Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы"

Филимонов Иван Сергеевич

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА И ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТА ПРОСТАГЛАНДИН Н СИНТАЗЫ

Специальность 03.01.02. - "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

1 6 СЕН 2010

Москва-2010

004608054

Работа выполнена в Международный учебно-научном биотехнологическом центре МГУ имени М.В.Ломоносова и Институте биохимической физики имени Н.М.Эмануэля РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Вржещ Петр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор физ.-мат. наук, профессор Вавилин Василий Александрович

доктор физ.-мат. наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита состоится "23" сентября 2010 г. в 14 часов 00 минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: "19" августа 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

М. Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фермент простагландин II сшггаза (РОНЙ, К.Ф.1.14.99.1) катализирует одну из ключевых реакций каскада арахидоновой кислоты -превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, исходное соединение в биосинтезе всех простагландинов, тромбоксана и простацнклина в организме млекопитающих, в том числе человека. РОПЭ имеет два активных центра, в которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до нроетагландина 02) и пероксидазная (восстановле1ше перекисной группы простаглапдана 02 до спиртовой с образованием нроетагландина Н2) реакции.

Изоферменты простагландин Н еинтазы являются значимыми фармакологическими мишенями (действие всех нестероидных противовоспалительных уедете обусловлено ингибированисм РОНБ), однако механизм действия фермента до конца не установлен, что обуславливает актуальность данной темы.

РОЩ - многосубстратный бифункциональный фермент, подвергающийся необратимой инактивации в ходе катализируемых им реакций. Для исследования кинетических свойств таких сложных ферментов требуется разработка новых теоретических подходов, учитывающих независимое протекание и взаимное влияние катализируемых реакций.

Наряду с арахидоновой кислотой в цикяооксигеназной реакции принимают участие две молекулы кислорода. Между тем работ, посвященных кинетическим исследованиям участия этого субстрата в ферментативной реакции, практически нет. Исследование концентрационных зависимостей по кислороду интересно также потому, что внутриклеточная концентрация кислорода сильно варьирует и отличается от концентрации растворенного молекулярного кислорода при атмосферном давлении.

Для детального исследования явления инактивации фермента РОШ необходимо разработать методы получения концентрационных зависимостей параметров инактивации, в том числе в области низких концентраций субстратов ферментативной реакции, где скорость реакции снижается вследствие расходования субстрата.

Химические механизмы инактивации фермента РСТК в ходе катализируемых реакций до сих пор не установлены. Современные методы масс-спеирометрии могут оказаться полезными для выявления возможных химических модификаций на молекулярном уровне, приводящих к инактивации фермента в ходе катализируемых реакций. Применение этих методов требует разработки и оптимизации способа пробоподготовки.

Эти актуальные вопросы и предстояло решить в данной диссертационной работе.

Цель исследования. Определить кинетический механизм катализа и инактивации в ходе катализируемых реакций бифункционального фермента простаглацдин Н сингазы.

Задачи исследования:

1) Определить условия применил квазистационарного приближения для ферментов, подвергающихся необратимой инактивации в ходе катализируемых реакций. Получить выражения для описания экспериментально наблюдаемых величин.

2) Провести экспериментальное исследование кинетических закономерностей катализа и инактивации РОНВ в случае циклооксигепазной и пероксидазной реакций.

3) Разработать кинетическую модель катализа бифункционального фермента РвШ, учитывающую состояние двух его активных центров, основываясь на двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов.

4) Разработать и обосновать теоретические и практические подходы для определения зависимости константы инактивации от концентрации субстрата путем анализа интегральной кривой в условиях истощения по субстрату.

5) Разработать оптимальный способ пробоподготовки и анализа фермента РОШ методами масс-спектрометрии.

Научная новизна. Проанализирована обобщенная кинетическая схема для ферментов, подверженых необратимой инактивации в ходе катализируемых реакций. Выявлены условия применимости квазистационарного приближения для инактивирующихся ферментов.

Предложен теоретический подход и разработан метод определения зависимости константы инактивации фермента от концентрации субстрата из

иитегральиых кинетических кривых при условии существенного расходования субстрата.

Экспериментально определены зависимости кинетических параметров циклооксигенжшой и пероксидазной реакций PGIIS от концентраций субстратов этих реакций. Показано, что цшшоокеигепазная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Мептен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. В кинетических механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций проведена локализация положения необратимых стадий.

На основании обобщенной двумерной кинетической модели действия для бифункциональных фермеитов разработана кинетическая модель действия фермента PGHS. Получено выражение для скорости циклооксигеназной реакции, описывающее весь набор экспериментальных фактов.

Экспериментально определены зависимости параметров инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций от концентраций субстратов реакций.

Разработана и оптимизирована методика пробоподготовки для исследования фермента PGIIS методами масс-спектрометрии. Получены масс-спектры PGHS для нативного фермента и для фермента, принимавшего участие в катализе циклооксигеназной и пероксидазной реакций.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволили подробнее изучить свойства PGHS и расширить наши представления о механизме функционирования этого фермента.

Представленные в работе кинетические модели могут быть использованы для анализа механизма действия конкретных бифункциональных ферментов.

Знание механизмов протекания реакций PGHS, важного фармакологического объекта, даст возможность скорректировать разработку повых лекарственных препаратов и способов контроля каскада арахидоиовой кислоты т vivo.

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы для подготовки по специальностям биофизика, катализ, биохимия и биотехнология.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международной конференции "Ломоносов-2004" (Москва, 2004 г.), Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005 г.), Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2006 г.), Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2008 г.), Международной конференции "Ломоносов-2009" (Москва, 2004 г.). Работа также докладывалась в рамках семинаров ИБХФ РАН и факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 в научных российских журналах по списку ВАК, 7 в тезисах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Количество страниц_, ссылок_, рисунков_, таблиц_.

Сокращения, пришлые в работе. РвШ - простагландин Н синтаза, Туг* -радикал аминокислотного остатка тирозина, РСС2 - простагландин С2, ГСН2 -простагландин АА - арахидоновая кислота, ВН - донор электронов, РР1Х -протопорфирин IX, 1ХУ - тркхлорусусная кислота, ПААГ - полиакриламидный гель.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Свойства фермента РСНБ

В главе говорится о биологической роли и месте РвШ в цепи синтеза простагландинов, тромбоксана и простациклина (схема 1).

фосфолипиды клеточной мембраны

фосфолипазы

арахидоновая кислота

202 I циклооксигеназная Т активность

pgg2 2е- I

pghs

пероксидазная активность

PGH2

PGH-PGD изомераза

PGH-PGE изомераза

PGF2 изомераза

тромбоксан-синтаза

pgd2

pge2

pgf2„

тха2

проста-циклин-синтаза pgi2

Схема 1. Биосинтез простагландинов, тромбоксана и простациклина Подробно рассмотрена доменная структура РОШ, структура пероксидазного и циклооксигеназного активных центров (рис.1). Описаны каталитические свойства РвШ: циклооксигеназная и пероксидазная реакции, химические превращения, происходящие в ходе этих реакций.

пжроксидазныЛ

активный гц-нтр

_ мед tjfgj

цнкчоокоштначный активный центр

Рис.1 Ленточная диаграмма пространственной структуры димера (А) и мономера (Б) фермента PGHS-1 барана со связанным обратимым ингибитором флурбипрофеном в гидрофобном канале циклооксигеназного активного центра (желтый) [Smith, 2000]. КАТ - каталитический домен (красным отмечена молекула гемина), МСД - мембрансвязывающий домен. EGF - EGF-подобный домен, N - N-конец белковой молекулы.

Глава 2. Критический анализ современного состояния проблемы

Описаны кинетические особенности действия PGHS, дан критический анализ схем, предложенных для описания катализа PGHS различными авторами. Рассмотрены имеющиеся в литературе сведения но инактивации PGHS в процессе катализируемых им реакций и проанализированы кинетические схемы, предложенные другими авторами. Рассмотрена проблема исследования кинетики бифункциональных ферментов. Представлен критический анализ предложенных механизмов для инактивации фермента PGHS. Рассмотрены современные методы масс-спекгрометрия и перспективы использования этих методов для исследования химического мехапизма инактивации фермента PGHS в ходе катализируемых реакций.

Глава 3. Материалы и методы

1) Солюбилизированный препарат PGHS выделяли из везикулярных желез барана по методу [Van der Ouderaa et.al., 1977] с изменениями.

2) Очистку солюбилизированного препарата PGHS проводили методом колоночной хроматографии на носителе DEAE Sepharose. Электрофоретическая чистота полученного препарата PGHS более 95%.

3) Концентрацию белка в препаратах фермента определяли с помощью колориметрических методов [Lowry et.al., 1951, Bradford, 1976].

4) Концентрирование белка для электрофореза в полиакриламидпом геле осуществляли путем осаждения белка при помощи ТХУ или ацетона.

5) Электрофорез в ПААГ проводили в денатурирующих условиях с добавлением детергента додецилсульфата натрия по методу Лэмли [Laemmli, 1970].

6) Гидролиз белка в ПААГ проводили с использованием трипсина в течение 3 часов при 374}, останавливали добавлением свежеприготовленного 0,5% (об/об) раствора муравьиной кислоты в воде.

7) Масс-спектры белка и смеси пептидов, образующихся после обработки белка трипсином, получали на MALDI-TOF масс-спектрометре MicioFlex с использованием стандартной мишени - MSP target polished steel (Bruker, Германия). Масс-спектры получены в рефлекгронной моде, детектировались положительные ионы.

8) Измерение концентрации кислорода для слежения за ходом ципслооксигеназной реакции PGHS осуществляли амперометрически с использованием полярографа «АКПМ-02-05» (ООО «Фирма «Альфа БАССЕНС», Россия), снабженным газодиффузионным платино-серебряным электродом Кларка.

9) Измерение концентрации окисленной формы донора элеетрояов для слежения за пероксидазной реакцией PGHS осуществляли с помощью спектрофотометра «Саху 100» («Varían Inc», США).

10) Методика обработки экспериментальных данных. Для получения значений констант экспериментальные данные аппроксимировали согласно полученным формулам методом нелипейной регрессии с использованием программы Origin 7.0 фирмы Microcal.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Теоретические основы обработки результатов

Глава посвящена выявлению критериев применимости квазистационарпого приближения для многосубстратных ферментов, подвержешшх необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции. В качестве иллюстрации выбран механизм неразветвленной многосубстратной ферментативной реакции, щггермедиагы которой могут подвергаться необратимой инактивации (схема 2) (Вржещ, 1985]

У _Д1 ■■ Y _°7 ч у _"i > у _а< - у _а—1 > у _"и ч у

— — зГ~Р3—" 'Tr~pt—р i—л* —Л| 4 л, 4 ^ 4 л, 4 я, 4 хп ^ 4 хп

к

Схема 2. Обобщенная модель неразветвлешюй ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивацией фермента в процессе реакция.

