Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика полиплоидизации гепатоцитов в процессе постнатального развития млекопитающих

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Кинетика полиплоидизации гепатоцитов в процессе постнатального развития млекопитающих"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи УДК 575.221.234.2:591.436.2

ШТЕЙН

Григорий Изранлевич

КИНЕТИКА ПОЛИПЛОИДИЗАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в Группе научно-методических основ цитодиагностики и биологического приборостроения Института цитологии АН СССР.

Научный руководитель — кандидат биологических наук Б. Н. Кудрявцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. Я. Бродский; кандидат биологических наук С. А. Комаров.

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет Петербургского государственного университета.

Защита состоится «24» января 1992 г. в часов на заседании

Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. Н. Писарева

.С) Институт цитологии АН СССР

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. В ходе эмбрионального и пост-натального развития, во время регенерации или при развитии патологического процесса клеточные популяции различных органов и тканей претерпевают сложные и закономерные изменения, связанные с размножением клеток, их ростом, дивФеренцировкой и гибелью. Количественные характеристики этих процессов в различных тканях

- Продолжительность митотического цикла и отдельных его периодов, соотношение проли$ерируших и вышедших из цикла клеток и другие показатели кинетики клеточных популяций - являлись предметом многочисленных исследований, значительная часть которых проведена на печени (Bûcher, 1963; carrlere, 1969; Полищук, 1983; Урываева, 1988). Популяция паренхиматозных клеток

- гепатоцитов - составляет болев 80% массы печени. Важной особенностью кинетики популяции гепатоцитов млекопитающих является их полиплоидизация, которая начинается почти сразу после рождения животного и продолжается в течение всей его жизни Полиплоидные клетки встречаются в печени всех изученных видов млекопитающих, однако наибольшего развития полиплоидия получила у грызунов, у некоторых видов которых полиплоидные клетки могут ¿оставлять большую часть паренхимы печени и достигать высоких степеней плоидности (Бродский, Урыв.аева, 1981; Gahan, Middleton, 1982).

Полиплоидизация гепатоцитов является следствием глубинных взаимоотношений процессов пролиферации и диэдереццировки, протекающих . в клеточной популяции паренхиму печени и представляет собой один из вариантов клеточной пролиферации. Проли$еративная активность гепатоцитов, интенсивная в эмбриональном периоде развития, быстро снижается после рождения, и у взрослых крыс индекс меченых клеток составляет лишь. доли процента.Вследствие этого возможности авторадиограйического исследования кинетки клеточной популяции# постнатальной печени, ограничены лишь коротким временным интервалом, составляющим 2-3 нед после рождения животных. В печени человека, несмотря на относительно высокую скорость ее роста после рождения, проли-$еративная активность гепатоцитов находится на еще более низком уровне, чем в печени грызунов.

Пролиферация гепатоцитов может быть усилена путем повреждения печени, например, посредством частичной гепатэктомии.

Однако в случае нормального постнатального развития существующие в настоящее время методы исследования кинетики популяции гепатоиитов оказываются • малоэффективными из-за слабой проли-Феративной активности последних. Поэтому изменение уровней плоидности гепатоиитов в процессе постнатального развития являются фактически единственным признаком, позволяющим судить о пролиФеративных процессах, протекающих в клеточной популяции. Количественные характеристики изменений в уровнях плоидности гепатоиитов содержат в неявном виде ценную информацию о кинетике клеточной популяции. Для получения этой информации необходимо примененить методы математического анализа.

Цель и задачи исследования. Цепью настоящей работы являлась разработка методов исследования и расчета кинетики слабо-пролиферируюиих клеточных популяций на примере паренхимы печени млекопитающих в процессе постнатального развития.

Непосредственные задачи работы состояли в .следующем:

1. Разработать метод исследования кинетики слабопролиФе-рирующей клеточной популяции гепатоцитов млекопитающих в ходе постнатального развития.

• 2. Оценить гетерогенность клеточной популяции гепатоцитов по классам плоидности в разных долях печени крыс, а также гетерогенность суспензии клеток по классам плоидности, вносимую различными способами изоляции гепатоцитов.

3. Разработать фотометрический метод измерения содержания ДНК и *Н-тимидиновой метки в ядре одной и той же клетки.

4, Исследовать кинетику клеточной . популяции паренхимы печени крысы и человека в процессе их роста и старения и определить параметры этого процесса.

