Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ тшш М.ВЛОМОНОСОВА

_з Г ~ П )1

Б »©логический факультет

7 я ПОП 7ПП0

На прамх рукопяси УДК 577.352.4

КАСПАРИНСКИЙ Феликс Освалвдовнч

КИНЕТИКА ЭЛЕКТРОГЕННОГО ТРАНСПОРТА ДВУХВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ.

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации п сонекгняе ученом степени кандидат« биологических паук

Моею» - 2000

Работа выполнена на кафедре биологической химии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор А. Д. Виноградов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Р. А. Звягильская

доктор биологических наук, Е. Н. Мохова

Ведущая организация: Институт проблем передачи информации

Российской Академии Наук

Защита состоится «18» декабря 2000 г. в 15:30 час. на заседани!

диссертационного совета Д.053.05.32 в Московском Государственно« Университете им. М. В. Ломоносова по адресу:

119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет аудитория ББА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическог факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "_2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, !

кандидат биологических наук ^ ^^ф М.В. Медведева

еогэ.Нъ

Еоп.Ш.Ш, О.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ туальнасть проблемы.

Ионы Са2< являются одним из универсальных регуляторов энергетического таболизма (McCormack, Denton, 1990) и могут служить проводниками сигналов цитозоля (Joseph, et al., 1984; Exton, 1988) в матрикс митохондрий (Brini, irafoli, 2000). К настоящему времени известно, что поглощение Са2+ является вариантной функцией митохондрий позвоночных (Carafoli, Lehninger, 1971; :Cormack, Denton, 1993), а также растений, грибов и простейших (Chen, hninger, 1973; Docampo, Vercesi, 1989; Bazheriova, et al., 1998). Это указывает

исключительную важность митохондриального транспорта Ca2t для ддержания жизнедеятельности организмов (Duchen, 1999; Pozzan, Rizzuto, 00; Brini, Carafoli, 2000). Низкоамплитудные изменения концентрации Са2*, по-димому, активируют Са2*-транспортирующие системы плазмалеммы и доплазматического ретикулума (Blaustein, et al., 1978; Joseph, et al., 1983). При явлении больших концентраций Са2* (Herrington, et al., 1996; Montero, et al., 00) и/или продолжительном повышении уровня Са2* цитозоле (Nicholls, Budd, 98) Са2*-сигнал передается внутрь митохондрий, что приводит к активации делительного метаболизма (Robb-Gaspers, et al., 1998; Hansford, Zorov, 1998) и еслечиваег защиту от перегрузки цитозоля ионами Са2+ (Khodorov, et al., 1996). следование кинетики митохондриального транспорта Са2* необходимо для нимания механизма, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность эведения Са2+-сигналов из цитозоля в митохондриальный матрикс.

Перенос Са2* по электрохимическому фадиенту через внутреннюю мембрану тохондрий обеспечивает так называемый Са2*-унипортер, чувствительный к гионам лантанидов и рутениевому красному (Saris, Akerman, 1980). Несмотря то, что поглощение Са2* в митохондрии из разных источников изучается уже зло полувека (De Luca, Engstnom, 1961; Pozzan, Rizzuto, 2000), молекулярная )уктура унипортера до сих пор не установлена, а кинетические параметры зреносчика» по данным разных лабораторий чрезвычайно варьируют и часто этиворечивы. Систематическое исследование кинетики транспорта Саг+ тохондриями было начато в начале 70-х годов. В 1971 r. Bygrave, Reed и oncer, используя измерения накопления 45Са2+ в митохондрии печени, наружили «кооперативную» зависимость скорости транспорта от его

концентрации. Два года спустя Vinogradov и Scarpa (1973) провели детальнь анализ кинетики накопления Са24 и Мпг* в митохондрии печени при помои быстро-регистрирующей фотометрии с применением непроникающего в матрм металлохромного индикатора мурексида. Ими было показано, что начаяьнь скорости поглощения Са2* и Мп2* в митохондрии сигмоидально зависят с концентрации этих катионов. Было установлено, что сигмоидная кинети» транспорта Мп2* исчезает после кратковременной преинкубации митохондрий небольшими концентрациями Са24. Авторы впервые предложили кинетическу модель функционирования ункпортера, согласно которой переноои функционально активен при связывании двух ионов переносимого катион (Vinogradov, Scarpa, 1973). С 1973 г. в литературе было опубликовано множеств работ, в которых кинетические параметры транспорта (кажущаяся величина «К„ и значения максимальных скоростей) и само существование кооперативное! варьировали в очень широких пределах (Reed, Bygrave, 1975; Hutson, 197' Akerman, 1977; Bragadin, et al., 1979; Affolter, Carafoli, 1981). В 1986 г. Лейкиным Гонсальвес с использованием изотопного и слектрофотометрического методе регистрации было показано, что удаление Са2* из внешней среды приводит ингибированию выхода предварительно накопленного Са2* из разобщеннь митохондрий (Лейкин, Гонсальвес, 1986). В это же время Крёнер независим показал, что продолжительная инкубация деэнергизованных митохондрий печен с ионами Са2* ускоряет поглощение ^Са2* в митохондрии после их энергизаци (Кгбпег, 1986). Из этих наблюдений логически следовало, что дл функционирования унипортера необходимо специфическое связывани «активирующего» катиона - вывод, хорошо соответствующий ране предложенной модели кооперативного переноса Са2* через внутренню! мембрану митохондрий (Vinogradov, Scarpa, 1973).

Ни механизм Са2*-зависимой активации транспорта Са2*, ни ег физиологическая значимость до настоящего времени оставались неизвестным! В настоящей работе на основании измерений скоростей транспорта Са: митохондриями печени в различных «начальных» условиях предложена модел функционирования Са2*-унипортера, непротиворечиво объясняющая кажущуюс кооперативность транспорта и вариации параметров накопления двухвалентны катионов митохондриями.

ль и задачи исследования.

Целью данной работы было исследование причин кинетической риабельности транспорта двухвалентных катионов митохондриями, хютветствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: Исследование кинетики активации и деактивации Саг*-унипортера. Анализ влияния активации Са2*-унипортера на кинетику поглощения двухвалентных катионов.

Определение вклада реакций активации и транспорта в формирование ряда катионной специфичности Са2*-унипортера. учнэя новизна работы.

Впервые проведено систематическое исследование кинетики Ме2*-зисимой активации митохондриального Са2+-унипортера. Определены пичины кажущихся констант диссоциации комплексов Са2\ Бг^ и Мп2*" для ктивационных» и транспортных центров переносчика. Показано, что зцифичность транспорта катионов в значительной степени определяется здией активации. Предложена модель механизма кинетической зперативности электропенного транспорта двухвалентных катионов. Главное в дели - медленный переход между неактивным и активным состояниями канала, ) позволяет рассматривать Саг*-унипортер в качестве фильтра, вспенивающего амплитудно-частотную селективность проведения Са^-сигнала цитозоля в матрикс митохондрий.

Поскольку канал не обладает абсолютной субстратной специфичностью, эссбность Са2*-унипортера к деактивации в отсутствие субстрата может иаться способом предотвращения неспецифического разобщения. С другой >роны, неспецифические утечки, индуцируемые физиологическими щентрациями субстрата (Са2*), могут контролировать мягкое разобщение тохондрий (8ки1асЪеу, 1996). актическая значимость работы.

Материалы диссертационной работы используются в спецсеминарах збранные главы биохимии», а также при проведении занятий по ункциональной биохимии» в рамках большого практикума для студентов-эхимиков. В ходе выполнения работы были разработаны методы получения гактных митохондрий с пониженным содержанием Са2* и очистки используемых

в работе сред от примесного Ca2*. Предложены простые способы получен митохондрий с активированным и деактивированным Са2*-унипортером. Апообаиия работы.

Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались i Международном симпозиуме "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995), на I IV и V Международной конференции студентов и аспирантов г фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 1996, 1997, 1998), на Втора съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на заседании кафедр биохимии МГУ (Москва, 1999); на Международной конференции «Митохондрт клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описани материалов и методов исследования (4 главы), результатов исследована (4 главы), обсуждения результатов исследования, выводов и списка литературы Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы i 33 рисунка. Список литературы включает 204 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Митохондрии получали из печени белых лабораторных крыс-самцое методом дифференциального центрифугирования гомогената в 0.25 M сахарозе, содержащей 1 мМ ЭДТА* (Johnson, Lardy, 1967). Выделенные митохондрии переосаждали в изотоническим растворе сахарозы, содержащем 10 мМ HEPES (pH 7.4) и пропущенном через катионообменную смолу Amberiite iRC-718. Для получения митохондрий, содержащих заданное количество Ca2* в диапазоне 0.5-12 нмоль Са2+/мг белка, последнее осаждение в среде с ЭДТА проводили в присутствии ротенона (0.5 нмоль/мг белка), и до переосаждения преинкубировали разведенную суспензию органелл (3 мг/мл) при 25°С.

Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом (Gornall et al, 1949). Коэффициент дыхательного контроля (Chance, Williams, 1956) всех препаратов, рассчитанный относительно скорости фосфорилирующего дыхания в присутствии сукцината, находился в пределах 3-7.

Оксидазную активность препарата митохондрий измеряли полярографически томощью открытого вращающегося платинового электрода. Концентрацию юльзуемых в работе растворов двухвалентных катионов определяли методом тлексонометрического титрования раствором ЭДТА в щелочных условиях «10) в присутствии металлохромных индикаторов (Шварценбах, зшка, 1970).

Транспорт Me2* регистрировали методом двухволновой спектрофотометрии, ользуя арсеназо III (Scarpa, 1979) для 1-15 мкМ Мег+ или тетраметилмурексид rogi et al., 1982) для 2-1000 мкМ Me21" при длинах волн 662/692 нм или /540 нм, соответственно. Содержание Са2* в митохондриях оценивали по иброванному увеличению оптического ответа арсеназо III после добавки iP* к деэнергизованным митохондриям.

За изменениями мембранного потенциала митохондрий наблюдали в сутствии сафранина О при длинах волн 555/523 нм (Akerman, Wikstrom, 1976). тема регистрации обеспечивала равномерное распределение реагентов в 50 измерений менее чем за 0.5 сек. Регистрацию транспорта Саг* с ценным разрешением 6 мсек производили на двухволновом ггрофотометре HITACHI-557, используя приставку «stopped-flowu.