Здесь X] = I,nj - каталитически актив1ше промежуточные формы фермента

(интермедиаты), Х} - инактивированные формы фермента, a¡ и ¡3¡ ^j = 1,и| -константы скорости реакций первого (псевдопервого) порядка для реакций взаимопревращения интермедиатов [aj > 0, /3, > 0, j = \,nj. Полагали, что субстрат принимает участие в реакции на стадии 1, то есть a¡=k¡-S, концентрации остальных субстратов существенно не меняются. Считали, что ферментативная реакция содержит хотя бы одау пеобратимую стадию, для определенности Рп = 0.

Мы включили в рассмотрение важный, с теоретической и практической точек зрения случай, когда расходование субстрата в ходе реакции приводит к существенному изменению скорости ферментативной реакции, сравнимому с изменением скорости реакции в процессе инактивации фермента.

Схема 2 описана следующей системой уравнений:

= .X^ + flJ-X]^{aJ + ß] l + Xi)-X} (I)

^ = « (п)

Q = ßrXM-krS-X, (Ш) (1)

t = 0: Xj =Х°, X] = О, S = S0,

В этой системе выделили три типа уравнений: (I) - уравнения, описывающие изменение концентраций каталитически активных промежуточных форм фермента (интермедиатов) X/, (II) - уравнения, описывающие изменение концентраций инакгивированных форм фермента Xj; (III) - уравнения, описывающие изменение концентраций субстратов (в данном случае одного субстрата 5).

Схему 2 анализировали с привлечением характеристических времен: тЕ -характеристическое время изменения X/, Ts - характеристическое время расходования S; тЫаа - характеристическое время накопления инактивированной формы фермента X".

С использованием теоремы Тихонова было показано, что для фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции (схема 2), необходимым условием установления квазистационарного состояния по активным формам фермента для процесса расходования субстрата и инактивации в ходе реакции является выполнение соотношений

£«1, ßj «I, (2)

где £ =£0/50, Hj = Xjj+ ß1A + Xj) - безразмерные параметры. Дальнейший анализ системы показал, что:

а) если Ts »тЫаа, происходит полная инактивация фермента при малой конверсии субстрата за время протекания реакции. В этом случае текущее значение стационарной скорости v изменяется согласно следующему уравнению:

v=v0exp(-A-f) (3)

где v0 - начальная стационарная скорость ферментативной реакции, Л -эффективная константа скорости инактивации фермента (далее константа инактивации).

Кинетика накопления продукта Р ферментативной реакции (схема 2) описывается уравнением:

Предельный выход продукта фермсптативной реакции (концентрация продукта реакции после прекращения реакции вследствие полной инактивации фермента) связан с величинами V,, и Л уравнением:

Определение параметров инактивации по данным интегральной кинетики с использованием уравнений (3-5) в условиях, при которых расходованием субстрата можно пренебречь, далее будем называть «метод-1».

б) если г5«тша, происходит полная конверсия субстрата при малой инактивации фермента за время протекания реакции. В этом случае из интегральной кинетики можно определить каталитические параметры фермента. При исследовании кинетики фермента РвНБ этот случай трудно реализуем, так как фермент полностью инактивируется за 1-2 минуты, инактивациошше процессы влияют на форму интегральной кривой уже с первых секунд реакции

в) если г, к тыа, скорость ферментативной реакции снижается как вследствие инактивации, так и по причине снижения концентрации субстрата. В работе показано, что путем обработки интегральных кривых в этом случае можно получить зависимость константы инактивации Л от концентрации субстрата

Где /(»У) - функция зависимости стационарной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата, V - текущая скорость ферментативной реакции, определяемая из интегральной кинетической кривой накопления продукта от времени.

Этот случай имеет важное прикладное значение. Уравнение (6) легло в основу метода определения из интегральных кинетических кривых зависимости константы инактивации фермента от концентрации субстрата при условии существенного расходования субстрата (алгоритм изложен в главе 7). Определение параметров инактивации с использованием уравнения (6), когда расходовагшем субстрата в ходе реакции пренебречь нельзя, далее будем называть «метод-2».

(4)

(5).

(б)

Глава 5. Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазпой реакций, катализируемых ферментом РСНв

Глава посвящена экспериментальному исследованию кинетических закономерностей циклооксигеназной и пероксидазной реакций с использованием «метода-1».

В отсутствие в среде донора электронов в широком диапазопе концентраций кислорода зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода строго линейна в двойных обратных координатах. При различных концентрациях арахидоновой кислоты такие зависимости собой серию прямых, в первом приближении параллельных (рис. 2а). Однако в присутствии донора электронов (представлены эксперименты с использованием адреналина в качестве донора электронов) зависимость скорости от концентрации кислорода в двойных обратных координатах можно считать линейной лишь в первом приближении. В области концентраций кислорода от 30 до 270 мкМ наблюдается воспроизводимое отклонение от линейности (рис. 26). Максимальное значение скорости достигается при 50 мкМ кислорода.

а"1*

Зо,8

□ П

Эо о

одд

*дД

□ 1 О 2 Д 3

0.03

0.12

0,05

0,10 0.15 ([02])-\ мкМ'1

0.06 0,09 ([02])'\ мкМ'1

Рис.2 Зависимость скорости цпклооксигепазпой реакции от концентрации кислорода в двойных обратных координатах в отсутствие донора электронов (о) и в присутствии донора электронов (б), при разных концентрациях АА Стандартный буферный раствор содержал 2мкМ гемина, 10,33 и 100 мкМ АА (1—3 соответственно), а - без донора электронов, б -1 мМ адреналина

Зафиксировав концентрацию арахидоновой кислоты, мы исследовали, как изменяется вид зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода в двойных обратных координатах при варьировании концентрации адреналина. Результаты представлены на рис.3. В результате линейной аппроксимации экспериментальных данных получена серия прямых, пересекающихся в одной точке во втором квадранте.

На рис.4 приведены зависимости скорости циклооксигеназной реакции фермента РОНЯ от концентрации арахидоиовой кислоты в двойных обратных координатах. Мы наблюдали нелинейную зависимость в области как низких (данные не приведены), так и высоких концентраций, что свидетельствует о сложной кинетике реакции. Подобные результаты получены как в присутствии, так и в отсутствие донора электронов, причем разница между кривыми оставалась приблизительно постоянной в области концентраций от 10 до 300 мкМ арахидоиовой кислоты (рис.4).

-0,10 -С,05

0.15

Й. ц а

1 3

2

5

0,05 0.10 ([ОД1, шМ"1

Рис.3 Зависимость скорости циклооксигсиазной реакции от котщецтрации кислорода в двойных обратных координатах, при разных концентрациях донора электронов (адреналин). Стандартный буферный раствор содержал 2 мкМ гемипа, 100 мкМ АА, 0, 30,1000 мкМ адреналина (1-3 соответственно).

О 1 Д 2

э 8 ° ° „ДД д Д Д

0.04

0,20

0,0В 0,12 0.16

([АА])'1, мкМ"' Рвс.4 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции в присутствии и в отсутствие донора электронов от концентрации арахидоиовой кислоты в двойных обратных коордштатах. Стандартный буферный раствор содержал 2ыкМ геыина, 260 мкМ 02, 0 и 1000 мкМ адреналина (1 и 2 соответственно).

Ниже приведена сводная таблица значений Км и Ум по кислороду для циклооксигеназной активности фермента простагландин Н синтаза.

[адреналин], [АА], мкМ 0 30 1000

10 14±2 0,310,05 - 5±0,5 0,9±0,1

33 Я«(0!)>мкМ Кц(02),мкМ/сек 19±2 0,4±0,05 - 6±1 1Д±0,1

100 ^(о,). мкМ 21±3 0,45±0,05 11±2 0,6±0,05 8±1 1,5±0,1

Табл. 1 Кинетические параметры циклоокстеназиой реакции (экспериментально наблюдаемая константа Михаэлиса по кислороду и максимальная скорость реакции).

Для экспериментов, в которых варьировали концентрацию двух субстратов пероксидазной реакции (перекиси водорода и донора электронов ТМРВ), зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации ТМРБ при различных концентрациях перекиси водорода в двойных обратных координатах представляет собой серию прямых, в первом приближении параллельных (рис. 5). Аналогичные результаты получали для зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации перекиси водорода для различых концентраций ТМГО (данные не приведены).

Рис.5 Зависимость скорости пероксидазной Рпс.6 Зависимость максимальной скорости реакции oí копцешращш донора электронов пероксидазной реакции по донору электронов TMPD в двойных обратных координатах, от концентрации Н202 в двойных обратных Стандартный буферный раствор содержал 270 координатах. мкМ Ог, 2000, 350, 200 и 105 мкМ Н2Од (1-4 соответственно).

На рис.б представлена зависимость максимальной скорости пероксидазной реакции по TMPD от концентраций субстрата партнера - перекиси водорода в двойных обратных координатах. Видно, что прямая, приближающая получившиеся зависимости (рис.6), проходит через начало координат. Это свидетельствует о том, что в доступном диапазоне концентраций субстратов величины констант скоростей псевдопервого порядка гораздо меньше величин констант скоростей первого порядка для мономолекулярных реакций в механизме действия фермента PGHS.

Глава б. Построение кинетической модели бифункционального фермепта

Р Ш

В этой главе на основании обобщешюй двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов с учетом экспериментальных кинетических закономерностей разрабатывается кинетическая модель действия фермента РвШ.

В качестве базовой была выбрана двумерная кинетическая схема для бифункциональных ферментов. Использование двумерной схемы единственно возможно для адекватного описания кинетики бифункциональных ферментов, так как необходимо одновременно учитывать состояния двух отдельных активных центров.

Были рассмотрены случаи протекания частных реакций.

Случай 1. Протекает только циклооксигеназная реакция, пероксидазная не

идет (в среде отсутствует допор электронов) (схема 3),

6 1

Схема 3. Цихлооксигеназпая реакция РвШ. Приведен механизм с минимальным количеством интермедиатов.

Введены следующие обозначения, характеризующие состояние циклооксигеназного активного центра: С! = [Туг*] (форма фермепта с радикалом на Туг385), С2 = [Тут*]АА, Сэ = [Туг]АА* (радикал арахидоновой кислоты по 11-му положению), С4 = [Тут]АА02* (11-пероксирадикал арахидоповой кислоты), С5 = [Туг]АА02 (радикал эндопероксида арахидоповой кислоты по 15-му положению), С6 = [Гу^ААОгСЬ* (15-пероксирадшсал РОС2 по 15-му положению), - константы скоростей. На основании имеющихся литературных данных стадию отщепления продукта реакции РОС2 считали необратимой (к^ = 0).