Научная новизна работы. Предложен метод исследования слабо-пролиферируюиих клеточных популяций паренхимы печени млекопитающих. Указанный метод, который использует данные о- частотах встречаемости гепатоцитов различных классов плоидности или данные по разведению аН-тимидиновой метки, позволил определить скорости переходов гепатоцитов из одного класса плоидности в другой и коэффициенты изменения их пролиферативной активности с увеличением плоидности в печени новорожденных и взрослых крыс. Показано, что по сравнению с новорожденными животными у взрослых крыс скорости переходов уменьшаются в 2-10 раз в зависимости от типа перехода. У новорожденных животных митотическое размножение диплоидных гепатоцитов преобладает над их полиплоидизацией. У

взрослы* крыс скорость образования двуядерных клеток, являющихся промежуточной стадией на пути образования полиплоидных гепато-цитов, значительно превышает скорость митотичвского размножения.

Впервые определены параметры, характеризующие проли#ера-тивные процессы в печени человека в разные периоды его жизни. Показано, что постнатальный рост печени человека осуществляется преимущественно за счет митотичвского деления диплоидных гепатоцитов. После рождения интенсивность проливвративных процессов быстро снижается и в периоде зрелости ( после 20 лет) находится на чрезвычайно низком уровне. Полиплоидия как «актор компенсаторного роста печени начинает играть заметную роль лишь после 50 лет, когда процессы полиплоидизации усиливаются по сравнению с периодом зрелости. Показано, что одноядерные полиплоидные клетки образуются преимущественно из двуядерных клеток. В период старения человека появляются прямые переходы 2с-*4с как ответ на усиление гибели клеток и атрофию печени.

Научно-практическое значение работы. Результаты работы, характеризующие кинетику слабопроли$ерирующих полиплоидизи-рующихся клеточных популяций печени млекопитающих, особенно человека, имеют прежде всего теоретическое значение и могут быть использованы в курсах лекций ВУЗов медико-биологического профиля. Данные о кинетике полиплоидизации в нор'мальной печени человека могут быть использованы и.в клинической практике для диагностики различных заболеваний печени и отклонения в развитии. Метод расчета скоростей образования клеток разной плоидности может использоваться не только для паренхимы печени, но и для других клеточных популяция, в которых ; имеет место полиплоидизация клеток. Метод одновременного измерения содержания ДНК и эН-тимидиновой метки может найти применение в экспериментальных исследованиях ДНК-синтетической ■ активности клеток.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущина, 1984), на и' Рабочем . совещании "Прикладная цитохимия хроматина" (Ленинград,1985), на Научной конференции молодых ученых • Института 'цитологии АН СССР (Ленинград, 1987). В целом диссертационная работа апробирована на совместном научном семинаре Лаборатории морфологии клетки, Лаборатории цитологии опухолевого роста и Группы научно-методических основ цитодиагностики и биологического приборо-

строения Института цитологии АН СССР ( С. Петербург, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и ил обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на ¡4! страницах машинописного текста, включая /2 таблиц и г О рисунков. Список литературы содержит 235 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовались белый беспородные крысы-самцы разного возраста. При исследовании гетерогенности популяции гепатоцитов по классам плоидности в разных долях печени использовалась группа из 5 животных, у которых материал получали из 6 долей: право- боковой, правой центральной, левой боковой, левой центральной, хвостовой н добавочной (Гамбарян, .Дукепьскап, 1955). В экспериментах по исследованию кинетики полиплоидизации гепатоцитов использовали группу из 6 животных в возрасте 5 мес и с массой тела 215-294 г в начале опыта. Материал получали ■ путем последовательных прижизненных пункционкых биопсий печени каждого животного через равныБ (1 мес) интервалы времени.

При исследовании кинетики разведенил 3Н-тимидиновой метки в развивающейся печени использовали крысят в возрасте 2 сут в начале эксперимента, у которых брали пробы печени с интервалом от 1 нед до 6 нед включительно. В каждой возрастной группе было от 3 до 6 (всего 32) животных. ,

Полиплоидию в печени человека в различные периоды его жизни исследовали на аутолсийном и биопсийном материале 155 человек в возрасте от 1 сут до 92 лет, • полученном в Детской больнице N* 10, Больнице для ветеранов войны и труда, Военно-медицинской академии и Санитарно-гигиеническом медицинском институте.

Изолированные гепатоциты получали несколькими способами:

1. Для получения изолированных гепатоцитов из материала пункционных биопсий биоптаты помещали в 1/15 M K,Na-ioc®aTHtif бу«ер СрН 8.0) и ,5У.-ный р-р сахарозы в соотношении 1:1 на 1! мин. Затем биоптаты помещали в $ос$атный бу$ер с рН 7.4 на S мин. (Кудрявцева и др., 1983).

2. Для изоляции гепатоцитов из печени взрослых крыс печен!

перФузировали фосфатным буфером и 5У.-ным р-ром сахарозы в соотношении 1:1 в течение 15 мин, после чего мелко измельченные "кусочки печени помещали в ФосФатный буфер на 10 мин (Кудрявцева и др., 1972).