Все измерения проводили при комнатной температуре в 2 мл среды ■бации, содержавшей 100 мМ сахарозу; 75 мМ KCI, 10 мМ HEPES* (рН7.4), < КНгРО», 1 мкМ ротенон. Перед внесением ротенона среду очищали от лесного Са2*, пропуская через катионообменную смолу Amberllte IRC-718. Для •гизации митохондрий в среду добавляли 5 мМ сукцинат (рН 7.4). Вариации ава среды и концентрация митохондриального белка указаны в подписях к нкам.

!нятые сокращения: \ - этилендиаминтетраацетат калия,

V - зтиленгликоль-бис(аминоэтил)-Ы,Ы,М,1Ы,-тетраацетат калия, Р - карбонилцианид-4-трифторметоксифенил-гидразон, ES - 4-(2-падроксиэтил)пиперазин-1-этан-сульфоновая кислота, - двухвалентный катион щелочноземельного металла.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕН И(

1. Влияние внугримитохондриального Са2+ на активность Са3*-унипортера.

Известно, что скорость выхода Са2< из матрикса митохондр контролируется концентрацией этого катиона с противоположной сторо» мембраны (Лейкин, Гонсальвес, 1986). Данные некоторых исследовател позволяли предполагать возможность подобного регулирования со сторс» матрикса (Кгйпег, 1986; Sparagna et al., 1995), поскольку изменения скорое поглощения Са2* коррелировали с вариациями Са2*-нагрузки митохондрий.

Мы показали, что начальные скорости поглощения Са2*, добавленного митохондриям до энергизации сукцинатом, не зависят от содержания Са2* матриксе. Инкубация митохондрий в присутствии Са2* до энергизации позволь насытить внешний активирующий центр переносчика (Лейкин, Гонсальвес, 198< Полученные результаты указывают на отсутствие Са2* зависимой регупяц! транспорта двухвалентных катионов со стороны мембраны, обращенной матриксу митохондрий.

2. Ме2*-зависимая активация Са2+-унипортера с внешней сторонь внутренней митохондриальной мембраны.

2.1 Кинетика Са2*-зависимой активации транспорта Са1*.

Известно, что предварительной добавка Са2* к энергизованным (Vinogrado Scarpa, 1973) или деэнергизованным митохондриям (Kroner, 1986) увеличива скорость последующего транспорта катиона. Кинетику активации мола проследить по увеличению скоростей поглощения Са2* после повторной добав! катиона в первом случае или после энергизации - во втором. На Рис. 1 показан что митохондрии, энергизованные после краткой инкубации с 5 мкМ Саг* поглощают катион с лаг-фазой (Рис. 1А). Если увеличить время инкубации с Са' то лаг-фаза исчезает (Рис. 1 Б), а при длительной инкубации в отсутствие Са2' сохраняется (Рис. 1В). При малом времени инкубации с Са2* начальная скорос аккумуляции второй добавки катиона оказывается в 5 раз выше, чем п{ поглощении первой (Рис. 1А). На Рис. 2 показано, что разница между начальныь скоростями поглощения двух последовательных добавок Са2* нивелируется г

дере увеличения времени предварительной инкубации с Са2+ (активации). Зтсюда следует, что по мере активации во времени может происходить смена :тадии, лимитирующей скорость поглощения Са2\

Время, (с«)

Рис. 1. Влияние времени инкубации деэнергизованных митохондрий (МХ) до и после добавки С а2* на кинетику поглощения Са2* при сукцинат-зависимой знергизации. Митохондрии (200 мг/п) инкубировали а среде измерений, содержавшей 50 мкМ арсеназоШ, как указано на рисунке. Регистрировали разницу оптических плотностей среды при 662 и 692 ни.

Начальная скорость поглощения обеих добавок экспоненциально увеличивается при увеличении инкубации деэнергизованных митохондрий с Са2*(Рис. 2). Идентичность кинетики активации поглощения последовательных

добавок Са2* подтвердила наше предположение о независимости механизма активации Са2* унипортера от энергизации митохондрий (Рис. 2, вставка). Низкая величина кажущейся константы скорости активации (к'(а)»0.45 мин'1) указывает на то, что переход транспортных центров унипортера из неактивного в активное состояние осуществляется медленно и обусловлен их изомеризацией и/или олигомеризацией после насыщения «активационных» центров ионами Са2\ Следует отметить, что в выбранных экспериментальных условиях для завершения поглощения 5 мкМ Саг* требуется 0.3-1 мин, тогда как для установления равновесия между активной и неактивной формами переносчика (в присутствии такой же концентрации Са2*) требуется в 5-10 раз больше времени.

200

в

I

§ .

8 10 12 14 16 Время инкубации (мин)

Рис. 2. Влияние времени инкубации деэнергизованных митохондрий с первой добавкой Св2* (1) на начальные скорости поглощения двух последовательных добавок 5 мкМ Са2+ (1 и 2) после энергизации. Условия эксперимента соответствуют описанию в подписи к Рис. 1. Варьировали время между добавкой Са и сукцинат-зависимой энергизацией.

Вставка: Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых активации поглощения первой (1) и второй (2) последовательных добавок Саг*.

2.2 Специфичность активации Са2*-унипортера двухвалентными катионами.

Было обнаружено, что лаг-фаза появляется на начальном участке кинетических кривых поглощения Са2*, Эг2* и Мп2*, если унипортер предварительно не активирован. При увеличении концентрации Ме2" длительность лаг-фазы уменьшается и ее конечная продолжительность зависит от природы катиона. Обратная величина продолжительности лаг-фазы линейно зависит от квадрата концентраций Ме2*, что указывает на необходимость связывания более чем одного иона Ме2 с Са2*-унипортером для его активации (Рис. 3).

Митохондрии (350-500 мг/л) инкубировали 4 мин в среде измерений, содержавшей 5 мМ сукцинат и 50 мкМ арсеназо /// для проб с Саг* (А, в) или 100 мкМ тетраметилмурексид для проб со Л-24" (Б, в) и Мпг* (В, ♦). Реакцию транспорта начинали добавлением Ме2* и во времени регистрировали разницу оптических плотностей среды при 662 и 692 нм. За продолжительность лаг-фазы принимали промежуток времени от момента добавки Ме1* до выхода кинетической кривой поглощения катиона на линейный участок.

Экстраполированные зависимости линейных анаморфоз отсекают на оси абсцисс отрезки, по величине которых мы рассчитали кажущиеся константы диссоциации Са2*, Бг2"1" и Мп2* для регуляторного центра унипортера (2.4±0.6; 38.5±0.2 и 426.0±2.5 мкМ, соответственно). Соотношение этих констант указывает

на то, что стадия активации вовлечена в формирование специфичности дл митохондриального транспорта Мег+. Зависимости начальной скорост транспорта Ме2+ от времени преинкубации с катионом линеаризуются координатах для обратимых реакций первого порядка.

2.3 Влияние температуры на активацию Са2*-унипортера.

На настоящее время сложилось мнение, что Са2+-унипортер функционируе как канал (Litsky, Pfeiffer, 1997). В пользу этого свидетельствует низка температурная чувствительность активированного транспорта Ca' (Bragadin, etal., 1979). Мы показали, что продолжительность лаг-фаз( поглощения Ca2* увеличивается в 4 раза при понижении температуры на 10°С Чувствительность активации к температуре подтверждает наши предположения i том, что переход между неактивным и активным состоянием транспортны: центров Са2*-унипортера может обеспечиваться олигомеризацией и/ил! изомеризацией компонента(ов) канала после насыщения ионами Ме2+.

3. Кинетика транспорта двухвалентных катионов.

3.1 Начальная скорость транспорта Ме2\

Совокупность данных, показанных на Рис. 1, указывает на то, что ; митохондрий с исходно неактивным унипортером скорость транспорт: лимитируется реакцией активации и на начальном участке может быть близка i нулю. Митохондрии, преинкубированные с 15 мкМ Ca2", после энергмзацт поглощают катион с начальной скоростью 370 нмоль/мин/мг (Рис. 4, кривая «2») Эта величина совпадает у кинетических кривых, полученных с высоким и низкик временным разрешением (кривая «2» на вставке Рис. 4). Если Ca2* добавлен i заранее энергизованным митохондриям (Рис. 4, кривая «1»), регистрируемо« поглощение катиона начинается только через 0.7 секунды и ускоряется дс 210 нмоль/мин/мг через 1.5 сек. Как показано на Рис. 4, начальный участа кинетических кривых транспорта не имеет фазы «быстрого поглощения» Ca2 (Sparagna, etal., 1995). Таким образом, начальная скорость поглощения Ca2* е митохондрии отличается от нуля лишь после предварительной преинкубации с Ca2*. Это противоречит представлениям об механизме активации, согласнс которым насыщение акгивационного центра приводит к понижению энергии

активации транспорта или увеличивает сродство транслокатора к субстрату (Gunter, Gunter, 1994).

S

я

св

о

16

14

12

10 8

0 12 3 4

Время (сек)

Зис. 4. Начальные участки кинетических кривых поглощения Са2* ютохондриями, преинкубированными с Са2* (2) или без Са2* (1).

Ъакцию начинали смешиванием равных объемов двух растворов при помощи

техники «stopped flow» и регистрировали разницу оптических плотностей

реды при 662 и 692 нм. Растворы преинкубировапи 10 мин при 25°С.

1), не активированный транспорт Са2*: шприц №1 содержал среду измерений,

О мМ сукцинат, 50 мкМ арсеназо III, 2 мкМ ротенон и митохондрии (563 мг/л),

трии, №2 содержал среду измерений, 50 мкМ арсеназо III и 30 мкМ Са .

?), активированный транспорт Са2': компоненты растворов такие же, как для

1», но Са2* был добавлен в шприц №1, а сукцинат - в шприц №2.

ставка: Полученные в режиме реального времени кривые поглощения Са2*

итохондриями, преинкубированными с Са2* (2) или без Са2*' (1).

2 Влияние Са2*-зависимой активации Са2*-унипортера на кажущийся грядок транспортной реакции.

