега в контроле были приняты за 100 %. Результаты эксперимента приведены в таблице 3.

Таблица 3. Фитотоксичность и фитостимулирующая активность исследуемых штаммов.

№ чистой культуры Всхожесть семян, в % Количество проросших семян Длина проростков кресс- салата

в абс. величинах, чгг. в % к контролю в абс. величинах, мм в % к контролю

корень побег корень побег

контроль 82 41±2,1 100 44,4±4,5 23,5±1,0 100 100

Bacillus sp. 3 96 48±2,4 117 47,8±3,б 26,1±0,9 107,7 111,1

Bacillus sp. 6 88 44±2,2 107 41,9±3,9 26,0±0,9 94,4 110,6

Bacillus sp. 10 86 43±2,2 104 55,0±4,8 24,0±1,1 123,9 102,1

Bacillus sp. 15 96 48±2,4 117 26,6±2,9 20,8±1,0 59,9 88,5

Анализ ростовых показателей и всхожести семян выявил, что штамм № 15 фитотоксичен, штаммы № 3, 6, и 10 являются не токсичными для растений и стимулируют их рост. Наибольшее положительное воздействие на всхожесть и ростовые процессы растения оказывает штамм № 3 (таблица 3).

По совокупности выявленных фунгицидных и фитостимулирующих свойств штамм №3 может быть использован в агроэкологии как средство защиты растений от грибных заболеваний и стимуляции их роста. Идентификация штамма Bacillus sp. 3 путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК позволила отнести его к Bacillus atrophaeus. Штамм депонирован ВКПМ под коллекционным номером В - 9918.

Изучение взаимодействия Bacillus atropheus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами

Установлено, что В. atrophaeus В-9918 (Bacillus sp. 3) проявляет фунгицидную активность по отношению к следующим микромицетам: F. culmorum, F. graminearum, Aspergillus niger, Alternaría sp., Cladosporium sp. и Mycelia sterilia. Фунгицидные свойства штамма проявлялись в полном подавлении прорастания F. culmorum, F. graminearum, Aspergillus niger, Cladosporium sp, и в аутолизе мицелия Alternaría sp. Для исследования более широкого спектра фунгицидных свойств штамма В. atropheus В-9918 использовались тест-культуры: F. роае, F. sporotrichoides, Phytium ultium, Alternaría tenuissima.

Исследования показали, что штамм В. atrophaeus В-9918 обладает выраженной фунгицидной активностью по отношению к исследуемым тест-объектам и подавляет прорастание конидий, что связано, по видимому, с высокой концентрацией антибиотических веществ, выделяемых антагонистом в среду. На рисунке 1 представлен полный спектр фунгицидного действия В. atrophaeus В-9918 и характер его воздействия на все исследуемые фитопатогенные грибы.

Штамм В. atrophaeus В-9918 оказывает фунгицидное воздействие на следующие фитопатогенные грибы: F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaría tenuissima, Alternaría sp., Cladosporium sp., My celia sterilia, Phytium idtium. У всех исследуемых тест-объектов, кроме Alternaría sp., В. atrophaeus В-9918 вызывает полное подавление роста (рисунок 1). У Alternaría sp. штамм вызывает аутолиз мицелия.

Исследование способности штамма В. atrophaeus В -9918 к эффективной колонизации томатов в лабораторных условиях. Микроорганизмы проявляют комплекс положительных эффектов на рост и развитие растений, в том числе фитостимуляцию, только при успешной колонизации корней и способности поддерживать свою численность в ризосфере (Benizeri et al., 2001). Положительный эффект на рост и развитие растений достигается при поддержании в ризоплане минимальной концентрации бактериальных клеток > 104 КОЕ/см2 корня (Соколов, 1990).

Ранее показана фитостимулирующая активность штамма, что вызывает необходимость подтверждения этого эффекта исследованием способности штамма к колонизации и поддержанию численности в ризосфере растения.

Способность штамма В. atrophaeus В -9918 к эффективной колонизации ризосферы и ризопланы растений исследовали на томатах сорта «Новичок». В качестве эталона использовался штамм В. subtilis 413, обладающий фунгицидной активностью, рост-стимулирующими свойствами и

являющийся активным колонизатором ризосферы и ризопланы растений (Кравченко и др., 2002; Чеботарь 2007).