3. Для получения суспензии клеток применяли метод щелочной диссоциации (Белов и др., 1975). Диссоциацию предварительно фиксированных в Ю'/.-ном Формалине кусочхов печени проводили в 50"/.-ном р-ре КОН. После выдерживания кусочков в дистиллированной водё их осторожно разбивали стеклянной палочкой.

4. Для сравнения разных методов изоляции клеток суспензию клеток получали диспергированием в коллагеназном буфере по методу Сеглена (segien, 1976). При этом печень сначала перФузировали бескальциевым буфером (pH 7.4), а затем осуществляли рециклинг коллагеназным буфером, содержащем коллагеназу в концентрации 500 мг/л, после чего кусочки печени размельчали в среде Вильямса,

Суспензию гепатоцитов, полученную тем или иным способом изоляции, наносили на предметные или покровные (в экспериментах с разведением метки) стекла и фиксировали метанолом. .

Для выявления ДНК в ядрах гепатоцитов крыс применяли как стандартную реакцию Фельгена (Пирс,1962), так и флуоресцентный вариант этой реакции, в котором в качестве реактива типа Шиффа применяли аурамин-sOj (Кудрявцев, Розанов, 1974). Гидролиз препаратов проводили в GN HCl при 20°С в течение 8 мин. .

Авторадиография. При исследовании разведения *Н-тимидиновой метки после однократного введения изотопа в процессе полиплоидизвции гепатоцитов крысятам в возрасте 2 сут подкожно вводили р-р 'Н-тимидииа в 50У.-ном этиловом .спирте ( удельная активность 660 ТБк/Моль) в дозе 1 МБк/1 г массы тела. Материал получали через 1 ч после введения изотопа и далее с интервалом 1 нед в течение 6 нед. Препараты, приготовленные на покровных стеклах, окрашивали аурамином-зо2, покрывали авторадиографической эмульсией марки "М" в разведении 1:5, экспонировали в течение 20 сут, после чего проявляли. Перед измерениями покровные стекла помещали на предметные стекла мазком вниз на каплю вазелинового масла.

Методы измерения. Для определения содержания ДНК в ядрах гепатоцитов, окрашенных с помощью стандартной реакции Фельгена, использовали анализатор микроизображений "МорФоквант" (К.Цейсс-Иена), работающий в режиме сканирующего цитоФотометра. Измерения проводили при освещении монохроматическим светом с длиной волны

550 нм; увеличение объектива 50*, шаг сканирования и диаметр зонда 0. 4 мкм.

Измерение содержания ДНК в ядра* гепатоцитов, окрашенных аурамином-sOj, проводили на импульсном цито$луориметре РИФ-1 (Кудрявцев и др.,1979) с ртутной лампой ДРШ-250-2 в качестве источника света. Максимум пропускания светофильтров возбуждающего света 400 нм, запирающих светофильтров > 500 нм.

Для одновременной «отометрни содержания ДНК и 3Н-тимиди-новой метки в ядрах гепатоцитов использовали комбинированный метод измерения с помошью микроскола-йотометра ЛЮМАМ-ИУФ-З.

На каждом препарате измеряли по 300-500 клеток.

Методы статистической обработки. По результатам измерения содержания ДНК в ядрах гепатоцитов строили гистограммы отдельно для одноядерных и двуядеркых клеток. ' Исходя из гистограмм, определяли границы классов плоидности и рассчитывали долю одно-и двуядерных клеток разной плоидности в популяции. Для оценки достоверности различий между распределениями" гепатоцитов по классам плоидности применяли критерий "хи-квадрат". В случае суммирования результатов по нескольким животным или пациентам вычисляли средние значения, стандартные отклонения и доверительные интервалы.

При исследовании различий в распределениях гепатоцитов пс классам плоидности в разных долях печени крыс применяли компьютерные методы многомерного статистического анализа, в частности, метод главных компонент.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Математическое описание процесса полиплоидизации гепатоцито

В процессе постнатального развития генатоциты претерпевак различные изменения, связанные• с образованием . попиплоиднь клеток, имеющих одно или два ядра. Имеются экспериментальнь доказательства того,что двуядерные клетки являются промежуточнь этапом на пути образования одноядерных полиплоидных клето* Полагают, что двуядерные клетки возникают путем ацитокиш тичесхого митоза,после чего происходит еще один цикл синтеза Д1 с последующим митотическим делением и образованием дв: одноядерных клеток с удвоенным содержанием ДНК (Nadal, Zajdei 19бб; Wheatley, 1972). Помимо такого способа обсуждаются

другие варианты образования полиплоидных, клеток.В частности, допускается прямое превращение диплоидных гепатоцитов в тетраплоидные, минуя стадию двуядерных клеток. Предполагается, что такой переход играет заметную роль в регенерирующей печени (Бродский, Урываева, 1981). Сведения о процессах образования различных типов полиплоидных клеток в паренхиме печени могут быть получены путем соответствующей математической обработки данных по кинетике развития полиплоидии, а именно при сравнении экспериментальных данных с моделью процесса, для чего необходимо составить структурную схему, отражавшую данный процесс.