Расчет скорости циклооксигеназной реакции для схемы 3 в квазистационарном приближении привел к получению квадратичной зависимости скорости от концентрации кислорода в двойных обратных координатах. Это находится в противоречии с реальными экспериментальными зависимостями, представляющими собой серию прямых, в первом приближен™ параллельных. Соответствие между экспериментом и теорией достигается в предположении существования необратимых стадий между пунктами донирования субстратов. В этом случае на схеме 3 константы

к_2 11 к-4 равны нулю и теоретическая и экспериментальная зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода хорошо согласуются.

Случай 2. Протекает только пероксидазная реакция, циклооксигеназная не идет (в среде присутствуют субстраты пероксидазной реакции перекись водорода и донор электронов и отсутствует арахидоновая кислота) (схема 4).

р г, р р р Г»Р1^ р Ъу р

Схема 4. Пероксидазная реакция РОНЭ. Приведен механизм с минимальным количеством шггермедпатов.

Введены следующие обозначения, характеризующие состояние пероксидазного активного центра: Р, - [(РР)Ре3+], Р2 - [(РР)Ре3+]ЯООН, Р3 - [(РР*)+ Ре4+0], Р4 -[(РР*УТ'е4Ч)]011, Р5 - [(РР) Ре4+0], Р6 - [(РР) Ре4+0]БН, константы скоростей. На осповании имеющихся литературных данных стадию отщепления продукта реакции РОН2 (либо продукта восстановления другой перекиси) считали необратимой (г.2 = 0).

Расчет скорости пероксидазной реакции для схемы 4 в квазистационарном приближении привел к получению квадратичной зависимости скорости от концентрации донора электронов в двойных обратных координатах. Это находится в противоречии с реальными экспериментальными зависимостями, представляющими собой серию прямых, в первом приближении параллельных. Соответствие между экспериментом н теорией достигается в предположении существования необратимых стадий между пунктами донирования субстратов. В этом случае на схеме 4 константы г.4 и Г-б равны нулю, и теоретическая и экспериментальная зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации донора электронов хорошо согласуются.

Рассмотрим вариант, когда фермент катализирует протекание обеих реакций, тогда двумерная схема для бифункциональных ферментов применительно к РОНБ, с учетом сформулированных выше выводов о необратимости некоторых стадий примет вид схемы 5, где сохранены обозначения, введенные ранее (схемы 3 и 4), но одновременно отображается состояние двух активных центров (циклооксигеназного и пероксидазного) на одной молекуле фермента. Так как присутствие донора электронов влияет на параметры циклооксигеназной реакции (скорость циклооксигеназной реакции возрастает при увеличении концентрации донора электронов, изменяются значения Км и Ум, см.табл.1), то константы скоростей элементарных стадий такой реакции должны зависеть от состояния пероксидазного

активного центра. Для простоты будем считать, что пероксидазиая реакция оказывает влияние только на одну из шести указанных нами на схеме 3 стадий циклооксигеназной реакции, например, па четвертую, то есть к, зависит от состояния активного центра пероксидазпой реакции, тогда как ки к2, к3, к5, к6 не зависят. Соответственно для константы скорости четвертой стадии циклооксигеназной реакции вводится второй индекс, отображающий состояние пероксидажого активного центра (схема 5).

Схема 5. Цихлооксигеназпм и пероксидазлая реакции.

Анализ литературы по кинетике РвШ и наши экспериментальные данные позволили предположить, что квазистационарное состояние, устанавливающееся для интермедиатов пероксидазной реакции, достигается быстро по сравнению с временем установления квазистационара по илтермедиатам циклооксигеназной реакции и не меняется в ходе протекания циклооксигеназной реакции. Тогда с учетом иерархии скоростей пероксидазной и циклооксигеназной реакций можно получить выражение для скорости циклооксигеназной реакции:

Р 1—-—I--—--к го, (7)

V«« [АА] I. |1)Н]+/0[О2] [ОН]+/<

где ц, в, р, ¡.I, V, а) выражаются через константы элементарных стадий пероксидазной, циклооксигеназной реакций и концентрацию 1ЮОН. Это выражение удовлетворительно описывает все полученные нами экспериментальные данные.

Мы наблюдали, что концентрация донора электронов существенно влияет па количественные параметры кислородных зависимостей цикпооксигеназной реакции. Так, например, при концентрациях кислорода 5-10 мкМ, что сравнимо с внутриклеточными концентрациями растворенного кислорода, скорость циклооксигеназной реакции в отсутствие донора электропов была в 6-8 раз меньше, чем в присутствии донора электронов. Это может играть существенную роль в функционировании клетки, особенно при гипоксии, и этот факт, несомненно должен учитываться при моделировании внутриклеточных процессов и создании новых лекарственных препаратов.

Глава 7. Методы определения параметров инактивации фермента РСТВ. Практическое применение результатов теории

Данная глава посвящена оптимизации методов определения параметров инактивации фермента, основы которых заложены в главе 4, с учетом реальных свойств фермента РО!К. Подробно изложен алгоритм действий при обработке экспериментальных данных. Показано, что «метод-2» (см.гл.4), учитывающий при расчетах снижение скорости вследствие конверсии субстрата, позволяет более точно определять параметры инактивации при условии существенного расходования субстрата, в то же время результаты применения «мстода-2» и «мстода-1» совпадают в случае, когда расходованием субстрата можно пренебречь (рис.7а, 76). а б

ад

Ц2 ■

Р'

«8

- 33 40 60 во tx 0 20 <0 Ю 80 100

ТОР0,И<М ршз,и<м

Рис. 7 Зависимость константы инактивации фермента в ходе пероксидазной реакции от концентрации TMPD, расчитанная без учета (а) и с учетом (б) снижения скорости реакции за счет расходования субстрата (а - «метод-!», б - «метод-2»). Стандартный буферный раствор содержал 2 мМ Н202, 2 и 10 нМ фермента PGHS (1 и 2 соответственно).

Кроме того, «мстод-2» позволяет воспроизводить непрерывную зависимость константы инактивации от концентрации субстрата путем обработки интегральной кинетической кривой (рис.8).

[ТМРО], мкМ

Рис. 8 Зависимость текущего значения константы инатшации от концентрации донора электронов ТМРО. Расчет выполнен по «методу-2». Стандартный буфер1шй раствор содержал 2 мМ Н202,10 нМ фермента РСШ.

Глава 8. Кинетические закономерности ипактивацпи фермента РСШ в ходе циклооксигепазнон н псроксидазпой реакций

В главе представлены экспериментально полученные зависимости параметров инактивации фермента РОНЗ в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций от концентраций субстратов этих реакций. Зависимости проанализированы в терминах связности интермедиатов фермента.

Показано, что если инактивация идет через те же интермедиаты, что и катализ, то возможны три случая, которым соответствуют три типа зависимостей значений константы инактивации и предельного выхода продукта реакции от концентраций субстратов. Подробный анализ зависимостей показал, что знаменатели в дробно-рациональных выражениях для скорости реакции и для константы инактивации должны совпадать, а выражение для предельного выхода продукта реакции должно быть либо равно константе, либо прямо пропорционально концентрации субстрата, либо совпадать по виду с уравнением Михаэлиса-Менгеи. Большая часть экспериментальных данных описывается в рамках этой концепции (рис.9).

а

б

НИ-

& МИ-

о <

о

Вг" о ' .-'-В' -■й

о

- -о-

оо

о -1 □ -2

Ц02О (МИ

V

■ё

012

1 X

5 «

«о ем ОДмкМ

-Я

[ЛА],

Рпс.9 Зависимость экспериментально наблюдаемой константы инактивации (а, кривая 1) фермента в ходе цихлооксигеназной реакшш, скорости цпклоокснгепазной реакции (а, кривая 2) и предельного выхода продукта (6) циклооксигеназной реакции фермента РОНЯ от концентрации арахидоновой кислоты. Расчитанно по «методу-2» (см. главу 4). Стандартный буферный раствор содержал 2 мкМ гемнна, 270 мкМ кислорода, 1000 мкМ адреналина.

Искшочением являются концентрационные зависимости значений константы инактивации и предельного выхода продукта пероксидазной реакции от перекиси водорода (рис.10). Механизм инактивации в этом случае другой, инактивации подвергаются интермедиаты, не входящие в каталитический цикл.

б

о-1 и-2

Ь 1 8''

VI

о*

'1

Г?

I-

[Н^, мМ

Рис.10 Зависимость экспериментально наблюдаемой константы ивактиващщ (а кривая /) фермента в ходе пероксидазной реакции, скорости пероксидазной реакции (а кривая 2) и предельного выхода продукта (б) пероксидазной реакции фермента РОИВ от концентрации перекиси водорода. Расчитанно по «методу-2» (см. главу 4). Стандартный буферный раствор содержал 270 мкМ 02, 20 мкМ донора электронов ТМИ).

Таким образом, показано, что существуют два механизма инактивации фермента РОНБ: инактивация, тесно связанная с актом катализа и инактивация, не связанная напрямую с актом катализа. В последнем случае инактивация может быть описана, как инактивация комплекса молекулы белка с молекулой перекиси.

Глава 9. Масс-спекгрометрпчсскне исследования РвПв

В этой главе разрабатываются методы пробоподготовки для исследования инактивации фермента РОШ методами масс-спектрометрии. Для полученных образцов проводятся измерения на масс-спектрометре.

Мы провели циклооксигеназную, пероксидазную, а также обе эти реакции одновременно, после чего определили масс-спектр фермента РОНЭ до и после протекания реакции. Из рис.11 видно, что масса белка возрастает после протекания реакций, причем увеличение массы различно для разных реакций. Масса наиболее распространенного изотопа белка РОН8-1 составила около 71 кДа для нативного фермента, около 72 кДа после пиклооксигеназной реакции, и 73 кДа после одновременного протекания пиклооксигеназной и пероксидазной реакций.

ЖНШЬМ ток, у.е.

Да/е"

1>исЛ1 Масс-спектр фермента РвНБ до реакции (сверху), после циклооксигеназной реакции (середаша), после циклооксигеназной и пероксидазной реакций (внизу).

В таблице 2 приведены сводные результаты анализа масс-спектров обработанного трипсином фермента РвНЗ (цативного и модифицированного в ходе катализируемых им циклооксигеназной и пероксидазной реакций).