Для получения проростков томата использовали методы поверхностной стерилизации семян и гнотобиотическую установку, разработанную Симонсом с коллегами (Simons et al., 1996). Поверхностно стерилизованные семена томата обрабатывали суспензией штаммов В. atrophaeus В -9918 и В. subtilis 413 с титром клеток 107 и 10б КОЕ/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Семена помещали в стерильный кварцевый песок, предварительно смоченный питательным раствором для растений, на глубину 1,0 см и проращивали в течение 14-35 суток при температуре 20 С в люминостате. Затем определяли количество микроорганизмов в ризосферной почве и численность микроорганизмов ризопланы. Результаты исследования представлены на рисунке 2.

Численность В. atrophaeus В -9918 в ризосфере томата на 14 сутки при обработке семян суспензией с титром 106 КОЕ/мл составляла 5x10 КОЕ/г. При обработке семян суспензией с титром Ю7КОЕ/мл - ЗхЮ8 КОЕ/г. Численность В. subtilis 4-13 в ризосфере при обработке семян суспензией штамма с титром 107 КОЕ/мл была несколько выше (5х 10 КОЕ/г) (рисунок 2).

Примечание - а) В. агтркаеш В -9918 с титром 106 КОЕ/ мл; 6) В. ШгорЬаеш В -9918 с титром 107 КОЕ/ мл; в) В. зиЫШ* 413 с тшром 106 КОЕ/ мл; г) В. шШк 413 с титром 107 КОЕ/ мл

Рисунок 2 - Динамика численности исследуемого штамма в а) ризосфере и б) ризоплане томата в гнотобиотических системах.

На 20 сутки в ризосферной почве растений, бактеризованных суспензией В. сИгоркает В-9918 с титром 10б КОЕ/мл, численность клеток штамма осталась на прежнем уровне (5х108 КОЕ/г). В ризосфере растений, бактеризованных суспензией штамма с титром 107-КОЕ/мл, численность клеток В. аЬгоркаеиз В-9918 на 20 сутки увеличилась до 10ш КОЕ/г. Численность эталонного штамма в ризосфере томатов, бактеризованных

суспензией с титром 10б КОЕ/мл, увеличилась до 1011 КОЕ/г, а в ризосфере растений, бактеризованных суспензией с титром 107 КОЕ/мл, составила Ю10 КОЕ/г.

На 35 сутки после бактеризации численность всех штаммов интродуцентов в ризосфере томата снижается до 108 КОЕ/г. Следовательно, В. atrophaeus В-9918 стабильно присутствует в ризосферной почве исследуемых томатов в течение эксперимента.

В наших экспериментах установлено, что штамм В. atrophaeus В -9918 заселяет не только ризосферу растения, но и поверхность корня (ризоплану) (рисунок 2).

В ризоплане в течение всего эксперимента численность клеток штаммов В. atrophaeus В-9918 и В. subtilis 4-13 колебалась незначительно в приделах 104-105 КОЕ/см2 корня (рисунок 2).

Таким образом, еще раз подтверждена колонизирующая способность эталонного штамма В. subtilis 4-13 и показано, что численность В. atrophaeus В-9918 на протяжении всего эксперимента была не ниже 104 КОЕ/см2 корня, что необходимо для проявления положительных эффектов на рост и развитие растений.

Изучение взаимодействия Bacillus atrophaeus В - 9918 с растениями и

фитопатогенными грибами в условиях вегетационных и полевых

опытов

Фунгицидная и Фитостимулируюшая активность штамма в различные Фазы культивирования. Для исследования фунгицидной и фитостимулирующей активности В. atrophaeus В -9918 в процессе культивирования использовали оптимальные для роста штамма жидкие среды: бобовый отвар и среду ВКМ-1. Штамм культивировали при температуре 28°С и непрерывном перемешивании на качалке (120 об/мин). В качестве тест-объекта использовался микромицет F. graminearum. Фунгицидная активность суспензии штамма определялась каждые 24 часа в течение 10 суток с помощью модификации метода диффузии в агар с использованием лунок на среде Чапека с титром F. graminearum - 10б спор/мл (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; ГОСТ 9.048-89). Полученные результаты представлены на рисунке 3 (а, б).

в)

Рисунок 3. Фунгицидная и фитостимулирующая активность В. cttrophaeus В -9918 в динамике: а) фунгицидная активность на бобовом отваре; б) фунгицидная активность на жидкой среде ВКМ-1; в) фитостимулирующая активность на бобовом отваре.