Процесс полиплоидизации в печени различных видов млекопитающих в основном развивается сходным образом. При построении схемы учитывались следующие особенности полиплоидизации, имеющие экспериментальные подтверждения:

1) Клетки не могут уменьшить свою- плоидность(количество геномов), а могут лишь увеличить ее или оставить прежней (Бродский, Урываева, 1981).

2) В нормальной печени практически отсутствуют клетки,длительное время находящиеся в »азе ( в^блок ) (Полииук и др., 1976).

3)Двуядерные клетки не могут самовоспроизводиться и этим путем поддерживать свое количество в клеточной популяции паренхимы печени. Они-возникают из одноядерных клеток предыдущего класса плоидности и существуют пишь как промежуточная стадия на пути образования одноядерных клеток более высокой степени плоидности (ИЪеаЬ1еу, 1972).

На рис.1 приведена обобщенная схема развития полиплоидии в печени млекопитающих. Через N. обозначено . числ^ клеток в состоянии 1; а^- относительное число клеток, переходящее из, состояния 1 в состояние j за единицу времени( или скорость перехода), скорость гибели клеток 1-того класса плоидности.

Число неизвестных параметров в схеме весьма велико, поэтому были введены следующие допущения:

1) Октаплоидное состояние гепатоцитов #является предельным,.

2)Скорость гибели клеток на начальном этапе постнатального развития мала. ЗЮкорости переходов а. 3 с возрастом уменьшаются, т.е. в посгиагальном развитии существует " обратная связь между скоростями переходов и массой печени :

И - М. '

я ___ О тая К О т , л \

аг . - а,, « - - а 1, * т ( 1 )

'' '' и - м„ 1'

же* О

-¿Л

' Рис.1. Схема пошплоидизации гепатоцигов. млекопитающих.

Здесь а°. - скорость перехода в начальный момент времени; мтак- максимальная масса печени для данного вида; ■ м^ - масса печени в момент времени к, . мо< м^ < М,, определяется через и весовые коэффициенты .для

клеток разной плоидности. Если принять массу диплоидного

гепатоцита за 1,то: ( 2 )

1=1

4) Пролийерат-ивная активность гепатоцитов может изменяться с увеличением их плоидности .т.е.:

«К*, - ( 3 )

Где; « - коэййициент изменения митотической активности клеток при увеличении их плоидности;

Кинетическую модель клеточной системы, представленной на рис.1, можно описать с помощью рекуррентных разностных соотношений, в которых состояние системы в момент времени t=k+^ выражается через состояние в момент времени t=к '(где

»..к..

1 + вт т

'г , к Г г1 , к

1 + «вт)из к + 2а°эТ11г к + а°3тн) Ь ( 4 )

1 - <3Т)Н4>, + «а^тм,>к 1 + «гвт)мз к + 2аа°,тн4_ к + «а°,тн3 к

_ _ о _ О О

В = а,г" а1в

Неизвестные параметры а^ и « могут быть найдены методом наименьших квадратов, для чего необходимо минимизировать Функционал вида:

^ $ ^ < н.к - р1к)г ик)1 ( ё )

(=1 1:1 к = 1 где: н.к- определенная в эксперименте частота встречаемости гепатоцитов 1-того класса плоидности в момент времени к;

- расчетная частота встречаемости гепатоцитов, ' которая определяется через N. к :

(6)

1=1'

Рк-измеренная в эксперименте масса печени.

А

и

Методические аспекты проблемы исследования кинетики полиплоидизации гепатоцитов

Кинетика клеточной популяции обычно исследуется на материале, получаемом из части органа или ткачи. Поскольку дальнейшие расчеты базируются на частотах 'встречаемости Гепатоцитов разных классов плоидности важно, чтобы частоты' встречаемости, определяемые по кусочку печени, отражали бы ситуацию для всего органа. На частоты встречаемости в принципе влияет неоднородность клеточного состава, которая может иметь место в разных . долях печени крыс, а также способ изоляции гепатоцитов при приготовлении препаратов-'мазков для цитоФото-' метрических исследований. Для выяснения роли этих факторов было проведено специальное исследование.