Принимая во внимание смену скорость-определяющей стадии при анспорте Са2+ по мере активации (см. §2.1) и влияние концентрации Ме2+ на 1ительность лаг-фазы (см. § 2.2), мы предположили, что для митохондрий с активированным унипортером кинетика транспорта будет зависеть от чцентрации Ме2* из-за вклада процесса активации. Именно такую тенденцию

мы обнаружили, сравнивая кинетические кривые поглощения 5 и ЮмкМ С; митохондриями с исходно деактивированным Са2*-унипортером (кривые «2» и « на Рис. 5, соответственно). Видно, что для таких митохондрий аккумуляция 2С добавленного Ca2* сопровождается 5-кратным увеличением скорости транспор в случае добавления 5 мкМ Ca2* и двукратным - при внесении 10 мкМ Сг (вставка <гА» в Рис. 5).

Продолжительность фазы ускорения транспорта для 5 мкМ Ca2* составляв примерно 1 минуту, а при удвоенной начальной концентрации Ca2* сокращает» вчетверо (вставка «Б» в Рис. 5). В течение 35 секунд, необходимых д/ поглощения первых 5 мкМ Ca2* (кривая «1» на Рис. 5), Са2*-унипортер ycneeai активироваться настолько, что скорость транспорта Ca2* в пробе «1» становится 6 раз выше, чем в пробе «2» при равной концентрации Ca2*. В результат кинетические кривые поглощения 5 и 10 мкМ Ca2* на 40-й секунде пересекаютс; Таким образом, кинетика поглощения Ca2* в митохондрии с исходь деактивированным унипортером зависит не только от концентрации Ca2*, но и с предыстории, что противоречит представлениям об изменении сродств транслокатора к субстрату при насыщении акгивационных центров ионами Ca (Gunter, Gunter. 1994).

Влияние концентрации добавленного Ca2* на кинетику его поглощени полностью пропадает у митохондрий с заранее активированным Ca2 унипортером (Рис. 5, кривые «3» и «4»). В результате преинкубации с Са: концентрационные зависимости скоростей поглощения 5 и 10 мкМ Ca2* (Рис. i вставка «А») и полулогарифмические анаморфозы кинетических кривы транспорта (Рис. 5, вставка «Б») линеаризуются и совпадают. Таким образом, результате предварительной активации Са2*-унипортера кажущийся порядо реакции транспорта снижается до единицы и перестает зависеть от исходно! концентрации катиона в среде измерений. Следует отметить, что значени; кажущихся констант скорости максимально активированного транспорта (Рис. 5 вставка «Б») в 10 раз превышают константы скорости активации в присутствш 5 мкМ Са2*(Рис. 2, вставка).

'и с. 5. Кривые спектрофотометр ической регистрации поглощения 5 и 10 шМ )а2* митохондриями с исходно деактивироаанным («2»и«1») и ктивированным («4» и «3») Саг*-унипортером.

1) и (2), митохондрии (276 т/л) помещали в среду измерений, содержащую мМ сущинат и 50 мкМ арсеназо (II, после чего добавляли Саг* и при помощи элиброванной разницы оптических плотностей среды при 662 и 692 нм педили за изменениями его концентрации,

1J и (4), митохондрии, последовательно обработанные в густой суспензии ■этеноном и 570 мкМ Сзг\ разводили а 400 раз в среде измерений с сукцинатом арсеназо III до концентрации 265 мг/л. Далее - см. описание к пробам (1) и (2). ставки:

к) - Концентрационная зависимость скоростей поглощения 5 мкМ Са2* (2 и 4) ЮмнМ Са1* (1 и 3) для митохондрий с исходно деактивироаанным (1 и 2) и тиеированным (Зи4) Са2*-унипортером. Ординаты точек всех графиков Iляются первыми производными концентрации Са2* по времени для ютветствующих кривых из Рис. 5.

i) - Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых поглощения тМ Са** (2 и 4) и 10 мкМ Са2* (1иЗ) в митохондрии с исходно ■активированным (1 и 2) и активированным (3 и 4) Са2*-унипортером.

3 Кинетика насыщения скоростей транспорта Me2*.

Сопоставляя эксперименты, в которых наблюдался транспорт по кинетике рвого порядка, мы предположили, что это определяется условиями, одерживающими активационное равновесие. Можно было ожидать, что

зависимость удельных скоростей транспорта от концентрации Ме2+ будет меняться от сишоиды к гиперболе по мере установления «активационного» равновесия. Мы попытались трансформировать сигмоидную кинетику насыщения в гиперболическую двумя разными способами. Деэнергиэованные митохондрии инкубировали либо при концентрации Са2*, близкой к К05 для реакции активации (см. § 2.2), либо использовали такой же Са2\ как при транспорте. При сопоставлении кинетических параметров транспорта Са2* в митохондрии с коротким временем активации видно, что ограничение концентрации активирующего Са2* приводит к снижению величин наблюдаемых К0.5 и V,™, на 3040% и увеличению коэффициента Хилла в 1.5 раза (Таблица 1). Как и ожидалось, после достижения активационного равновесия при длительном времени инкубации с Са2* кинетика насыщения скоростей транспорта приближается к гиперболической, что сопровождается уменьшением К05 и ростом У™* вне зависимости от ограничений на концентрацию активирующего Са2*. Надо отметить, что разница между величинами Утаж , обусловленная ограничением концентрации активирующего Са2\ становится значительно больше после длительной активации (Таблица 1).

Таблица 1.

Влияние условий инкубации деэнергизованных митохондрий с Са2* на кинетические параметры его поглощения после энергизации.

Митохондрии (190-230 мг/п) помещали в среду измерений, содержащую 50 мкМ арсеназо III или 100 мкМ тетраметипмурексид и преинкубировали 4 мин. По окончании преинкубации добавляли Са1* и 5 мМ сукцинат с интервалом 3 сек или 10 мин, после чего регистрировали транспорт Са2* согласно описанию в разделе «Материалы и методы». Если концентрацию Са2* при инкубации ограничивали на уровне 2 мкМ, одновременно с сукцинатом добавляли 0-13 мкМ Са2". Данные получены при обработке кинетических кривых насыщения начальных скоростей транспорта' Са2* методом нелинейной регрессии к эмпирическому уравнению Хилла.

Кинетические параметры Ко. 5 (нмоль/мин/мг) V™, (нмоль/мин/мг) Коэффициент Хилла

(Саг* ] при инкубации 2 мкМ 2-100 мкМ 2мкМ 2-100 мкМ 2 мкМ 2-100 мкМ

3 сек инкубации с Са** 6.6±0.4 15.5±0.6 262±16 365±6 2.8±0.3 1.7±0.1

10 мин инкубации с Са2* 4.1±0.2 8.1 ±0.6 278±9 491113 1.4±0.1 1.0±0.1

Таким образом, Са2*-зависимое смещение равновесия между неактивной и активной формами унипортера может приводить к сильному искажению результатов кинетических экспериментов. Пренебрежение изменениями количества активного унипортера при расчете удельных скоростей поглощения Са2* может приводить к появлению кажущейся кооперативное™ транспорта, давно известной из литературы (Bygrave, et а!., 1971; Vinogradov, Scarpa, 1973). В условиях, обеспечивающих постоянство активационного равновесия, транспорт Са2' подчиняется кинетике Михазлиса-Ментен.

3.4 Специфичность транспорта Мег*.

Данные из §3.3 этого раздела (Таблица 1) позволили нам считать, что в эезультате длительной активации для транспорта каждого Me2* произойдет уменьшение Kas и увеличение , но оставалось неизвестным, как поменяется эяд специфичности. Поскольку соотношение кажущегося сродства двухвалентных этионов к активационному центру (см. § 2.2) соответствует ряду специфичности шчальных скоростей транспорта Me2*(Vainio, et а)., 1970), собственно реакция •ранспорта может оказаться неспецифичной к субстрату. Мы получили кривые (асыщения начальных скоростей транспорта Мег* в митохондрии после краткой ти продолжительной преинкубации с Me2*. В первом случае- мы получили мгмоидные зависимости, распределяющиеся по увеличению Ка.5 и уменьшению 'mm в ряду Ca2*/Sr2+/Mn2* (Таблица 2).

При сопоставлении кинетических параметров транспорта Me2* видно, что в яду Ca^/Sr^/Mn2* для митохондрий с мало активированным унипортером оотношения наблюдаемых Ка5 и V„,0, составляют 1/4/13 и 1.0/0.9/0.2, оответственно. После активации в. присутствии транспортируемых катионов оотношения Каг и V™, изменяются (Таблица 2). В результате длительной ктивации соотношение Kas поглощения Me2* убывает вдвое. Это зидетельствует о сопоставимом вкладе реакций активации и транслокации в юрмирование ряда специфичности. Специфичность V™* для транспорта Са2* и г2+- не меняется после предварительной активации, однако для пары Са2* и 1п2+ уменьшается вдвое. Как и ожидалось, кинетика активированного эанспорта для всех катионов приближается к гиперболической. Полученные ээультаты указывают на то, что ряд специфичности транспорта катионов

(\Уатю, е1 а!., 1970) формируется в большей степени на стадии активации, и в меньшей - при транслокации.

Таблица 2.

Влияние времени преинкубации деэнергизоввнных митохондрий с Мег* на кинетические параметры поглощения Мег' после энергизации.

Митохондрии (230-255 мг/л) помещали в среду измерений, содержащую 100 мкМ тетраметилмурексид и преинкубировапи 4 мин. По окончании преинкубации добавляли Саг* и 5 мМ сукцинат с интервалом 3 сек или 10 мин, после чего регистрировали транспорт Саг* согласно описанию в разделе «Материалы и методы». Данные получены при обработке кинетических кривых насыщения начальных скоростей транспорта Са2* методом нелинейной регрессии к эмпирическому уравнению Хита.

Me2* Ko.5 (мкМ) Vm„ (нмоль/мин/мг)

3 сек 10 мин 3 сек 10 мин

Ca2* 15.5±0.6 8.1±0.6 365.1±6.3 490.8±13.0

Sr2* 54.5±1.3 18.411.0 346.9±4.5 449.0±10.5

Mns+ 202.4±30.3 51.5±11.7 62.0±6.1 216.7±18.1

4. Обратимость активации Са2+-унипортера.