Установлено, что пики фунгицидной активности В. atrophaeus В-9918 при его культивировании на бобовом отваре приходятся на экспоненциальную фазу роста с титром клеток 5*109 КОЕ/мл (48ч культивирования) и на фазу отмирания с титром клеток 10‘2 КОЕ/мл (216 ч культивирования). Наличие двух максимумов фунгицидной активности при культивировании В. atrophaeus В-9918 на бобовом отваре, по-видимому, связано с выделением первичных метаболитов в экспоненциальной фазе роста, а также вторичных метаболитов (антибиотики) в фазе отмирания. Полученные данные соответствуют мнению Г.Э. Актуганова с соавторами (Актуганов и др., 2003) о комплексном механизме подавления роста грибов штаммами рода Bacillus, заключающемся во взаимодействии гидролитических ферментов с антибиотическими веществами.

При культивировании штамма на жидкой питательной среде ВКМ-1 пик фунгицидной активности приходится на экспоненциальную фазу роста (72 ч) с титром клеток в суспензии - Ю10 КОЕ/мл (рисунок 3 (б)).

Установлено, что максимум фунгицидной активности штамма при культивировании на бобовом отваре приходится на 48 ч культивирования, а на ВКМ-1 на 72 часа культивирования. При культивировании штамма на среде ВКМ-1 физиологическое действие штамма заключается как в полном подавлении роста фитопатогена (48-148 ч), так и в аутолизе мицелия (24 ч, 192-216ч) и усилении спороношения микромицета (240 ч). При

культивировании В. Шгоркаеиз В-9918 на бобовом отваре фитопатоген чувствительнее к суспензии штамма, что проявляется в полном подавлении роста микромицета, а также в большем, чем на среде ВКМ-1 диаметре стерильных зон.

Таким образом, бобовый отвар по сравнению со средой ВКМ-1 является средой наиболее оптимальной для культивирования В. а^оркаеиа В-9918 и проявления им фунгицидных свойств. Поэтому для исследования фитотоксичности и фитостимулирующих свойств, проявляемых в процессе культивирования штамма, использовался бобовый отвар.

Фитотоксичность и фитостимулирующую активность штамма определяли каждые 24 часа с помощью бактеризации семян кресс-салата «Весенний». Зависимость длины проростков кресс-салата от фазы роста штамма В.Мгоркает В-9918 представлена на рисунке 3 (в).

Исследования показали, что максимумы стимуляции роста проростков приходятся на 48 и 216 часов культивирования при титре клеток 109 и 1012 КОЕ/мл соответственно (рис. 3 (в)).

Таким образом, суспензию штамма В. сйгоркает В-9918 с активными антифунгальными свойствами и фитостимулирующей активностью можно получить через 48 часов культивирования на бобовом отваре, при этом титр клеток составляет 109 КОЕ/мл.

Вегетационные опыты с томатами сорта «Победитель». Изучение влияния на рост томатов бактеризации семян и однократной и двукратной корневой инокуляции растений суспензией штамма В. а^орИаеиз В-9918 проводилось в вегетационных опытах на томатах сорта «Победитель».

В опыте по бактеризации семян использовалась суспензия штамма в экспоненциальной фазе роста с титром клеток 109 КОЕ/мл. В эксперименте по изучению влияния однократной и двукратной инокуляции использовался интервал значений титра клеток от 107 до 109 КОЕ/мл. Полученные данные представлены в таблице 4.

При бактеризации семян суспензией штамма В. аггоркаеия В-9918 с титром клеток Ю9КОЕ/мл высота растения и длина корня соответствуют

данным контроля (таблица 4). Биомасса растений в опыте была ниже, чем контроле.

Таблица 4. Влияние бактеризации и корневой инокуляции суспензией штамма Bacillus

Титр клеток в суспензии, КОЕ/г (количество обработок) возраст растений (сут.) средняя высота растений, мм средняя длина корня, мм биомасса растений, г

Контроль

15 67,6*15,4 61,3*1,3 1,2*0,21

25 132,8±16,6

40 183,3*30,3

Бяктепиіаиия

10* 15 59.2±5,3 46,5*1,5 8,65*0,07 *

25 102,1*7,2

40 132.0*3,1

Кооневан инокуляция

107 (однократно) 15 128.4:19,5* 41,5*9,8 ■ ■ SilfiMi 1,94*0,1 (61%)