Известно, что анатомически печень крыс разделена на 6 хорошо различимых долей, отличающихся как размерами, так и месторасположением в органе. У 5 животных получали материал из каждой доли печени, приготовляли мазки изолированных гепато-

"э.к*,

цитов, окрашивали на ДНК и фотометрировали для определения частот встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности. Для выяснения закономерностей в распределениях применяли методы многомерного статистического анализа. Результаты показали, что различия в распределениях гепатоцитов по классам плоидности в разных долях печени одной и той же крысы недостоверны. Стандартные отклонения частот встречаемости в зависимости от класса плоидности составляют 0.8-3.9'/.. Достоверные различия возникают лишь между препаратами печени крыс разного возраста. Была также определена ошибка■ метода исследования частот встречаемости, которая составила 0. 2-0. 7 X .

На частоты встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности может также повлиять способ изоляции клеток, используемый для приготовления препаратов. Для исследования влияния этого фактора из печени трех крыс приготовляли мазки-препараты изолированных гепатоцитов, получаемых тремя способами: с помошью $ос$атного буфера, коллагеназного буфера и путем щелочной диссоциации предварительно фиксированных формалином кусочков печени. Определение частот встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности на препаратах, полученных этими способами, показало, что между ними нет достоверных различий. Разница между частотами встречаемости отдельных классов плоидности на • препаратах, полученных с использованием коллагеназного и фосфатного буферов, составила от -3.3 до +2.3 ■ %, а с использованием щелочной диссоциации и фосфатного буфера - от -1.7 до +1.5 '/..

Таким образом, частоты встречаемости гепатоцитов ра-зных классов плоидности, измеренные на препаратах, полученных из разных долей печени и при использовании разных способов изоляции хлетох, могут характеризовать весь орган в целом.

_ Экспериментальное исследование кинетики клеточной популяции ' в печени крыс

Результаты исследования кинетики попиплоидизации гепатоцитов в ходе постнатального развития ' крыс, моделирование процесса полиплоидизации согласно вышеприведенным формулам и сравнение с имеющимися экспериментальными данными позволили найти начальные скорости переходов а°. и коэффициент ослабления митотической активности а. Поиск значений неизвестных параметров проводился на персональном компьютере ДВК-3 по алгортим>

оптимизации, включающем методы градиентного спуска и случайного поиска. Результаты расчетов приведены в табл.1. В качестве меры соответствия экспериментальных и расчетных данных принято стандартное отклонение . Шаг времени был выбран равным 1 нед.

Таблица 1. Относительные скорости переходов в печени .новорожденных и взрослых крыс для двух типов моделей (А- по кинетике полиплоидизации и Б- по разбавлению метки )

Модель Начальные скорости- переходов «о ™ О О л О а а %

А. Новорожденные 0.33 0.13 0.00 0.19 0.35 5. г

А. Взрослые 0. 031 0.064 0. 00 0.54 0; 060 1. 0

Б.Новорожденные 0.27 0.06 0. 00 0.08 0.48 . 4 . 1

На рис. 2 приведены расчетные и экспериментальные данные по частотам встречаемости гепатоцитов различных классов плоидности в ходе раннего постнатального развития крыс. Видно, что имеется достаточно хорошее совпадение расчетных кривых с экспериментальными точками. 1.0

Рис.2. Частоты встречаемости гепатоцитов различной плоидности на разных сроках пост-• катального развития крыс. Сплошные линии - расчет. Вертикальные отрезки. -95У.-ный доверительный интервал.

16 30 ЧЧ 58 Возраст,' сут '

В табл.1 представлены также результаты исследования кинетики полиплоидизации гепатоцитов в печени взрослых крыс, у которых прблиФеративн&я активность клеток настолько низка, что метод авторадиогра#ии оказывается практически неприменимым. В таблице указаны средние значения по группе из 6 животных, приведенные к интервалу времени 1 нед,

Существенно, что во всех вариантах расчетов а°3=0- Подобный «акт указьвает на то, что образование полиплоидных клеток происходит только через стадию двуядерных клеток. Прямые переходы 2с-4с-8с в процессе нормального постнатального развития крыс маловероятны, что подтверждает данные других исследователей (Nadal, Zajdela, 1966; wheatley, 1972). У взрослых крыс скорости переходов в 2-10 раз. ниже, чем у новорожденных животных, что cвйдeteльcтвyeт о значительном снижении проли$еративной активности с возрастом. У новорожденных животных скорость митотического размножения диплоидных' гепатоцитов a°t заметно превышает скорость образования двуядерных клеток а°г, в то время как у взрослых крыс a°t < т.е. процессы полиплоидизации

превалируют над размножением клеток. ■.

С целью альтернативной проверки получаемых результатов было проведено исследование процесса разведения 3Н-тимидиновой метки в ходе .полиплоидизации гепатоцитов. Подобный подход требует одновременного измерения содержания ДНК и 3Н-тимидиновой метки в одной и той же клетке.