Номера Посл-ть П1 П2 Ш П4 П5

а/к в белке а/к »ряд А В А В А В \ В А В

181-184 FLLR 548 * 4 i * +

308-311 EHNR 555 + - 568 - 568 568 - 568

50-54 FGLDR 607 + - + 4 615

110-114 DTLMR 635 - - 650,666 I- 639,649, 666 - 637

312-317 VCDLLK 690 + 4 - + 4

115-120 LVLTVR 700 - 704 4 - + f

241-245 QYQLR 707 + 4 - 4 704 4 704

216-222 MGPGFIX 737 742 - _ _ -

151-157 ILPSVPR 781 + - + 4

567-573 LVCLNTK 790 + - _ - -

55—61 YQCDCTR 888 - 893 - 877,913 - 877,913 - 913 - 861,877, 913

158-166 DCPTPMGTK 949 - - - -

334-342 LIUGETIK 1000 - - - 4 1022 4 1022

460-467 LQPFNEYR 1067 + 4 + + 4 1088

170-179 QLPDAEFLSR 1176 * 1139,1158 + t 4 1158, 1194, 1283 4 1139,1158, 1194

547-560 ASTFGGEVGFNLVK 1426 + 1303,1380, 1399,1439 1303,1399, 1439 - 1305,1415, 1439,1460 4 1303,1305, 1380,1399, 1439, 1460 4 1303,1305, 1380,1399, 1439

574-586 TCPYVSFHVPDPR 1518 * 1503 1 1503 - 1476,1497, 1503 4 1475,1487, 1503 - 1475,1503

98-109 WLWDFVNATFIR 1568 + + - 1561,1566 + 1561 4

533-546 GLLGNPICSPEYWK 1577 + 1588,1595 - 1588,1595 - 1588 - 1588,1595 - 1588,1595

587-600 QEDEPGVERPPTEL 1623 + 1605,1608, 1647 4 1605,1608 + 1626,1631 4 1605,1608 +- 1605,1608

439-453 N1DHHILHVAVDVIK 1723 + 4 1696 _ 1716 + 1696 f 1696,1716

361-374 FDPELLFGAOFOYR 1731 + 4- - + 1738 4 1770,1791

470-455 FGMKPYTSFOELTGEK 1863 + 1841,1879 4 1841,1879 - 1815 4 1841 4

318-333 AEHPTWGDEQLFQTAR 1886 + 1900,1907 f 1901,1907 4- 4 1878,1901, 1907 f 1878

223-240 ALGHGVDLGHIYGDNLE R 1936 + 1918, 1923, 1974 4- 1959,2010 t + 1959 4 1959,2010

62-79 TGYSGPNCTIPEIWTWLR 2094 _ 2044,2080 _ 2044,2080 - 4 2044.2080 - 2044

80-97 TTLRPSPSFIHFMLTHGR 2098 - - _ - -

343-360 IVIEEYVOOLSGYFLOLK 2170 - _ - - -

512-532 CHPNSIFGESMIEMGAPF 2295 - 2305 - 2305 - 2383 - 2305,2383 - 2383

377-396 [AMEFNQLYHWHPLMPD SFR 2532 + 2548 2548 - 4 2548,2564 4 2468,2509, 2548,2581

25-49 ADPGAPAPVNPCCYYPC QHQ GICVR 2659 + 2655 4 2655 - + 2655 2655,2677, 2704,2716

254-277 YQMLNGEVYPPSVEEAP VLMHYPR 2819 + 2799,2835 2840,2857 4 2799,2835 2893 4 2835,2850 2835,2893

Табл.2 Масс-лист обработанного трипсином фермента PGHS. П1 - нативный фермент; П2 -нативный фермент, разбавленный буфером и осажденный ТХУ (контроль); ГО - образец фермента после циклоокситеназной реакции; П4 - образец фермента после пероксидазной реакции; П5 — образец фермента после циклоокситеназной и пероксидазной реакций. А — наличие/отсутствие (+/-) в масс-спектре ионов, совпадающих по массе с пептидами, которые теоретически должны появляться в ходе обработки просгагландин Н синтазы трипсином; В -массы ионов, присутствующие в полученном масс-спектре, отличающиеся от масс пептидов, которые теоретически должны появляться в ходе обработки простагландин Н синтазы трипсином.

Масс-спектры фермента РСИЯ, обработанного трипсшюм, отличаются для нативного фермента и фермента после циклооксигеназной и пероксидазной реакций. В масс-спекгре пативного фермента РИЕ? и фермента после циклооксигеназной и пероксидазной реакций присутствует иоп полипептида, содержащего каталлитически важный аминокислотный остаток Туг385. Количество ионов, представленных в масс-листе, но не совпадающих по массе с полипептидами, которые должны образовываться в ходе трипсинолиза, существенно возрастает после протекания реакций фермента РОНБ, по сравнению с иативным белком, что может быть свидетельством химических модификаций в процессе катализа и инактивации.

ВЫВОДЫ

1. Проведено экспериментальное исследование кинетики катализа фермента РСЖ. Показано, что циклооксигеназная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Ментен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. Показано, что п присутствии донора электронов циклооксигеназная реакция ингибируется избытком кислорода. Показано, что зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты не линеаризуется в двойных обратных координатах, как в отсутствие донора электронов, так и в присутствии донора электропов.

2. Показано, что в механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций присутствуют пеобратимые стадии между пунктами допирования субстратов. Показано, что кинетические закономерности катализа фермента РОНЭ могут быть объяснены в рамках двумерной кинетической модели для многосубстратных бифункциональных ферментов. Показано, что в доступном диапазоне концентраций субстратов величины констант скоростей псевдопервого порядка в механизме пероксидазной реакции гораздо меньше величин констант скоростей первого порядка для мономолекулярных реакций в механизме действия фермента Р01К.

3. Проведено теоретическое исследование обобщенной модели многосубстратной ферментативной реакции, интермедиаты которой могут подвергаться необратимой инактивации в ходе реакции. С применением теоремы Тихонова о предельном переходе в дифференциальных уравнениях с мальм параметром при старшей производной определены условия применимости квазистационарного приближения. Проанализировано квазистационарное решение исходной системы. Дискриминированы решения для каталитических и инактивационпых процессов. Определены экспериментально наблюдаемые характеристики для катализа и инактивации.

4. Разработан метод определения константы инактивации из интегральной кинетической кривой накопления продукта ферментативной реакции в условиях истощения по субстрату. Показано, что метод позволяет рассчитывать константу ипактивации для всего диапазона концентраций варьируемого субстрата, а также позволяет воспроизводить непрерывную зависимость копстаиты инактивации от концентрации субстрата путем обработки интегральной кинетической кривой.

5. Показано, что существуют два механизма инактивации фермента РОТК: инактивация, тесно связанная с актом катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций, и инактивация, обусловленная дополнительным взаимодействием фермента с перекисью водорода.

6. Показано, что масса нативного фермента РСНК меньше, чем масса фермента РОТК после катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Масс-спектры фермента РОНЭ, обработанного трипсином, отличаются для образца нативного фермента и образцов фермента после протекания циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Это может быть свидетельством химических модификаций в процессе катализа и инактивации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Цагтлина Л.А., Каратассо Ю.О., Филимонов НС., Вржещ П.В. Кинетический механизм действия фермента простагландин-Н-синтазы. Влияние доноров электронов на циклооксигеназную реакцию. Биохимия, 2006, том 71, № 11, с. 1534-1543.

2. Филимонов И.С., Вржещ, П.В. Молекулярный кислород (субстрат щшюоксигеназной реакции) в кинетическом механизме бифункционального фермента простаглашщн-Н-синтаза. Биохимия, 2007, том 72, № 9, с.944-953.

3. Цаплина Л.А., Филимонов И.С., Вржещ П.В. Обобщенная модель бифункциональных ферментов с учетом иерархии быстрых и медленных каталитических циклов: молекулярный кислород в кинетическом механизме простагландин-Н-синтазы. Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический, 2007, том 112, № 1, Прил.1., с.155-184.

4. Трушкин Н.А., Филимопов И.С., Вржещ П.В. Ингибирование пикпооксигеназной активности фермента простагландин-Н-сшггазы-1 избытком субстрата (молекулярного кислорода). Биохимия, 2010, том 75, № И.

Тезисы

1. Каратассо Ю.О., Филимопов И.С., Цаплина Л.А. Кинетическая модель бифункционального многосубстратного фермента в стационарном приближении. Тезисы докладов 11-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломопосов-2004", секция Физика, 2004. М.: МГУ. - С. 105.

2. Цаплина Л.А., Каратассо Ю.О., Филимонов И.С. Ферментативный синтез простагландинов. Кинетический механизм действия фермента простагландин-Н-синтазы. Тезисы докладов 11-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2004", секция Биология, 2004. М.: МГУ. -С.168.

3. Филимонов И.С. Зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции фермента простагландин-Н-синтазы от концентрации кислорода // Тезисы

докладов V международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». - 2005. С.34-35.

4. Филимонов И.С. Инактивация фермента фермента простагландин-Н-сшггазы в ходе катализируемых реакций // Тезисы докладов VI международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». - 2006. С.267-269

5. Филимонов И.С., Вржещ П.В. Исследование инактивации фермента простагландин-Н-синтазы методами масс-спектромстрии // Тезисы докладов VIII международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика».-2008. С.231-234

6. Бархатов В.И., Филимонов И.С. Кинетика пероксидазной реакции фермента Егростаглацдин-Н-синтазы // Тезисы докладов 16-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009", секция Биоинженерия и биоипформатика, 2009.

7. Филимонов Й.С., Бархатов В.И. Расчет параметров инактивации фермента простагландин-Н-синтазы с учетом снижения скорости реакции за счет конверсии субстрата в ходе ферментативной реакции // Тезисы докладов 16-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009", секция Физика, 2009.

Отпечатано в ПЦ «Петергоф Принт» Подписано в печать 17.08.2010г. Тираж 100 экз. г.Москва, Ломоносовский пр-т, 23 Тел/факс: 8 (495) 930-84-44 e-mail: petergofprint@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Филимонов, Иван Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Свойства фермента PGHS.

1.1 Биологическая роль PGHS.

1.2 Структура PGHS.

1.3 Каталитические свойства PGHS.

Глава 2. Критический анализ современного состояния проблемы.

2.1 Механизм циклооксигеназной реакции PGHS.

2.2 Механизм пероксидазной реакции PGHS.

2.3 Взаимодействие пероксидазной и циклооксигеназной активностей.

2.4 Бифункциональные ферменты.

2.5 Инактивация PGHS в ходе катализируемых реакций.