25 184.0*24

40 214,2*5.8

107(двукратно) 15 113.1±1.9* 60,0*10,0 1,60*0,10 (33%)*

25 167.5*18,0

40 240,0*5.8*

5 *107(однократко) 15 72.8*9,0 44,2*7,5 1,27*0,25

25 106,1*13.6

40 133.1*19.2

5*107(двукратно) 15 98.3*6.8* 43,3*1,7 0,65*0,08 (-46%)*

25 124.8*8.9

40 150.3*18.1

10* (однократно) 15 90.2*4.1* 48,5*1,0 1,14*0,41

25 114.0*7,7

40 155.8=tl 5.9

10*(двукратно) 15 89J2±8.8* 37,5*7,5 0,73*0,04 (-39%)*

25 123.6±13,0

40 158,7*2,8

5*10*(однократно) 15 75.3=Ы 6,8 62,5*17,5 1,27*0,41

25 119.3±29,3

40 190.3±39,4

5*10*(двукратно) 15 67.9*4.5 43,9*7,6 0,64*0,15 (-47%)*

25 106.1=4=16,6

40 150,3=tl 8,1

109(однократно) 15 82.8*11,2 50,0*10,0 0,96*0,1

25 ¡28.6*18,6

40 155.5*29,3

!09 (двукратно) 15 65.5*12,4 40,0*1,1 0,60*01,1 (-45%)

25 104.0=Ы 5,0

40 135.7*20,1

Примечание: * различия с контролем существенны при р-0,95, к скобках указан % стимуляции или ингибирования роста по отношению к контролю

Анализ данных эксперимента (40 суток) показал, что инокуляция под корень суспензии штамма 5. а1гор1паеи$ В-9918 может не оказывать влияния, ингибировать или стимулировать рост томатов в зависимости от титра клеток

и от варианта обработки. Суспензия с титром >107 КОЕ/мл при однократной инокуляции не оказывает влияния на ростовые процессы томатов, при двукратной инокуляции ингибирует прирост биомассы. Угнетение роста томатов, возможно, связано с высокой концентрацией метаболитов в суспензии, что согласуется с мнением А.И. Мелентьева (Мелентьев, 2007), о том, что микроорганизмы рода Bacillus при высоких концентрациях подавляют рост растений, а при низких - активируют защитные реакции организма, и тем самым стимулируют их рост. Последнее наблюдается при однократной и двукратной инокуляции суспензией клеток с титром 107 КОЕ/мл. При этом прирост биомассы составляет 61% и 33 % соответственно.

Таким образом, наиболее выраженное положительное влияние на томаты оказывают однократная и двукратная инокуляция суспензией штамма с титром 107 КОЕ/мл под корень растения.

Полевые опыты. Изучение влияния штамма В. atrophaeus В-9918 на рост и устойчивость арбузов к фузариозу проводилось в открытом фунте на гибриде арбуза первого поколения «Васко». Для инокуляции семян использовался рабочий раствор с концентрацией клеток штамма В. atrophaeus В-9918 - 107 КОЕ/мл. В полевом опыте определяли нарастание биомассы, количество настоящих листьев, симптомы фузариоза и влияние интродукции штамма на аборигенную микрофлору ризосферы арбуза.

Установлено, что бактеризация семян суспензией В.atrophaeus В-9918 не оказывает негативного влияния на аборигенную микрофлору ризосферы арбуза. В контроле количество растений с симптомами фузариоза составляет 9%, у растений, обработанных суспензией штамма, симптомы фузариоза отсутствуют. При этом прирост биомассы по сравнению с контролем составляет 79%.

Изучение влияния штамма В. atrophaeus В-9918 на рост и устойчивость томатов к альтернариозу проводили на томате «Рио-Гранде Оригинал». В опыте использовался рабочий раствор с концентрацией клеток В. atrophaeus В-9918 - 107 КОЕ/мл. Схема опыта включала следующие варианты: 1) контроль; 2) бактеризация семян; 3) бактеризация семян + 2-х кратный пролив растений под корень; 4) бактеризация семян + 2-х кратное опрыскивание.

Установлено, что бактеризация семян штаммом В. atrophaeus В-9918 с титром клеток 107 КОЕ/мл не оказывает ингибирующего воздействия на основные ростовые показатели томатов в фазу 1-4 настоящего листа и фазу цветения, при этом наблюдается более раннее образование первой цветочной кисти.

Исследование ростовых показателей томатов в фазу цветения при обработке рабочим раствором показало, что высота растений, общая длина побегов и площадь листовой поверхности зависят от вариантов опыта. Наиболее эффективным вариантом является бактеризация + опрыскивание, при котором высота растений превышает контрольную на 33%, площадь листовой поверхности - на 72%.

Исследования биометрии томатов в фазу плодообразования показало, что все варианты обработки растений рабочим раствором оказывают стимулирующее воздействие на высоту растений (12-22%) и количество плодов (121-182%). В варианте бактеризация + опрыскивание кроме того наблюдается увеличение площади листовой поверхности на 54,8%.