Измерение содержания ДНК и 3Н-тимидиновой метки в ядре одной и той же клетки

С этой цепью был разработан модифицированный фотометрический метод, основанный на измерении света люминесценции от красителя, связанного с ДНК, и отраженного света от зерен серебра авторадиогра»ической эмульсии. В качестве базового прибора использовали микроскоп-йотометр ЛЮМАМ-ИУФ-.З. Возбуждение света люминесценции( 500 нм) красителя, связанного с ядерной ДНК, и освещение зерен серебра авторадиогра»ической эмульсии осушествляли на длинах волн 400 и 600 нм соответственно. Быстрое переключение режимов освещения обеспечивалось электроприводом. Измерения производили в отраженном свете. Препараты приготовляли на покровных стеклах, которые после обработки помещали на предметные стекла мазком вниз на вазелиновое масло. Гакой подход

исключает экранирование света люминесценции зернами серебра. Для повышения чувствительности метода измерения проводили в поляризованном свете, что позволило повысить чувствительность в 2 раза. Источник света (лампа ДРШ-250-2) был подключен к стабилизированному блоку питания. Сравнение Фотометрического метода регистрации количества зерен серебра и визуального счета зерен показало их линейную связь. Воспроизводимость измерений метки составила 2.3 % а микроФпуорометрических измерений - 0.5 */.. Время измерения двух параметров а ядре одной клетки составляет несколько секунд.

Математическое описание процесса разведения 3Н-тимияиновой метки при пролиферации гепатоцитов и сравнение методоз расчета

Процесс разведения количества 3Н-тимидиновой метки , как и процесс полиплоидизации гепатоцитов! см. стр 8-9), можно также описать системой рекуррентных уравнений. При моделировании распределения 3Н-тимидиновой метки по клеткам разной плоидности в процессе их пролиферации полагали, "что:

1.3Н-тимидин, который включился в ядерную ДНК, не выводится из клеток и может только перераспределяться между ними. Общее количество его нормировано к 1 т.е. •

I ^ = t 3 • - < 7 >

i = 1 ¡=i

где: Qtk- количество Н-тимидина, содержащегося во всех клетках i-roro класса плоидности в произвольный момент времени

2. Меченые клетки в процессе по.стнатального развития претерпевают те же превращения, что и немеченые, т.е. для них также справедлива схема полиплоидизации,изображенная на рис.1.

3. Поскольку• эксперименты по' изменению ' интенсивности метки', проводились на молодых животных(до 6 нед),то можно ограничиться рассмотрением только следующих классов плоидности:. 2с, 2с»2, 4с, На основании этих допущений получаем следующие уравнения:

f1 " <Q,% + а°3>т1 0.,»

- О» e,.k + a,V Q, к ( 8 )

Ii -.«К,* О*] 0,,» +.0 Q <, к + а J ? Q I, v

Для нахождения неизвестных параметров а° и » минимизировалось значение функционала:

плоидности в момент времени определенное в эксперименте.

Поиск значений .параметров проводился на персональном компьютере ДВК-3. Результаты расчетов с использованием экспериментальных данных по изменению содержания радиоактивной метки в гепатоцитах новорожденных крысят на разных сроках после введения метки приведены в табл.1. Эти результаты свидетельствуют, что расчетный коэффициент ослабления митотической активности составляет О. 35-0. 48, что хорошо • совпадает с ориентировочной величиной снижения митотической активности 4с-гепатоцитов по сравнению с Ес-геп'атоцитами, найденной в эксперименте (Урываева, Маршак, 1969). Расчетная скорость перехода 2с-*2с«Н, .по нашим данным, равна 0.06-0.13. Скорость'подЬбного перехода в печени мыши, измеренная в опыте, р|авна 0.025У. в час (Урываева, Ланге, 1971), что в пересчете на % неделю дает величину порядка 0.05.

На рис. 3 приведены расчетные кривые и экспериментальные точки по изменению содержания метки в гепатоцитах с течением времени. Видно, что расчетные кривые хорошо описывают реальный процесс.. ; '_____ __________________________

ч и

Рис.3. Среднее содержание *Н-тимидинОВой метки в гепатоцитах различной плоидности на разных сроках постнаталь-ного развития крыс после однократного введения изотопа. Сплошные линии - расчет.

2С-2

Вертикальные отрезки -95У.-ный доверительный интервал.

'2 С

' - 1 ' , , - „ ? '......, » . ,

2 16 зо м

Возраст, суг

Близкие значения расчетных и экспериментальных данных показывают хорошее соответствие модели реальным процессам полиплоидизации, происходящим в печени млекопитающих при росте органа. Проверка математической модели с помощью двух независимых методик - по изменению частот встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности и по изменению содержания радиоактивной метки во времени - дает удовлетворительную сходимость результатов расчетов несмотря на то, что они используют разные экспериментальные подходы. Это позволяет сделать вывод о правильности принципов построения моделей, а также осуществить взаимоконтроль результатов расчетов, поскольку они базируются на одной и той же схейе лолиплоидизации и описываются теми же параметрами, но используют разные экспериментальные' данные. Устойчивость моделей к возмущающему влиянию ошибок эксперимента можно сравнить, подставив параметры, полученные из одной модели в другую и получив соответствующие расчетные кривые. Результаты такого численного эксперимента (для 2с- клеток) изображены на рис.2 и 3 пунктирное! "линией. Видно, что в модели по кинетике полиплоидизации отклонение от экспериментальных данных сильнее. И наоборот, вводя в обе модели одинаковые отклонения .данных, получим меньшее отклонение расчетных параметров для модели по кинетике полиплоидизации. Поэтому • применение этой модели предпочтительнее, особенно на поздних сроках постнатального развития, когда метод авторадногра$ин' оказывается неэффективным.

Полученные расчетные данные показывают, что в печени крыс в процессе нормального постнатального развития наиболее вероятный путь полиплоидизации гепатоцитов проходит через стадию дву-ядерных клеток, которые образуются из одноядерных клеток более низкого класса плоидности в результате ацитокинетического митоза. В следующем цикле синтеза ЛНК митоз двуядерной клетки,' протекавший со слиянием ядер, приводит к образованию двух одноядерных полиплоидных клеток. Образование полиплоидных, клеток в результате незавершенного митоза непосредственно из диплоидных клеток - маловероятный процесс.

Исследование кинетики клеточной популяции в печени человека

Исследование кинетики популяции гепатоцитов в процессе развития и старения человека является наиболее трудной задачей вследствие очень низкой проливеративноя активности гепатоцитов

даже в постнатальном периоде развития. Метод исследования кинетики популяции по изменению частот встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности является по-сушеству единственно возможным в этом случае. Исследования кинетики популяции гепатоцитов человека в разные периоды его жизни после рождения показали, что около 907. клеток паренхимы печени в периоде интенсивного роста органа (до 20 лет) составляют одноядерные диплоидные гепатоциты. Затем доля этих ■ клеток постоянно снижается и в 90-летнем возрасте составляет около Б07. популяции гепатоцитов. Относительное число двуядерных- гепатоцитов с диплоидными ядрами после рождения медленно увеличивается и к 20 годам достигает 77., после чего их количество стабилизируется, но в ■ ходе старения вновь начинает увеличиваться. Полиплоидные клеткй встречаются в небольшом количестве уже у новорожденных детей. В периоде зрелости!20-50 лег) их доля возрастает до 6-87., а в старости достигает 25/i. ПосЛе 75 лет в печени человека встречаются единичные клетки 16с.

Физиологи условно разделяют жизнь человека на три периода: период роста(от рождения до 20 лет),-, период зрелости (21-50 лет) и период старения (после 50 лет) (Пэмб, 1980; Канунго, 1982). Поэтому определение относительных скоростей переходов гепатоцитов из одного класса плоидности в другой мы проводили по этим периодам раздельно, полагая, что в период роста скорости переходов уменьшаются согласно зависимости (1), а в периоды зрелости и старения они постоянны. Результаты приведены в табл.2.

Таблица 2. Относительные скорости переходов в печени человека в разные периоды жизни

Возраст, Относительные-скорости переходов « о

лет O.i а,, ап В» а . 7.

0 1.10 0.12 0. 00 0.04 )

5 0. 98 0.11 0. 00 0.04 1 0 1.10 9.5

10 0. 77 0. 08 0. 00 0.03 1

15 0. 46 0.05 . 0. 00 0.02 J

21-50 0. 012 0.008 0. ООО 0.040 0. 005 0.50 1.6

51-92 0. 022 0. 028 0. 012 0.041 0.100 1.25 3.1

Примечание: Скорости переходов даны в расчете на период 5 лет.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы. ПролиФеративная актиивность гепатоцитов человека наиболее высока в первые годы после рождения. Затем она быстро снижается и в периоде зрелости находится на наиболее низком уровне. В печени стареющего человека ДНК-синтетическая активность гепатоцитов усиливается, но все же она оказывается на порядок ниже активности клеток в раннем постнатальном развитии. Результаты определения уровнен клеточной полиплоидии в печени человека от рождения до 50 лет показывают, что интенсивный посткатальный рост печеии человека и Физиологическая регенерация органа осуществляются в основном за счет митотических делений одноядерных диплоидных гепатоцитов. Полиплоидия начинает играть заметную роль лишь в ходе старения печени как регенераторный ответ клеток на атрофию и ухудшение Функции печени. . Полученные результаты (табл.2) свидетельствуют также, что процесс иоли-плоидизации в паренхима печени человека в основном следует известным схемам полиплоидизации, описанным для печени грызунов, т. е. осуществляется через стадию двуядерных клеток. Особенностями процесса полиплоидизации в" печени человека является, появление при старении прямого перехода 2с-»4с, а. также отсутствие 1 за исключением периода зрелости ) снижения проли-Феративной активности гепатоцитов • с увеличением степени их ллоидности.

Применение метода исследования слабопролийерируюией поли-плоидизируюшейся клеточной популяции печени, предложенного в данной работе позволяет не только ответить на вопрос о возможных путях полиплоидизации гепатоцитов, но и оценить конкретньв параметры пролиФеративных процессов, определение которых другими методами весьма затруднительно. В случае слабопролиферируших клеточных, популяций, например в печени взрослых животных и человека, где метод авторадиографии оказывается .неэффективным, применение разработанного метода с использованием данных по кинетике полиплоидизации может дать хорошие практические результаты. Таким образом, математический анализ данных по изменению во времени частот встречаемости гепатоцитов разных классов плоидности позволяет получать новую информацию о состоянии и характере изменения клеточной популяции печеии. Этот метоп может быть применен для исследования и других слабопролиферируюших клеточных популяций.

ВЫВОДЫ " * *

1. Разработан метод исследования кинетики слабопролиФери- .. • рующей полиплоидизирующейся клеточной популяции паренхимы печени. Метод использует информацию о частотах встречаемости одно- и двуядерных гепатоаитов различных классов плоидности и позволяет определить скорости их образования, изменение пропи$еративной' активности гепатоцитов при увеличении их плоидности; скорость гибели клеток.

2. Интенсивный постиатальный рост печени человека осуществляется в основном за счет митотических делений диплоидных гепатоцитов. Полиплоидия как «актор Физиологической регенерации начинает играть заметную роль лишь при старении. . .

3. ПролиФеративная активность гепатоцитов человека, наиболее высокая в первые годы после' рождения, .затем быстро снижается и в периоде от '20 до 50 лет находится на наиболее низком уровне. При старении ДНК-синтетическая активность, вновь усиливается . примерно в 3 раза по сравнению с периодом зрелости!

4. Полиплоидизация гепатоцитов млекопитающих осуществля-' ется преимущественно через стадию двуядерности. Прямые переходы^ 2с->4с в нормальной печени отсутствуют.

5. Процесс полиллоидизации. в печени человека сходен с процессами в печени грызунов й отличается существенно меньшими скоростями образования полиплоидных клеток.

6. .Достоверные различия в' распре-делении гепатоцитов по классам плоидности,между разными долями печени крыс отсутствуют.

7. Использование различных способов получения суспензии изолированных.гепатоцитов ( в ' фосфатном буфере, коллагеназном буфере, методом щелочной диссоциации) не, приводит к появлению достоверных различий в распределении гепатоцитов по классам плоидности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Штейн Г. И., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н. Цитофото-' метрический анализ диплоидных и полиплоидных ядер гепатоцитов в" разных долях печени крысы // Структура и функции клеточного ядра. Тез. дохл. VIII Всес. симп. Пуиино, 1984.- С. 37-38.

2. Кудрявцев Б.Н., Штейн Г. И., Терешин Г. Г. Анализ кинетики полиплоидизации клеток паренхимы печени крысы // Цитология. 1986. Г. 28, № 8. С. 828-836.

3. Штейн Г. И, Моделирование процесса полиплоидизации гепатоцитов млекопитающих // Матер, научн. конф. мол. ученых Ин-та цитологии АН СССР. М.: ВИНИТИ, 1988. № 3474-В88. С. 82-84.

4. Штейн Г. И., Кудрявцев Б.Н. Одновременная фотометрия ДНК и числа зерен серебра в клетках печени, меченных 'Н-тимидином или 'Н-лейцином //Цитология. 1988. Г. 30. К» 12. С. 1472-1477.

5. Штейн Г. И., Малев В. В., Кудрявцев Б'. Н. Изменение количества 3Н-тимидиновой метки в гепатоцитах разной плоидности в онтогенезе крыс после однократного введения изотопа // Цитология. 1991. Т. 33, №5. С. 31-38.

6. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В., Сакута Г. А., Штейн Г. И. Кинетика клеточной популяции паренхимы печени человека в течение постнатального развития, в период стабилизации роста и при старении // Цитология. 1991. Т. 33, (Г 8. С. 95-107.