2.6 Кинетический механизм инактивации PGHS.

2.7 Исследование PGHS методами масс-спектрометрии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1 Материалы.

3.2 Методы.

3.2.1 Получение PGHS.

3.2.2 Очистка PGHS.

3.2.3 Определение белка.

3.2.4 Осаждение белка.

3.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.2.6 Гидролиз белков в ПААГ.

3.2.7 Получение масс-спектров.

3.2.8 Определение активностей PGHS.

3.2.9 Обработка кинетических кривых.

3.2.10 Приготовление растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Теоретические основы обработки результатов.

4.1 Проблема интерпретации экспериментальных данных.

4.2 Анализ математической модели фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции.

4.2.1 Модель фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции.

4.2.2 Оценка характерных времен тЕ, ts, thwct.

4.2.3 Достижение стационарных состояний по активным формам фермента при расходовании субстрата и инактивации фермента в ходе реакции.

4.2.4 Связность интермедиатов как критерий кинетического поведения механизма ферментативной реакции.

4.2.5 Изменение концентрации субстрата и инактивация фермента в ходе реакции.

Глава 5. Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых ферментом PGHS.

5.1 Молекулярный кислород (субстрат циклооксигеназной реакции) в кинетическом механизме бифункционального фермента простагландин Н синтазы.

5.1.1 Влияние типа донора электронов на качественный вид зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентраций кислорода.

5.1.2 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода при различных концентрациях арахидоновой кислоты.

5.1.3 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода при разных концентрациях донора электронов (адреналина).

5.1.4. Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты в присутствии и в отсутствие донора электронов.

5.2 Пероксидазная активность бифункционального фермента простагландин

Н синтазы.

5.2.1 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации перекиси водорода.

5.2.2 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации TMPD при различных концентрациях перекиси водорода.

Глава 6. Построение кинетической модели бифункционального фермента PGHS.

Глава 7. Методы определения параметров инактивации фермента PGHS.

Практическое применение результатов теории.

7.1. Определение параметров инактивации фермента PGHS в случае малого расходования субстрата за время реакции.

7.2 Определение параметров инактивации фермента PGHS при существенном расходовании субстрата за время реакции.

7.3 Сравнение методов расчета параметров инактивации на модельном эксперименте.

Глава 8. Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций.

8.1 Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной реакции.

8.2 Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе пероксидазной реакции.

8.3 Анализ экспериментальных данных в терминах связности.

Глава 9. Масс-спектрометрические исследования PGHS.

9.1 Изменение массы молекулы PGHS в ходе катализируемых реакций.

9.2 Разработка и оптимизация методов пробоподготовки для исследования фермента PGHS методами масс-спектрометрии.

9.3 Сравнение методов пробоподготовки фермента PGHS для масс-спектрометрических исследований.

9.4 Масс-спектр белка, обработанного трипсином.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы"

Фермент простагландин Н синтаза (PGHS, простагландин-эндопероксид синтаза, циклооксигеназа К.Ф. 1.14.99.1) — катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, который является исходным соединением в биосинтезе простагландинов, тромбоксана и простациклина в организме млекопитающих, в том числе человека [1]. PGHS имеет два активных центра, в которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до простагландина G2 [2]) и пероксидазная (восстановление перекисной группы простагландина G2 до спиртовой [3]) реакции. В результате двух реакций образуется простагландин Н2 [4], который далее под действием специфических ферментов — конвертаз — может превращаться в другие физиологически активные соединения, такие как простагландины Е2, D2, F2a, тромбоксан А2, простациклин [1, 5, 6, 7].

Простагландины являются внутриклеточными сильнодействующими регуляторами, участвующими в формировании клеточного ответа на самые различные внешние воздействия, включая гормональные, механические, действие лекарственных препаратов и др. [8].

У млекопитающих одна изоформа простагландин Н синтаза (PGHS-1) постоянно присутствует в клетках, обеспечивая их нормальное функционирование [9], другая изоформа (PGHS-2) нарабатывается в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста [10]. Изоферменты простагландин Н синтазы являются значимыми фармакологическими мишенями (действие всех нестероидных противовоспалительных средств обусловлено ингибированием этого фермента), однако механизм действия фермента до конца не установлен, что обуславливает актуальность данной темы.

PGHS является многосубстратным бифункциональным ферментом, подвергающимся, необратимой инактивации в ходе катализируемых им реакций. Для исследования кинетических свойств таких сложных ферментов 7 требуется разработка новых теоретических подходов, учитывающих независимое протекание и взаимное влияние катализируемых реакций.

Наряду с арахидоновой кислотой в циклооксигеназной реакции принимают участие две молекулы кислорода. Между тем работ, посвященных исследованию влияния концентрации этого субстрата на ферментативную реакцию практически нет [11, 12]. Исследование концентрационных зависимостей по кислороду интересно также потому, что внутриклеточная концентрация кислорода сильно варьирует и отличается от концентрации растворенного молекулярного кислорода при атмосферном давлении. [12].

Для детального исследования явления инактивации фермента PGHS необходимо разработать методы получения концентрационных зависимостей параметров инактивации, в том числе в области низких концентраций субстратов ферментативной реакции, где скорость реакции снижается вследствие расходования субстрата.

Химические механизмы инактивации фермента PGHS в ходе катализируемых реакций до сих пор не установлены. Современные методы масс-спектрометрии могут оказаться полезными для выявления возможных химических модификаций на молекулярном уровне, приводящих к инактивации фермента в ходе катализируемых реакций. Применение этих методов требует разработки и оптимизации способа пробоподготовки.

Эти актуальные вопросы и предстояло решить в данной диссертационной работе.

Цель исследования. Определить кинетический механизм катализа и инактивации в ходе катализируемых реакций бифункционального фермента простагландин Н синтазы.

Задачи исследования:

1) Определить условия применения стационарного приближения для ферментов, подвергающихся необратимой инактивации в ходе 8 катализируемых реакций. Получить выражения для описания экспериментально наблюдаемых величин.

2) Провести экспериментальное исследование кинетических закономерностей катализа и инактивации PGHS в случае циклооксигеназной и пероксидазной реакций.

3) Разработать кинетическую модель катализа бифункционального фермента PGHS, учитывающую состояние двух его активных центров, основываясь на двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов.

4) Разработать и обосновать теоретические и практические подходы для определения зависимости константы инактивации от концентрации субстрата путем анализа интегральной кривой в условиях истощения по субстрату.

5) Разработать оптимальный способ пробоподготовки и анализа фермента PGHS методами масс-спектрометрии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Филимонов, Иван Сергеевич

выводы

1. Проведено экспериментальное исследование кинетики катализа фермента PGHS. Показано, что циклооксигеназная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Ментен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. Показано, что в присутствии донора электронов циклооксигеназная реакция ингибируется избытком кислорода. Показано, что зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты не линеаризуется в двойных обратных координатах, как в отсутствие донора электронов, так и в присутствии донора электронов.

2. Показано, что в механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций присутствуют необратимые стадии между пунктами донирования субстратов. Показано, что кинетические закономерности катализа фермента PGHS могут быть объяснены в рамках двумерной кинетической модели для многосубстратных бифункциональных ферментов. Показано, что в доступном диапазоне концентраций субстратов величины констант скоростей псевдопервого порядка в механизме пероксидазной реакции гораздо меньше величин констант скоростей первого порядка для мономолекулярных реакций в механизме действия фермента PGHS.

3. Проведено теоретическое исследование обобщенной модели многосубстратной ферментативной реакции, интермедиаты которой могут подвергаться необратимой инактивации в ходе реакции. С применением теоремы Тихонова о предельном переходе в дифференциальных уравнениях с малым параметром при старшей производной определены условия применимости стационарного приближения. Проанализировано квазистационарное решение исходной системы. Дискриминированы решения для каталитических и инактивационных процессов. Определены экспериментально наблюдаемые характеристики для катализа и инактивации.

141

4. Разработан метод определения константы инактивации из интегральной кинетической кривой накопления продукта ферментативной реакции в условиях истощения по субстрату. Показано, что метод позволяет рассчитывать константу инактивации для всего диапазона концентраций варьируемого субстрата, а также позволяет воспроизводить непрерывную зависимость константы инактивации от концентрации субстрата путем обработки интегральной кинетической кривой.

5. Показано, что существуют два механизма инактивации фермента PGHS: инактивация, тесно связанная с актом катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций, и инактивация, обусловленная дополнительным взаимодействием фермента с перекисью водорода.

6. Показано, что масса нативного фермента PGHS меньше, чем масса фермента PGHS после катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Масс-спектры фермента PGHS, обработанного трипсином, отличаются для образца нативного фермента и образцов фермента после протекания циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Это может быть свидетельством химических модификаций в процессе катализа и инактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Проанализирована обобщенная кинетическая схема для ферментов, подверженных необратимой инактивации в ходе катализируемых реакций. Выявлены условия применимости стационарного приближения для инактивирующихся ферментов.

Предложен теоретический подход и разработан метод определения зависимости константы инактивации фермента от концентрации субстрата из интегральных кинетических кривых при условии существенного расходования субстрата.

Экспериментально определены зависимости кинетических параметров циклооксигеназной и пероксидазной реакций PGHS от концентраций субстратов этих реакций. Показано, что циклооксигеназная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Ментен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. В кинетических механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций проведена локализация положения необратимых стадий.

На основании обобщенной двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов разработана кинетическая модель действия фермента PGHS. Получено выражение для скорости циклооксигеназной реакции, описывающее весь набор экспериментальных фактов.

Экспериментально определены зависимости параметров инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций от концентраций субстратов реакций.

Разработана и оптимизирована методика пробоподготовки для исследования фермента PGHS методами масс-спектрометрии. Получены масс-спектры PGHS для нативного фермента и для' фермента, принимавшего участие в катализе циклооксигеназной ^ пероксидазной реакций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Филимонов, Иван Сергеевич, Москва

1. Samuelsson, В. Prostaglandins and thromboxanes / В. Samuelsson, M. Goldyne, E. Granstrom, M. Hamberg, S. Hammarstrom, C. Malmsten // Annu. Rev. Biochem. 1978. - V. 47. - P. 997-1029.

2. Hamberg, M. Isolation and structure of two prostaglandin endoperoxides that cause platelet aggregation / M. Hamberg, J. Svensson, T. Wakabayashi, B. Samuelsson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974. - V. 71. - №2. - P. 345-349.

3. Hamberg, M. Detection and isolation of an endoperoxide intermediate in prostaglandin biosynthesis / M. Hamberg, B. Samuelsson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. - V. 70. - №3. - P. 899-903.

4. Helliwell, R.J.A. Prostaglandin synthases: recent developments and a novel hypothesis / R.J.A. Helliwell, L.F. Adams, M.D. Mitchell // Prost. Leukot. and Essential Fatty Acids. 2004. - V. 70. - №2. - P. 101-113.

5. Vane, J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs / J.R. Vane // Nature 1971. - V. 231. - P. 232-235.

6. Hammarstrom, S. Biosynthesis and biological actions of prostaglandins and thromboxanes / S. Hammarstrom // Arch. Biochem. Biophys. — 1982. V. 214.-№2.-P. 431-445.

7. Yokoyama, С. Cloning of human gene encoding prostaglandin endoperoxide synthase and primary structure of the enzyme / C. Yokoyama, T. Tanabe // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - V. 165. - P. 888-894.

8. Lands, W.E.M. Oxygen requirement for prostaglandin biosynthesis / W.E.M. Lands, J. Sauter, G.W. Stone // Biochem. Prostaglandins and Medicine-1978.-V. 1. —№2. — P. 117-120.

9. Juranek, I. Affinities of various mammalian arachidonate lipoxygenases and cyclooxygenases for molecular oxygen as substrate / I. Juranek, H. Suzuki, S. Yamamoto // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1436. - №3. - P. 509-518.

10. Kuehl, F.A.Jr. Prostaglandins, arachidonic acid, and inflammation / F.A.Jr. Kuehl, R.W. Egan // Science. 1980 Nov 28. - V. 210. - №4473. - P. 978984.

11. Feigen, L.P. Vascular influences of prostaglandins: introduction / L.P. Feigen, A.L. Hyman // Fed. Proc. 1981 May 15. - V. 40. - №7. - P. 19851986.

12. Patrono, С. Aspirin as an antiplatelet drug / C. Patrono // N. Engl. J. Med. -1994.-V. 330.-№18.-P. 1287-1294.

13. Kuehl, F.A.Jr. Role of prostaglandin endoperoxide PGG2 in inflammatory processes / F.A.Jr. Kuehl, J.L. Humes, R.W. Egan, E.A. Ham, G.C. Beveridge, C.G. Van Arman // Nature. 1977. - V. 265. - P. 170-173.

14. Vane, J.R. Prostaglandins as mediators of inflammation / J.R. Vane // Adv. Prostaglandin and Thromboxane Res. 1976. - V. 2. - P. 791-801.

15. Zhang, Y. Inhibition of cyclooxygenase-2 rapidly reverses inflammatory hyperalgesia and prostaglandin E2 production / Y. Zhang, A. Shaffer, J. Portanova, K. Seibert, P.C. Isakson // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1997. V. 283. -№3.- P. 1069-1075.

16. Watanabe, K. Biosynthesis of prostaglandin F2 alpha from prostaglandins H2 and D2 by an apparently homogeneous enzyme / K. Watanabe, R. Yoshida, T. Shimizu, O. Hayaishi // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 1985.- V. 15.-P. 151-153.

17. Wlodawer, P. Some properties of prostacyclin synthase from pig aorta / P. Wlodawer, S. Hammarstrom // FEBS Lett. 1979. - 97 (1). - P. 32-36.

18. Ullrich, V. Thromboxane synthase as a cytochrome P450 enzyme / V. Ullrich, M. Haurand // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. -1983.-V. 11.-P. 105-110.

19. Christ-Hazelhof, E. Purification and characterisation of prostaglandin endoperoxide D-isomerase, a cytoplasmic, glutathione-requiring enzyme / E. Christ-Hazelhof, D.H. Nugteren // Biochim. Biophys. Acta 1979. - V. 572. -№1.-P. 43-51.

20. Bergstrom, S. The enzymic formation of prostaglandin E2 from arachidonic acid. Prostaglandins and related factors 32 / S. Bergstrom, H. Danielsson, B. Samuelsson // Biochim. Biophys. Acta 1964. - V. 90. - P. 207-210.

21. Hayaishi, O. Prostaglandins and sleep / O. Hayaishi, H. Matsumura // Adv. Neuroimmunol. 1995. - V. 5. - P. 211-216.

22. Варфоломеев, С.Д. Простагландины молекулярные биорегуляторы / С.Д. Варфоломеев, А.Т. Мевх. - М.: Изд-во Московского ун-та, 1985.

23. Giles, H. The biology and pharmacology of PGD2 / H. Giles, P. Leff // Prostaglandins 1988 Feb. - V. 35. - №2. - P. 277-300.

24. Hayaishi, O. Prostaglandin D synthase is the key enzyme in the promotion of physiological sleep / O. Hayaishi, H. Matsumura, Y. Urade // J. Lipid. Mediat.- 1993.-V. 6.-P. 429-431.

25. Tomura, T. Distribution of prostaglandins in the animal kingdom / T. Tomura, H. Ogata // Biochem. Biophys. Acta 1976. - V. 431. - №2. - P. 127-131.

26. Borgeat, P. Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leucocytes:unstable intermediates in formation of dihydroxy acids / P. Borgeat, B.146

27. Samuelsson//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976.-V. 73.-№7.-P. 32133217.

28. Miyamoto, T. Purification of prostaglandin endoperoxide synthetase from bovine vesicular gland microsomes / T. Miyamoto, N. Ogino, S. Yamamoto, O. Hayaishi // J. Biol. Chem. 1976 May 10. - V. 251. - №9. - P. 26292636.

29. Roth, G.J. The heme-binding properties of prostaglandin synthetase from sheep vesicular gland / G.J. Roth, E.T. Machuga, P. Strittmatter // J. Biol. Chem. 1981 Oct 10.-V. 256.-№19.-P. 10018-10022.

30. Van der Ouderaa, F.J. On the haemoprotein character of prostaglandin endoperoxide synthetase / F.J. Van der Ouderaa, M. Buytenhek, F.J. Slikkerveer, D.A. van Dorp // Biochim. Biophys. Acta. — 1979 Jan 29. -572(1).-P. 29^12.

31. Kulmacz, R.J. Protection of prostaglandin H synthase from trypsin upon binding of heme / R.J. Kulmacz, W.E.M. Lands // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982 Jan 29. - V. 104. - №2. - P. 758-764.

32. Veno, R. Activation mechanism of prostaglandin endoperoxide synthetase by hemoproteins / R. Veno, T. Shimizu, K. Kondo, O. Hayaishi // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - №10. - P. 5584-5588.

33. Marshall, P.J. Prostaglandin H synthase: distinct binding sites for cyclooxygenase and peroxidase substrates / P.J. Marshall, R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1988. - V. 266. - P. 162-170.

34. Picot, D. The X-ray crystal structure of the membrane protein prostaglandin H2 synthase-1 / D.Picot, P.J. Loll, R.M. Garavito // Nature 1994. - V. 367. - P. 243-249.

35. Fu, J.Y. The induction and suppression of prostaglandin H2 synthase (cyclooxygenase) in human monocytes / J.Y. Fu, J.L. Masferrer, K. Seibert, A. Raz, P. Needleman // J. Biol. Chem. 1990 Oct 5. - V. 265. - №28. - P. 16737-16740.

36. Hla, T. Human cyclooxygenase-2 cDNA / T. Hla, K. Neilson // Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 1992 Aug 15.-V. 89.-№16.-P. 7384-7388.

37. Smith, W.L. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology / W.L. Smith, D.L. DeWitt, R.M. Garavito // Annu. Rev. Biochem. 2000. -V. 69.-P. 145-182.

38. Luong, С. Flexibility of the NSAID binding site in the structure of human cyclooxygenase-2 / C. Luong, A. Miller, J. Barnett, J. Chow, C. Ramesha, M.F. Browner // Nat. Struct. Biol. 1996. - V. 3. - P. 9277-9233.

39. Kulmacz, R.J. Concerted loss of cyclooxygenase and peroxidase activities from prostaglandin H synthase upon proteolytic attack / R.J. Kulmacz // Prostaglandins 1989. - V. 38. - P. 277-288.

40. Raz, A. Differential modification of cyclooxygenase and peroxidase activities of prostaglandin endoperoxidase synthase by proteolytic digestion and hydroperoxides / A. Raz, P. Needleman // Biochem. J. 1990. — V. 269. - P. 603-607.

41. Guo, Q. Comparison of prostaglandin H synthase isoform structures using limited proteolytic digestion / Q. Guo, S. Chang, L. Diekman, G. Xiao, R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 344. - P. 150-158.

42. Kulmacz, R.J. Comparison of the properties of prostaglandin H synthase-1 and -2 / R.J. Kulmacz, W.A. van der Donk, A.L. Tsai // Prog. Lipid. Res. — 2003. V. 42. - №5. - P. 377^104.

43. Toh, H. Prostaglandin endoperoxide synthase contains an EGF-like domain /H. Toh//FEBS Lett. 1989.-V. 258.-P. 317-319.

44. Smith, T. Purification and characterization of the human recombinant histidine-tagged prostaglandin endoperoxide H synthases-1 and -2 / T. Smith, J. Leipprandt, D. DeWitt // Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 375.-P. 195-200.

45. Chandraseseekharan, N.V. COX-3 a cyclooxygenase-1 variant inhibited byacetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, andexpression / N.V. Chandraseseekharan, H. Dai, K.L. Roos, N.K. Evanson, J.149

46. Tomsik, T.S. Elton, D.L. Simmons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 99.-P. 13926-13931.

47. Shaftel, S.S. COX-3: a splice variant of cyclooxygenase-1 in mouse neural tissue and cells / S.S. Shaftel, J.A. Olschowka, S.D. Hurley, A.H. Moore, M.K. O'Banion // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 2003. - V. 119. - P. 213215.

48. Smith, W.L. Prostaglandin endoperoxide H synthases (cyclooxygenases)-l and -2 / W.L. Smith, R.M. Garavito, D.L. DeWitt // J. Biol. Chem. 1996. -V. 271.-P. 33157-33160.

49. Malkovski, M.G. The productive conformation of arachidonic acid bound to prostaglandin synthase / M.G. Malkovski, S.L. Ginell, W.L. Smith, R.M. Garavito // Science 2000. - V. 289. -№5486. - P. 1933-1937.

50. Nugteren, D.H. Isolation and properties of intermediates in prostaglandin biosynthesis / D.H. Nugteren, E. Hazelhof // Biochim. Biophys. Acta 1973 Dec 20. - V. 326. -№3. - P. 448-461.

51. Struijk, C.B. Specificity in the enzymayic conversion of polyunsaturated fatty acids into prostaglandins / C.B. Struijk, R.K. Beerthuis, D.A. Van Dorp // Nobel Symposium 2. Prostaglandins, Stokholm, Almqwist & Wiksell. — 1967.-P. 51-56.