Анализ развития альтернариоза в фазу плодообразования показал, что альтернариоз отмечен как в контроле, так и во всех вариантах опыта. Сопоставимые результаты получены в контроле и в варианте бактеризация + пролив. Биологическая эффективность суспензии штамма В. aírophaeus В-9918 против альтернариоза отмечена в вариантах бактеризация (8,1%) и бактеризация + опрыскивание (34,6%).

По совокупности положительных эффектов можно отметить вариант бактеризация + опрыскивание, при котором наблюдается стимуляция роста томатов, на фоне которой фунгицидные свойства штамма В. aírophaeus В-9918 способствуют снижению развития альтернариоза.

Таким образом, суспензию штамма В. aírophaeus В-9918 с титром Ю7КОЕ/мл можно рекомендовать для разработки средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней.

ВЫВОДЫ

1. Из агроэкосистемы аридной зоны выделено 16 штаммов аэробных спорообразующих бактерий, которые по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим свойствам отнесены к роду Bacillus.

2. В результате скрининга по фунгицидной активности отобрано 14 штаммов, действие которых по отношению к исследуемым микромицетам является избирательным и специфичным. Наибольшей антифунгальной активностью обладают 4 штамма, из них один — фитотоксичен, три - способны к фитостимуляции.

3. Штамм, обладающий наиболее выраженной фунгицидной активностью к представителям рода Fusarium и Alfemaria, фитостимулирующей активностью и способностью к колонизации растений идентифицирован как Bacillus aírophaeus. Штамм В. aírophaeus В-9918 способен поддерживать

численность в ризосфере томата в приделах 2*107-Ю10 КОЕ/ г а.с.п.; в ризоплане - в приделах 4,8*104-4,6*105 КОЕ/ см2 корня, что достаточно для проявления положительных эффектов на рост и развитие растений.

4. Наиболее эффективной концентрацией клеток в суспензии при корневой инокуляции томатов в вегетационных экспериментах является титр 107 КОЕ/мл, стимулирующий прирост биомассы растения на 61% и 33% при однократной и двукратной инокуляции соответственно.

5. В полевых опытах на арбузах показано, что бактеризация семян суспензией штамма В. atrophaeus В-9918 с титром 107 КОЕ/мл стимулирует прирост биомассы растения на 79% и подавляет развитие фузариоза на 100%.

6. В полевых опытах на томатах во всех вариантах обработки (бактеризация семян, бактеризация + опрыскивание, бактеризация + пролив под корень) суспензией штамма В. atrophaeus В-9918 с тигром 107 КОЕ/мл стимулируются ростовые процессы растения: увеличивается высота растений (12-33%), площадь листовой поверхности (38-72%). Наиболее эффективным вариантом обработки, снижающим развитие альтернариоза на 34,6%, является бактеризация + опрыскивание.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидной активности представителей рода Bacillus И Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем: Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова. - Астрахань, 2008,- С. 121-124.

2. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидной активности представителей рода Bacillus // Естественные науки. - 2009.- № 2. - С. 16-20.

3. Коряжкина М.Ф., Дзержинская И.С. Полифункциональный комплекс микроорганизмов для повышения эффективности биоремедиации прибрежных нефтезагрязненных территорий//Защигас*5^8агадач^1внгфкгазсвсмкш1П1исое. - 2009. - №9. - С. 59-61.

4. Коряжкина М.Ф. Фунгицидные и фигосгимулирующие свойства Bacillus atrophaeus // Биология - наука XXI века: Тезисы 13-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2009. - С. 168.

5. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Фунгицидные свойства Bacillus atrophaeus II Бюллетень Московского Общества испытателей природы. Отдел биологический. Приложение 1 «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах». - Москва, 2009. - Том 114. - Выпуск 2. -С. 229-231.

6. Коряжкина М.Ф. Метаболиты, участвующие в формировании фунгицидной активности

Bacillus atrophaeus II Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы: тезисы

Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых. -Белгород, 2009. - С. 21-23.

7. Коряжкина М.Ф., Дзержинская И.С. Bacillus atrophaeus В-9918 - перспективный штамм для разработки биопрепарата для защиты растений и стимуляции их роста // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. - М.:МАКС Пресс, 2009. - С. 55.

8. Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидных и фигостмулирующих свойств штамма В. atrophaeus В-9918 в лабораторных и полевых экспериментах // Биология - наука XXI века: Тезисы 14-й Путинской международной школы-конференции молодых ученых. -Пущино, 2010. - С. 260-261.