Активность Са2*-унилортера можно снизить, уменьшая концентрацию внешнего Ca2* добавкой подходящего комплексона {Лейкин, Гонсальвес, 1986) или посредством аккумуляции катиона в митохондрии (Kröner, 1986). Для исследования кинетики деактивации мы воспользовались первым способом (см. Рис. 6). В этих опытах мы использовали митохондрии с низким содержанием эндогенного Ca2*, чтобы избежать неконтролируемого освобождения катиона из матрикса после добавки ЭГТА (Igbavboa, Pfeiffer, 1988).

Зависимость начальных скоростей транспорта от времени деактивации линеаризуется в полулогарифмических координатах дпя необратимых реакций первого порядка (Рис. 6). Кажущаяся константа скорости деактивации оказалась равна 0.8 мин"1. Снижение начальных скоростей транспорта при увеличении времени деактивации сопровождается отклонением кинетики транспорта от первого порядка вплоть до появления лаг-фазы на начальном участке. Таким образом, показано, что обусловленные активацией изменения кинетики транспорта Ca2* (см. § 3.2) полностью обратимы и происходят медленно.

]с. 6. Кинетике деактивации поглощения Саг* митохондриями с исходно ■тивироввнным Саг*-унипортером..

жокондрии с пониженным содержанием Саг* (0.5 нмоль/мг) помещали а среду мерений (279 мг/л), содержавшую 50 мкМ арсеназо III и преинкубировали тн, вслед за чем добавляли 10 мкМ Са2\ После 4-минутной инкубации в исутствии Саг* с указанным на графике интервалом времени добавляли мкМ ЭГТА (рН7.4) и смесь 5 мМ сукцината с 43 мкМ Са Транспорт Свг* гистрировали согласно описанию в разделе «Материалы и методы». )-скорость поглощения Са2* для контрольной пробы, в которой 43 мкМ Са2* давили на 10 минут раньше, чем сукцинат.

таена: Линейная анаморфоза кинетической кривой деактивации Са2'-тортера в полулогарифмических координатах для необратимых реакций того порядка.

Модель функционирования Саа*-унипортера.

Совокупность представленных в работе результатов суммирована в виде мы, описывающей поведение переносчика (канала) в мембране охондрий (Рис. 7). Согласно схеме, Саг*-унипортер может существовать в трех >мах, лишь одна из которых («3») имеет высокую проводимость (Т.) для Са1* и эторых других катионов. Быстрое связывание п ионоа Ме2+ с регуляторным гром деактивированного унипортера (Тй) приводит к образованию формы «2», г переход может быть связан с Мег*-зависимой ассоциацией регуляторного

гликопротеина с внешней поверхностью внутренней мембраны митохондрий (Prestipino, et al. 1974; Igbavboa, Pfeiffer, 1991). Формы «1» и «2» обладают низкой ионной проводимостью. Переход между формами «2» и «3» является медленным процессом, который может заключаться в ассоциации протомеров канала и/или изомеризации его ворот. Активация унипортера обратима и не зависит от энергизации митохондрий. Положение равновесия между формами унипортера определяется внемитохондриальной концентрацией Ме2\ Совокупность этих кинетических свойств позволяет рассматривать Саг*-унипортер в качестве фильтра, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Са2*-сигнала из цитозоля в матрикс митохондрий.

Ca2+(MefK+,H+)

межмембранное пространство

(2)

f. медленно (3)

-mTd-Ме п Та ♦ (Ме

активация

транспорт

Рис. 7. , Схематическое представление предполагаемого механизма кинетической кооперативности между митохондриальным транспортом Са2* и его активацией.

Та - деэкгивированный Са2*-у импортер; Т„ - активированный Са2+-унипортер.

ВЫВОДЫ.

Предложена модификация процедуры получения интактных митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования, позволяющая ;низить содержание эндогенного Са2* до 0.5 нмоль/мг белка. Исследовано взаимодействие кинетики активации Са2*-унипортера иитохондрий в присутствии Са2*, Зг24" и Мп2* и транспорта этих катионов. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Са2*, Бг2* 1 Мп2* с активационными и транспортными центрами Са2"-унипортера иитохондрий. Соотношение этих констант указывает на то, что ряд ;пецифичности транспорта катионов формируется в большей степени на ггадии активации, и в меньшей - при транслокации.

\ктивационный центр Са2*-унипортера обращен в межмембранное фостранство. Активация уиипортера обусловлена медленным переходом из неактивной формы в активную и происходит независимо от знергизации литохондрий в соответствии с кинетикой обратимых реакций псевдопервого юрядка. Начальная скорость транспорта Ме2* в митохондрии с ^активированным унипортером равна нулю.

Скорость активированного транспорта Са2+ более чем на порядок превышает :корости переходов Са2*-унипортера из неактивного состояния а активное и »братно.

кинетические параметры насыщения скоростей транспорта Ме2* определяются онцентрацией активирующего Ме2* и продолжительностью активации. После становления равновесия между неактивной и активной формами унипортера ранспорт Ме2* (при небольших его концентрациях) происходит в соответствии ; кинетикой псевдопервого порядка.

]редложена модель функционирования Ме2>-унипортера в митохондриальной (ембране.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Каспаринский Ф.О. Выделение интактных митохондрий с низким содержанием Са2' из митохондрий печени крысы. II В кн.: Тр. конф. «Второй съезд Биохимического Общества РАН», Москва, 19-23 мая 1997. С.381-382.

2. Каспаринский Ф.О. и Виноградов А.Д. Кинетика деактивации Саг*-переносчика митохондрий. IIВ кн.: Материалы Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», Пущино, 6-9 июня 2000. С. 59-60.

3. Каспаринский Ф.О. и Монахова Л.Г. Влияние внутримитохондриального содержания Са2* на сукцинат-зависимое дыхание митохондрий в различных функциональных состояниях. // В кн.: Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов». Выпуск 3, Москва, 1999. С.20-21.

4. Kasparinsky F.O. and Vinogradov A.D. Slow Caz*-induced inactive/active transition of the energy-dependent Ca2+ transporting system of rat liver mitochondria: clue for Ca2+ influx cooperativity. IIFEBS Lett. 1996. V.389. P.293-296

Изд.лии. 020456 от 04.03.97.

Подписано в печать [5.10.2000. Формат 60 х 64 1/Т6. Бумага офсетная. Петать офсетная. Усл.пеи.л. 1,40. Усл.кр.-отт. 5,£в. Уи.-изд.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 571.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каспаринский, Феликс Освальдович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль митохондрий в метаболизме кальция.

1.1 Участие ионов кальция в регулировании метаболизма.

1.2 Контроль распределения внутриклеточного кальция.

1.3 Проведение кальциевого сигнала из цитозоля в матрикс митохондрий.

2. Электрогенный транспорт двухвалентных катионов в митохондриях.

2.1 Молекулярный механизм транспорта Ме2*.

2.2 Движущая сила аккумуляции Ме2* в митохондриях.

2.3 Кальциевая емкость митохондрий.

2.4 Контроль трансмембранного распределения Ме2*.

2.5 Кинетика транспорта Ме2*.

2.5.1 К(,5 иУШ1 транспорта Ме2+.

2.5.2 Кинетика насыщения начальных скоростей транспорта Ме2+.

2.5.3 Аллостерическая активация транспорта двухвалентных катионов.

2.5.4 «Быстрое поглощение Са2+».

2.5.5 Субстратная специфичность Са2+-унипортера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

2. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ.

2.1 Очистка реакционных сред от примесного Са2*.

2.1.1 Подготовка смолы АтЬег1ке Ш.С-718 к работе.

2.1.2 Приготовление ионообменных колонок со смолой АшЬегШе Ш.С-718.

2.1.3 Использование ионообменных колонок со смолой АтЬегШе 111С-718.

2.2 Получение препаратов изолированных митохондрий из печени крысы.

2.2.1 Стандартная процедура выделения митохондрий.

2.2.2 Модификации стандартной процедуры выделения митохондрий.

2.2.2.1 Поиск способа уменьшения содержания Са2+ в препаратах митохондрий.

2.2.2.2 Процедура получения препаратов митохондрий с низким содержанием Са2+.

3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.1 Определение концентрации ионов М^* и Са2* и Мп2* в стандартных растворах MgCl2, СаС12и МпС12 методом комплексонометрического титрования.

3.1.1 Титрование раствора М^СЬ с кальмагитом или эриохромом черным Т.

3.1.2 Титрование растворов СаСЬ и МпСЬ с кальконом.

3.2 Оценка концентраций Са2* в средах и содержания Са2* в митохондриях.

3.3 Регистрация митохондриалъного транспорта Ме?*.

3.4 Регистрация изменений мембранного потенциала митохондрий.

3.5 Измерение скорости дыхания митохондрий.

3.6 Определение концентрации белка митохондрий.

4. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ.

4.1 Среды.'.

4.1.1 Среда выделения.

4.1.2 Среда промывки.

4.1.3 Среда измерений.

4.2 Ме2*-зависимая активация митохондриалъного транспорта Ме2*.

4.2.1 Активация Са2+-унипортера в густой суспензии митохондрий.

4.2.2 Активация транспорта Ме2+ в среде измерений.

4.3 Деактивация митохондриалъного транспорта Ме2*.

4.3.1 Деактивация Са2~-унипортера в густой суспензии митохондрий.

4.3.2 Деактивация Са2+-унипортера митохондрий в среде измерений.

4.4 Концентрация митохондрий в среде измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Влияние внутримитохондриального Са2" на активность Са2+-унипортера.

2. Ме2+-зависимая активация Са2+-унипортера с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны.

2.1 Кинетика Са2*-зависимой активации транспорта Са2*.

2.2 Специфичность активации Ссг*-унипортера двухвалентными катионами.

2.3 Влияние температуры на активацию Са2*-унипортера.

3. Кинетика транспорта двухвалентных катионов.

3.1 Начальная скорость транспорта Ме2*.

3.2 Влияние Са2*-зависимой активации Са2*-унипортера на кажущийся порядок транспортной реакции.

3.3 Кинетика насыщения скоростей транспорта Ме2*.