52. Van Dorp, D.A. Recent development in the biosynthesis and analyses of prostaglandins / D.A. Van Dorp // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1971. - V. 180. — №1. - P. 181-195.

53. Hemler, M.E. Lipoxygenation activity of purified prostaglandin-forming cyclooxygenase / M.E. Hemler, C.G. Crawford, W.E.M. Lands // Biochemistry-1978 May2.-V. 17.-№9.-P. 1772-1779.

54. Hemler, M.E. Accelerative autoactivation of prostaglandin biosynthesis by PGG2 / M.E. Hemler, G. Graff, W.E.M. Lands // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978 Dec 29.-V. 85.-№4.-P. 1325-1331.

55. Hemler, M.E. Evidence for a peroxide-initiated free radical mechanism of prostaglandin biosynthesis / M.E. Hemler, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. — 1980 Jul 10.-V. 255.-№13.-P. 6253-6261.

56. Marnett, L.J. Oxygen 18 investigation, of the prostaglandin synthetasedependent co-oxidation of diphenylisobenzofuran / L.J. Marnett, M.J:151

57. Bienkowski, W.R. Pagels // J. Biol. Chem. 1979 Jun 25. - V. 254. - №12. -P. 5077-5582.

58. Hamberg, M. On the mechanism of the biosynthesis of prostaglandins E-l and F-l-alpha / M. Hamberg, B. Samuelsson // J. Biol. Chem. — 1967 Nov 25.-V. 242.-№22.-P. 5336-5343.

59. Nugteren, D.H. The participation of molecular oxygen in the biosynthesis of rostaglandins / D.H. Nugteren, D.A. van Dorp // Biochim. Biophys. Acta -1965 Jun 1. V. 98. - №3. - P. 654-656.

60. Samuelsson, B. On the incorporationn of oxygen in the conversion of 8,11,14-eicosatrienoic acid to prostaglandin El / B. Samuelsson // J. Amer. Chem. Soc. 1965. - V. 87.-№13.-P. 3011-3013.

61. Samuelsson, B. Biosynthesis of prostaglandins / B. Samuelsson // Fed. Proc. 1972. -V. 31. -№5. — P. 1442-1450.

62. Egan, R.W. Mechanism for irreversible self-deactivation of prostaglandin synthetase / R.W. Egan, J. Paxton, F.A.Jr. Kuehl // J. Biol. Chem. 1976. -V. 251.-P. 7329-7335.

63. Kalyanaraman, B. The free radical formed during the hydroperoxide-mediated deactivation of ram seminal vesicles is hemoprotein-derived / B. Kalyanaraman, R.P. Mason, B. Tainer, Т.Е. Eling // J. Biol. Chem. 1982. -V. 257. - №9. - P.4764-4768.

64. Karthein, R. Higher oxidation states of prostaglandin H synthase. EPR study of a transient tyrosyl radical in the enzyme during the peroxidase reaction / R. Karthein, R. Dietz, W. Nastainczyk, H.H. Ruf// Eur. J. Biochem. 1988. -V. 171.-№1-2.-P.313-320.

65. Shimokawa, T. Tyrosine 385 of prostaglandin endoperoxide synthase is required for cyclooxygenase catalysis / T. Shimokawa, R.J. Kulmacz, D.L. DeWitt, W.L. Smith // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - №33. - P. 2007320076.

66. Marnett, L.J. Cyclooxygenase mechanisms / L.J. Marnett // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - V. 4. - P. 545-552.

67. Longu S. The reaction mechanism of plant peroxidases / S. Longu, R. Medda, A. Padiglia, J.Z. Pedersen, G. Floris // Ital. J. Biochem. 2004. - V. 53.-№1.-P. 41-45.

68. Hsuanyu, Y. Prostaglandin H synthase kinetics. The effect of substituted phenols on cyclooxygenase activity and the substituent effect on phenolicperoxidatic activity / Y. Hsuanyu, H.B. Dunford // J. Biol. Chem. — 1992. -V. 267. -№25. -P. 17649-17657.

69. Koshkin, V. Coupling of the peroxidase and cyclooxygenase reactions of prostaglandin H synthase / V. Koshkin, B.H. Dunford // Biochim. Biophys.Acta 1999. - V. 1430. - №2. - P. 341-348.

70. Kulmacz, R.J. Comparison of branched-chain and tightly coupled reaction mechanisms for prostaglandin H synthase / R.J. Kulmacz, A.-L. Tsai, C. Wei//Biochemistry 1995.-V. 34.-№26.-P. 8499-8512.

71. Hazelton, W.D. Prostaglandin H synthases: members of a class of quasi-linear threshold switches / W.D. Hazelton, J.H. Tien, V.W. Donato, R. Sparks, C.M. Ulrich // Biochem. Pharmacol. 2004. - V. 68. - №3. - P. 423—432.

72. Yourno, J. Enzyme evolution: generation of a bifunctional enzyme by fusion of adjacent genes / J. Yourno, T. Kohno, J.R. Roth // Nature 1970. - V. 228. - №5274. - P. 820-824.

73. Huang, X. Channeling of substrates and intermediates in enzyme-catalyzed reactions / X. Huang, H.M. Holden, F.M. Raushel // Annu Rev. Biochem. -2001. — V. 70.-P. 149-180.

74. Meek, T.D. Purification and characterization of the bifunctional thymidylate synthetase-dihydrofolate reductase from methotrexate-resistant Leishmania tropica / T.D. Meek, E.P. Garvey, D.V. Santi // Biochemistry -1985. V. 24. - №3. - P. 678-686.

75. Miles, E.W. The molecular basis of substrate channeling / E.W. Miles, S. Rhee, D.R. Davies // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №18. - P. 1219312196.

76. Schneider, T.R. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase / T.R. Schneider, E. Gerhardt, M. Lee, P.H. Liang, K.S. Anderson, I. Schlichting // Biochemistry 1998. - V. 37. - №16. - P. 53945406.

77. Leys, D. Channelling and formation of 'active' formaldehyde in dimethylglycine oxidase / D. Leys, J. Basran, N.S. Scrutton // EMBO J. -2003. V. 22. - №16. - P. 4038-^4048.

78. Gehring, A.M. Acetyltransfer precedes uridylyltransfer in theformation of UDP-N-acetylglucosamine in separable active sites of thebifunctional GlmU protein of Escherichia coli / A.M. Gehring, W.J. Lees,155

79. D.J. Mindiola, C.T. Walsh, E.D. Brown // Biochemistry 1996. - V. 35. -№2.-P. 579-585.

80. Miles, B.W. Regulatory control of the amidotransferase domain of carbamoyl phosphate synthetase / B.W. Miles, J.A. Banzon, F.M. Raushel // Biochemistry 1998. - V. 37. - №47. - P. 16773-16779.

81. Eling, Т.Е. Studies on the reduction of endogenously generated prostaglandin G2 by prostaglandin H synthase / Т.Е. Eling, W.C. Glasgow, J.F. Curtis, W.C. Hubbard, J.A. Handler // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. -№19.-P. 12348-12355.

82. Easterby, J.S. A generalized theory of the transition time for sequential enzyme reactions / J.S. Easterby // Biochem. J. 1981. - V. 199. — №1. — P. 155-161.

83. Easterby, J.S. The kinetics of consecutive enzyme reactions. The design of coupled assays and the temporal response of pathways / J.S. Easterby//Biochem. J. 1984. -V. 219.-№3.-P. 843-847.

84. Liang, P.H. Kinetic reaction scheme for the dihydrofolate reductase domain of the bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate reductase from Leishmania major / P.H. Liang, K.S. Anderson // Biochemistry — 1998. -V. 37.-№35.-P. 12206-12212.

85. Kulmacz, R.J. Interaction between peroxidase and cyclooxygenase activities in prostaglandin-endoperoxide synthase. Interpretation of reaction kinetics / R.J. Kulmacz, R.B. Pendleton, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. -1994. V. 269. - №8. - P. 5527-5536.

86. Вржещ, П.В. Кинетическая модель бифункционального многосубстратного фермента. Стационарное приближение / П.В. Вржещ//Биохимия 1999.-Т. 64.-№4.-С. 502-512.

87. Волькенштейн, М.В. I Диаграмный метод решения задач стационарной ферментативной кинетики / М.В. Волькенштейн, Ю.Б. Магаршак // Биофизика 1970. - Т. 15. - С. 777-784.

88. Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден. -М.: Мир, 1979.

89. Cha, S. A simple method for derivation of rate equations for enzyme-catalyzed reactions under the rapid equilibrium assumption or combined assumptions of equilibrium and steady state / S. Cha // J. Biol. Chem. -1968.-V. 243.-№4.-P. 820-825.

90. Тихонов, A.H. Системы дифференциальных уравнений, содержащие малые параметры при производных / А.Н. Тихонов // Математический сборник 1952. - Т. 31. - №73. - С. 575-586.

91. Smith, W.L. Oxygenation of polyunsaturated fatty acids during prostaglandin biosynthesis by sheep vesicular gland / W.L. Smith, W.E.M. Lands // Biochemistry 1972. - V. 11. - P. 3276-3285.

92. Deeb, R.S. Heme catalyzes tyrosine 385 nitration and inactivation of• prostaglandin» H2 synthase-1 by peroxynitrite' / R.S. Deeb, G. Hao, S.S.157

93. Gross, M. Laine, J.H. Qiu, B. Resnick, E.J. Barbar, D.P. Hajjar, R.K. Upmacis // J. Lipid. Res. 2006 May. - V. 47. - №5. - P. 898-911.

94. Marshall, P.J. Constraints on prostaglandin biosynthesis in tissues / P.J. Marshall, R.J. Kulmacz, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262.-№8.-P. 3510-3517.

95. Kulmacz, R.J. Prostaglandin H synthase and hydroperoxides: peroxidase reaction and inactivation kinetics / R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 249. - №2. - P. 273-285.

96. Song, I. Different suicide inactivation processes for the peroxidase and cyclooxygenase activities of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 / I. Song, T.M. Ball, W.L. Smith // Biochem. Biophys. Res. Communs. -2001.-V. 289.-№4.-P. 869-875.

97. Wu, G. A mechanistic study of self-inactivation of the peroxidase activity in prostaglandin H synthase-1 / G. Wu, C. Wei, R.J. Kulmacz, Y. Osawa, A.L. Tsai // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №14. - P. 92319237.

98. Tsai, A.L. Prostaglandin H synthase. Kinetics of tyrosyl radical formation and of cyclooxygenase catalysis / A.L. Tsai, G. Palmer, R.J. Kulmacz//J. Biol. Chem. 1992. - V. 267.-№25.-P. 17753-17759.

99. Bambai, В. Role of Asn-382 and Thr-383 in activation and inactivation of human prostaglandin H synthase cyclooxygenase catalysis / B. Bambai, C.E. Rogge, B. Stec, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 2004. - V.г 279. №6. - P. 4084—4092.

100. Lu, G. Comparison of the peroxidase reaction kinetics of prostaglandin H synthase-1 and -2 / G. Lu, A.L. Tsai, H.E. Van Wart, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №23. - P. 16162-16167.

101. Wu, G. Cyclooxygenase inactivation kinetics during reaction of prostaglandin H synthase-1 with peroxide / G. Wu, RJ. Kulmacz, A.L. Tsai // Biochemistry 2003. - V. 42. - №46. - P. 13772-13777.

102. Цаплина, JI.A. Потеря циклооксигеназной и пероксидазной активностей простагландин-Н-синтазы в процессе катализа / Л.А. Цаплина, П.В. Вржещ // Биохимия 2007. - Т. 72. - №6. - С. 774-784.

103. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. -М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. — 493 с.

104. Whitehouse, С.М. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers / C.M. Whitehouse, R.N. Dreyer, M. Yamashita, J.B Fenn // Anal. Chem. 1985. - V. 57. - №3. - P. 675-679.

105. Dole, M. Molecular Beams of Macroions / M. Dole, R.L. Hines, R.C. Mack, R.C. Mobley, L.D. Ferguson, M.B. Alice // J. Chem. Phys. 1968. -V. 49. - №5. - P. 2240-2249.

106. Snyder, P. Biochemical and biotechnological applications of electrospray ionization mass spectrometry / P. Snyder. — ACS, Washington D. C., 1995, -601 p.

107. Gaskell, S.J. Electrospray: Principles & Practice / S.J. Gaskell // J. Mass Spectrom. 1997. - V. 32. - P. 677-688.

108. Gamero-Castano, M. Kinetics of small ion evaporation from the charge and mass distribution of multiply charged clusters in electrosprays /

109. Kebarle, P. A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry/ P. Kebarle // J. Mass Spectrom. -2000.-V. 35.-№7.-P. 804-817.

110. Fernandez de la Mora, J. Electrochemical Processes in Electrospray Ionization Mass Spectrometry / J. Fernandez de la Mora, G. J. Van Berkel, C. G. Enke, R. B. Cole, M. Martinez-Sanchez, J. B. Fenn // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 939-952.

111. Tito, M.A. Electrospray time-of-flight mass spectometry of the intact MS2 virus capsid / M.A. Tito, K. Tars, K. Valegard, J. Hajdu, C.V. Robinson // J. Am. Chem. 2000. - V. 122. - P. 3550-3551.

112. Lawrence, E.O. On the Production of High Speed Protons / E.O. Lawrence, N.E. Edelfsen // Science 1930 October 10. - V. 72. - P. 376377.

113. Sommer, H. A Precise Method of Determining the Faraday by Magnetic Resonance / H. Sommer, H.A. Thomas, J.A. Hippie // Phys. Rev. 1949.-V. 76.-P. 1877-1878.

114. Marshall, A.G. Relaxation and spectral line shape in Fourier transform ion resonance spectroscopy / A.G. Marshall, M.B. Comisarow, G. Parisod // J. Chem. Phys. 1979. - V. 71. - №11. - P. 4434-4444.

115. Karas, M. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds / M. Karas, D. Bachmann, D. Bahr, F. Hillenkamp // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. - V. 78. - P. 53-68.

116. Tanaka, К. Protein and Polymer Analyses up to m/z 100,000 by Laser Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry / K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1988.-V. 2. -№8. P. 151-153.

117. Karas, M. Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules / M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp // Anal. Chem. 1985. - V. 57. - P. 2935-2939.

118. Karas, M. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons / M. Karas, F. Hillenkamp // Anal. Chem. 1988.-V. 60.-№20.-P. 2299-2301.

119. Spengler, B. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis / B. Spengler, R.S. Cotter // Anal. Chem. 1990. - V. 62. - №8. -P. 793-796.

120. Hillenkamp, F. How cool is MALDI? An introduction to high pressure MALDI ion sources / F. Hillenkamp, S. Berkenkamp, A. Leisner // Proc. 50th ASMS Conf. On Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, F.L. -2002.

121. Zenobi, R. Ion formation in MALDI mass spectrometry / R. Zenobi, R. Knochenmuss // Mass Spectrom. Rev. 1998. - V. 17. - P. 337-366.

122. Karas, M. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors / M. Karas, M. Glucksmann, J. Schafer // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 1-12.

123. Knochenmuss, R. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization / R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker, R. Zenobi // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 1237-1245.

124. Nemeth, J.F. Characterization of the glycosylation sites in cyclooxygenase-2 using mass spectrometry / J.F. Nemeth, G.P.Jr.

125. Hochgesang, L.J. Marnett, R.M. Caprioli // Biochemistry 2001 Mar 13. -V. 40.-№10.-P. 3109-3116.

126. Mutsaers, J.H. Determination of the structure of the carbohydrate chains of prostaglandin endoperoxide synthase from sheep / J.H. Mutsaers, H. van Halbeek, J.P. Kamerling, J.F.Vliegenthart // Eur. J. Biochem. 1985 Mar 15. - V. 147. - №3. - P. 569-574.

127. Otto, J.C. N-glycosylation of prostaglandin endoperoxide synthases-1 and -2 and their orientations in the endoplasmic reticulum / J.C. Otto, D.L. DeWitt, W.L. Smith // J. Biol. Chem. 1993 Aug 25. - V. 268. - №24. - P. 18234-18242.

128. Shimokawa, T. Expression of prostaglandin endoperoxide synthase-1 in a baculovirus system / T. Shimokawa, W.L. Smith // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 Mar 31. - V. 183. - №3. - P. 975-982.

129. Boutaud, О. Characterization of the lysyl adducts formed from prostaglandin H2 via the levuglandin pathway / O. Boutaud, C.J. Brame, R.G. Salomon, L.J. 2nd Roberts, J.A. Oates // Biochemistry 1999 Jul 20. -V. 38. -№29. - P. 9389-9396.

130. Kulmacz, R.J. Attachment of substrate metabolite to prostaglandin H synthase upon reaction with arachidonic acid / R.J. Kulmacz // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987 Oct 29. - V. 148. - №2. - P. 539-545.

131. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. 1951. -V. 193.-№1.-P. 265-272.

132. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254

133. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature 1970 Aug 15. - V. 227. - №5259. - P. 680-685.

134. Франк, Г.М. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / Г.М.Франк, М.Н. Кондрашова, Е.Н. Мохова, Ю.С. Ротенберг. М.: Наука, 1973.

135. Kulmacz, R.J. Prostaglandin Н synthase: spectroscopic studies of the interaction with hydroperoxides and with indomethacin / R.J. Kulmacz, Y. Ren, A.-L. Tsai, G. Palmer // Biochemistry 1990. - V. 29. - №37. - P. 8760-8771.

136. Кузнецова, Ю.А. Чувствительный метод определения активности простагландин-Н-синтазы / Ю.А. Кузнецова, В.Б. Ромах, M.JL Строкин, А.Т. Мевх // Вестн. моек, ун.-та 1998. - Т. 39. - №5. - С. 302-304.

137. Falk, J.E. Porphyrins and metalloporphyrins / J.E. Falk // Elsevier Amsterdam. N.Y.-L. 1964. - V. 2. - P. 181-241.

138. Вржещ, П.В. Квазиравновесное приближение в ферментативной кинетике. Необходимые и достаточные условия применения в случае односубстратных реакций и оценка точности / П.В. Вржещ // Биохимия -2008.-Т. 73.-№Ю.-С. 1390-1397.

139. Рубин, А.Б. Биофизика / А.Б. Рубин // В 2 т. М.: Наука, 2004. -Т. 1: Теоретическая биофизика.

140. Тихонов, А.Н. Дифференциальные уравнения / А.Н. Тихонов, А.Б. Васильева, А.Г. Свешников. М.: Наука. Физматлит, 1998. — 232 с.

141. Li, В. Quasy-steady-state laws in enzyme kinetics / В. Li, Y. Shen, B. Li // J. Phys. Chem. A 2008. - V. 112. - P. 2311-2321.

142. Klonowski, W. Simplifying principles for chemical and enzyme reaction kinetics / W. Klonowski // Biophys. Chem. 1983. - V. 18. - P. 73-87

143. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Инактивация фермента в процессе реакции / П.В. Вржещ, С.Д. Варфоломеев // Биохимия 1985. - Т. 50. - №1. - С. 139-147.

144. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Ингибирование продуктами, обратимыми и необратимыми ингибиторами / П.В. Вржещ // Биохимия 1988. - Т. 53. -№10.-С. 1704-1711.

145. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных* реакций / П.В. Вржещ. М.: ООО «МАКС Пресс», 2003.

146. Волькенштейн, M.B. / М.В. Волькенштейн, Б.Н. Гольдштейн // Биохимия 1966. - Т. 31 - С. 541-547.

147. King, E.L. A schematic method of deriving the rate laws for enzyme-catalyzed reactions / E.L. King, C. Altman // J. Phys. Chem. — 1956. — V.60. -P. 1375-1378.

148. Swinney, D.C. Differential allosteric regulation of prostaglandin H synthase 1 and 2 by arachidonic acid / D.C. Swinney, A.Y. Mak, J. Barnett, C.S. Ramesha//J. Biol. Chem. 1997. - V.272.-P. 12393-12398.

149. Garavito, R.M. The structure of mammalian cyclooxygenases / R.M. Garavito, A.M. Mulichak // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003. -V.32.-P. 183-206.

150. Вржещ, П.В. Интегральная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Критерии кинетического поведения и характеристические координаты для решения прямой и обратных задач / П.В. Вржещ // Биохимия 1996. - Т. 61 - С. 2069-2083.

151. Bambai, В. Prostaglandin Н synthase: effects of peroxidase cosubstrates on cyclooxygenase velocity / B. Bambai, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 2000. - V.275. - P. 27608-27614.

152. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика бифункциональных ферментов. Учет иерархии быстрых и медленных каталитических циклов в обобщенной модели / П.В. Вржещ // Биохимия — 2007. Т. 72. - №9. - С. 936-943.

153. Chen W. Hydroperoxide dependence and cooperative cyclooxygenase kinetics in prostaglandin H synthase-1 and -2. / W. Chen, T.R. Pawelek, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - №29. - P. 20301-20306.