9. Коряжкина М.Ф. Использование культуры Bacillus atrophaeus SKD- 1 для разработки биопрепарата с фунгицидными свойствами // Первые Международные Беккеровские чтения (Волгоград, 27-29 мая 2009 года). Сборник научных трудов по материалам конференции. Часть 2. - Волгоград, 2009. - С. 123-125.

10. Коряжкина М.Ф. Исследование эффекта колонизации арбузов (CITRULLUS VULGARIS) штаммом Bacillus atrophaeus В-9918 И Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки: Материалы Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием. Том 2.-Уфа: РИЦ БашГУ, 2010. -С. 234-239.

11. Коряжкина М.Ф. Новый микробный препарат для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур и оздоровления почв сельскохозяйственного назначения // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ- 2010»: Материалы. Международной научной конференции (Астрахань, 11-14 мая 2010 года). Том 3. - Астрахань, 2010. - С. 33 - 34.

12. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Штамм Bacillus atrophaeus В-9918— перспективный объект сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии // Международная отраслевая научная конференция профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященная 80-летию основания АГТУ. - Астрахань, 2010. - С. 19-20.

13. Коряжкина М.Ф. Bacillus atrophaeus SKD - 1 как перспективный штамм для разработки биопрепарата // Юг России: экология, развитие. -2010. - № 4. - С. 80-83.

14. Коряжкина М.Ф. Изучение хозяйственно-ценных свойств штамма Bacillus atrophaeus // Материалы V Международной конференции молодых ученых (Харьков, Украина, 22-25 ноября 2010 года).- X.: Оперативная полиграфия, 2010. - С. 224-225.

15. Коряжкина М.Ф. Изучение фунгицидных и фигостимулирующих свойств штамма Bacillus atrophaeus В-9918 в условиях лабораторного эксперимента // Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии: Материалы Международной конференции с элементами научной школы для молодежи. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2010. - С. 368 - 371.

Подписано в печать 01.02.12 г. Тираж 100 экз. Заказ № 82 Типография ФГБОУ ВПО «АГТУ», тел. 61-45-23 г. Астрахань, Татищева 16ж.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коряжкина, Мария Федоровна, Астрахань

61 12-3/718

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ

ФГБОУ ВПО

«АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

КОРЯЖКИНА МАРИЯ ФЕДОРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BACILLUS ATROPHAEUS В - 9918 С РАСТЕНИЯМИ И ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

И.С. Дзержинская

Астрахань-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ПРЕДСТАВИТЕЛИ РОДА BACILLUS КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ АГЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ И ФИТОСТИМУЛЯЦИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ 12

1.1 Особенности взаимодействия растений и микроорганизмов 12

1.2 Фитопатогены и способы борьбы с заболеваниями растений 21

1.3 Характеристика бацилл и перспективность их использования для разработки биопрепаратов и средств защиты растений 31

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ' 41

2.1 Объекты исследований 41

2.2 Методы исследований 41 ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BACILLUS В ТИПИЧНОЙ ДЛЯ АРИДНОЙ ЗОНЫ

АГРОЭКОСИСТЕМЕ 48

3.1 Выделение представителей рода Bacillus 48

3.1.1 Учет численности и оценка разнообразия сапротрофных микроорганизмов в агроценозе и фрагментах естественных агроэкосистем 48

3.1.2 Выделение и изучение морфологических, культуральных

и физиолого-биохимических свойств и идентификация аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus 52

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНГИЦИДНЫХ СВОЙСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ БАЦИЛЛ 57

4.1 Исследование взаимодействия выделенных штаммов с микромицетами 57

4.2 Изучение фитотоксичности штаммов и выбор штамма с наиболее выраженными хозяйственно-полезными свойствами 62

4.3 Изучение морфологических, культуральных,

физиолого-биохимических свойств и идентификация штамма 66

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BACILLUS АTROPHAEUS В - 9918 С РАСТЕНИЯМИ И ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ 70

5.1 Фунгицидная активность 70

5.2 Исследование способности к колонизации растений

(на примере томата сорта «Новичок») 72

5.3 Зависимость фунгицидной и фитостимулирующей активности Bacillus atrophaeus В -9918 от фазы роста культуры при непрерывном культивировании 75

5.3.1 Фунгицидная активность штамма 75

5.3.2 Фитотоксичность и фитостимулирующая активность штамма 81

5.3.3 Методика получения маточной культуры и суспензии штамма Bacillus atrophaeus В - 9918 .85