3.4 Специфичность транспорта двухвалентных катионов.

4. Обратимость активации Са2+-унипортера.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях"

Ионы Са2+ являются одним из универсальных регуляторов энергетического метаболизма и могут служить проводниками сигналов из цитозоля в матрикс митохондрий. К настоящему времени известно, что поглощение Са2+ является инвариантной функцией митохондрий позвоночных, а также растений, грибов и простейших. Это указывает на исключительную важность митохондриального транспорта Са2+ для поддержания жизнедеятельности организмов. Низкоамплитудные Са2+-сигналы (до 300 нМ), не сопровождающиеся значительным увеличением Са2+-нагрузки клеток (до 5 нмоль/мг сухого веса клетки), по-видимому, активируют Са2+-транспортирующие системы плазмалеммы и эндоплазматического ретикулума. При появлении высокоамплитудных и/или продолжительных Са2+-волн в цитозоле Са2+-сигнал передается внутрь митохондрий, что приводит к активации окислительного метаболизма и обеспечивает защиту от перегрузки цитозоля ионами Са2+. Исследование кинетики митохондриального транспорта Са2+ необходимо для понимания механизма, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Са2+-сигналов из цитозоля в митохондриальный матрикс.

Перенос Са2+ по электрохимическому градиенту через внутреннюю мембрану митохондрий обеспечивает так называемый Са2+-унипортер, чувствительный к катионам лантанидов и рутениевому красному. Несмотря на то, что поглощение Са2+ в митохондрии из разных источников изучается уже около полувека, молекулярная структура унипортера до сих пор не установлена, а кинетические параметры транспорта по данным разных лабораторий сильно варьируют и часто

Введение противоречивы. Систематическое исследование кинетики транспорта Са2+ митохондриями было начато в начале 70-х годов. В 1971 г. Бигрейв, Рид и Спенсер, используя измерения накопления 45Са2+ в митохондрии печени, обнаружили «кооперативную» зависимость скорости транспорта от его концентрации. Два года спустя Виноградов и Скарпа провели детальный анализ кинетики накопления Са2+ и Мп2+ в митохондрии печени при помощи быстро-регистрирующей фотометрии с применением непроникающего в матрикс металлохромного индикатора мурексида. Ими было показано, что начальные скорости поглощения Са2+ и Мп2+ в митохондрии сигмоидально зависят от концентрации этих катионов. Было установлено, что сигмоидная кинетика транспорта Мп2+ исчезает после кратковременной преинкубации митохондрий с небольшими концентрациями Са2+. Авторы впервые предложили кинетическую модель функционирования унипортера, согласно которой переносчик функционально активен при связывании двух ионов переносимого катиона. С 1973 г. в литературе было опубликовано множество работ, в которых кинетические параметры транспорта (кажущаяся величина «Кт» и значения максимальных скоростей) и само существование кооперативности варьировали в очень широких пределах. В качестве причин кинетической изменчивости авторы рассматривали зависимость транспорта Са2+ от генерации ДЧ7, компенсации АрН, ионной силы окружающей среды а также присутствия активаторов и ингибиторов. Однако ни одна из предложенных моделей не позволяла непротиворечиво объяснить наблюдаемый в ряде случаев переход от сигмоидной кинетики митохондриального транспорта катионов к гиперболической.

Введение

В 1986 г. Лейкиным и Гонсальвес с использованием изотопного и спектрофотометрического методов регистрации было показано, что удаление Са2+ из внешней среды приводит к ингибированию выхода предварительно накопленного Са2+ из разобщенных митохондрий. В это же время Крёнер независимо показал, что продолжительная инкубация деэнергизованных митохондрий печени с ионами Са2+ ускоряет поглощение 45Са2+ в митохондрии после их энергизации. Из этих наблюдений логически следовало, что для функционирования унипортера необходимо специфическое связывание «активирующего» катиона - вывод, хорошо соответствующий модели кооперативного переноса Са2+ через внутреннюю мембрану митохондрий, ранее предложенной Виноградовым и Скарпа. Кинетика активации унипортера охарактеризована не была, хотя отдельные факты указывают на то, что эта реакция протекает медленно и обладает катионной специфичностью. Известные из литературы гипотезы о понижении энергии активации транспорта или увеличении канальной проводимости после насыщения «активирующих» центров позволяют объяснить лишь часть известных фактов. Таким образом, ни механизм Са2+-зависимой активации транспорта Са2+, ни его физиологическая значимость до настоящего времени оставались неизвестными.

Мы предположили, что катионная и амплитудно-частотная селективность Са2+-унипортера обеспечиваются тем же механизмом, который обусловливает появление кооперативности поглощения Ме2+, а именно интерференцией кинетики транспорта и его активации. Таким образом, основой диссертационной работы стал кинетический анализ взаимодействия митохондриального транспорта двухвалентных катионов и его активации.

Введение

В разделе «Обзор литературы», состоящем из двух частей, мы рассматриваем, каким образом кинетика митохондриального транспорта Са2+ определяет роль этого процесса в метаболизме клетки. В первой части раздела «Обзор литературы» перечислены основные способы регулирования внеклеточной и внутриклеточной концентрации Са2+ и обозначено место митохондрий в иерархии систем, участвующих в Са2+-сигнализации. Принимая во внимание ограниченный объем диссертационной работы, мы позволили себе ограничиться лишь узкими рамками при рассмотрении такой безбрежной темы, как метаболизм Са2+ и его роль в регулировании клеточных процессов. Вторая часть обзора литературы посвящена особенностям электрогенного транспорта Са2+ в митохондриях.

Раздел «Материалы и методы» состоит из четырех частей. В первых трех частях описаны применявшиеся в работе материалы и известные из литературы препаративные и аналитические методы исследования, а также разработанные нами способы модификации традиционных процедур. В частности, обсуждаются способы очистки инкубационных сред от примесного Са2+ и модификации процедуры выделения митохондрий печени крысы, которые позволяют получать сопряженные митохондрии с заданным количеством эндогенного Са2+. Четвертую часть раздела «Материалы и методы» мы посвятили способам оптимизации экспериментальных условий, без применения которых выполнение настоящей работы оказалось бы невозможным. Аргументирован перечень ингредиентов используемых в работе сред, а также рассмотрены преимущества и недостатки известных из литературы и предложенных нами способов активации и деактивации Са2+-унипортера митохондрий.

Введение

Раздел «Результаты исследования» состоит из четырех глав (частей). Первая часть посвящена исследованию влияния внутримитохондриального Са2+ на активность Са2+-унипортера. Полученные результаты указывают на асимметричность Са2+-зависимого регулирования унипортера относительно внутренней мембраны митохондрий. Во второй главе описано проанализирована и количественно описана кинетика активации унипортера ионами Са2+, 8г2+ и Ва2+. В третьей главе количественно охарактеризована кинетика транспорта Са2+, Бг2* и Ва2+ , а также ее вариации, обусловленные изменениями активности унипортера. Особое внимание уделено зависимости начальных скоростей транспорта катионов и их специфичности от активации унипортера. В четвертой главе показано, что активационные изменения кинетики транспорта Са2+ полностью обратимы и приведены количественные характеристики деактивации Са2+-унипортера.

В разделе «Обсуждение результатов» предложена кинетическая модель кооперативности между электрогенным транспортом Са2+ и его медленной активацией. Проведен анализ соответствия предлагаемой кинетической модели полученным нами и известным из литературы экспериментальным фактам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Каспаринский, Феликс Освальдович

выводы

1. Предложена модификация процедуры получения интактных митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования, позволяющая снизить содержание эндогенного Са2+ до 0.5 нмоль/мг белка.

2. Исследовано взаимодействие кинетики активации Са2+-унипортера митохондрий в присутствии Са2+, 8г2+ и Мп2+ и транспорта перечисленных двухвалентных катионов. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Са2+, 8г2+ и Мп2+ из активационных и транспортных центров Са2+-унипортера митохондрий. Соотношение этих констант указывает на то, что ряд специфичности транспорта катионов формируется в большей степени на стадии активации, и в меньшей - при транслокации.

3. Активационный центр Са2+-унипортера обращен в межмембранное пространство и связывает не менее двух ионов Ме2+. Активация унипортера заключается в его медленном переходе из неактивной формы в активную и происходит независимо от энергизации митохондрий в соответствии с кинетикой обратимых реакций псевдопервого порядка. При отсутствии предварительной активации унипортера начальная скорость транспорта Ме2+ в митохондрии равна нулю.

4. Кажущиеся константы скорости активированного транспорта более чем на порядок превышают наблюдаемые константы скорости его активации в присутствии физиологических концентраций Ме2+. Такое соотношение констант скорости реакций приводит к искажению кинетики транспорта при условии его одновременной активации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каспаринский, Феликс Освальдович, Москва

1. Предложена модель предполагаемого механизма кинетической кооперативности электрогенного транспорта двухвалентных катионов и его медленной активации.1. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2. Affolter, H. and Carafoli, E. (1981) Hyperbolic kinetics of the electrophoretic carrier of Ca2+ uptake in liver mitochondria. Eur.J.Biochem., 119, 199-201.

3. Akerman, K.E. and Nicholls, D.G. (1981) Ca2+ transport by intact synaptosomes: the voltage-dependent Ca2+ channel and re-evaluation of the role of Na+/Ca2+ exchange. Eur.J.Biochem., 117, 491-497.

4. Akerman, K.E.O. (1977) Effect of cations on the temperature sensitivity of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria and safranine uptake by liposomes. J.Bioenerg.Biomembr., 141-149.

5. Akerman, K.E.O. (1977) Effect of Mg2+ and spermine on the kinetics of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria. J.Bioenerg.Biomembr., 9, 65-72.

6. Akerman, K.E.O. (1978) Changes in membrane potential during calcium ion influx and efflux across the mitochondrial membrane. Biochim.Biophys.Acta, 502, 359-366.

7. Akerman, K.E.O. and Wikstrom, M.K.F. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett., 68, 191-197.

8. Akerman, K.E.O., Wikstrom, M.K.F. and Saris, N.-E.L. (1977) Effect of inhibitors on the sigmoidicity of Ca2+ ion transport. FEBS Lett., 78, 32-36.

9. Akerman, K.E.O., Wikstrom, M.K.F. and Saris, N.-E.L. (1977) Effect of inhibitors on the sigmoidicity of the calcium ion transport kinetics in rat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 464, 287-294.

10. Allshire, A., Bernardi, P. and Saris, N.-E.L. (1985) Manganese stimulatescalcium flux through the mitochondrial uniporter. Biochim.Biophys.Acta, 807, 202-209.

11. Azzi, A. and Azzone, G.F. (1966) Swelling and shrinkage phenomena in liver mitochondria. 3. Irreversible swelling induced by inorganic phosphate and Ca2+. Biochim.Biophys.Acta, 113, 438-444.1. Список литературы

12. Babcock, D.F., Herrington, J., Goodwin, P.С., Park, Y.B. and Hille, B. (1997)

13. Mitochondrial participation in the intracellular Ca2+ network. J.Cell Biol., 136, 833-844.

14. Bazhenova, E.N., Deryabina, Y.I., Eriksson, O., Zvyagilskaya, R.A. and Saris,

15. N.E. (1998) Characterization of a high capacity calcium transport system in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. J.Biol.Chem., 273, 43724377.

16. Bazhenova, E.N., Saris, N.E. and Zvyagilskaya, R.A. (1998) Stimulation of theyeast mitochondrial calcium uniporter by hypotonicity and by ruthenium red. Biochim.Biophys.Acta, 1371, 96-100.

17. Becker, G.L. (1980) Steady state regulation of extramitochondrial Ca2+ by ratliver mitochondria: effects of Mg2+ and ATP. Biochim.Biophys.Acta, 591, 234239.

18. Behan, A.R., Krall, A.R. and Dogherty, W.S. (1985) Localization and hypotonicextraction of ruthenium-red-staining substances in mitochondria. Biochem. Soc. Trans., 13, 468-469.

19. Bernardi, P. (1984) Modulation of Ca2+ efflux and rebounding Ca2+ transport inrat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 766, 277-282.

20. Bernardi, P. (1996) The permeability transition pore. Control points of acyclosporin A- sensitive mitochondrial channel involved in cell death. Biochim.Biophys.Acta, 1275, 5-9.

21. Bernardi, P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers,and permeability transition. Physiol.Rev., 79, 1127-1155.

22. Bernardi, P. and Azzone, G.F. (1983) Regulation of Ca2+ efflux in rat livermitochondria. Role of membrane potential. Eur.J.Biochem., 134, 377-383.

23. Bernardi, P., Colonna, R., Costantini, P., Eriksson, O., Fontaine, E., Ichas, F.,

24. Massari, S., Nicolli, A., Petronilli, V. and Scorrano, L. (1998) The mitochondrial permeability transition. Biofactors, 8, 273-281.

25. Bernardi, P., Paradisi, V., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1984b) Pathway foruncoupler-induced calcium efflux in rat liver mitochondria: Inhibition by ruthenium red. Biochemistry, 23, 1645-1651.

26. Bernardi, P. and Pietrobon, D. (1982) On the nature of Pi-induced, Mg2+ -prevented Ca2+ release in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 139(1), 9-12.

27. Bielawski, J. and Lehninger, A.L. (1966) Stoichiometric relationships in mitochondrial accumulation of calcium and phosphate supported by hydrolysis of adenosine triphosphate. J.Biol.Chem., 241, 4316-4322.

28. Blaich, G., Krell, H., Tafler, M. and Pfaff, E. (1984) On the state of calcium ions in isolated rat liver mitochondria. II. Effects of phosphate and pH on Ca2+-induced Ca2+ release. Hoppe Seylers.Z.Physiol. Chem., 365, 73-82.

29. Borle, A.B. (1975) Regulation of cellular calcium metabolism and calcium transport by calcitonin. J.Membr.Biol., 21, 125-146.

30. Bowser, D.N., Minamikawa, Т., Nagley, P. and Williams, D.A. (1998) Role of mitochondria in calcium regulation of spontaneously contracting cardiac muscle cells. Biophys.J., 75, 2004-2014.

31. Bragadin, M., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1979a) Activation energies and enthalpies during Ca2+ transport in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 104, 347-351.

32. Bragadin, M., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1979b) Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. Biochemistry, 18, 5972-5978.

33. Bremel, R.D. and Weber, A. (1975) Calcium binding to rabbit skeletal myosin under physiological conditions. Biochim.Biophys.Acta, 376, 366-374.

34. Brierley, G.P., Davis, M. and Jung, D.W. (1987) Respiration-dependent uptake and extrusion of Mg2+ by isolated heart mitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 253, 322-332.

35. Brini, M. and Carafoli, E. (2000) Calcium signalling: a historical account, recent developments and future perspectives. Cell Mol.Life Sci., 57, 354-370.

36. Broekemeier, K.M., Dempsey, M.E. and Pfeiffer, D.R. (1989) Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. J.Biol.Chem., 264, 7826-7830.

37. Broekemeier, K.M., Krebsbach, R.J. and Pfeiffer, D.R. (1994) Inhibition of the mitochondrial Ca2+ uniporter by pure and impure ruthenium red. Mol.Cell Biochem., 139, 33-40.

38. Brustovetsky, N. and Klingenberg, M. (1996) Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. Biochemistry, 35, 84838488.

39. Bygrave, F.L., Reed, K.C. and Spencer, T. (1971) Cooperative interactions in energy-dependent accumulation of Ca2+ by isolated rat liver mitochondria. Nat.New Biol., 230, 89-89.

40. Carafoli, E. (1967) In vivo effect of uncoupling agents on the incorporation of calcium and strontium into mitochondria and other subcellular fractions of rat liver. J.Gen.Physiol., 50, 1849-1864.

41. Carafoli, E. (1979) The calcium cycle of mitochondria. FEBS Lett., 104, 1-5.

42. Carafoli, E. (1994) The signaling function of calcium and its regulation, J.Hypertens.Suppl., 12, S47-56.

43. Carafoli, E. and Lehninger, A.L. (1971) A survey of the interaction of calcium ions with mitochondria from different tissues and species. Biochem. J., 122, 681-690.

44. Carafoli, E., Rossi, C.S. and Lehninger, A.L. (1965b) Uptake of adeninenucleotides by respiring mitochondria during active accumulation of Ca2+ and phosphate. J.Biol.Chem., 240, 2254-2261.1. Список литеоатиоы

45. Carafoli, E., Weiland, S. and Lehninger, A.L. (1965a) Active accumulation of Sr2*by rat-liver mitochondria. I. General features. Biochim.Biophys.Acta, 97, 8898.

46. Chance, B. (1965) The energy-linked reaction of calcium with mitochondria.

47. J.Biol.Chem., 240,"2729-2748.

48. Chance, B., Azzi, A. and Mela, L. (1969) Molecular Interactions of Calcium

49. Transport in Mitochondrial Membranes. In Tosteson, D.C. (ed.) The Molecular Basis of Membrane Function, Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, pp. 561-573.

50. Chance, B., Nakase, Y. and Itshak, F. (1979) Membrane energization at subzerotemperatures: calcium uptake and oxonol-V responses. Arch.Biochem.Biophys., 198, 360-369.

51. Chance, B. and Williams, G.R. (1956) The Respiratory Chain and Oxidative

52. Phosphorylation. Advanced Enzymol.Relat.Subj.Biochem., 17, 65-134.

53. Chazotte, B„ Wu, E.S., Hochli, M. and Hackenbrock, C.R. (1985) Calciummediated fusion to produce ultra large osmotically active mitochondrial inner membranes of controlled protein density. Biochim.Biophys.Acta, 818, 87-95.

54. Chen, C.H. and Lehninger, A.L. (1973) Ca2+ transport activity in mitochondriafrom some plant tissues. Arch.Biochem.Biophys., 157, 183-196.

55. Cheung, J.Y., Constantine, J.M. and Bonventre, J.V. (1986) Regulation ofcytosolic free calcium concentration in cultured renal epithelial cells. Am.J.Physiol., 251, F690-F701

56. Crompton, M. (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its rolein cell death. Biochem.J., 341, 233-249.

57. Crompton, M., Capano, M. and Carafoli, E. (1976) The sodium-induced efflux ofcalcium from heart mitochondria. A possible mechanism for the regulation of mitochondrial calcium. Eur.J.Biochem., 69, 453-462.

58. Cullis, P.R., de Kruijff, B. and Hope, M.J. (1980) Phospholipids and membranetransport. Can.J.Biochem., 58, 1091-1100.

59. David, G., Barrett, J.N. and Barrett, E.F. (1998) Evidence that mitochondria buffer physiological Ca2+ loads in lizard motor nerve terminals see comments. J.Physiol.(Lond), 509, 59-65.

60. De Luca, H.F. and Engstrom, G.W. (1961) Calcium uptake by rat kidney mitochondria. Proc.NatiAcad.Sci.U.S.A., 47, 1744-1754.

61. Docampo, R. and Vercesi, A.E. (1989) Characteristics of Ca2+ transport by Trypanosoma cruzi mitochondria in situ. Arch.Biochem.Biophys., 272, 122129.

62. Dorogi, P.L. (1984) Kinetics and mechanism of Ca2+ binding to arsenazo III and antipyrilazo III. Biochim.Biophys.Acta, 799, 9-19.

63. Dorogi, P.L., Santarius, U. and Neumann, E. (1982) Arsenazo I and

64. Tetramethylmurexide as Optical Calcium Indicators. Anal.Biochem., 124, 2736.

65. Drahota, Z., Gazzotti, P., Carafoli, E. and Rossi, C.S. (1969) A comparison of the effects of different divalent cations on a number of mitochondrial reactions linked to ion translocation. Arch.Biochem.Biophys., 130, 267-273.

66. Duchen, M.R. (1999) Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death. J.Physiol.(Lond), 516, 1-17.

67. Exton, J.H. (1980) Mechanisms involved in alpha-adrenergic phenomena: role of calcium ions in actions of catecholamines in liver and other tissues. Am.J.Physiol., 238, E3-12.

68. Exton, J.H. (1988) The role of calcium and phosphoinositides in the mechanism of «-adrenergic and other agonists. Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol., 3, 118-224.

69. Ezawa, I. and Ogata, E. (1979) Ca2+-induced activation of succinate dehydrogenase and the regulation of mitochondrial oxidative reactions. J.Biochem.(Tokyo), 85, 65-74.

70. Favaron, M. and Bernardi, P. (1985) Tissue-specific modulation of themitochondrial calcium uniporter by magnesium ions. FEBS Lett., 183, 260264.1. Список литератиоы

71. Fierro, L., Dipolo, R. and Llano, I. (1998) Intracellular calcium clearance in

72. Purkinje cell somata from rat cerebellar slices. J.Physiol.(Lond), 510, 499512.

73. Fletcher, J.M., Greenfield, B.F., Hardy, C.J., Scargill, D. and Woodhead, J.L.1961) Ruthenium red. J.Chem.Soc., 5, 2000-2006.

74. Fonyo, A., Ligeti, E., Palmieri, F. and Quagliariello, E. (1975) Carrier mediatedtransport of phosphate in mitochondria, pp. 287- 306.1.:. Gardos. G,. Szasz. I,. ed. Biomembranes:. structure, and. function. Amsterdam,.1. North-Holland,., 35,

75. Frieden, C. (1970) Kinetic aspects of regulation of metabolic processes. Thehysteretic enzyme concept. J.Biol.Chem., 245, 5788-5799.

76. Gavin, C.E., Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1990) Manganese and calcium effluxkinetics in brain mitochondria. Relevance to manganese toxicity. Biochem.J., 266, 329-334.

77. Gavin, C.E., Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1999) Manganese and calciumtransport in mitochondria: implications for manganese toxicity. Neurotoxicology., 20, 445-453.

78. Goring, G.G., Nayler, W.G. and Spieckermann, P.G. (1977) The release ofcalcium from cardiac mitochondria: the importance of the calcium-protein ratio. Basic Res.Cardiol., 72, 77-81.

79. Gornall, A.G., Bardawill, C.J. and David, M.M. (1949) Determination of serumpriteins by means of the biuret reaction. J.Biol.Chem., 177, 751-766.

80. Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1994) Transport of calcium by mitochondria.

81. J.Bioenerg.Biomembr., 26, 471-485.

82. Gunter, Т.Е., Buntinas, L„ Sparagna, G.C. and Gunter, K.K. (1998) The Ca2+transport mechanisms of mitochondria and Ca2+ uptake from physiological-type Ca2+ transients. Biochim.Biophys.Acta, 1366, 5-15.

83. Gunter, Т.Е., Gunter, K.K., Puskin, I.S. and Russel, P.R. (1978) Efflux of Ca2+and Mg2+from rat liver mitochondria. Biochemistry, 17, 339-345.

84. Gunter, Т.Е. and Pfeiffer, D.R. (1990) Mechanisms by which mitochondriatransport calcium. Am.J.Physiol., 258, c755-c786

85. Gunter, T.E., Wingrove, D.E., Banerjee, S. and Gunter, K.K. (1988) Mechanisms of mitochondrial calcium transport. Adv.Exp.Med.Biol., 232, 1-14.

86. Hajnoczky, G., Hager, R. and Thomas, A.P. (1999) Mitochondria suppress local feedback activation of inositol 1,4,5- trisphosphate receptors by Ca2+. J.Biol.Chem., 274, 14157-14162.

87. Halestrap, A.P. (1989) The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochim.Biophys.Acta, 973, 355-382.

88. Hansford, R.G. (1994) Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport. J.Bioenerg.Biomembr., 26, 495-508.

89. Hansford, R.G. and Zorov, D. (1998) Role of mitochondrial calcium transport in the control of substrate oxidation. Mol.Cell Biochem., 184, 359-369.

90. Happel, R.D. and Krall, A.R. (1979) Partial reconstitution of calcium uptake with a soluble calcium- binding glycoprotein in rat liver mitochondria proceedings. Biochem.Soc.Trans., 7, 1311-1312.

91. Harris, E.J. and Zaba, B. (1977) The phosphate requirement for Ca2+ uptake by heart and liver mitochondria. FEBS Lett., 79, 284-290.

92. Heaton, G.M. and Nicholls, D.G. (1976) The calcium conductance of the inner membrane of rat liver mitochondria and the determination of the calcium electrochemical gradient. Biochem.J., 156, 635-646.

93. Hoser, N., Dawczynski, H., Winnefeld, K. and Dargel, R. (1978) Control of mitochondrial Mg++-efflux. Acta Biol.Med.Ger., 37, 19-29.

94. Hutson, S.M. (1977) Steady state kinetics of energy-dependent Ca2+ uptake in rat liver mitochondria. J.Biol.Chem., 252(13), 4539-4545.

95. Khodorov, B., Pinelis, V., Storozhevykh, T., Vergun, O. and Vinskaya, N. (1996)

96. Dominant role of mitochondria in protection against a delayed neuronal Ca2+ overload induced by endogenous excitatory amino acids following a glutamate pulse. FEBS Lett., 393, 135-138.

97. Kraus-Friedmann, N. (1990) Calcium sequestration in the liver. Cell Calcium,11, 625-640.

98. Kretsinger, R.H. (1976) Calcium-binding proteins. Annu.Rev.Biochem., 45, 239266.

99. Kroner, H. (1986a) "Allosteric regulation" of calcium-uptake in rat livermitochondria. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 367, 483-493.

100. Kroner, H. (1986b) Ca2+ ions, an allosteric activator of calcium uptake in rat livermitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 251, 525-535.

101. Kroner, H. (1988b) Spermine, another specific allosteric activator of calciumuptake in rat liver mitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 267, 205-210.

102. Kroner, H. (1988a) The real kinetics of the mitochondrial calcium uniporter of theliver and its role in cell calcium regulation. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 369, 149-155.

103. Kuboyama, M., Yong, F.C. and King, T.E. (1972) Studies on cytochromeoxidase. 8. Preparation and some properties of cardiac cytocrome oxidase. J.Biol.Chem., 247, 6375-6383.

104. Kun, E. (1976) Kinetics of ATP-dependent Mg2+ flux in mitochondria.

105. Biochemistry, 15, 2328-2336.

106. Kushnareva, Y.E., Haley, L.M. and Sokolove, P.M. (1999) The role of low (< or =1 mM) phosphate concentrations in regulation of mitochondrial permeability: modulation of matrix free Ca2+ concentration. Arch.Biochem.Biophys., 363, 155-162.

107. Langer, G.A. (1992) Calcium and the heart: exchange at the tissue, cell, andorganelle levels. FASEBJ., 6, 893-902.

108. Massari, S. (1996) Kinetic analysis of the mitochondrial permeability transition. J.Biol.Chem., 271, 31942-31948.

109. McCormack, J.G. (1989) Effects of spermine on mitochondrial Ca2+ transport and the ranges of extramitochondrial Ca2+ to which the matrix Ca2+- sensitive dehydrogenases respond. Biochem.J., 264, 167-174.

110. McCormack, J.G. and Denton, R.M. (1993) Mitochondrial Ca2+ transport and the role of intramitochondrial Ca2+ in the regulation of energy metabolism. Dev.Neurosci., 15, 165-173.

111. Medvedev, B.I., Azarashvily, T.S., Evtodienko, Yu.V., Luk'yanenko, A.I. and Yagushinskij, L.S. (1982) Isolation of calcium-transporting lipid from the mitochondrial glycolipoprotein. Mol.Cell Biochem., 48, 19-23.

112. Mela, L. (1968) Interactions of La3+ and local anesthetic drugs with mitochondrial Ca++ and Mn++ uptake. Arch.Biochem.Biophys., 123, 286-293.

113. Mela, L. and Chance, B. (1969) Calcium carrier and the "high affinity calcium binding site" in mitochondria. Biochem.Biophys.Res.Commun., 35, 556-559.

114. Metz, A. and Reinert, K. (1974) The influence of fat on the determination of protein by the biuret and the Folin-Ciocalteau methods in liver homogenates. Z.Klin. Chem.Klin.Biochem., 12, 361-366.

115. Miyamae, M., Camacho, S.A., Weiner, M.W. and Figueredo, V.M. (1996) Attenuation of postischemic reperfusion injury is related to prevention of Ca2+.m overload in rat hearts. Am.J.Physiol. , 271, H2145-53.

116. Monteith, G.R. and Blaustein, M.P. (1999) Heterogeneity of mitochondrial matrix free Ca2+: resolution of Ca2+ dynamics in individual mitochondria in situ. Am.J.Physiol., 276, C1193-204.

117. Moore, C.L. (1971) Specific inhibition of mitochondrial Ca++transport by ruthenium red. Biochem.Biophys.Res.Commun., 42, 298-305.

118. Moravec, C.S. and Bond, M. (1991) Calcium is released from the junctional sarcoplasmic reticulum during cardiac muscle contraction. Am.J.Physiol., 260, H989-H997

119. Nicchitta, C.V. and Williamson, J.R. (1984) Spermine. A regulator of mitochondrial calcium cycling. J.Biol.Chem., 259, 12978-12983.

120. Nicholls, D.G. (1974) The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur.J.Biochem., 50, 305-315.

121. Nicholls, D.G. (1978) The regulation of extramitochondrial free calcium ion concentration by rat liver mitochondria. Biochem.J., 176, 463-474.

122. Nicholls, D.G. and Budd, S.L. (1998) Neuronal excitotoxicity: the role of mitochondria. Biofactors, 8, 287-299.

123. Nicholls, D.G. and Scott, I.D. (1980) The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport. The role of ATP in the discrimination between kinetic and membrane- potential-dependent calcium-ion efflux mechanisms. Biochem.J., 186, 833-839.

124. Noack, E.A. and Heinen, E.M. (1977) A kinetic study of calcium transort by heart mitochondria. Eur.J.Biochem., 79, 245-250.1. Список литературы

125. Ohnuma, К., Kazawa, Т., Ogawa, S., Suzuki, N., Miwa, A. and Kijima, H. (1999)

126. Cooperative Ca2+ removal from presynaptic terminals of the spiny lobster neuromuscular junction. Biophys.J., 76, 1819-1834.

127. Panfili, E., Sandri, G„ Sottocasa, G.L., Lunazzi, G„ Liut, G. and Graziosi, G.1976) Specific inhibition of mitochondrial Ca2+ transport by antibodies directed to the Ca2+-binding glycoprotein. Nature, 264, 185-186.

128. Panov, A. and Scarpa, A. (1996) Mg2+ control of respiration in isolated rat livermitochondria. Biochemistry , 35, 12849-12856.

129. Pardee, A.B. and Potter, V.R. (1948) Inhibition of succinic dehydrogenase byoxaloacetate. J.Biol.Chem., 176, 1085-1090.

130. Pinton, P., Pozzan, T. and Rizzuto, R. (1998) The Golgi apparatus is an inositol1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. EMBO J., 17, 5298-5308.

131. Pozzan, T. and Rizzuto, R. (2000) The renaissance of mitochondrial calciumtransport. Eur.J.Biochem., 267, 5269-5273.

132. Prentki, M., Janjic, D. and Wollheim, C.B. (1983) The regulation ofextramitochondrial steady state free Ca2+ concentration by rat insulinoma mitochondria. J.Biol.Chem., 258, 7597-7602.

133. Prestipino, G., Ceccarelli, D., Conti, F. and Carafoli, E. (1974) Interactions of amitochondrial Ca2+-binding glycoprotein with lipid bilayer membranes. FEBS Lett., 45, 99-103.

134. Puskin, J.S., Gunter, Т.Е. and Coene, M.T. (1980) On the role of inorganicphosphate in divalent-cation sequestration by mitochondria. Eur.J.Biochem., 106, 425-429.

135. Puskin, J.S., Gunter, Т.Е., Gunter, K.K. and Russell, P.R. (1976) Evidence formore than one Ca2+ transport mechanism in mitochondria. Biochemistry, 15, 3834-3842.

136. Rahamimoff, R„ Erulkar, S.D., LevTov, A. and Meiri, H. (1978) Intracellular andextracellular calcium ions in transmitter release at the neuromuscular synapse. Ann.N.Y.Acad.Sci., 307, 583-598.

137. Rasgado-Flores, H., Sanchez-Armass, S., Blaustein, M.P. and Nachshen, D.A. (1987) Strontium, barium, and manganese metabolism in isolated presynaptic nerve terminals. Am.J.Physiol., 252, C604-10.

138. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) A re-evaluation of energy-independent calcium-ion binding by rat liver mitochondria. Biochem.J., 142, 555-566.

139. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) Accumulation of lanthanum by rat liver mitochondria. Biochem.J., 138,239-252.

140. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) The inhibition of mitochondrial calcium transport by lanthanides and ruthenium red. Biochem.J., 140, 143-155.

141. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1975) A kinetic study of mitochondrial calcium transport. Eur.J.Biochem., 55, 497-504.

142. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1975) Methodology for in vitro studies of Ca2+ transport. Anal.Biochem., 67, 44-54.

143. Reinhart, P.H., van de Pol, E., Taylor, W.M. and Bygrave, F.L. (1984) An assessment of the calcium content of rat liver mitochondria in vivo. Biochem.J., 218, 415-420.

144. Riley, W.W., Jr. and Pfeiffer, D.R. (1986) Rapid and extensive release of Ca2+ from energized mitochondria induced by EGTA. J.Biol.Chem., 261, 28-31.

145. Rizzuto, R., Pintón, P., Brini, M., Chiesa, A., Filippin, L. and Pozzan, T. (1999) Mitochondria as biosensors of calcium microdomains In Process Citation., Cell Calcium, 26, 193-199.

146. Rottenberg, H. and Marbach, M. (1990) Regulation of Ca2+ transport in brain mitochondria. I. The mechanism of spermine enhancement of Ca2+ uptake and retention. Biochim.Biophys.Acta, 1016, 77-86.

147. Rottenberg, H. and Scarpa, A. (1974) Calcium uptake and membrane potential in mitochondria. Biochemistry, 13, 4811-4817.

148. Rugolo, M. and Zoccarato, F. (1984) Magnesium transport by brain mitochondria: energy requirement and dependence on Ca2+ fluxes. J.Neurochem., 42, 1127-1130.1. Список литеоатиры

149. Sandri, G., Panfili, E. and Sottocasa, G.L. (1976) The calcium-bindingglycoprotein and mitochondrial calcium movements. Biochem.Biophys.Res. Commun., 68, 1272-1279.

150. Sandri, G., Sottocasa, G., Panfili, E. and Liut, G. (1979) The ability of themitochondrial Ca2+-binding glycoprotein to restore Ca2+ transport in glycoprotein-depleted rat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 558, 214-220.

151. Saris, N.-E.L. and Akerman, K.E.O. (1980) Uptake and release of bivalentcations in mitochondria. Curr.Top.Bioenerg., 10, 103-179.

152. Saris, N.E. and Kröner, H. (1990) Regulation of Ca2+ fluxes in rat livermitochondria by Ca2+. Effects on Ca2+ distribution. J.Bioenerg.Biomembr., 22, 81-90.

153. Scarpa, A. (1979) Measurements of cation transport with metallochromicindicators. Methods Enzymol., 56, 301-338.

154. Scarpa, A. and Azzone, G.F. (1968) Ion transport in liver mitochondria. VI. Therole of surface binding on aerobic Ca++translocation. J.Biol.Chem., 243, 5132-5138.

155. Scarpa, A. and Azzone, G.F. (1970) The mechanism of ion translocation inmitochondria. 4. Coupling of K+ efflux with Ca2+ uptake. Eur.J.Biochem., 12, 328-335.

156. Schinder, A.F., Olson, E.C., Spitzer, N.C. and Montal, M. (1996) Mitochondrialdysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. J.Neurosci., 16, 6125-6133.

157. Selivanov, V.A., Ichas, F., Holmuhamedov, E.L., Jouaville, L.S., Evtodienko,

158. Yu.V. and Mazat, J.P. (1998) A model of mitochondrial Ca2+-induced Ca2+ release simulating the Ca2+ oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys.Chem., 72, 111-121.

159. Selwyn, M.J., Fulton, D.V. and Dawson, A.P. (1978) Inhibition of mitochondrialanion permeability by local anaesthetics. FEBS Lett., 96, 1481-1451.

160. Siess, E.A., Kientsch-Engel, R.I. and Wieland, O.H. (1984) Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem.J., 218, 171-176.

161. Skulachev, V.P. (1996) Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maitenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants. Quarterly Reviews of Biophysics, 29, 169-202.

162. Slater, E.C. and Cleland, K.W. (1953) The Effect of Calcium on the Respiratory and Phosphorylative Activities of Heart-Muscle Sarcosomes. Biochem.J., 55, 566-572.

163. Sparagna, G.C., Gunter, K.K. and Gunter, T.E. (1994) A system for producing and monitoring in vitro calcium pulses similar to those observed in vivo. Anal.Biochem., 219, 96-103.

164. Sparagna, G.C., Gunter, K.K., Shen, S.S. and Gunter, T.E. (1995) Mitochondrial calcium uptake from physiological-type pulses of calcium A description of the rapid uptake mode. J.Biol.Chem., 270, 27510-27515.

165. Streb, H., Irvine, R.F., Berridge, M.J. and Schulz, I. (1983) Release of Ca2+from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature , 306, 67-69.

166. Szabo, I. and Zoratti, M. (1992) The Mitochondrial Megachannel Is the Permeability Transition Pore. J.Bioenerg.Biomembr., 24, 111-117.

167. Tashchmukhamedov, B.A., Gagel'gans, A.I., Mamatkulov, K.H. and

168. Makhmudova, E.M. (1972) Inhibiton of Ca2+Transport in Mitochondria by Selective Blockade of Memdrane Mucopolysaccharides by Hexamine Cobaltichloride. FEBS Lett., 28, 239-245.

169. Vainio, H., Mela, L. and Chance, B. (1970) Energy dependent bivalent cation translocation in rat liver mitochondria. Eur.J.Biochem., 12, 387-391.

170. Vasington, F.D. and Murphy, J.V. (1962) Ca++ uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. J.Biol.Chem., 237, 2670-2677.

171. Vinogradov, A. and Scarpa, A. (1973) The initial velocities of calcium uptake by rat liver mitochondria. J.Biol.Chem., 248, 5527-5531.

172. Vinogradov, A.D. (2000) Steady-state and pre-steady-state kinetics of the mitochondrial F(1)F(0) ATPase: is ATP synthase a reversible molecular machine? J.Exp.Biol., 203, 41-49.

173. Williamson, J.R., Williams, R.J., Coll, K.E. and Thomas, A.P. (1983) Cytosolic free Ca2+ concentration and intracellular calcium distribution of Ca2+-tolerant isolated heart cells. J.Biol.Chem., 258, 13411-13414.

174. Wingrove, D.E. and Gunter, T.E. (1986) Kinetics of mitochondrial calcium transport. I. Characteristics of the sodium-independent calcium efflux mechanism of liver mitochondria. J.Biol.Chem., 261, 15159-15165.

175. Yamaguchi, M. (1989) Effect of calcitonin on exchangeable calcium transport in isolated rat hepatocytes. Mol.Cell Endocrinol., 62, 313-318.

176. Ying, W.L., Emerson, J., Clarke, M.J. and Sanadi, D.R. (1991) Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo- bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry, 30, 4949-4952.

177. Zazueta, C., Zafra, G., Vera, G., Sanchez, C. and Chavez, E. (1998) Advances in the purification of the mitochondrial Ca2+ uniporter using the labeled inhibitor 103Ru360. J.Bioenerg.Biomembr., 30, 489-498.

178. Zhou, Z., Matlib, M.A. and Bers, D.M. (1998) Cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals in patch clamped mammalian ventricular myocytes. J.Physiol.(Lond), 507, 379-403.1. Список литературы

179. Автор благодарит заведующего кафедрой биохимии, доктора биологических наук, профессора Андрея Дмитриевича Виноградова за предоставление условий для проведения этой работы и проявленное к ней внимание.

180. Автор признателен своим первым учителям в области биоэнергетики Юрию Наумовичу Лейкину и Татьяне Вадимовне Жаровой - за привитые навыки и стиль научной работы.

181. Автор благодарен всем коллегам по кафедре за понимание и творческую атмосферу, а родным и близким за терпение и поддержку.