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BACILLUS ATROPHAEUS В - 9918 С РАСТЕНИЯМИ И ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ В УСЛОВИЯХ ВЕГЕТАЦИОННЫХ И ПОЛЕВЫХ ОПЫТОВ 86

6.1 Вегетационные опыты с томатами сорта «Победитель» 86

6.1.1 Бактеризация семян 86

6.1.2 Инокуляция растений 89

6.2 Полевые опыты 95

6.2.1 Изучение влияния штамма Bacillus atrophaeus В-9918

на рост и устойчивость арбузов к фузариозу . 95

6.2.2 Изучение влияния штамма Bacillus atrophaeus В-9918 на рост и устойчивость томатов к альтернариозу 102

ВЫВОДЫ 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120

ПРИЛОЖЕНИЯ 147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.с.п. - Абсолютно сухая почва

КОЕ - Колониеобразующие единицы

МПА - Мясо-пептонный агар

РПБ - Рыбо-пептонный бульон

В. - Bacillus

Ps. — Pseudomonas

sp. - Species

PGPR - plant growth-promoting rhizobacteria

ВВЕДЕНИЕ

Представители рода Bacillus способны заселять ризосферу и рщоплану растений, используя питательные вещества, продуцируемые растениями в виде корневых экзометаболитов, а также синтезировать необходимые для растений биоконтрольные вещества, фитогормоны и витамины (Martin et al., 1987; Foldes et al., 2000; Мелентьев, 2007; Idris et al., 2007; Ortiz-Castro et al., 2008; Ahmed, Hasnain, 2010; Chen et al., 2010), все вышеперечисленные свойства позволяют отнести их, наряду с ризобиями, псевдомонадами и микоризными грибами к группе PGPR (Schippers, 1992).

Бациллы участвуют во всех формах взаимоотношений с растениями: могут являться возбудителями заболеваний (Hosford, 1982; Пересдпкин, 1989; George N. Agrios, 2005); способствовать устойчивому росту и развитию растения; защищать растение от фитопатогенов (Nielsen, Sorensen, 1997; Широков и др., 2002; Harsh et al., 2004; Мелентьев, 2007; Чеботарь, 2007; Halalisani Gumede, 2008; Saharan, Nehra, 2011).

На протяжении последних двадцати лет рядом исследователей (Filippi, 1987; Kim et al., 1997; Кузьмина, 1998; Новикова, 2004; Мелентьев, 2007; Gacitua et al., 2009; U. S. Patent № 8025875, 2009) проводится работа по поиску бациллярных штаммов для создания эффективных биопрепаратов и

средств защиты растений. Такие препараты перспективны, так как штаммы, входящие в их состав, продуцируют Б AB, гормоны и витамины, а также обладают пластичным метаболизмом и смешанной жизненной стратегией, сочетающей элементы r-, L- и К- стратегов (Новикова, 2005), что позволяет им приспосабливаться к различным почвенным условиям, в том числе влажности (Backman et al., 1997; Мелентьев, 2000). Бациллярные биопрепараты совместимы с протравителями семян, гербицидами и инсектицидами (Кузьмина, 1998; Захарова, 2006; Фомина, 2009), у них выше срок хранения, благодаря наличию эндоспор, позволяющих сохранить культуру в жизнеспособном состоянии длительное время (Алехин, Злотников, 2006; Lolloo et al., 2010), что является важными условиями при использовании их в интегрированной защите растений.

Современный ассортимент биопрепаратов позволяет осуществлять

защиту сельскохозяйственных культур от наиболее опасных заболеваний. Однако их эффективность зависит от множества факторов, например: конкурентоспособности штаммов, входящих в состав биопрепарата по отношению к аборигенным микроорганизмам и возбудителям заболеваний растений, почвенно-климатических и других региональных условий (Захарова, 2006; Хайруллин и др., 2010). Биопрепаратов и микробиологических средств защиты, максимально адаптированных к условиям аридной зоны России в настоящее время не разработано.

Таким образом, поиск среди представителей рода Bacillus, выделенных

из агроэкосистем аридной зоны, обладающих биоконтрольными свойствами является весьма актуальным.

Задачи исследований:

2. Исследовать взаимодействие выделенных штаммов с растениями и фитопатогенными грибами.

4. Изучить влияние штамма на рост томатов в вегетационных условиях.

Впервые показана перспективность применения суспензии штамма Bacillus atrophaeus В-9918 как средства защиты сельскохозяйственных растений на примере томатов и арбузов.

Результаты исследований являлись частью научной работы по госконтракту: «Разработка микробного препарата для борьбы с

заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области» в 2010 -2011 гг. Материалы диссертации использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами специальности «Микробиология», бакалаврами направления «Биология» и магистрами магистерской программы «Микробиология и вирусология» института рыбного хозяйства, биологии и природопользования АГТУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 подавляет рост F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaria tenuissima, Cladosporium sp., Mycelia sterilia, Phytium ultium, и вызывает аутолиз мицелия у Alternaria sp.

4. Показана, что фунгицидная и фитостимулирующая активность штамма Bacillus atrophaeus В-9918 зависит от фазы роста культуры. Максимум антифунгальной и стимулирующей рост и развитие растений активности приходится на экспоненциальную фазу роста.

5. Выявлена оптимальная концентрация клеток В. atrophaeus В-9918 в суспензии - Ю7КОЕ/мл, при обработке которой наблюдается наибольший

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008); 13-й, 14-й Пущинских международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009, 2010); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Международной научной конференции: «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ- . 2010» (Астрахань, 2010); Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010); Международной конференции молодых ученых: «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2010), на Международной конференции с элементами научной школы для молодежи: «Экокультура и фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования,

изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 29 рисунками.

Работа выполнялась под руководством д.б.н., проф. И.С. Дзержинской

которой автор выражает особую признательность и благодарность. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Т.С. Фоминых за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и ценные советы; к.б.н. В.К. Чеботарю за ценные советы и помощь в работе; д.с.-х. н. Ш.Б. Байрамбекову и к. с.-х. н. Е.В. Поляковой за методическую помощь в постановке полевых экспериментов; всему коллективу кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ за помощь и поддержку в процессе работы.

ГЛАВА 1 ПРЕДСТАВИТЕЛИ РОДА BACILLUS КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ АГЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ И ФИТОСТИМУЛЯЦИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

1.1 Особенности взаимодействия растений и микроорганизмов

Растительный организм можно рассматривать как сложную экосистему, в которой различные ниши заселены микроорганизмами (Купренович, 1947). Взаимодействия, возникающие между микроорганизмами и растениями, базируются как на обмене метаболитами, так и на обеспечении физического контакта и их условно можно разделить на несколько типов, важнейшими из которых являются симбиоз, паразитизм и антагонизм, наблюдать которые можно во всех частях растения (Громов, Павленко, 1989; Экология микрооорганизмов, 2004).

Микробно - растительные взаимоотношения устанавливаются уже на ранней стадии образования семени, оболочка которого, а часто и внутренние структуры несут клетки и покоящиеся формы микроорганизмов, количество и таксономическая принадлежность которых определяются множеством физико-химических и биологических факторов окружающей среды, а также свойством самого семени (Нетрусов, Котова, 2006). Как отмечают А.И. Нетрусов и И.Б. Котова, структуры семени и микроорганизмы находятся под влиянием продуктов обмена веществ друг друга (Нетрусов, Котова, 2006).

В семенах сохраняются многие возбудители болезней растений, вызывающие гибель семян, снижение всхожести или поражение и гибель проростков (Торопова и др., 2002). Фитопатогенные микроорганизмы могут находиться на поверхности, под семенной кожурой или в тканях семени. Если патоген находится внутри, он защищен тканями семени и не повреждает его, однако при прорастании использует ткани семени в качестве источника питания (Tapp, 1975), а также может выделять токсины, которые угнетающе действуют на развитие растений, снижая при этом

жизнеспособность проростков (Sharma, Singh, 2003). Растение, в свою очередь, реагируя на атаку фитопатогена, выделяет различные вещества, сдерживающие развитие инфекции, например ингибиторы протеаз, подавляющие активность ферментов фитопатогенных микроорганизмов (Дунаевский и др., 1994).

При прорастании семени в благоприятных физико-химических условиях метаболические процессы в нем и в микробной популяции, с ним связанной, значительно активизируются. Метаболиты, выделяемые как микроорганизмами, так и семенем, обладают определенной специфичностью, стимулируют или сдерживают рост различных групп микроорганизмов, влияя таким образом на процессы роста и развития молодого растения (Нетрусов, Котова, 2006). Так, ингибиторы трипсина и хемотрипсина из сои, фасоли и картофеля способны подавлять активность протеиназ, секретируемых грибом Fusarium solani, разрушающих ткани семе

Информация о работе

Коряжкина, Мария Федоровна
кандидата биологических наук
Астрахань, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Особенности взаимодействия Bacillus atrophaeus B-9918 с растениями и фитопатогенными грибами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы